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La présente invention a pour objet un procédé de pré- paration de produits d'assaisonnement, qui consiste à préparer un bouillon de culture en ajoutant à des saccharides, comme milieu de nutrition, un produit contenant de l'azote et choisi parmi le grou pe comprenant des sels ammoinques, de l'ammoniac, de l'urée, des amino-acides, des nitrates et des nitrites, en une quantité supé-
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rieure à la quantité nécessaire à la croissance des micro-organis mes On inocule un ou plusieurs micro-organismes choisis parmi ceux qui peuvent produire de l'acide @ -cétoglutarique, comme par exemple le Pseudomonas, le Lactobacillus, l'Acétobacter, l'Aéro- bacter, l'Escherichia, le Serratia, le Saccharomyess,
l'Aspergil- lus et le B,subtilis. On cultive ces micro-organismes dans un- mi- lieu aéré ou non; à une température de 10 à 50'-Ce de façon à obte- nir de l'acide @ -cétoglutarique par l'action physiologique des micro-organismes. En même temps,.on provoque l'amination du produi par l'action de l'enzyme formé par les micro-organismes. On ob- tient l'amino-acide en utilisant progressivement l'acide Ó -céte- glutarique tout en assimilant la teneur d'azote. On sépare l'acide glutamique après avoir concentré le bouillon ou par des méthodes conventionnelles, en vue d'obtenir le produit d'assaisonnement.
La présente invention a pour objet la préparation biochimique, à rendement élevé, de produits d'assaisonnement composés d'acide L-glutamique en effectuant, en continu, la préparation d'acide cétoglutarique et d'amino-acide.
On savait que les acides @ -céto, tels que l'acide @ -céto-glutarique, l'acide oxalacétique, l'acide pyrogluconique, peuvent être obtenus comme produits intermédiaires ou comme pro- duits finals dans le métabolisme du sucre, par la fonction de dif- férents micro-organismes, dont en particulier le Pseudomonas, l'Aérobacter, le B,subtilis, le Serratia, le Lacobacillus, l'Acéte bacter et le Gluconobacter. Toutefois, ces céto-acides n'ont pas été utilisés à des fins commerciales, car ils sont biochimiquement instables ( ils se transforment dans le procédé de métabolisme) ou ils sont difficilement séparables de la liqueur de fermentation.
On savait également très bien, en théorie, que le.s acides @ -céto se combinent avec NH3, dans le procédé de métabo- lisme, par la fonction des micro-organismes pour forcer des ../ - amino-acides et que la synthèse de la protéine s'effectuait. A
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présent, on connaît très bien la théorie permettant dexpliquer la croissance du corps de micro-organisme :le corps de micro-or- ganisme croit et se multiplie à partir du sucre et des sels d'NH4.
Toutefois, dans les expériences scientifiques, il n'y a guère d'exemples pour lesquels on ait effectué des études et des recherches quant au métabolisme de l'ammoniac se produisant en même temps que le métabolisme du sucre par addition de sels ammoni- ques, d'urée, de nitrates ou de nitrites en quantité supérieure à la quantité nécessaire pour la croissance du micro-organisme. On pense que, jusqu'à présent, personne n'a essayé de préparer un pro' duit d'assaisonnement par ce procédé et l'objet de la présente in- vention constitue un premier pas effectué dans ce sens.
Suivant la présente invention, on a essayé d'appli- quer la théorie de la synthèse de la protéine physiologique - théo- rie de l'importante synthèse oiochimique - ,à savoir que l'acide ,,,le -céto se transforme en -amino-acide, et ce, pour préparer de l'acide glutamique, produit d'assaisonnement le plus important.
En cultivant un ou plusieurs micro-organismes, qui ont une fonc- tion particulièrement forte pour former de l'acide # -céto-gluta- rique dans un milieu contenant du sucre et des sels ammoniques, de l'urée, des nitrates ou des nitrites en quantités différentes, on a trouvé que le taux de croissance et de multiplication du micro- organisme n'augmentait pas au-delà d'une certaine limite, même si la quantité de composé azoté augmentait; toutefois, la consommation de composé azoté ajouté au milieu augmente fortement suivant que l'addition de composé azoté augmente. En d'autres termes, le com- posé azoté additionné est en partie utilisé pour la croissance des micro-organismes, mais l'excès de composé azoté est métabolisé en dehors de l'assimilation pour la croissance et il se forme un amino-acide.
Il suffit.généralement d'employer 0,1-0,2 % de sulfa- te ammonique comme source d'azote dans le bouillon de culture,pour
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la croissance des micro-organismes ou pour l'industrie de férmen- tation en général et l'on a considéré qu'il était inutile ou néfas te d'en employer plus. Au contraire, suivant la présente invention, on est allé, dans certains cas, jusqu'à 15 % dans le bouillon de culture. Par conséquent, la présente invention diffère totalement de la conception qu'on s'est faite jusqu'à présent en ce qui con- cerne la culture des micro-organismes.
Comme on l'a fait remarquer ci-avant, l'excès de ma- tière azotée n'est pas utilisé comme milieu de nutrition pour la culture des micro-organismes, la croissance du micro-organisme étant arrêtée à une 'certaine limite, mais on l'utilise exclusive- ment en vue de poursuivre la préparation d'acide -céto-glutari- que après que ce dernier s'est transformé en amino-acide. Ci-après, les résultats des essais effectués pour établir la relation entre la quantité de matière azotée ajoutée, la quantité d'acide glutami- que obtenu et la croissance de la bactérie.
Essai 1.
EMI4.1
Bouillon de culture : glucose 8 )1, KHPOy : 0,05 %, K 2HPO4 : 0,05%, mgso 4* ZH20 0,03 lit, NaCl, CaCl., ici 2 et
CuSO4 0,001 % respectivement.
Au milieu basique indiqué ci-avant, on a jouté du sulfate ammoni- que dans les quantités suivantes : 0,01- 0,03 - 0,05 - 0,1 - 0,2 - 0,3 - 0,5 - 1 - 3 - 5 - 6 et 8 %.
Tous les milieux préparés'comme indiqué ci-avant ont été stérilisés par chauffage à 130 C pendant 20 minutes, puis ils ont été utili- sés.
Micro-organismes : (a) Deux types d'Aérobacters.
(b) Un type d'Acétobacter et deux types de Gluconobacters.
(c) Un type de Pseudomonas et un type de Serratia.
Procédé de culture : on effectue la culture dans un milieu aéré, pendant 48 heures à 32 C, puis on laisse le milieu au repos et
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on le décante. La bactérie est séparée par centrifugation. La quantité de liqueur est de 10 litres pour chaque essai.
Remarques : Dans le tableau suivant, les chiffres de l'acide glu- tamique sont en % de l'hydrochlorure, ceux de la bactérie représenr tent 'les quantités.(%) de la bactérie séchée et le signe "- " indique que l'on n'a pas découvert de trace d'acide glutamique par chromatographie sur papier, tandis que le signe Il * " indique que l'on a découvert des traces d'acide glutamique par chromatographie sur papier.
EMI5.1
<tb>
Bactérie <SEP> Acide <SEP> glutamique <SEP> % <SEP> Corps <SEP> bactérien
<tb>
<tb> (a) <SEP> (b) <SEP> (c) <SEP> ' <SEP> (a) <SEP> (b) <SEP> (c)
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> am-
<tb>
<tb> monique <SEP> %
<tb>
EMI5.2
------------------------------------------------------------------
EMI5.3
<tb> 0,01 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 0,017 <SEP> 0,019 <SEP> 0,008
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,03 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 0,050 <SEP> 0,062 <SEP> 0,031
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,05 <SEP> ¯ <SEP> - <SEP> - <SEP> 0,071 <SEP> ;
<SEP> 0,081 <SEP> 0,068
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,1 <SEP> 0,03 <SEP> - <SEP> ¯ <SEP> 0,113 <SEP> 0,134 <SEP> 0,101
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,2 <SEP> 0,12 <SEP> + <SEP> 0,04 <SEP> 0,165 <SEP> 0,153 <SEP> 0,114
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,3 <SEP> 0,24 <SEP> 0,19 <SEP> 0,13 <SEP> 0,159 <SEP> 0,160 <SEP> 0,125
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,5 <SEP> 0,75 <SEP> 0,81 <SEP> 0,53 <SEP> 0,174 <SEP> 0,168 <SEP> 0,122
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1,0 <SEP> 1,07 <SEP> 1,12 <SEP> 0,92 <SEP> 0,146 <SEP> 0,167 <SEP> 0,110
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3;
0 <SEP> 1,15 <SEP> 1,24 <SEP> 1,08 <SEP> 0,157 <SEP> 0,169 <SEP> 0,113
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 5,0 <SEP> 1,23 <SEP> 1,29 <SEP> 1,16 <SEP> 0,160 <SEP> 0,176 <SEP> 0,104
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 6,0 <SEP> 1,20 <SEP> 1,36 <SEP> 1,21 <SEP> 0,145 <SEP> 0,152 <SEP> 0,098
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 8,0 <SEP> 0,98 <SEP> 1,19 <SEP> 1,05 <SEP> 0,119 <SEP> 0,135 <SEP> 0,076
<tb>
Comme on le constate dans le tableau ci-avant, la croissance et la multiplication des bactéries sont pratiquement ar- rêtées lorsqu'on atteint une certaine limite, mais la production d'acide glutamique augmente suivant que la quantité de sulfate ammo- nique ajouté augmente.
L'essai ci-après indique la relation entre les
EMI5.4
quantités obtenues d'acide "J -céto-glutarique et d'acide glutami- que par rapport à la durée.
Essai 2.
Bouillon de culture : Au lieu de la glucose du milieu basique de l'essai 1, on ajoute 5,4 % de liqueur d'amidor.
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saccharifiée, calculés sur le sucre réduit. A ce mi- lieu basique substitué, on ajoute 2 % de sulfate ammonique et, en'outre, on ajoute¯également 0,2 % de sulfate ammonique uniquement au bouillon de cul- ture des micro-organismes de (C).
Micro-organismes :
A. Un type d'Aérobacter et un type de Serratia.
B. Un type d'Acétobacter, deux types d'Acétogluconobacter et un type de Saccharomyces cerevisiae.
C. Deux types de Pseudomonas.
Procédé de culture : on utilise un bouillon de 20 litres à 32 C, tout en agitant et en laissant au repos. De temps en temps, on pré- lève des échantillons.
Remarques : Dans le tableau ci-après, les quantités d'acide glutami- que et d'acide -.--,'.-cétoglutarique sont données en % et elles repré- sentent les résultats obtenus par estimation conventionnelle. La ,bactérie est mise en suspension dans de l'eau en soumettant la li- queur à centrifugation; elle est évaluée par photonéphélométrie et la valeur est recalculée sur la base de la bactérie séchée.
EMI6.1
<tb>
Acide <SEP> glutamique
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Micro-organisme <SEP> A <SEP> B <SEP> G <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> ammonique <SEP> % <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 0,2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Temps, <SEP> heures
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 15 <SEP> 0,02 <SEP> ¯ <SEP> ¯ <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> 30 <SEP> 0,25 <SEP> 0,17 <SEP> 0,30 <SEP> ¯
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 50 <SEP> 0,96 <SEP> 0,24 <SEP> 0,71 <SEP> 0,01
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 75 <SEP> 1,53 <SEP> 1,33 <SEP> 1,08 <SEP> 0,01
<tb>
<tb>
<tb> 100 <SEP> 1,60 <SEP> 1,52 <SEP> 1,45 <SEP> 0,02
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 125 <SEP> 1,61 <SEP> 1,53 <SEP> 1,47 <SEP> 0,
03
<tb>
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EMI7.1
<tb> Acide <SEP> -cétoglutarique <SEP> Bactérie
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Micro-organisme
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ¯¯¯ <SEP> A <SEP> B <SEP> C <SEP> A <SEP> B <SEP> C <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> ammonique <SEP> %
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 0,2 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 0,2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Temps,
<tb>
<tb>
<tb> heures
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 15 <SEP> 0,01 <SEP> 0,02 <SEP> ¯ <SEP> 0,01 <SEP> 0,04 <SEP> 0,05 <SEP> 0,02 <SEP> 0,03
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 30 <SEP> 0,23 <SEP> 0,31 <SEP> 0,12 <SEP> 0,18 <SEP> 0,12 <SEP> 0,10 <SEP> 0,11 <SEP> 0,13
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 50 <SEP> 0,72 <SEP> 0,98 <SEP> 0,03 <SEP> 0',74 <SEP> 0,14 <SEP> 0,14 <SEP> 0,15 <SEP> 0,
15
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 75 <SEP> 0,18 <SEP> 0,20 <SEP> 0,01 <SEP> 0,95 <SEP> 0,14 <SEP> 0,15 <SEP> 0,16 <SEP> 0,15
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 100 <SEP> 0,02 <SEP> 0,01 <SEP> ¯ <SEP> 1,02 <SEP> 0,14 <SEP> 0,15 <SEP> 0,16 <SEP> 0,16
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 125 <SEP> ¯ <SEP> - <SEP> ¯ <SEP> 1,02 <SEP> 0,13 <SEP> 0,15 <SEP> 0,15 <SEP> 0,16
<tb>
Comme on peut le constater d'après le tableau ci-avant, ' l'acide glutamique n'est pas obtenu pratiquement par addition de 0,2% de sulfate ammonique, tandis que, en ajoutant 2 % de sulfate arnmonique, il se forme de l'acide glutamique avec de l'acide -cé- toglutarique après 50-75 heures de culture et ensuite, la production d'acide glutamique augmente tandis que la consommation d'acide cétoglutarique diminue progressivement.
De la sorte, le rendement en acide glutamique augmente remarquablement, ce qui diffère du cas où l'on ajoute 0,2 % de sulfate ammonique. D'une manière plus dé- 'taillée, la croissance du micro-organisme ou l'accroissement de la bactérie sont pratiquement indépendants de la quantité de 2 % ou d 0,2 % de sulfate ammonique, niais la quantité d'acide -cétogluta rique formé augmente considérablement et la majeure partie de cet acide -cétoglutarique se transforme en acide glutamique. Dans le tableau, les chiffres renseignés pour l'acide -cétoglutariqu sont ceux que l'on obtient après la transformation en 'acide gluta- rique.
Ils ne représentent pas les chiffres réels de l'acide,/ - cétoglutarique formé, mais, si l'on tient compte de la quantité d'acide glutamique formé, on notera que la production d'acide céto- glutamique augmente d'environ 50-60 % au total, au cas où l'on ajou- te 2 % de sulfate ammonique, comparativement au cas où l'on ajoute
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0,2% de sulfate ammonique. Cette augmentation de la production d'acide cétoglutatique contribue à augmenter celle de l'atide glu- gamique.
A présent,, pouf mieux comprendre la présente invention-, 'on donnera quelques exemples d'application du procédé qui en fait l'objet. Il est toutefois bien entendu que ces. exemples ne citent pas là présente invention' EXEMPLE 1.
A une solution aqueuse de 10% de mélasses de sucre, on ajoute 10% de (NH4)2SO4 et l'on inocule la liqueur mixte avec un type d'Aérobacter et un type de Pseudomonas, c'est-à-dire avec deux types de micro-organismes, puis on cultive cette liqueur pesant 7 jours à 33 C. Après avoir raffine et concentré la liquenr enltivée, on obtient un produit d'assaisonnement ayant un bon goût.
EXEMPLE 2.
On utilise 10 litres d'une liqueur de culture contenant
5 % d'urée additionnée à 8 % de sucrose (avec une addition complé- mentaire de 0,1% de KH2PO4 et 0,05% de MgSO4 comme milieu de nu- trition). La quantité d'urée ajoutée à cette liqueur correspond à environ 2,3 , calculés sur la base d'azote.
Dans 10 litres de bouillon de culture décrit ci-avant, on a inoculé un type d'Aérobacter et un type de Gluconocétobacter, puis on a cultivé le tout pendant 72 heures, dans un milieu aéré, à 30 C.
Sans retirer la bactérie, on a concentré et traité la liqueur culti- vée avec du HCl concentré. On a séparé l'acide glutamique sous for- me d'hydrochlorure suivant la méthode conventionnelle et l'on a obtenu 105,6 gr. du produit. Lorsque l'on examine séparément l'é- chantillon contenant les bactéries, on évalue qu'il ne contient que 18,5 gr. de bactéries, calculés sur la base des conditions sèches et l'on constate que l'acide glutamique formé n'est pas obtenu di- rectement à partir des bactéries, mais qu'il est préparé par un nouveau procédé biochimique, dans la liqueur, à partir de.l'excès
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d'urée.
EXEMPLE 3.
On prépare un bouillon de culture en ajoutant, au moût (10 % sous forme de sucre), 15 % de (NR4)2SO4 (3,1 % sous forme de
N) et 5 % de CaCO3. A 10 litres de ce bouillon de culture, on ajou- te un morceau de fromage ( environ 1 gr) et on cultive à 33 C.
Dans cette liqueur, il y a un type de Pfeudomonas, deux types 'dAéro- bacter, deux types de Saccharomyces, un type d'Aspergillus, un type
Je B, subtilis et un type de B,coagulans.
La quantité d'azote du composé ammonique a été évaluée de temps en temps au cours de la culture de 15 jours et l'on a trouvé que la valeur d'azote est à son minimum, le 13e jour. A ce point minimum, on met la culture en suspension, on élimine l'excès de
CaCO3 et le CaS04 formés, on concentre la liqueur, on élimine les ions Ca et l'excès d'ammonium par addition de Na2CO3, on neutralise la liqueur par addition de HC1 et on concentre la liqueur. On ob- tient ainsi un produit d'assaisonnement ayant un bon goût.
Dans cet-'' te opération, on constate que 67,4 % d'azote du composé ammonique ont été utilisés et que l'azote du composé amino obtenu atteint 43% 'de toute la quantité d'azote ajoutée au départ, la moitié environ de toute la quantité d'azote métabolisé (67,4 %) étant assimilée en composé amino, tandis que toute la, quantité de bactérie n'est que de 3,1 gr. soit 1 % seulement de toute la quantité d'azote (310 gr sous forme d'azote) ajoutée à la liqueur, même si l'on suppose que ces 3,1 gr de la bactérie se composent entièrement de protéine.
Dès lors, on constate que la majeure partie d'azote ajoutée en excès est métabolisée et que la majeure partie d'azote métabolisée s'est accumulée sous forme d'amino-acides dans la liqueur.
EXEMPLE 4.
On inocule un type d'Aérobacter dans un bouillon de cul- ture contenant 5% de glucose, 0,1% de K2HPO4, 0,05% de MgSO4 et
2 % de MaNO3 comme source d'azote. On cultive ce bouillon à 30 C
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pendant 5 jours. Après 5 jours, on analyse ce bouillon cultivé et l'on trouve 1,50% d'acide glutamique (environ 30% de sucre). Pour effectuer une comparaison,on ajoute 1,5 % de NHCl au lieu de NaNO3. (La quantité d'azote est la même que celle indiquée ci-avant, soit 0,33 jl). 0n a inoculé le même micro-organisme et on a effectué la culture dans les mêmes conditions. Dans ce dernier cas, le rende- ment en acide glutamique est de 1,48 %.
EXEMPLE 5.
On prépare un bouillon de culture en ajoutant, à la li- queur d'amidon saccharifiée (5 % sous forme de sucre), 0,1 % de K2HPO4, 0,04 % de MgSO4 et 2 % de NaNO3. On inocule ce bouillon avec un type de Pseudomonas et on le cultive de la même manière qu'à l'exemple précédent. Le cinquième jour de la culture, on-ob- tient 1,25% d'acide glutamique (25 % de sucre).
EXEMPLE 6.
On prépare un bouillon de culture en ajoutant 0,75 % de NH4C1 et 1 % de NaNO3. comme sources d'azote, à une liqueur conte- nant 5 % de sucrose, 0,1% de KH2PO4 et 0,05 % de MgSO4. On inocule un mélange de Serratia et de B,subtilis, puis on cultive le bouil- lon à-33 C, pendant 5 jours. Lorsque la fermentation est achevée, on obtient 1,70% d'acide glutamique (34% de sucre) dans la liqueur de culture.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.
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The present invention relates to a process for preparing seasoning products, which consists in preparing a culture broth by adding to saccharides, as a nutrition medium, a product containing nitrogen and selected from the group comprising amino salts, ammonia, urea, amino acids, nitrates and nitrites, in an amount greater than
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greater than the amount necessary for the growth of the microorganisms One or more microorganisms chosen from among those which can produce β-ketoglutaric acid, such as for example Pseudomonas, Lactobacillus, Acetobacter, Aerobacter, Escherichia, Serratia, Saccharomyess,
Aspergillus and B, subtilis. These microorganisms are cultivated in an airy or non-ventilated environment; at a temperature of 10 to 50 ° C so as to obtain β-ketoglutaric acid by the physiological action of microorganisms. At the same time, the amination of the product is caused by the action of the enzyme formed by the microorganisms. The amino acid is obtained by gradually using Ó-keto-glutaric acid while assimilating the nitrogen content. The glutamic acid is separated after having concentrated the broth or by conventional methods, in order to obtain the seasoning product.
The present invention relates to the biochemical preparation, in high yield, of seasoning products composed of L-glutamic acid by carrying out, continuously, the preparation of ketoglutaric acid and amino acid.
It was known that @ -keto acids, such as @ -keto-glutaric acid, oxalacetic acid, pyrogluconic acid, can be obtained as intermediates or as end products in sugar metabolism, by function of various microorganisms, including in particular Pseudomonas, Aerobacter, B, subtilis, Serratia, Lacobacillus, Acete bacter and Gluconobacter. However, these keto acids have not been used for commercial purposes because they are biochemically unstable (they convert in the process of metabolism) or they are difficult to separate from the fermentation liquor.
It was also well known, in theory, that β-keto acids combine with NH3, in the process of metabolism, by the function of microorganisms to force β-amino acids and that the protein synthesis was taking place. AT
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At present, the theory for explaining the growth of the micro-organism body is well known: the micro-organism body grows and multiplies from sugar and NH4 salts.
However, in scientific experiments there are few examples where studies and research have been carried out on the metabolism of ammonia occurring concurrently with the metabolism of sugar by addition of ammonium salts. , urea, nitrates or nitrites in an amount greater than the amount necessary for the growth of the microorganism. It is believed that heretofore no one has attempted to prepare a seasoning product by this process and the object of the present invention is a first step in this direction.
According to the present invention, attempts have been made to apply the theory of physiological protein synthesis - the theory of important oiochemical synthesis -, namely that the acid ,,, keto is transformed into - amino acid, to make glutamic acid, the most important seasoning product.
By cultivating one or more microorganisms, which have a particularly strong function to form #-keto-glutaric acid in a medium containing sugar and ammonium salts, urea, nitrates or nitrites in different amounts, it was found that the rate of growth and multiplication of the microorganism did not increase beyond a certain limit even if the amount of nitrogen compound increased; however, the consumption of nitrogen compound added to the medium increases sharply as the addition of nitrogen compound increases. In other words, the nitrogen compound added is partly used for the growth of microorganisms, but the excess nitrogen compound is metabolized outside of assimilation for growth and an amino acid is formed. .
It is generally sufficient to use 0.1-0.2% ammonium sulphate as a source of nitrogen in the culture broth, to
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growth of microorganisms or for the fermentation industry in general and it was considered unnecessary or undesirable to use more. On the contrary, according to the present invention, we went, in certain cases, up to 15% in the culture broth. Therefore, the present invention differs completely from the conception hitherto taken with regard to the cultivation of microorganisms.
As pointed out above, the excess nitrogenous material is not used as a nutrient medium for the culture of the microorganisms, the growth of the microorganism being stopped at a certain limit. but it is used exclusively for the further preparation of-keto-glutaric acid after the latter has transformed into the amino acid. The following are the results of the tests carried out to establish the relationship between the amount of nitrogenous material added, the amount of glutamic acid obtained and the growth of the bacteria.
Test 1.
EMI4.1
Culture broth: glucose 8) 1, KHPOy: 0.05%, K 2HPO4: 0.05%, mgso 4 * ZH20 0.03 lit, NaCl, CaCl., Here 2 and
CuSO4 0.001% respectively.
Ammonium sulfate was added to the basic medium indicated above in the following quantities: 0.01-0.03 - 0.05 - 0.1 - 0.2 - 0.3 - 0.5 - 1 - 3 - 5 - 6 and 8%.
All media prepared as above were sterilized by heating at 130 ° C for 20 minutes, and then used.
Microorganisms: (a) Two types of Aerobacter.
(b) One type of Acetobacter and two types of Gluconobacter.
(c) One type of Pseudomonas and one type of Serratia.
Culture process: the culture is carried out in an aerated medium for 48 hours at 32 ° C., then the medium is left to stand and
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it is decanted. The bacteria are separated by centrifugation. The quantity of liquor is 10 liters for each test.
Notes: In the following table, the figures for glutamic acid are in% of the hydrochloride, those for the bacteria represent the quantities (%) of the dried bacteria and the sign "-" indicates that the No trace of glutamic acid was found by paper chromatography, while the sign II * "indicates that traces of glutamic acid were found by paper chromatography.
EMI5.1
<tb>
Bacterium <SEP> Glutamic acid <SEP> <SEP>% <SEP> Bacterial <SEP> body
<tb>
<tb> (a) <SEP> (b) <SEP> (c) <SEP> '<SEP> (a) <SEP> (b) <SEP> (c)
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> am-
<tb>
<tb> monique <SEP>%
<tb>
EMI5.2
-------------------------------------------------- ----------------
EMI5.3
<tb> 0.01 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 0.017 <SEP> 0.019 <SEP> 0.008
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0.03 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 0.050 <SEP> 0.062 <SEP> 0.031
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0.05 <SEP> ¯ <SEP> - <SEP> - <SEP> 0.071 <SEP>;
<SEP> 0.081 <SEP> 0.068
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0.1 <SEP> 0.03 <SEP> - <SEP> ¯ <SEP> 0.113 <SEP> 0.134 <SEP> 0.101
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0.2 <SEP> 0.12 <SEP> + <SEP> 0.04 <SEP> 0.165 <SEP> 0.153 <SEP> 0.114
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0.3 <SEP> 0.24 <SEP> 0.19 <SEP> 0.13 <SEP> 0.159 <SEP> 0.160 <SEP> 0.125
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0.5 <SEP> 0.75 <SEP> 0.81 <SEP> 0.53 <SEP> 0.174 <SEP> 0.168 <SEP> 0.122
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1.0 <SEP> 1.07 <SEP> 1.12 <SEP> 0.92 <SEP> 0.146 <SEP> 0.167 <SEP> 0.110
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3;
0 <SEP> 1.15 <SEP> 1.24 <SEP> 1.08 <SEP> 0.157 <SEP> 0.169 <SEP> 0.113
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 5.0 <SEP> 1.23 <SEP> 1.29 <SEP> 1.16 <SEP> 0.160 <SEP> 0.176 <SEP> 0.104
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 6.0 <SEP> 1.20 <SEP> 1.36 <SEP> 1.21 <SEP> 0.145 <SEP> 0.152 <SEP> 0.098
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 8.0 <SEP> 0.98 <SEP> 1.19 <SEP> 1.05 <SEP> 0.119 <SEP> 0.135 <SEP> 0.076
<tb>
As can be seen in the table above, the growth and multiplication of bacteria are practically stopped when a certain limit is reached, but the production of glutamic acid increases as the amount of ammonium sulfate added increases. .
The test below shows the relationship between
EMI5.4
obtained amounts of "J-keto-glutaric acid and glutamic acid with respect to time.
Test 2.
Culture broth: Instead of the glucose of the basic medium of test 1, 5.4% of amidor liquor is added.
<Desc / Clms Page number 6>
saccharified, calculated on reduced sugar. To this substituted basic medium is added 2% ammonium sulphate and, in addition, 0.2% ammonium sulphate is also added only to the culture broth of the microorganisms of (C).
Micro-organisms:
A. One type of Aerobacter and one type of Serratia.
B. One type of Acetobacter, two types of Acetogluconobacter and one type of Saccharomyces cerevisiae.
C. Two types of Pseudomonas.
Method of culture: a broth of 20 liters at 32 ° C. is used, while stirring and leaving to stand. From time to time, samples are taken.
Remarks: In the table below, the amounts of glutamic acid and -.--, .- ketoglutaric acid are given in% and they represent the results obtained by conventional estimation. The bacteria are suspended in water by subjecting the liquor to centrifugation; it is evaluated by photonephelometry and the value is recalculated on the basis of the dried bacteria.
EMI6.1
<tb>
Glutamic acid <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Micro-organism <SEP> A <SEP> B <SEP> G <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> ammonium <SEP>% <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 0.2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Time, <SEP> hours
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 15 <SEP> 0.02 <SEP> ¯ <SEP> ¯ <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> 30 <SEP> 0.25 <SEP> 0.17 <SEP> 0.30 <SEP> ¯
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 50 <SEP> 0.96 <SEP> 0.24 <SEP> 0.71 <SEP> 0.01
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 75 <SEP> 1.53 <SEP> 1.33 <SEP> 1.08 <SEP> 0.01
<tb>
<tb>
<tb> 100 <SEP> 1.60 <SEP> 1.52 <SEP> 1.45 <SEP> 0.02
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 125 <SEP> 1.61 <SEP> 1.53 <SEP> 1.47 <SEP> 0,
03
<tb>
<Desc / Clms Page number 7>
EMI7.1
<tb> <SEP> -ketoglutaric acid <SEP> Bacteria
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Microorganism
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ¯¯¯ <SEP> A <SEP> B <SEP> C <SEP> A <SEP> B <SEP> C <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> ammonium <SEP>%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 0.2 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 0.2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Time,
<tb>
<tb>
<tb> hours
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 15 <SEP> 0.01 <SEP> 0.02 <SEP> ¯ <SEP> 0.01 <SEP> 0.04 <SEP> 0.05 <SEP> 0.02 <SEP> 0.03
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 30 <SEP> 0.23 <SEP> 0.31 <SEP> 0.12 <SEP> 0.18 <SEP> 0.12 <SEP> 0.10 <SEP> 0.11 <SEP> 0 , 13
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 50 <SEP> 0.72 <SEP> 0.98 <SEP> 0.03 <SEP> 0 ', 74 <SEP> 0.14 <SEP> 0.14 <SEP> 0.15 <SEP> 0,
15
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 75 <SEP> 0.18 <SEP> 0.20 <SEP> 0.01 <SEP> 0.95 <SEP> 0.14 <SEP> 0.15 <SEP> 0.16 <SEP> 0 , 15
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 100 <SEP> 0.02 <SEP> 0.01 <SEP> ¯ <SEP> 1.02 <SEP> 0.14 <SEP> 0.15 <SEP> 0.16 <SEP> 0.16
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 125 <SEP> ¯ <SEP> - <SEP> ¯ <SEP> 1.02 <SEP> 0.13 <SEP> 0.15 <SEP> 0.15 <SEP> 0.16
<tb>
As can be seen from the above table, 'glutamic acid is not obtained practically by adding 0.2% ammonium sulfate, while adding 2% ammonium sulfate is formed. glutamic acid with ketoglutaric acid after 50-75 hours of culture and then the production of glutamic acid increases while the consumption of ketoglutaric acid gradually decreases.
In this way, the yield of glutamic acid increases remarkably, which differs from the case where 0.2% of ammonium sulfate is added. In more detail, the growth of the microorganism or the increase of the bacterium is practically independent of the amount of 2% or of 0.2% ammonium sulfate, but the amount of ketogluta acid. The risk formed increases considerably and most of this ketoglutaric acid is transformed into glutamic acid. In the table, the figures given for -ketoglutaric acid are those obtained after conversion to glutaric acid.
They do not represent the real figures of the acid, / - ketoglutaric formed, but, if one takes into account the quantity of glutamic acid formed, it will be noted that the production of keto-glutamic acid increases by about 50 -60% in total, in the case of adding 2% ammonium sulphate, compared to the case of adding
<Desc / Clms Page number 8>
0.2% ammonium sulfate. This increase in the production of ketoglutatic acid contributes to an increase in the production of glucose aid.
Now, to better understand the present invention, 'we will give some examples of application of the process which is the subject. It is however of course understood that these. Examples do not cite the present invention. EXAMPLE 1.
To a 10% aqueous solution of sugar molasses, 10% (NH4) 2SO4 is added and the mixed liquor is inoculated with one type of Aerobacter and one type of Pseudomonas, i.e. with two types of microorganisms, then this liquor weighing 7 days at 33 C. After refining and concentrating the resulting liquor, a flavoring product having a good taste is obtained.
EXAMPLE 2.
10 liters of a culture liquor containing
5% urea plus 8% sucrose (with a further addition of 0.1% KH2PO4 and 0.05% MgSO4 as nutrient medium). The amount of urea added to this liquor is approximately 2.3, calculated on the basis of nitrogen.
In 10 liters of culture broth described above, one type of Aerobacter and one type of Gluconocetobacter was inoculated, then the whole was cultured for 72 hours, in an aerated medium, at 30 C.
Without removing the bacteria, the cultured liquor was concentrated and treated with concentrated HCl. Glutamic acid was separated off in the form of hydrochloride according to the conventional method and 105.6 g were obtained. of the product. When the sample containing the bacteria is examined separately, it is assessed that it contains only 18.5 g. bacteria, calculated on the basis of dry conditions and it is found that the glutamic acid formed is not obtained directly from the bacteria, but is prepared by a new biochemical process, in the liquor, from.excess
<Desc / Clms Page number 9>
urea.
EXAMPLE 3.
A culture broth is prepared by adding, to the must (10% in the form of sugar), 15% of (NR4) 2SO4 (3.1% in the form of
N) and 5% CaCO3. To 10 liters of this culture broth, add a piece of cheese (about 1 g) and cultivate at 33 C.
In this liquor there is one type of Pfeudomonas, two types of Aerobacter, two types of Saccharomyces, one type of Aspergillus, one type.
I B, subtilis and a type of B, coagulans.
The amount of nitrogen of the ammonium compound was evaluated from time to time during the 15 day culture and the nitrogen value was found to be at its minimum on the 13th day. At this minimum point, the culture is suspended, the excess of
CaCO3 and CaSO4 formed, the liquor is concentrated, the Ca ions and excess ammonium are removed by addition of Na2CO3, the liquor is neutralized by the addition of HCl and the liquor is concentrated. There is thus obtained a seasoning product having a good taste.
In this operation, it is found that 67.4% nitrogen of the ammonium compound was used and that the nitrogen of the amino compound obtained reached 43% of the total amount of nitrogen added at the start, half approximately of the whole quantity of metabolized nitrogen (67.4%) being assimilated into amino compound, while the whole quantity of bacteria is only 3.1 gr. or only 1% of the total amount of nitrogen (310 gr as nitrogen) added to the liquor, even if we assume that these 3.1 gr of the bacteria consist entirely of protein.
Therefore, it is found that most of the excess nitrogen added is metabolized and that most of the metabolized nitrogen has accumulated in the form of amino acids in the liquor.
EXAMPLE 4.
One type of Aerobacter is inoculated into a culture broth containing 5% glucose, 0.1% K2HPO4, 0.05% MgSO4 and
2% MaNO3 as nitrogen source. We cultivate this broth at 30 C
<Desc / Clms Page number 10>
during 5 days. After 5 days, this cultured broth is analyzed and 1.50% glutamic acid (about 30% sugar) is found. For comparison, 1.5% NHCl is added instead of NaNO3. (The quantity of nitrogen is the same as that indicated above, ie 0.33 dl). The same microorganism was inoculated and cultivation was carried out under the same conditions. In the latter case, the glutamic acid yield is 1.48%.
EXAMPLE 5.
A culture broth is prepared by adding to the saccharified starch binder (5% as sugar) 0.1% K2HPO4, 0.04% MgSO4 and 2% NaNO3. This broth is inoculated with a type of Pseudomonas and grown in the same way as in the previous example. On the fifth day of the culture, 1.25% glutamic acid (25% sugar) is obtained.
EXAMPLE 6.
A culture broth is prepared by adding 0.75% NH4Cl and 1% NaNO3. as sources of nitrogen, to a liquor containing 5% sucrose, 0.1% KH2PO4 and 0.05% MgSO4. A mixture of Serratia and B, subtilis is inoculated, then the broth is cultured at -33 ° C. for 5 days. When fermentation is complete, 1.70% glutamic acid (34% sugar) is obtained in the culture liquor.
** ATTENTION ** end of DESC field can contain start of CLMS **.