BE1030865B1

BE1030865B1 - Voederadditief voor het verbeteren van de darmgezondheid en/of de verteerbaarheid van voeder in vee

Info

Publication number: BE1030865B1
Application number: BE20225716A
Authority: BE
Inventors: Dirk Janssens; Ronny Mombaerts
Original assignee: Nu3Guts Bv
Priority date: 2022-09-12
Filing date: 2022-09-12
Publication date: 2024-04-09
Also published as: BE1030811A1; BE1030865A1; BE1030811B1; NL2035782A; NL2035782B1

Abstract

De huidige uitvinding betreft voederadditief voor het verbeteren van de darmgezondheid en/of de verteerbaarheid van voeder in vee, omvattende een serineprotease isoleerbaar uit Bacillus licheniformis met een eerste enzymactiviteit gemeten bij een pH gelegen tussen 7 en 8, en een zuur endoprotease isoleerbaar uit Aspergillus niger met een tweede enzymactiviteit gemeten bij een pH gelegen tussen 2,5 en 3,5, waarin de verhouding tussen de eerste enzymactiviteit en de tweede enzymactiviteit gelegen is tussen 0,8/1 en 1/0,8. De uitvinding betreft eveneens een werkwijze voor het bereiden van een voornoemd voederadditief, alsook een voedersamenstelling omvattende voornoemd voederadditief en een gebruik van voornoemd voederadditief.

Description

1 BE2022/5716

VOEDERADDITIEF VOOR HET VERBETEREN VAN DE DARMGEZONDHEID EN/OF

DE VERTEERBAARHEID VAN VOEDER IN VEE

TECHNISCH DOMEIN

De uitvinding heeft betrekking op een voederadditief voor het verbeteren van de darmgezondheid en/of de verteerbaarheid van voeder in vee, alsook een voeder waarin zo’n voederadditief is toegepast en een gebruik van het voederadditief.

STAND DER TECHNIEK

Door het niet evenwichtige aminozuurgehalte en de daaruit voortvloeiende beperkte oplosbaarheid van plantaardige eiwitten, in het bijzonder die van tarwe- en maïseiwitten, is efficiënte proteolyse in het spijsverteringskanaal van monogastrische dieren suboptimaal. Wanneer bijvoorbeeld soja of een sojaderivaat is opgenomen in het voer van dieren met één maag, zoals varkens en pluimvee, wordt een aanzienlijk deel van de vaste stoffen van de soja niet efficiënt verteerd.

Soja bevat namelijk veel anti nutritionele factoren die de uitgebreide toepassing ervan beperken. Proteaseremmer, trypsineremmer of trypsine inhibitor (TI) is een van de meest voorkomende anti nutritionele factoren (ANF's) in sojabonen en andere graanvoeders. TI remt de activiteit van enzymen die eiwitten verteren in het spijsverteringskanaal, zoals trypsine en chymotrypsine.

TI is hittegevoelig, maar het gebruik van warmtebehandeling om TI te verminderen is niet gemakkelijk. Een strenge warmtebehandeling elimineert TI volledig, maar kan het soja-eiwit vernietigen, waardoor de eiwitbenutting bij de dieren daalt.

Glycinine en B-conglycinine zijn soja-antigenen. Wanneer jonge dieren worden gevoederd met diëten die soja-eiwit bevatten, komt een klein deel van de onverteerde eiwitten in de lymfe en het bloed terecht via openingen tussen de darmepitheelcellen.

Deze macromoleculen hebben een aanzienlijke antigene activiteit en stimuleren het immuunsysteem, wat leidt tot specifieke antigeen-antilichaamreacties en T-lymfoïde celgemedieerd vertraagde overgevoeligheid. Soja-antigenen kunnen dus darmstoornissen veroorzaken, waardoor de opname van voedingsstoffen vermindert en bijgevolg de groeiprestaties dalen. Soja-antigenen zijn hittestabiel, waardoor een warmtebehandeling weinig effectief is voor het verwijderen van soja antigenen.

2 BE2022/5716

Het gebruik van serineproteasen in veevoeder is gekend, zoals bijvoorbeeld uit

WO2004034776.

Gekende technieken houden echter geen rekening met het feit dat in éénmagige dieren het voeder aan 2 pH regio’s blootgesteld wordt, de zure maag (2-4) en het neutrale darmkanaal (7-7,5). Serineproteasen zijn neutrale proteasen die quasi niet werken in de zure regio’s van het spijsverteringsstelsel. Hierdoor is de efficiënte proteolyse in het spijsverteringskanaal van éénmagige (monogastrische) dieren nog steeds suboptimaal.

De huidige uitvinding beoogt een oplossing te vinden voor tenminste enkele van bovenvermelde problemen.

SAMENVATTING VAN DE UITVINDING

De uitvinding betreft een voederadditief voor het verbeteren van de darmgezondheid en/of de verteerbaarheid van voeder in vee volgens conclusie 1. Voorkeursvormen zijn weergegeven in conclusies 2 tot en met 11.

In een tweede aspect betreft de uitvinding een voeder voor vee omvattende een voederadditief voor het verbeteren van de darmgezondheid en/of de verteerbaarheid van voeder in vee volgens conclusie 12. Een voorkeursvorm is weergegeven in conclusie 13. Alsook een gebruik volgens conclusie 14.

Een doelstelling van de uitvinding is het verbeteren van de eiwitverteerbaarheid en eiwitbenutting in het volledige maagdarmstelsel door enerzijds de verteerbaarheid van de eiwitten die de planten zoals tarwe, mais, soja, fabaceae, aanmaken als reservestikstofbron te verbeteren, en anderzijds het verbeteren van de afbraak van de anti nutritionele factoren (ANF's) op eiwit basis (glycinine en B-conglycinine, TI, …).

Door de gemeenschappelijke aminozuur-spectra van deze complete groep van op eiwit gebaseerde ANF zijn zij een ideaal substraat voor de Bacillus licheniformis serineprotease.

Het is een doelstelling van de uitvinding om de proteolyse doorheen het volledige spijsverteringskanaal van éénmagige dieren te optimaliseren. Hiertoe heeft de uitvinding tot doel een efficiënte proteolyse te verzorgen zowel in de zure, als in de neutrale regio’s van het maagdarmstelsel.

3 BE2022/5716

Een doel van de uitvinding is het vrijstellen van extra beschikbare eiwitten, peptiden en aminozuren in zo veel mogelijk regio’s van het maagdarmstelsel, en zo eveneens te besparen op dieetkosten door het verminderen van de toevoeging van extra benodigde eiwitten en aminozuren.

Het is een doelstelling van de uitvinding de verteerbaarheid van voeders met hoge gehalten aan glutamine en asparagine te verhogen in zo veel mogelijk regio’s van het maagdarmstelsel.

Een andere doelstelling van de uitvinding is het verbeteren van de rentabiliteit en verhogen van de valorisatie van bijproducten in het volledige maagdarmstelsel.

De uitvinding heeft eveneens tot doel de stikstofuitscheiding in het milieu en het waterverbruik te verminderen. Bovendien heeft de uitvinding tot doel de diergezondheid te verbeteren en de voedselveiligheid te verbeteren of waarborgen. De uitvinding staat eveneens in voor het verbeteren van de strooiselkwaliteit.

GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING

De uitvinding betreft een voederadditief voor het verbeteren van de darmgezondheid en/of de verteerbaarheid van voeder in vee.

Tenzij anders gedefinieerd hebben alle termen die gebruikt worden in de beschrijving van de uitvinding, ook technische en wetenschappelijke termen, de betekenis zoals ze algemeen begrepen worden door de vakman in het technisch veld van de uitvinding.

Voor een betere beoordeling van de beschrijving van de uitvinding, worden de volgende termen expliciet uitgelegd. “Een”, ”de” en “het” refereren in dit document aan zowel het enkelvoud als het meervoud tenzij de context duidelijk anders veronderstelt. Bijvoorbeeld, “een segment” betekent een of meer dan een segment.

Wanneer “ongeveer” of “rond” in dit document gebruikt wordt bij een meetbare grootheid, een parameter, een tijdsduur of moment, en dergelijke, dan worden variaties bedoeld van +/-20% of minder, bij voorkeur +/-10% of minder, meer bij voorkeur +/- 5% of minder, nog meer bij voorkeur +/-1% of minder, en zelfs nog meer bij voorkeur

4 BE2022/5716 +/-0.1% of minder dan en van de geciteerde waarde, voor zoverre zulke variaties van toepassing zijn in de beschreven uitvinding. Hier moet echter wel onder verstaan worden dat de waarde van de grootheid waarbij de term “ongeveer” of “rond” gebruikt wordt, zelf specifiek wordt bekendgemaakt.

De termen “omvatten”, “omvattende”, “voorzien van”, “behelzen”, “behelzende”, “inhouden”, “inhoudende” zijn synoniemen en zijn inclusieve of open termen die de aanwezigheid van wat volgt aanduiden, en die de aanwezigheid niet uitsluiten of beletten van andere componenten, kenmerken, elementen, leden, stappen, gekend uit of beschreven in de stand der techniek.

De termen “bestaan uit”, “bestaande uit”, “bevatten”, “bevattende” zijn synoniemen en zijn exclusieve of gesloten termen die de aanwezigheid van wat volgt aanduiden, en die de aanwezigheid uitsluiten of beletten van andere componenten, kenmerken, elementen, leden, stappen, gekend uit of beschreven in de stand der techniek.

Het citeren van numerieke intervallen door de eindpunten omvat alle gehele getallen, breuken en/of reële getallen tussen de eindpunten, deze eindpunten inbegrepen.

De uitdrukking “gewichtsprocent”, “gew.%", “m%"” of “% gew” refereert in dit document naar het relatieve gewicht van een component gebaseerd op het totale gewicht van het volledige product waarnaar verwezen wordt. “IU” of “U” is de enzymeenheid die enzymatische activiteit weergeeft. 1 U of 1 IU (umol/min) wordt gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die in staat is om in 1 minuut de omzetting van 1 umol substraat te katalyseren.

In een eerste aspect betreft de uitvinding een voederadditief voor het verbeteren van de darmgezondheid en/of de verteerbaarheid van voeder in vee.

Volgens een voorkeurdragende uitvoeringsvorm omvat het voederadditief een serineprotease isoleerbaar uit Bacillus licheniformis en een zuur endoprotease isoleerbaar uit Aspergillus niger.

Volgens een uitvoeringsvorm bezit de serineprotease een eerste enzymactiviteit gemeten bij een pH gelegen tussen 7 en 8, bij voorkeur 7,5, en bezit het zuur endoprotease een tweede enzymactiviteit gemeten bij een pH gelegen tussen 2,5 en

3,5, bij voorkeur 3. De enzymactiviteit wordt gemeten in U/g protease. De verhouding tussen de eerste enzymactiviteit en de tweede enzymactiviteit is bij voorkeur gelegen tussen 0,8/1 en 1/0,8, uitgedrukt in U/g serineprotease op U/g zuur endoprotease, meer bij voorkeur gelegen tussen 0,85/1 en 1/0,85, nog meer bij voorkeur gelegen tussen 5 0,9/1 en 1/0,9, zelfs nog meer bij voorkeur gelegen tussen 0,95/1 en 1/0,95.

In een alternatieve of een verdere voorkeursvorm omvat het voederadditief de serineprotease en het zuur endoprotease, in een massaverhouding gelegen tussen 0,5/1 en 3,5/1, uitgedrukt in g serineprotease op g zuur endoprotease.

Er is gebleken dat het gebruik van een combinatie een serineprotease en een zuur endoprotease leidt tot een synergetische eiwithydrolyse. Hierbij zorgt de serineprotease voor efficiënte proteolyse in de neutrale regio’s van het maagdarmstelstel, terwijl het zuur endoprotease zorgt voor een efficiënte proteolyse in de zure regio’s van het maagdarmstelsel.

De serineprotease is geschikt voor het hydrolyseren van peptidebindingen die zich naast de aminozuren asparaginezuur (Asp) of glutaminezuur (Glu) bevinden. Het zuur endoprotease is geschikt voor glutamine-rijke regio’s op eiwitketens in de maag te hydrolyseren. Het iso-elektrisch punt van bijvoorbeeld glutamine is namelijk 5,7, waardoor deze in de maag geprotoneerd zullen worden en hierdoor makkelijker hydrolyseerbaar zijn door de zure endoproteasen.

De term "protease" wordt hierin gedefinieerd als een enzym dat peptidebindingen (eiwitbindingen) hydrolyseert. De term "protease" omvat elk enzym dat behoort tot de

EC 3.4-enzymgroep (inclusief elk van de dertien subklassen daarvan). Het EC-nummer verwijst naar Enzyme Nomenclature 1992 van NC-IUBMB, Academic Press, San Diego,

Californië.

De term “endoprotease” refereert naar een protease dat intern in de eiwitketens bindingen hydrolyseert. Endoproteasen vertonen activiteit op N- en C-terminaal geblokkeerde peptidesubstraten die relevant zijn voor de specificiteit van de protease in kwestie. Een serineprotease is een endopeptidase die de peptidebindingen van eiwitten hydrolyseert, waarbij serine fungeert als een nucleofiel aminozuur van het actieve centrum, d.w.z. dat serine een onderdeel is van de katalytische triade dat fungeert als actief centrum. Een zuur endoprotease is een endoprotease met een optimale werking bij zure pH.

6 BE2022/5716

Met de term “voeder”, zoals gebruikt in de tekst, worden alle verbindingen, preparaten, mengsels of samenstellingen beoogd die geschikt zijn voor of bedoeld zijn voor consumptie door een dier.

De term “verbeteren van de verteerbaarheid” van een diervoeder betekent verbetering van de beschikbaarheid van de eiwitten, hetgeen leidt tot een verhoogde eiwitextractie, een hogere eiwitopbrengst, en/of een verbeterde eiwitbenutting. De voedingswaarde van het voeder wordt daardoor verhoogd en de groeisnelheid en/of de gewichtstoename en/of de voederconversie (d.w.z. het gewicht van het opgenomen voeder in verhouding tot de gewichtstoename) van het dier wordt/ worden verbeterd.

De term vee omvat alle dieren die in de landbouw en visserij om economische redenen gehouden worden, doorgaans als voedselbron. Voorbeelden van dieren zijn niet- herkauwers en herkauwers. Herkauwers omvatten bijvoorbeeld dieren zoals schapen, geiten, paarden en runderen, bijvoorbeeld vleesrunderen, koeien en jonge kalveren. In een bepaalde belichaming is het dier een niet-herkauwend dier. Niet-herkauwende dieren omvatten mono-gastrische dieren, b.v. varkens of varkens (met inbegrip van, maar niet beperkt tot, biggen, groeiende varkens, en zeugen); pluimvee zoals kalkoenen, eenden en kippen (met inbegrip van, maar niet beperkt tot, vleeskuikens, leghennen); jonge kalveren; en vissen (met inbegrip van, maar niet beperkt tot zalm, forel, tilapia, meerval en karpers; en schaaldieren (met inbegrip van, maar niet beperkt tot garnalen en steurgarnalen).

In een uitvoeringsvorm omvat het voederadditief verder een dragermateriaal, bij voorkeur is dit dragermateriaal krijt.

In een voorkeursvorm omvat het voederadditief de serineprotease, in een hoeveelheid gelegen tussen 10 en 50 m%, uitgedrukt in relatieve gewicht van de serineprotease op het totale gewicht van het voederadditief, bij voorkeur tussen 15 en 45 m%, meer bij voorkeur tussen 20 en 40 m%, en met de meeste voorkeur tussen 25 en 35 m%.

In een voorkeursvorm omvat het voederadditief het zuur endoprotease, in een hoeveelheid gelegen tussen 1 en 40 m%, uitgedrukt in relatieve gewicht van het zuur endoprotease op het totale gewicht van het voederadditief, bij voorkeur tussen 5 en 35 m%, nog meer bij voorkeur tussen 10 en 30 m%.

7 BE2022/5716

In een voorkeursvorm bevat het voederadditief: - de serineprotease en het zuur endoprotease, in een massaverhouding gelegen tussen 0,5/1 en 3,5/1, - additieven en/of onzuiverheden, in een hoeveelheid van maximaal 1 m%, uitgedrukt in relatieve gewicht van de totale hoeveelheid additieven en/of onzuiverheden gebaseerd op het totale gewicht van het voederadditief. - krijt, aangevuld tot 100%.

In een bijzondere uitvoeringsvorm is de serineprotease, in de vorm waarin het aan het voeder wordt toegevoegd, of wanneer het wordt opgenomen in een voederadditief, goed gedefinieerd. Goed gedefinieerd betekent dat de serineprotease voor ten minste 50% zuiver is, zoals bepaald door middel van maatexclusiechromatografie. In andere bijzondere uitvoeringsvormen is de serineprotease ten minste 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94, of ten minste 95% zuiver, zoals bepaald met deze methode.

In een bijzondere uitvoeringsvorm is het zuur endoprotease, in de vorm waarin het aan het voeder wordt toegevoegd, of wanneer het wordt opgenomen in een voederadditief, goed gedefinieerd. Goed gedefinieerd betekent dat het zuur endoprotease voor ten minste 50% zuiver is, zoals bepaald door middel van maatexclusiechromatografie. In andere bijzondere uitvoeringsvormen is de serineprotease ten minste 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94, of ten minste 95% zuiver, zoals bepaald met deze methode.

De serineproteasen en de zure endoproteasen met zuiverheden van deze orde van grootte zijn met name te verkrijgen met behulp van recombinante productiemethoden.

Een goed gedefinieerde protease is voordelig. Het is bijvoorbeeld veel gemakkelijker om een protease die in wezen vrij is van interfererende of verontreinigende andere proteasen, op de juiste wijze aan het voeder te doseren. De term juist doseren heeft met name betrekking op de doelstelling om consistente en constante resultaten te verkrijgen, en op de mogelijkheid om de dosering te optimaliseren op basis van het gewenste effect.

Voor het gebruik in diervoeder behoeven de proteasen echter niet zo zuiver te zijn; het kan b.v. andere enzymen bevatten.

8 BE2022/5716

De serineprotease en het zuur endoprotease zijn aanwezig in een voederadditief dat vervolgens aan voeder voor vee wordt toegevoegd (of in een behandelingsproces wordt gebruikt).

Alternatief kunnen de protease, d.i. de serineprotease en het zuur endoprotease rechtstreeks aan het voeder worden toegevoegd (of rechtstreeks in een eiwitbehandelingsproces worden gebruikt), in dit geval bestaat het voederadditief bij voorkeur dus hoofdzakelijk uit de serineprotease en het zuur endoprotease.

Dergelijke proteasen kunnen uiteraard worden gemengd met andere enzymen. Volgens een voorkeursvorm omvat het voederadditief verder fytase, xylanase, amylase, of een combinatie hiervan.

Een fytase is een fosfatase-enzym dat geschikt is voor het katalyseren van de hydrolyse van fytinezuur (een onverteerbare, organische vorm van fosfor die in veel plantenweefsels wordt aangetroffen, vooral in granen en oliehoudende zaden) en een bruikbare vorm van anorganisch fosfor vrij te maken.

Xylanase (EC 3.2.1.8) is elk enzym dat geschikt is voor het afbreken van het lineaire polysacharide xylaan tot xylose, en zo hemicellulose, een van de hoofdbestanddelen van plantencelwanden, af te breken.

Amylase is een enzym dat tijdens de spijsvertering zetmeel hydrolyseert. Een amylase is geschikt voor het aangrijpen op de lineair a-1,4-glycoside polymeerbinding tussen de glucosemoleculen van zetmeel.

Volgens een uitvoeringsvorm heeft het voeder een ruw eiwitgehalte van 50-800 g/kg, en omvat het voeder bovendien ten minste één serineprotease isoleerbaar uit Bacillus licheniformis.

Het voederadditief moet uiteraard in een effectieve hoeveelheid worden toegepast, d.w.z. in een hoeveelheid die voldoende is om de oplosbaarheid, verteerbaarheid en/of voedingswaarde van het voeder te verbeteren. In een voorkeursvorm wordt de totale hoeveelheid protease, d.i. de serineprotease en het zuur endoprotease, daarom aan het voeder toegevoegd in een concentratie van 50-1000 ppm. De term “ppm” is gedefinieerd als mg protease per kg voeder.

9 BE2022/5716

Eiwitten uit plantenzaden (maïs, tarwe, soja, koolzaad, erwt, zonnebloem, aardnoot, …) zijn opslagproteïnen en hebben een hoger stikstofgehalte dan dierlijke opslageiwitbronnen (melk, ei-eiwit) om een overmaat aan stikstof (N) aan de zich ontwikkelende zaailing te voorzien. Het hogere stikstofgehalte is hoofdzakelijk het gevolg van een hogere aanwezigheid van aminozuren met een secundair stikstof gehalte zoals glutamine (Gin) en asparagine (Asn).

Deze aminozuren hebben secundaire amidegroepen die waterstofbruggen vormen met aangrenzende eiwitketens. Onderlinge waterstofbruggen zorgen ervoor dat de eiwitten een hydrofobe aard hebben in een waterige oplossing.

Tarwe-eiwit bevat ongeveer 80% gluten-eiwit. Gluteneiwitten kunnen verdeeld worden in twee hoofd fracties op basis van hun oplosbaarheid in waterige alcoholen: de oplosbare gliadinen en de onoplosbare glutenines. Beide fracties bestaan uit talrijke, gedeeltelijk nauw verwante eiwitcomponenten gekenmerkt door hoge glutamine- en prolinegehalten.

De onoplosbaarheid van gluteninen is een gevolg van de hoge concentratie van apolaire aminozuurresiduen zoals proline en leucine en van het zeer polaire maar niet- ioniseerbare residu glutamine, en aan de lage concentratie van ioniseerbare zijketens zoals lysine, arginine, glutaminezuur en asparaginezuur. De interacties tussen glutamine en asparagine door waterstofbruggen spelen een belangrijke rol bij het bevorderen van de associatie van gliadine- en glutenininemoleculen. Het hydrofiele deel van het eiwit is begraven, en het en het hydrofobe deel vormt de buitenkant van het eiwit waardoor het niet in water oplosbaar is.

Maïseiwit verschilt slechts gedeeltelijk van tarwe-eiwitten heeft een uitgebreide (50%) fractie genaamd zeïne. Het heeft ook een uitgesproken Gin en Asn gehalte, wat de beperkte oplosbaarheid in water en functionaliteit verklaart.

Door het niet evenwichtige aminozuurgehalte en de daaruit voortvloeiende beperkte oplosbaarheid van plantaardige eiwitten, in het bijzonder die van tarwe- en maïseiwitten, is efficiënte proteolyse in het spijsverteringskanaal van éénmagige dieren suboptimaal. Het hydrofobe karakter en het niet-uniforme aminozuurpatroon vereist een zeer specifieke proteolytische werking.

10 BE2022/5716

Proteasen uit Bacillus licheniformis hebben een hoge affiniteit voor hydrofobe eiwitten en eiwitdelen. Volgens een voorkeursvorm is de serineprotease in het voeder geschikt voor het hydrolyseren van peptidebindingen die zich naast de aminozuren asparaginezuur (Asp) of glutaminezuur (Glu) bevinden.

Volgens een uitvoeringsvorm is de serineprotease in het voederadditief in staat om eiwitten op te lossen. Dit komt doordat de serineprotease in staat is om de peptidebindingen die zich naast de hydrofobe delen in het eiwit zitten te hydrolyseren, waardoor de oplosbaarheid verhoogt.

Het eiwit kan een dierlijk eiwit zijn, zoals vlees- en beendermeel, en/of vismeel; of het kan een plantaardig eiwit zijn, bij voorkeur is omvat het voeder een plantaardig eiwit.

De term “plantaardige eiwitten”, zoals hierin gebruikt, verwijst naar elke verbinding, samenstelling, bereiding of mengsel dat ten minste één eiwit bevat dat is afgeleid van of afkomstig is van een groente, met inbegrip van gemodificeerde eiwitten en eiwit- derivaten. In verdere uitvoeringsvormen bedraagt het eiwitgehalte van de plantaardige eiwitten ten minste 10, 20, 30, 40, 50, of 60% (9/9).

Plantaardige eiwitten kunnen afkomstig zijn van plantaardige eiwitbronnen, zoals peulvruchten en granen, bijvoorbeeld materialen van planten van de families Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae, en Poaceae, zoals sojameel, lupinemeel en raapzaadmeel. In een uitvoeringsvorm is de plantaardige eiwitbron materiaal van een of meer planten van de familie Fabaceae, bijvoorbeeld sojaboon, lupine, erwt, of boon. In een andere uitvoeringsvorm is de plantaardige eiwitbron materiaal van een of meer planten van de familie Chenopodiaceae, b.v. biet, suikerbiet, spinazie of quinoa. Andere voorbeelden van plantaardige eiwitbronnen zijn koolzaad, zonnebloemzaad, katoenzaad, en kool. Andere voorbeelden van plantaardige eiwitbronnen zijn granen zoals gerst, tarwe, rogge, haver, maïs (maïs), rijst, triticale, en sorghum.

Soja is een plantaardige eiwitbron van voorkeur in het voeder. Soja kan voorkomen als, maar niet gelimiteerd tot soja, sojameel, sojaschroot of een combinatie hiervan.

Volgens een voorkeursvorm is het voeder gekozen uit de lijst van: tarwe, mais, tarwezemelen, DDGS tarwe, sojaschroot, rogge, raapzaad, raapzaadschroot, haver,

11 BE2022/5716 gerst, erwten, zonnebloemzaadschroot, koolzaadschroot, sorghum of een combinatie hiervan.

Deze voeders hebben allen een eiwitprofiel met hoge hoeveelheden Gin en Asn, die zowel door de serineprotease als door het zuur endoprotease goed gehydrolyseerd worden in de zure en neutrale regio’s van het maagdarmstelsel. De serineprotease is namelijk geschikt om in neutrale regio’s peptidebindingen die zich naast de aminozuren asparaginezuur (Asp) of glutaminezuur (Glu) bevinden te hydrolyseren. Het zuur endoprotease is geschikt om in zure regio’s glutamine-rijke regio’s op eiwitketens in de maag te hydrolyseren. Dit leidt tot een synergetisch hydrolyse-effect dat vooral tot uiting komt bij gebruik in voeders omvattende hoge gehalten glutamine en asparagine.

Het voederadditief volgens de uitvinding resulteert in een verhoogde oplosbaarheid van eiwitten, vergeleken met de blanco. Ten minste 101%, of 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 110%, 111%, 112%, 113%, 114%, 115%, of ten minste 116% opgelost eiwit kan worden verkregen met behulp van de serineprotease van de uitvinding, verwijzend naar het in vitro model van voorbeelden 1-9 hierin. De term oplosbaarheid van eiwitten betekent in feite het in oplossing brengen van eiwit(en).

Dergelijke oplosbaarheid kan het gevolg zijn van protease-gemedieerde afgifte van eiwit uit andere componenten van de gewoonlijk complexe natuurlijke samenstellingen zoals diervoeder. Oplosbaarheid kan worden gemeten als een toename van de hoeveelheid oplosbare eiwitten, in vergelijking met een monster zonder serineproteasebehandeling.

Het voederadditief volgens de uitvinding resulteert in een verhoogde verteerbaarheid van eiwitten, in vergelijking met de blanco. Ten minste 101%, of 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 110%, 111%, 112%, 113%, 114%, 115%, of ten minste 116% verteerbaar eiwit kan worden verkregen met behulp van het voederadditief omvattende de serineprotease.

Volgens een voorkeursvorm is de serineprotease isoleerbaar uit Bacillus licheniformis, meer bij voorkeur is de serineprotease geïsoleerd uit Bacillus licheniformis.

Volgens een voorkeursvorm is het zuur endoprotease isoleerbaar uit Aspergillus niger, meer bij voorkeur is het zuur endoprotease geïsoleerd uit Aspergillus niger.

Volgens een uitvoeringsvorm is het voederadditief toepasbaar voor elk vee. In een voorkeursvorm wordt het voederadditief toegevoegd aan voeder bestemd voor

12 BE2022/5716 éénmagig vee. Meer bij voorkeur betreft het vee varkens, pluimvee of aquacultuur, nog meer bij voorkeur varkens en/of pluimvee.

Volgens een uitvoeringsvorm is het voederadditief toepasbaar voor vee van elke leeftijd.

In een voorkeursvorm wordt het voederadditief toegevoegd aan voeder bestemd voor vee tussen 0 en 1 jaar oud, bij voorkeur tussen 0 en 6 maand oud, nog meer bij voorkeur tussen 0 en 3 maand oud.

Volgens een voorkeursvorm is de serineprotease geschikt voor het hydrolyseren van peptidebindingen, meer bij voorkeur is de serineprotease geschikt voor het hydrolyseren van peptidebindingen in trypsine inhibitoren. Trypsine inhibitoren omvatten een hoge concentratie aan asparaginezuur (Asp), asparagine (Asn), glutaminezuur (Glu) en glutamine (Gin). De serineprotease is in het bijzonder geschikt voor het hydrolyseren van peptidebindingen die zich naast de aminozuren Asp of Glu bevinden. Asn en Gin worden gedesamideerd (in zure omstandigheden) in de maag van het vee tot Asp en

Glu. Er zijn bijgevolg in het eiwit een hoog aantal peptidebindingen aanwezig die door de serineprotease gehydrolyseerd kunnen worden.

Volgens een voorkeursvorm omvat het voeder soja, sojaschroot, of een combinatie hiervan. Soja omvat anti nutritionele factoren zoals glycinine, B-conglycinine en trypsine inhibitor (TI), waartegen de serineprotease bij voorkeur effectief is.

Volgens een voorkeursvorm is de serineprotease geschikt voor het hydrolyseren van peptidebindingen in soja antigenen, zoals glycinine, B-conglycinine, of glycinine en B- conglycinine. Glycinine en B-conglycinine omvatten een hoge concentratie aan asparaginezuur (Asp), asparagine (Asn), glutaminezuur (Glu) en glutamine (Gin). De serineprotease is in het bijzonder geschikt voor het hydrolyseren van peptidebindingen die zich naast de aminozuren Asp of Glu bevinden. Asn en Gin worden gedesamideerd (in zure omstandigheden) in de maag van het vee tot Asp en Glu. Er zijn bijgevolg in het eiwit een hoog aantal peptidebindingen aanwezig die door de serineprotease gehydrolyseerd kunnen worden.

Macromineralen worden in een uitvoeringsvorm ook opgenomen in het voederadditief.

Verder zijn eventuele voederadditiefbestanddelen kleurstoffen, bijvoorbeeld carotenoïden zoals beta-caroteen, astaxanthine en luteïne; aromaverbindingen;

13 BE2022/5716 stabilisatoren; antimicrobiële peptiden; meervoudig onverzadigde vetzuren; reactieve zuurstof genererende species.

Voorbeelden van antimicrobiële peptiden (AMP's) zijn CAP18, Leucocine A, Tritrpticine,

Protegrine-1, Thanatine, Defensine, Lactoferrine, Lactoferricine, en Ovispirine zoals

Novispirine (Robert Lehrer, 2000), Plectasinen, en Statinen, waaronder de verbindingen en polypeptiden beschreven in WO 03/044049 en WO 03/048148, alsook varianten of fragmenten van het bovenstaande die antimicrobiële activiteit behouden.

Voorbeelden van antifungale polypeptiden (AFP's) zijn de Aspergillus giganteus en

Aspergillus niger peptiden, alsook varianten en fragmenten daarvan die antifungale activiteit behouden, zoals beschreven in WO 94/01459 en WO 02/090384.

Voorbeelden van meervoudig onverzadigde vetzuren zijn meervoudig onverzadigde

C18-, C20- en C22-vetzuren, zoals arachidonzuur, docosohexaeenzuur, eicosapentaeenzuur en gamma-linoleïnezuur.

Voorbeelden van reactieve zuurstof genererende verbindingen zijn chemicaliën zoals perboraat, persulfaat of percarbonaat; en enzymen zoals een oxidase, een oxygenase of een syntethase.

In een tweede aspect betreft de uitvinding een werkwijze voor het vervaardigen van een voederadditief volgens het eerste aspect.

In een voorkeurdragende uitvoeringsvorm omvat de werkwijze het aanbrengen van een serineprotease isoleerbaar uit Bacillus licheniformis met een eerste enzymactiviteit gemeten bij een pH gelegen tussen 7 en 8, en een zuur endoprotease isoleerbaar uit

Aspergillus niger met een tweede enzymactiviteit gemeten bij een pH gelegen tussen 2,5 en 3,5, op een dragermateriaal, bijvoorbeeld door te verstuiven, waarbij in het voederadditief een verhouding tussen de eerste enzymactiviteit en de tweede enzymactiviteit gelegen tussen 0,8/1 en 1/0,8 bereikt wordt.

In een uitvoeringsvorm kunnen de proteasen in vloeibare toestand aangebracht worden op het dragermateriaal middels verstuiven. In een andere uitvoeringsvorm kunnen de proteasen aangebracht worden op het dragermateriaal in poedervorm middels een menging.

14 BE2022/5716

In een derde aspect betreft de uitvinding een voedersamenstelling voor vee omvattende een voederadditief volgens het eerste aspect en een voeder, waarbij het voeder bestanddelen omvat gekozen uit de lijst van: tarwe, mais, tarwezemelen, DDGS tarwe, sojaschroot, rogge, raapzaad, raapzaadschroot, haver, gerst, erwten, zonnebloemzaadschroot, koolzaadschroot, sorghum of een combinatie hiervan.

In een voorkeursvorm bestaat het voeder voor ten minste een deel uit soja, sojaschroot, sojameel, of een combinatie hiervan.

In een vierde aspect betreft de uitvinding een gebruik van een voederadditief volgens het eerste aspect voor het verbeteren van de darmgezondheid en/of de verteerbaarheid van voeder in vee, waarbij dit voederadditief gedoseerd wordt aan het voeder van éénmagige dieren, zoals pluimvee en/of varkens.

Bij het gebruik volgens de uitvinding kan de protease aan het dier worden gevoerd vóór, na, of gelijktijdig met de voeding. Het laatste heeft de voorkeur.

In wat volgt, wordt de uitvinding beschreven a.d.h.v. niet-limiterende voorbeelden die de uitvinding illustreren, en die niet bedoeld zijn of geïnterpreteerd mogen worden om de omvang van de uitvinding te limiteren.

VOORBEELDEN

Voorbeeld 1-9: verbeterde verteerbaarheid

Tabel 1 geeft de in vitro verbeterde verteerbaarheid weer door toediening van de proteasen aan het veevoeder.

TABEL 1

Verteerbaarheid | Verteerbaarheid | Verbeterde eiwitten eiwitten met verteerbaarheid protease (*) (300 ppm)

15 BE2022/5716

Raapzaadschroot 55,3 61,5 11,21% en

Zonnebloemzaad- 63,2 77,2 22,15% mame LEE * verbeterde verteerbaarheid (%) = verteerbaarheid eiwitten met supplement Verteerbaarheld eiwitten chien mer supplenen vertsorbaameid ever , 100

De verteerbaarheid is gemeten en berekend aan de hand van het CVB-protocol (centraal veevoederbureau).

Voorbeeld 10-13: verbeterde verteerbaarheid

Tabel 2 geeft de in vivo verbeterde verteerbaarheid weer door toediening van de protease aan het veevoeder.

TABEL 2

Verteerbaarheid | Verteerbaarhei | Verbeterde eiwitten d eiwitten met verteerbaarheid protease (*)

Raapzaadschroot * verbeterde verteerbaarheid (%) = verteerbaarheid eiwitten met supplement Verteerbaarheld eiwitten chien mer supplenen vertsorbaameid siwitten , 100

Voorbeeld 14-16: aminozuursamenstelling anti nutritionele factoren

TABEL 3 [Free [Gee (vb. 15) | B-congiycmine (vb. 26) mem | sJéM]| | sw] 5] +

16 BE2022/5716

CEO

HS | sji] 6] | 5] mem | >|] | #8] 4

MO | oj0mm| 6j Go] 6] 00% eur | 0 [00% [0] 00e] 5j 00%

De drie anti nutritionele factoren, glycinine, B-conglycinine en TI, bezitten elk een hoge concentratie aan Asp, Asn, Glu en Gin:

TI: 5,2% (Asn) + 8,9% (Asp) + 2,6% (Glu) + 7,3% (GIn) = 24%

Glycinine: 7,8% (Asn) + 3,6% (Asp) + 10,1% (Glu) + 8,6% (GIn) = 30,1%

B-conglycinine: 7,8% (Asn) + 3,5% (Asp) + 10,7% (Glu) + 8,3% (GIn) = 30,3%

Voorbeelden 17-19: protease-activiteitsbepaling

Een protease-activiteitsbepaling werd uitgevoerd op verschillende enzym extracten. De extracten werden als volgt bereid: - 0,5 g enzym in 5,0 ml buffer (buffer pH 7,5 /pH 3,0), - 30 min extraheren bij kamertemperatuur, - centrifugeren en verdunnen.

De protease-activiteitsmeting werd uitgevoerd bij 37°C en buffer pH 7,5 /pH 3,0.

17 BE2022/5716

De resultaten, weergegeven in tabel 4, tonen aan dat het mengsel serineprotease/zuur endoprotease (vb. 19) een hogere activiteit bezit dan het gemiddelde van de activiteit van de preparaten afzonderlijk (vb. 17 en 18).

TABEL 4

Activiteit (U/g) Gemiddelde activiteit (U/g)

Serineprotease 113,6 (vb. 17)

Zuur endoprotease 121,3 (vb. 18) erineprotease zuur endoprotease 145,4 (vb. 19) 3,0 | 180,1

Claims

18 BE2022/5716 CONCLUSIES

1. Een voederadditief voor het verbeteren van de darmgezondheid en/of de verteerbaarheid van voeder in vee, omvattende een serineprotease isoleerbaar uit Bacillus licheniformis met een eerste enzymactiviteit gemeten bij een pH gelegen tussen 7 en 8, en een zuur endoprotease isoleerbaar uit Aspergillus niger met een tweede enzymactiviteit gemeten bij een pH gelegen tussen 2,5 en 3,5, waarin de verhouding tussen de eerste enzymactiviteit en de tweede enzymactiviteit gelegen is tussen 0,8/1 en 1/0,8, uitgedrukt in U/g serineprotease op U/g zuur endoprotease, waarbij het voederadditief het serineprotease en het zuur endoprotease, in een massaverhouding gelegen tussen 0,5/1 en 3,5/1, en krijt omvat.

2. Voederadditief volgens conclusie 1, waarbij het voederadditief het serineprotease en het zuur endoprotease omvat, in een massaverhouding gelegen tussen 0,5/1 en 3,5/1, uitgedrukt in g serineprotease op g zuur endoprotease.

3. Voederadditief volgens één der voorgaande conclusies, waarbij het voederadditief verder een dragermateriaal omvat, bij voorkeur krijt.

4, Voederadditief volgens één der voorgaande conclusies, waarbij het voederadditief het serineprotease omvat, in een hoeveelheid gelegen tussen 25 en 35 m%, uitgedrukt in relatieve gewicht van de serineprotease op het totale gewicht van het voederadditief.

5. Voederadditief volgens één der voorgaande conclusies, waarbij het voederadditief het zuur endoprotease omvat, in een hoeveelheid gelegen tussen 10 en 30 m%, uitgedrukt in relatieve gewicht van het zuur endoprotease op het totale gewicht van het voederadditief.

6. Voederadditief volgens één der voorgaande conclusies, waarbij de serineprotease in het voeder geschikt is voor het hydrolyseren van peptidebindingen die zich naast de aminozuren asparaginezuur (Asp) of glutaminezuur (Glu) bevinden.

7. Voederadditief volgens één der voorgaande conclusies, waarbij de serineprotease geïsoleerd is uit Bacillus licheniformis.

19 BE2022/5716

8. Voederadditief volgens één der voorgaande conclusies, waarbij het zuur endoprotease geïsoleerd is uit Aspergillus niger.

9, Voederadditief volgens één der voorgaande conclusies, waarbij het vee éénmagig vee is, bij voorkeur is het vee varkens, pluimvee of aquacultuur is.

10. Voederadditief volgens één der voorgaande conclusies, waarbij het vee tussen 0 en 1 jaar oud is, bij voorkeur tussen O en 6 maand.

11.Voederadditief volgens één der voorgaande conclusies, waarbij het voederadditief verder phytase, xylanase, amylase, of een combinatie hiervan omvat.

12.Een werkwijze voor het vervaardigen van een voederadditief volgens een van de conclusies 1-11 omvattende het aanbrengen van een serineprotease isoleerbaar uit Bacillus licheniformis met een eerste enzymactiviteit gemeten bij een pH gelegen tussen 7 en 8, en een zuur endoprotease isoleerbaar uit Aspergillus niger met een tweede enzymactiviteit gemeten bij een pH gelegen tussen 2,5 en 3,5, op een dragermateriaal, bijvoorbeeld door te verstuiven, waarbij in het voederadditief een verhouding tussen de eerste enzymactiviteit en de tweede enzymactiviteit gelegen tussen 0,8/1 en 1/0,8 bereikt wordt.

13.Een voedersamenstelling voor vee omvattende een voederadditief volgens een van de conclusies 1-11 en een voeder, waarbij het voeder bestanddelen omvat gekozen uit de lijst van: tarwe, mais, tarwezemelen, DDGS tarwe, sojaschroot, rogge, raapzaad, raapzaadschroot, haver, gerst, erwten, zonnebloemzaadschroot, koolzaadschroot, sorghum of een combinatie hiervan.

14.Een gebruik van een voederadditief volgens een van de conclusies 1-11, voor het verbeteren van de darmgezondheid en/of de verteerbaarheid van voeder in vee, waarbij dit voederadditief gedoseerd wordt aan het voeder van éénmagige dieren, zoals pluimvee en/of varkens.