BE1029075B1 - Use of protolichesteric acid in inhibiting the formation of fungal hyphae and reversing the drug resistance activity of Candida albicans - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung offenbart eine Anwendung von der Protolichesterinsäure bei der Hemmung der Bildung von Pilzhyphen und der Umkehrung der Arzneimittelresistenzaktivität von Candida albicans. Die durch die Erfindung hergestellte Protolichesterinsäure (protolichesterinic acid) hat eine gute Wirkung bei der Hemmung der Bildung von Pilzhyphen und der Umkehrung der Arzneimittelresistenzaktivität von Candida albicans.The present invention discloses an application of protolichesteric acid in inhibiting the formation of fungal hyphae and reversing the drug resistance activity of Candida albicans. The protolichesterinic acid produced by the invention has a good effect of inhibiting the formation of fungal hyphae and reversing the drug resistance activity of Candida albicans.
Description
Anwendung von der Protolichesterinsäure bei der Hemmung der Bildung von Pilzhyphen und der Umkehrung der Arzneimittelresistenzaktivität von Candida albicansApplication of protolichesteric acid in inhibiting the formation of fungal hyphae and reversing drug resistance activity of Candida albicans
TECHNISCHES GEBIET Die vorliegende Erfindung betrifft das technische Gebiet der Medizintechnik, insbesondere eine Anwendung von der Protolichesterinsäure bei der Hemmung der Bildung von Pilzhyphen und der Umkehrung der Arzneimittelresistenzaktivität von Candida albicans.TECHNICAL FIELD The present invention relates to the technical field of medical technology, particularly to an application of protolichesteric acid in inhibiting the formation of fungal hyphae and reversing the drug resistance activity of Candida albicans.
STAND DER TECHNIK Candida albicans ist ein konditionell pathogener Pilz, der den menschlichen Körper besiedelt. Wenn die Immunität des Körpers nachlässt, kann es zu systemischen Pilzinfektionen in den oberflächlichen Schleimhautschichten der Haut und sogar im ganzen Körper kommen. In den letzten 30 Jahren haben aufgrund des übermäßigen Einsatzes von Breitbandantibiotika, der weit verbreiteten Anwendung von Tumorchemotherapie, Organtransplantation und anderen Behandlungsmethoden sowie der Zunahme von Patienten mit Erkrankungen des Immunsystems die klinischen Infektionen durch Pilze immer intensiver zugenommen. Mit der weit verbreiteten Verwendung klinischer Antimykotika, insbesondere antibakterieller Medikamente, hat die Resistenz gegen Pilze weiter zugenommen und wird immer ernster. Das Auftreten solcher Resistenzen führt in der Regel zu Multiresistenzen, was der Behandlung klinischer Pilzinfektionen äußerst große Schwierigkeiten und sogar Behandlungsversagen bringt. Candida ist einer der am häufigsten vorkommenden konditionell pathogenen Pilze in der Klinik, und unter Candida ist Candida albicans das am häufigsten vorkommende Infektionsmodell des pathogenen Pilzes. Candida albicans ist dimorph, und die Hyphenform ist ein wichtiger Virulenzfaktor von Candida albicans und spielt eine wichtige Rolle im Prozess der pathogenen Infektion. Aufgrund dessen sind eine eingehende Erforschung und Entwicklung von Medikamenten, die die morphologische Transformation von Pilzen hemmen oder die Pilzresistenz umkehren können, von großer Bedeutung. Die Flechte ist ein symbiotischer Komplex aus Pilzen und Algen und unterscheidet sich sowohl von Pilzen als auch von Algen unterscheidet. Nephromopsis pallescens (Schaer.) Park, auch als Baumhaut genannt, ist eine Flechtenpflanze der Gattung Nephromopsis in der Familie der Parmeliaceae. Der Flechtenkörper ist mittelgroß, blattartig, hart und weist einen Durchmesser von 7-15 cm auf, nur die Unterseite derBACKGROUND ART Candida albicans is a conditionally pathogenic fungus colonizing the human body. When the body's immunity declines, systemic fungal infections can occur in the superficial mucosal layers of the skin and even throughout the body. In the past 30 years, due to the overuse of broad-spectrum antibiotics, the widespread use of tumor chemotherapy, organ transplantation and other treatment methods, and the increase in patients with immune system diseases, clinical fungal infections have become more and more intense. With the widespread use of clinical antifungal drugs, especially antibacterial drugs, resistance to fungi has continued to increase and is becoming more serious. The emergence of such resistances usually leads to multidrug resistances, which makes the treatment of clinical fungal infections extremely difficult and even treatment failure. Candida is one of the most common conditionally pathogenic fungi in the clinic, and among Candida, Candida albicans is the most common infection model of the pathogenic fungus. Candida albicans is dimorphic, and hyphal shape is an important virulence factor of Candida albicans and plays an important role in the process of pathogenic infection. Because of this, in-depth research and development of drugs that can inhibit morphological transformation of fungi or reverse fungal resistance are of great importance. The lichen is a symbiotic complex of fungi and algae and is distinct from both fungi and algae. Nephromopsis pallescens (Schaer.) Park, also known as tree skin, is a lichen plant of the genus Nephromopsis in the family Parmeliaceae. The lichen body is medium-sized, leaf-like, hard and 7-15 cm in diameter, only the underside of the
Mittellappen haftet lose an dem Substrat an, und der Flechtenkörper dehnt sich rosettenförmig aus; die Oberseite ist hellgelb bis gelbgrün, mit starken Falten und ohne Puderknospen und rissige Knospen; die Unterseite ist hellgelb bis gelb-braun und mit starken Falten, weiße punktförmige falsche Becher werden auf den Kämmen geboren, und die falschen Wurzeln sind spärlich, und es haftet oft an den Stämmen von Kiefern und Eichen und Totholzpfählen an.Middle lobe loosely adheres to the substrate, and the lichen body expands in a rosette shape; the upper surface is light yellow to yellow-green, with strong wrinkles and without powdery buds and cracked buds; the underside is light yellow to yellow-brown and with strong wrinkles, white punctate false cups are born on the ridges, and the false roots are sparse, and it often attaches to the trunks of pine and oak and deadwood posts.
INHALT DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG Die vorliegende Erfindung stellt eine Anwendung von der Protolichesterinsäure bei der Hemmung der Bildung von Pilzhyphen und der Umkehrung der Arzneimittelresistenzaktivität von Candida albicans zur Verfügung.SUMMARY OF THE PRESENT INVENTION The present invention provides an application of protolichesteric acid in inhibiting the formation of fungal hyphae and reversing the drug resistance activity of Candida albicans.
Um das Ziel zu erreichen, verwendet die vorliegende Erfindung die folgende technische Lösung: eine Anwendung von der Protolichesterinsäure bei der Hemmung der Bildung von Pilzhyphen und der Umkehrung der Arzneimittelresistenzaktivität von Candida albicans.In order to achieve the object, the present invention uses the following technical solution: an application of the protolichesteric acid in inhibiting the formation of fungal hyphae and reversing the drug resistance activity of Candida albicans.
Die Protolichesterinsäure wird durch die folgenden Schritte hergestellt: 1) Das Nephromopsis pallescens wird zerkleinert und passiert ein 80-mesh-Sieb, um grobes Pulver zu erhalten; Zugeben von 78% Ethanol in grobem Pulver und Tränken für mehr als 24 Stunden, Extrahieren mit Ultraschall für 30 Minuten und Filtrieren, um ein Filtrat zu erhalten; wiederholtes Tränken, Extrahieren und Filtrieren des Filterrückstandes für 2 Male, Mischen von Filtraten von den 3 Malen und Konzentrieren, bis kein Alkoholgeschmack mehr vorhanden ist, um den Extrakt von Nephromopsis pallescens zu erhalten; 2) Verwenden einer chromatographischen Kieselgelsäule mit Normaldruck, um die Kieselgelsäulen-Chromatographie-Abscheidung der Protolichesterinsäure durchzuführen, Durchführen einer Gradientenelution mit Petrolether und Aceton, um ein Eluat zu erhalten; Verfeinern des Eluats, um eine Protolichesterinsäurelösung zu erhalten; 3) Nehmen der Protolichesterinsäurelösung als Probe und Verwenden des gemischten Lösungsmittels als mobile Phase, um die Kieselgelsäulen-Chromatographie- Abscheidung durchzuführen; Verwenden der Kieselgel-Dünnschichtchromatographie- Detektion, um die Fraktion der Protolichesterinsäure zu erhalten; Legen der Fraktion der Protolichesterinsäure in eine gemischte Lösung von Petrolether und Aceton und Umkristallisieren, um die Protolichesterinsäure zu erhalten.The protolichesteric acid is produced by the following steps: 1) The Nephromopsis pallescens is crushed and passed through an 80-mesh sieve to obtain coarse powder; Adding 78% ethanol in coarse powder and soaking for more than 24 hours, ultrasonically extracting for 30 minutes and filtering to obtain a filtrate; repeatedly soaking, extracting and filtering the filter cake for 2 times, mixing filtrates from the 3 times and concentrating until there is no alcohol taste to obtain the extract of Nephromopsis pallescens; 2) using a normal pressure silica gel chromatography column to carry out the silica gel column chromatography separation of the protolichesteric acid, carrying out gradient elution with petroleum ether and acetone to obtain an eluate; refining the eluate to obtain a protolichesteric acid solution; 3) sampling the protolichesteric acid solution and using the mixed solvent as the mobile phase to carry out the silica gel column chromatography deposition; using silica gel thin layer chromatography detection to obtain the fraction of protolichesteric acid; Putting the fraction of the protolichesteric acid in a mixed solution of petroleum ether and acetone and recrystallizing to obtain the protolichesteric acid.
Im Schritt 1) beträgt die verwendete Menge vom Ethanol das 20-fache des Gewichts des groben Pulvers.In step 1), the amount of ethanol used is 20 times the weight of the coarse powder.
Im Schritt 2) beträgt während der Gradientenelution vom Petrolether und Aceton der Gradientenbereich des Volumenanteils vom Aceton 0-100%. Im Schritt 2) wird beim Verfeinern des Eluats das Eluat bei einer Temperatur von 55°C und dem Vakuumgrad von 0,08-0,09 MPa unter reduziertem Druck konzentriert. Im Schritt 3) beträgt der Durchmesser der Kieselgelsäule 30 mm, wobei die Kieselgelsäule mit 480 mL Kieselgel von 300-400 mesh gefüllt ist. Im Schritt 3) wird das gemischte Lösungsmittel aus Petrolether, Aceton und Ameisensäure in einem Volumenverhältnis von 9:1:0,01 hergestellt. Im Schritt 3) wird während der Kieselgel-Dünnschichtchromatographie-Detektion der Entwickler aus Petrolether, Aceton und Ameisensäure in einem Volumenverhältnis von 7:3:0,1 hergestellt; wobei der Farbentwickler 15% konzentrierte Schwefelsäure-Ethanol- Lösung ist. Im Schritt 3) beträgt das Volumenverhältnis vom Petrolether und Aceton 7:3. Durch die vorliegende Erfindung hergestellte Protolichesterinsäure hat eine Molekularformel von C19H3204 und ein Molekulargewicht von 324, wobei ihre Strukturformel wie folgt ist: Die vorliegende Erfindung hat folgende Vorteile: Die durch die Erfindung hergestellte Protolichesterinsäure (protolichesterinic acid) hat eine gute Wirkung bei der Hemmung der Bildung von Pilzhyphen und der Umkehrung der Arzneimittelresistenzaktivität von Candida albicans. Für spezifische Wirkungen wird Bezug auf Ausführungsbeispiele und Aktivitätsexperimente genommen.In step 2), during the gradient elution of petroleum ether and acetone, the gradient range of the volume fraction of acetone is 0-100%. In step 2), when refining the eluate, the eluate is concentrated under reduced pressure at the temperature of 55°C and the degree of vacuum of 0.08-0.09 MPa. In step 3), the diameter of the silica gel column is 30 mm, and the silica gel column is filled with 480 mL of 300-400 mesh silica gel. In step 3), the mixed solvent is prepared from petroleum ether, acetone and formic acid in a volume ratio of 9:1:0.01. In step 3), during silica gel thin layer chromatography detection, the developer is prepared from petroleum ether, acetone and formic acid in a volume ratio of 7:3:0.1; wherein the color developer is 15% concentrated sulfuric acid ethanol solution. In step 3) the volume ratio of petroleum ether and acetone is 7:3. Protolichesterinsäure produced by the present invention has a molecular formula of C19H3204 and a molecular weight of 324, its structural formula is as follows: The present invention has the following advantages: The protolichesterinic acid produced by the invention has a good effect in inhibiting formation of fungal hyphae and reversal of drug resistance activity of Candida albicans. For specific effects, reference is made to working examples and activity experiments.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG Figur 1 zeigt ein 'H-NMR-Spektrogramm der im Ausführungsbeispiel 1 hergestellten Protolichesterinsäure. Figur 2 zeigt ein ‘“C-NMR-Spektrogramm der im Ausführungsbeispiel 1 hergestellten Protolichesterinsäure. Figur 3 zeigt ein ESI-MS-Spektrogramm der im Ausführungsbeispiel 1 hergestellten Protolichesterinsäure. Figur 4 zeigt ein Diagramm der Prüfung der Reinheit der im Ausführungsbeispiel 1 hergestellten Protolichesterinsäure. Figur 5 zeigt ein Vergleichsdiagramm der Hemmwirkung der im Ausführungsbeispiel 1 hergestellter Protolichesterinsäure auf die Wachstumsaktivität der Hyphe von Candida albicans.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWING FIG. FIG. 2 shows a “C-NMR spectrogram of the proto-esteric acid produced in Example 1. FIG. 3 shows an ESI-MS spectrogram of the protolichesteric acid produced in Example 1. FIG. 4 shows a diagram of the examination of the purity of the protolichesteric acid produced in Example 1. Fig. 5 is a comparative chart showing the inhibitory effect of the protolichesteric acid prepared in Example 1 on the growth activity of the hypha of Candida albicans.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG Im Zusammenhang mit Ausführungsbeispielen wird die vorliegende Erfindung näher erläutert, dabei sollte es darauf hingewiesen werden, dass die folgende Beschreibung nur die vorliegende Erfindung erläutert, statt deren Inhalt zu beschränken.DETAILED DESCRIPTION The present invention is explained in more detail in connection with exemplary embodiments, it should be noted that the following description only explains the present invention and does not limit the content thereof.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Nephromopsis pallescens (Chuxiong, Provinz Yunnan, China) wurde freundlicherweise von Lisong Wang, einem leitenden Ingenieur vom Kunming Pflanzenforschungsinstitut der chinesischen Akademie der Wissenschaften bereitgestellt.Nephromopsis pallescens (Chuxiong, Yunnan Province, China) used in the present invention was kindly provided by Lisong Wang, a senior engineer at the Kunming Plant Research Institute of the Chinese Academy of Sciences.
Ausführungsbeispiel 1 Anwendung von der Protolichesterinsäure bei der Hemmung der Bildung von Pilzhyphen und der Umkehrung der Arzneimittelresistenzaktivität von Candida albicans.Working Example 1 Application of protolichesteric acid in inhibiting the formation of fungal hyphae and reversing the drug resistance activity of Candida albicans.
Die Protolichesterinsäure wird durch die folgenden Schritte hergestellt: Zerkleinern von 150 g Nephromopsis pallescens, die in Chuxiong, Provinz Yunnan, China, gesammelt wurden, anschließendes Passieren eines 80-mesh-Siebs, um grobes Pulver zu erhalten; Zugeben von 3L 78% Ethanol (Volumenfraktion, Ethanol-Wasser) in grobem Pulver und Tränken für mehr als 24 Stunden bei 25°C, Extrahieren mit Ultraschall für 30 Minuten und Filtrieren unter Normaldruck, um ein Filtrat zu erhalten; wiederholtes Extrahieren des Filterrückstandes für 2 Male mit 3L 78% Ethanol, Mischen von Filtraten von den 3 Malen und Konzentrieren, bis kein Alkoholgeschmack mehr vorhanden ist, um 70 g Extrakt von Nephromopsis pallescens zu erhalten; der Extrakt von Nephromopsis pallescens wird mit Kieselgel von 100-200 mesh gemischt und einer chromatographischen Abscheidung über eine Kieselgelchromatographiesäule (100-200 mesh Kieselgel, 60 x 600 mm) beim Normaldruck unterzogen, Durchführen einer Gradientenelution mit einem gemischten Lösungsmittel aus Petrolether und Aceton (der Gradientenbereich des Volumenanteils vom Aceton beträgt 0-100%)}, um ein Eluat zu erhalten; Konzentrieren des Eluats bei einer Temperatur von 55°C und dem Vakuumgrad von 0,08-0,09 MPa unter reduziertem Druck, Dünnschichtchromatographie-Detektion der Hauptkomponentenflecke und Mischen der Fraktionen der Hauptkomponentenflecke, um die Protolichesterinsäurelôsung zu erhalten: Nehmen der Protolichesterinsäurelôsung als Probe und Mischen mit Kieselgel von 100-200 mesh, Verwenden des gemischten Lösungsmittels (das gemischte Lösungsmittel wird aus Petrolether, Aceton und Ameisensäure in einem Volumenverhältnis von 9:1:0,01 hergestellt) als mobile Phase, um eine Kieselgelsäulen-Chromatographie-Abscheidung durchzuführen; wobei der Durchmesser der Kieselgelsäule 30 mm beträgt, und wobei die Kieselgelsäule mit 480 mL Kieselgel von 300-400 mesh gefüllt ist, und wobei derThe protolichesteric acid is produced through the following steps: crushing 150 g of Nephromopsis pallescens collected in Chuxiong, Yunnan Province, China, then passing through an 80-mesh sieve to obtain coarse powder; Adding 3L of 78% ethanol (volume fraction, ethanol-water) in coarse powder and soaking for more than 24 hours at 25°C, extracting with ultrasonic for 30 minutes and filtering under normal pressure to obtain a filtrate; repeatedly extracting the filter cake for 2 times with 3L of 78% ethanol, mixing filtrates from the 3 times and concentrating until there is no alcohol taste to obtain 70 g of Nephromopsis pallescens extract; the extract of Nephromopsis pallescens is mixed with silica gel of 100-200 mesh and subjected to chromatographic separation through a silica gel chromatography column (100-200 mesh silica gel, 60 × 600 mm) at normal pressure, conducting gradient elution with a mixed solvent of petroleum ether and acetone (the gradient range of volume fraction of acetone is 0-100%)} to obtain an eluate; concentrating the eluate at a temperature of 55°C and the vacuum degree of 0.08-0.09 MPa under reduced pressure, thin-layer chromatography detection of the main component spots and mixing the fractions of the main component spots to obtain the protomaleic acid solution: sampling the protomaleic acid solution and Mixing with silica gel of 100-200 mesh, using the mixed solvent (the mixed solvent is prepared from petroleum ether, acetone and formic acid in a volume ratio of 9:1:0.01) as a mobile phase to carry out silica gel column chromatography separation; wherein the diameter of the silica gel column is 30 mm, and wherein the silica gel column is filled with 480 mL of silica gel of 300-400 mesh, and the
Entwickler aus Petrolether, Aceton und Ameisensäure in einem Volumenverhältnis von 7:3:0,1 hergestellt ist; und wobei der Farbentwickler 15% konzentrierte Schwefelsäure- Ethanol-Lösung ist. Die Fraktionen mit dem gleichen Verhältnisverschiebungswert werden kombiniert und unter reduziertem Druck konzentriert, um die Fraktion der 5 Protolichesterinsäure zu erhalten; die Fraktion der Protolichesterinsäure wird mit Petrolether und Aceton (das Volumenverhältnis vom Petrolether und Aceton beträgt 7:3) gelöst, Stehenlassen, bis weiße Kristalle ausfällt, und wiederholtes Durchführen der Umkristallisation für 2 Male, um 0,45 g weiße kristalline Verbindung zu erhalten. Nach der HPLC-Analyse erreicht die Reinheit 97%, wie in Figur 4 dargestellt.developer is made from petroleum ether, acetone and formic acid in a volume ratio of 7:3:0.1; and wherein the color developer is 15% concentrated sulfuric acid-ethanol solution. The fractions having the same ratio shift value are combined and concentrated under reduced pressure to obtain the fraction of 5 protolichesteric acid; the fraction of protolichesteric acid is dissolved with petroleum ether and acetone (the volume ratio of petroleum ether and acetone is 7:3), left until white crystals precipitate, and repeatedly performing recrystallization 2 times to obtain 0.45 g of white crystalline compound. According to HPLC analysis, the purity reaches 97% as shown in Figure 4.
Die erhaltene weiße kristalline Verbindung wird analysiert, die Silikongel- Dünnschichtchromatographie (Petrolether:Aceton = 7:3) zeigt Rf = 0,54, beim Besprühen mit 15% konzentrierter Schwefelsäure-Ethanol-Lösung wird die lila Farbe entwickelt.The obtained white crystalline compound is analyzed, silicone gel thin layer chromatography (petroleum ether:acetone = 7:3) shows Rf = 0.54, purple color is developed on spraying with 15% concentrated sulfuric acid-ethanol solution.
MS, m/z 324 (M-+1), und die Formel ist C1 9H3204. UV(MeOH), 218 nm (3,82). 1H- NMR (400MHz, Acetone-d6):6,27 (1H, d, J=3 Hz, C5-Hb), 5,98 (1H, d, J=3 Hz, C5-Ha), 4,78 (1H, ddd, J3-4=6 Hz, J6-7=6 Hz, C4-H), 3,80 (1H, M.C3-H) , 1,75 (2H, m, C2-H), 1,29 (22H, brs, C7-8-H), 0,88 (3H, m, C19-H);13C-NMR (100MHz, Acetone-d6):171, 89 (C-1), 136,19 (C-2), 51,17 (C-3), 80,79 (C-4), 125,17 (C-5), 169,55(C-6), 37,12 (C-7), 26,53 (C-8), 30,16-31,31 (C-9-17), 24,22 (C-18), 15,25 (C-19). Es ist bekannt, dass die Verbindung die Protolichesterinsäure ist.MS, m/z 324 (M-+1), and the formula is C1 9H3204. UV(MeOH), 218nm (3.82). 1H NMR (400MHz, Acetone-d6): 6.27 (1H, d, J=3Hz, C5-Hb), 5.98 (1H, d, J=3Hz, C5-Ha), 4.78 (1H, ddd, J3-4=6 Hz, J6-7=6 Hz, C4-H), 3.80 (1H, M.C3-H) , 1.75 (2H, m, C2-H), 1.29 (22H, brs, C7-8-H), 0.88 (3H, m, C19-H);13C NMR (100MHz, Acetone-d6):171, 89 (C-1), 136, 19 (C-2), 51.17 (C-3), 80.79 (C-4), 125.17 (C-5), 169.55 (C-6), 37.12 (C-7 ), 26.53 (C-8), 30.16-31.31 (C-9-17), 24.22 (C-18), 15.25 (C-19). The compound is known to be the protolichesteric acid.
Die *H-NMR-, 13C-NMR- und ESI-MS-Spektrogramme, die an der Identifizierung der Verbindung beteiligt sind, sind in Figuren 1 bis 3 dargestellt.The *H-NMR, 13C-NMR and ESI-MS spectrograms involved in the identification of the compound are shown in Figures 1-3.
Aktivitätsversuchactivity trial
1. Experimentelle Materialien: Candida albicans-Wildtyp-Stamm YEM30, Azol- resistenter Stamm CA10, RPMI1640-Kultursubstrat.1. Experimental materials: Candida albicans wild-type strain YEM30, azole-resistant strain CA10, RPMI1640 culture medium.
2. Experimentelle Methode2. Experimental method
2.1 Resistenzumkehr Der über Nacht aktivierte Candida albicans CA10-Stamm wird mit RPMI1640- Kultursubstrat auf 2x 103 Zellen pro ML eingestellt, und die verdünnte Bakterienlösung wird verwendet, um eine Arbeitslôsung von Fluconazol (FLC) und der im Ausführungsbeispiel 1 hergestellten Protolichesterinsäure mit einem 2-fachen Konzentrationsgradienten zuzubereiten. Zugeben von 50 Mikroliter der doppelt konzentrierten FLC-Arbeitslôsung jedes Konzentrationsgradienten in jede Bohrung der 96-Bohrungs-Platte in den Spalten 1-11 und Zugeben von Arbeitslôsung mit der doppelten Konzentration der Protolichesterinsäure in die AG-Reihe, um eine gemischte Verabreichung von FLC und der Protolichesterinsäure mit der Schachbrettmethode zu realisieren, Kultivieren von 48 Stunden bei 35°C.2.1 Resistance reversal The Candida albicans CA10 strain activated overnight is adjusted to 2x 103 cells per ML with RPMI1640 culture medium and the diluted bacterial solution is used to prepare a working solution of fluconazole (FLC) and the protolichesteric acid prepared in Example 1 with a 2- to prepare multiple concentration gradients. Adding 50 microliters of the double strength FLC working solution of each concentration gradient to each well of the 96-well plate in columns 1-11 and adding working solution with double the concentration of the protolichesteric acid to the AG row to ensure mixed administration of FLC and of protoesteric acid by the checkerboard method, culturing at 35°C for 48 hours.
Das FICI-Modell wird verwendet, um die Wechselwirkung zu bewerten. FICI=MICAB/MICA+MICBA/MICB Dabei sind MICA und MICB die MIC-Werte, wenn die Arzneimittel A und B allein verwendet werden, und MICAB und MICB sind die Konzentrationen von A und B, die der Mindestdosis der kombinierten Verwendung der Arzneimittel entsprechen. FICI < 0,5, die Wechselwirkung vom Arzneimittel A und Arzneimittel B ist ein synergistischer Effekt.The FICI model is used to evaluate the interaction. FICI=MICAB/MICA+MICBA/MICB where MICA and MICB are the MIC values when drugs A and B are used alone, and MICAB and MICB are the concentrations of A and B that correspond to the minimum dose of combined use of the drugs . FICI < 0.5, the interaction of drug A and drug B is a synergistic effect.
2.2 Hemmung der Hyphenbildung Der über Nacht aktivierte Candida albicans YEM30-Stamm wird mit RPMI1640- Kultursubstrat auf 1x 10° Zellen pro mL eingestellt und in eine sterile 96-Bohrungs-Platte gegeben. Verschiedene Dosen der im Ausführungsbeispiel 1 hergestellten Protolichesterinsäure werden in einem Gradienten zugegeben, Kultivieren im stillen Zustand bei 37°C in 3, 6, 9 und 24 Stunden, Beobachten der Form des Pilzes mit einem Mikroskop.2.2 Inhibition of hyphae formation The Candida albicans YEM30 strain activated overnight is adjusted to 1x 10° cells per mL with RPMI1640 culture medium and placed in a sterile 96-well plate. Various doses of the protolichesteric acid prepared in Working Example 1 are added in a gradient, culturing under still conditions at 37°C in 3, 6, 9 and 24 hours, observing the shape of the fungus with a microscope.
3. Experimentelle Ergebnisse Wie in Figur 5 gezeigt, kann das in Ausführungsbeispiel 1 hergestellte Protolichesterinsäure die Bildung der Hyphen des Candida albicans YEM30-Stamms konzentrationsabhängig hemmen, wodurch die Virulenz von Candida albicans gehemmt wird; und die Verbindung wird mit Fluconazol in Kombination verwendet, um bei 4 ug/ml den MHK-Wert der klinischen Azol-resistenten Stämme 28A und 28D von 128 ug/ml auf 2 g/ml zu senden, was einen starken Effekt der Resistenzumkehr zeigt. Bei der Bewertung mit dem FICI-Modell beträgt der FIC-Wert 0,078, was viel weniger als 0,5 ist, was zeigt, dass die Kombination von der Protolichesterinsäure und dem Fluconazol eine starke synergistische antimykotische Wirkung hat.3. Experimental results As shown in Fig. 5, the protolichesteric acid prepared in Working Example 1 can inhibit the formation of hyphae of Candida albicans YEM30 strain in a concentration-dependent manner, thereby inhibiting the virulence of Candida albicans; and the compound is used in combination with fluconazole to send at 4 µg/ml the MIC value of clinical azole-resistant strains 28A and 28D from 128 µg/ml to 2 g/ml, showing a strong resistance reversal effect. When evaluated with the FICI model, the FIC value is 0.078, which is much less than 0.5, which shows that the combination of the protolichesteric acid and the fluconazole has a strong synergistic antifungal effect.
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