BE1024355A1 - DETERMINATION OF MICROBIAL COMMUNITIES AND BIOFILMS - Google Patents
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Abstract
Les techniques d’entretien et de soins standards actuels tendent à éliminer toute forme de vie microbiologique. Il est clair que cette approche n’est pas durable et pose déjà d’énormes problèmes sanitaires (inefficacité, résistances, biofilms, coût environnemental, etc.). Les méthodes probiotiques de première génération essaient quant à elles de modifier l’environnement par l’adjonction massive d’une association de quelques microorganismes mal caractérisés (inefficace, mauvaise caractérisation, QC incertains, monitoring quasi impossible, etc.). De manière générale, la principale innovation de la présente demande de brevet consiste en la mise au point de produits sophistiqués destinés à réaliser l’homéostasie des communautés microbiennes existantes sur les surfaces visées par ces produits ainsi que des méthodes destinées au monitoring de leur utilisation ( sécurité, QC d’efficacité, etc.).Current standard care and treatment techniques tend to eliminate all microbiological life forms. It is clear that this approach is not sustainable and already poses enormous health problems (inefficiency, resistance, biofilms, environmental cost, etc.). First generation probiotic methods try to modify the environment by the massive addition of an association of some poorly characterized microorganisms (inefficient, poor characterization, uncertain QC, almost impossible monitoring, etc.). In general, the main innovation of the present patent application is the development of sophisticated products intended to achieve the homeostasis of existing microbial communities on the surfaces targeted by these products as well as methods for monitoring their use ( safety, QC effectiveness, etc.).
Description
DETERMINATION DES COMMUNAUTES MICROBIENNES ET DES BIOFILMSDETERMINATION OF MICROBIAL COMMUNITIES AND BIOFILMS
DOMAINE DE L'INVENTIONFIELD OF THE INVENTION
Les techniques d’entretien et de soins standards actuels tendent à éliminer toute forme de vie microbiologique. Il est clair que cette approche n’est pas durable et pose déjà d’énormes problèmes sanitaires (inefficacité, résistances, biofilms, coût environnemental, etc.). Les méthodes probiotiques de première génération essaient quant à elles de modifier l’environnement par l’adjonction massive d’une association de quelques microorganismes mal caractérisé (inefficace, mauvaise caractérisation, QC incertains, monitoring quasi impossible, etc.).Current standard care and treatment techniques tend to eliminate all microbiological life forms. It is clear that this approach is not sustainable and already poses enormous health problems (inefficiency, resistance, biofilms, environmental cost, etc.). First generation probiotic methods try to modify the environment by the massive addition of a combination of some poorly characterized microorganisms (ineffective, poor characterization, uncertain QC, near impossible monitoring, etc.).
De manière générale, la principale innovation de la présente demande de brevet consiste en la mise au point de produits sophistiqués destinés à réaliser l’homéostasie des communautés microbiennes existantes sur les surfaces visées par ces produits ainsi que des méthodes destinées au monitoring de leur utilisation (sécurité, QC d’efficacité, etc. ).In general, the main innovation of the present patent application is the development of sophisticated products intended to achieve the homeostasis of existing microbial communities on the surfaces targeted by these products as well as methods for monitoring their use ( safety, QC effectiveness, etc.).
CONTEXTE DE L'INVENTIONBACKGROUND OF THE INVENTION
Le récent rapport Européen [Pedicini P. Rapport sur des soins de santé plus sûrs en Europe: améliorer la sécurité des patients et lutter contre la résistance aux antimicrobiens, 4 mai 2015] sur la manière d’améliorer la sécurité des patients dans les hôpitaux, présenté par l’eurodéputé italien Piernicola Pedicini et voté à Strasbourg ce 18 mai 2015, souligne que pas moins de 8 à 12 % des patients hospitalisés dans l’Union Européenne, c’est-à-dire plus de 3 millions de personnes sont « victimes d’événements indésirables, notamment des infections associées aux soins (IAS), nosocomiales ou non, dont une grande partie pourraient être évitées ». Les coûts en dépenses de santé de ces « événements indésirables » sont estimés, toujours pour l’ensemble de l’Union Européenne, à près de 2,7 milliards d’euros par an et ces évènements indésirables représentent 1,1 % de toutes les hospitalisations. Autre constat du rapport Pedicini, parmi ces IAS, celles causées par les bactéries multi-résistantes aux antibiotiques entraînent le décès d’au moins 25.000 personnes en Europe chaque année.The recent European report [Pedicini P. Report on safer healthcare in Europe: improving patient safety and combating antimicrobial resistance, 4 May 2015] on how to improve patient safety in hospitals, presented by the Italian MEP Piernicola Pedicini and voted in Strasbourg on May 18, 2015, underlines that no less than 8 to 12% of patients hospitalized in the European Union, that is to say more than 3 million people are " victims of adverse events, including healthcare-associated infections (HAIs), nosocomial or otherwise, many of which could be prevented. " The health costs of these "undesirable events" are estimated, still for the whole of the European Union, at nearly 2.7 billion euros per year and these adverse events represent 1.1% of all hospitalizations. Another finding of the Pedicini report, among these IAS, those caused by multi-resistant bacteria to antibiotics result in the death of at least 25,000 people in Europe each year.
La surveillance microbiologique de l’environnement dans les établissements de santé est un sujet qui s’intégre dans l’actualité de la prévention des infections nosocomiales, évoquée dans le rapport Pedicini. Habituellement le monitoring de l’environnement des hôpitaux - comme des industries pharmaceutiques - est réalisé par des techniques classiques de microbiologie dépendantes de la culture. Ces techniques ne permettent de suivre que les microorganismes cultivables qui sont estimés à seulement 1% des microorganismes présents dans l’environnement. En plus ces techniques sont en effet réputées être tout à fait inefficaces pour prélever et étudier quantitativement et qualitativement les communautés microbiennes et les biofilms.Microbiological monitoring of the environment in health care facilities is a topic that is relevant to the topic of prevention of nosocomial infections mentioned in the Pedicini report. Usually environmental monitoring of hospitals - like pharmaceutical industries - is carried out by conventional techniques of microbiology dependent on culture. These techniques only make it possible to track only culturable microorganisms that are estimated at only 1% of the microorganisms present in the environment. In addition, these techniques are indeed considered to be quite ineffective for taking and studying quantitatively and qualitatively microbial communities and biofilms.
Mieux comprendre la formation des communautés microbiennes et des biofilms pathogènes dans l’environnement clinique ainsi que la manière dont les bactéries y entretiennent des interactions synergiques utiles ou pathogènes, facilitant l'apparition d'antibio-résistance, est donc un enjeu de santé publique. Permettre aux hôpitaux de disposer de solutions et de moyens techniques pour lutter efficacement contre ces configurations microbiologiques est d’une importance capitale pour rompre le cercle vicieux qui consiste à utiliser de manière excessive des agents antimicrobiens (antibiotiques, biocides, ...) dont le principal effet est souvent finalement de renforcer l’émergence de bactéries multi-résistantes. Cette résistance aux antimicrobiens pour les bactéries pathogènes formant un biofilm entraîne une hausse de la prévalence des infections nosocomiales et des échecs thérapeutiques face aux maladies infectieuses chez l’homme. Ce phénomène déjà bien réel aujourd’hui, impactera encore les générations futures qui, en outre, devront faire face à un épuisement des ressources thérapeutiques pour combattre les microorganismes multi-résistants. Bien entendu, ces problèmes de résistance bactérienne ne sont pas seulement présents dans les soins de la santé humaine, mais ils sont aussi présentés dans les soins de santé animale, même au niveau de l'agriculture industrielle. C’était donc l’objective de la présente demande de brevet de développer des protocoles pour identifier et quantifier tous les microorganismes et les gènes ciblés dans ces biofilms, par rapport aux techniques classiques d’écouvillonnage et/ou de boîtes de contact (Rodac) utilisés traditionnellement dans le monitoring des environnements hospitaliers (et pharmaceutiques).Better understanding the formation of microbial communities and pathogenic biofilms in the clinical environment as well as the way in which bacteria have useful synergistic interactions or pathogenic, facilitating the appearance of antibiotic resistance, is therefore a public health issue. Providing hospitals with solutions and technical means to effectively fight against these microbiological configurations is of paramount importance to break the vicious circle of excessive use of antimicrobial agents (antibiotics, biocides, etc.) whose main effect is often ultimately to enhance the emergence of multi-resistant bacteria. This antimicrobial resistance for pathogenic bacteria forming a biofilm leads to an increase in the prevalence of nosocomial infections and therapeutic failures in the face of infectious diseases in humans. This phenomenon, which is already very real today, will still affect future generations, who will also have to deal with the exhaustion of therapeutic resources to combat multi-resistant microorganisms. Of course, these problems of bacterial resistance are not only present in the care of human health, but they are also presented in animal health care, even in industrial agriculture. It was therefore the objective of the present patent application to develop protocols for identifying and quantifying all the microorganisms and genes targeted in these biofilms, compared to conventional techniques of swabbing and / or contact boxes (Rodac). traditionally used in the monitoring of hospital (and pharmaceutical) environments.
RESUME DE L'INVENTIONSUMMARY OF THE INVENTION
La présente demande de brevet concerne un procédé pour caractériser le microbiome dans un environnement, ce procédé étant basé sur la combinaison d’une analyse génétique / génomique avec une analyse métabolique et / ou une analyse physico-chimique des échantillons d'un environnement donné. Eventuellement complétée par une analyse choisie parmi épigénétique, metagénomique, protéomique, transcriptomique, et metabolomique,The present patent application relates to a method for characterizing the microbiome in an environment, this method being based on the combination of a genetic / genomic analysis with a metabolic analysis and / or a physico-chemical analysis of the samples of a given environment. Possibly complemented by an analysis chosen from epigenetics, metagenomics, proteomics, transcriptomics, and metabolomics,
En particulier ce procédé est basé sur la combinaison d’une analyse génétique / génomique avec une analyse métabolique et une analyse physico-chimique des échantillons d'un environnement donné. L’analyse génétique / génomique inclut le génotypage et le séquençage, par exemple par séquençage ciblé d’amplicons pour l’identification d’espèces, et séquençage complet de génomes pour la détection de nouveaux gènes d’intérêt. De préférence les gènes de résistance aux antibiotiques et les facteurs de virulence présents dans cet environnement sont détectés et quantifiés par PCR quantitative en temps réel (qPCR), utilisant l’un quelconque des séquenceur capillaires, d’une plateforme de génotypage comme Taqman SNP Genotyping Assay sur 7900 HT (Applied Biosystem) et d’une plateforme Haut débit (NGS) comme GS-FLX (Roche Diagnostics), HiSeq 2500 (Illumina) ou MiSeq (Illumina) ; ou des combinaisons de ceux-ci. L’analyse métabolique utilise la spectrométrie de masse et la résonance magnétique nucléaire pour caractériser l'ensemble des métabolites (sucres, acides aminés, acides gras, protéines, peptides, etc.) présents dans les échantillons d'un environnement donné.In particular, this method is based on the combination of a genetic / genomic analysis with a metabolic analysis and a physico-chemical analysis of the samples of a given environment. Genetic / genomic analysis includes genotyping and sequencing, for example by targeted sequencing of amplicons for species identification, and complete sequencing of genomes for the detection of novel genes of interest. Preferably the antibiotic resistance genes and virulence factors present in this environment are detected and quantified by real-time quantitative PCR (qPCR), using any of the capillary sequencers, of a genotyping platform such as Taqman SNP Genotyping Assay on 7900 HT (Applied Biosystem) and a Broadband Platform (NGS) such as GS-FLX (Roche Diagnostics), HiSeq 2500 (Illumina) or MiSeq (Illumina); or combinations thereof. Metabolic analysis uses mass spectrometry and nuclear magnetic resonance to characterize all metabolites (sugars, amino acids, fatty acids, proteins, peptides, etc.) present in samples of a given environment.
Pour l’analyse physico-chimique des protocoles complémentaires seront utilisés : l’XPS (spectroscopie électronique induite par rayons X) et l’IRRAS (Infra Rouge de Surface par réflexion) pour obtenir des informations sur la structure et la composition d’une couche adsorbée ou des bactéries ; la MATS (Adhésion microbienne aux solvants) pour connaître les propriétés acido-basiques au sens de Lewis de la bactérie comme élaboré dans la thèse de doctorat de C. Rubio [Céline Rubio, thèse de doctorat de l’université paris 6, Juillet 5, 2002] ; et le nanoSIMS pour obtenir des informations sur la localisation et l'analyse quantitative des complexes d'antigène-anticorps se liant sur une surface.For the physico-chemical analysis of complementary protocols will be used: XPS (X-ray induced electron spectroscopy) and IRRAS (Infrared Surface Reflection) to obtain information on the structure and composition of a layer adsorbed or bacteria; the MATS (Microbial Adhesion to Solvents) to know the Lewis acid-base properties of the bacterium as elaborated in the doctoral thesis of C. Rubio [Céline Rubio, doctoral thesis of the University Paris 6, July 5, 2002]; and nanoSIMS to obtain information on the location and quantitative analysis of antigen-antibody complexes binding to a surface.
Le procédé se prête pour des environnements et des échantillons sélectionnés : d’environnements des animaux de compagnie (soins et environnement ) d’environnements d’élevage industriel (ovin, bovin, pisciculture ) d’environnements construits humains non-médicaux d’environnements paramédicaux du milieu hospitalier de la peau chez l’homme et l’animalThe process lends itself to selected environments and samples: from pet environments (care and environment) to industrial animal husbandry environments (sheep, cattle, fish farming) of non-medical human constructed environments of paramedical environments of the hospital environment of the skin in humans and animals
Ainsi, les échantillons analysés comprennent des surfaces construites ou des environnements biologiques, comme des échantillons de peau, poil, sabot, ongles, boues de culture, etc.Thus, the samples analyzed include constructed surfaces or biological environments, such as skin, hair, hoof, nail, culture sludge, etc. samples.
En plus, la présente demande de brevet concerne l’utilisation des procédures ci-dessus : pour surveiller la présence de pathogènes dans les échantillons d'un environnement donné. En particulier à surveiller la présence des germes pathogènes ou opportunistes dans l’hôpital (« vecteurs biotiques des infections nosocomiales ») ; pour monitorer l’efficacité des traitements de nettoyage, en particulier des traitements à obtenir ou à garder une flore saine « anti-pathogène ».In addition, the present patent application relates to the use of the above procedures: to monitor the presence of pathogens in samples of a given environment. In particular to monitor the presence of pathogenic or opportunistic germs in the hospital ("biotic vectors of nosocomial infections"); to monitor the effectiveness of cleaning treatments, especially treatments to obtain or maintain a healthy flora "anti-pathogenic".
Finalement, la présente demande de brevet concerne un procédé de traitement d’un environnement pour obtenir ou garder une flore saine de micro-organismes, ledit procédé utilisant une combinaison de facteurs identifiés au moyen d'une analyse génétique avec une analyse métabolique et / ou une analyse physico-chimique des échantillons dudit environnement. En particulier pour l’entretien et la désinfection des surfaces des locaux (sols, murs, plafonds), des surfaces ouvertes (Open Plant Cleaning ou OPC), des équipements, machines et instruments médicaux et autres ; et des surfaces non accessibles (Cleaning In Place ou CIP) des équipements, machines et instruments.Finally, the present patent application relates to a method of treating an environment to obtain or maintain a healthy flora of microorganisms, said method using a combination of factors identified by means of a genetic analysis with a metabolic analysis and / or a physico-chemical analysis of the samples of said environment. In particular for the maintenance and disinfection of the surfaces of premises (floors, walls, ceilings), open surfaces (Open Plant Cleaning or OPC), medical equipment, machines and instruments and others; and non-accessible surfaces (Cleaning In Place or CIP) of equipment, machines and instruments.
Dans ce procédé de traitement les facteurs identifiés incluent : des coatings spécifiques anti-adhésion bactérienne sur les surfaces considérées comme les plus à risque dans le cadre de la transmission de pathogènes ; des cocktails enzymatiques pour décrocher les biofilms ; des cocktails complexes, constitués de microorganismes favorisant l’installation durable d’un écosystème luttant par des propriétés intrinsèques sélectionnées contre la contamination par d’autres microorganismes environnementaux dégradant la santé ou le bien-être ; des biomarqueurs de résistance aux agents antimicrobiens ; ou toute combinaison de ceux-ciIn this method of treatment the identified factors include: specific bacterial anti-adhesion coatings on the surfaces considered most at risk in the transmission of pathogens; enzymatic cocktails to get the biofilms; complex cocktails, consisting of microorganisms favoring the sustainable installation of an ecosystem struggling with intrinsic properties selected against contamination by other environmental microorganisms degrading health or well-being; biomarkers of resistance to antimicrobial agents; or any combination thereof
DESCRIPTION DE L’INVENTIONDESCRIPTION OF THE INVENTION
Pour atteindre l'objectif mentionné ci-dessus, la présente invention est basée sur la combinaison de technologies récentes et disruptives dans le secteur de la microbiologie. Les procédés de l’invention implique la combinaison de la technologie en trois catégories ; génétique et génomique : typage par séquençage ciblés d’amplicons pour l’identification d’espèces, séquençage complet de génomes pour la détection de nouveaux gènes d’intérêt, mise au point de méthodes pour la détection rapide de gènes, ... métabolique : identification de molécules clé par exemple pour le contrôle de la croissance compétitive inter-espèces ou pour le contrôle de la production de toxines ou de résistances aux antibiotiques ou encore aux procédés de nettoyage traditionnels, par exemple par la formation de biofilms protecteurs. Egalement, la mise au point de méthodes pour la détection rapide de molécules,... physico-chimique : caractérisation des propriétés des surfaces et des écosystèmes (ex : nature moléculaire, charge électrique, T°, concentration en oxygène, etc. ) et de leurs importance dans le contrôle du développement de communautés microbiennes et de leurs bénéfices ou inconvénients.To achieve the above mentioned objective, the present invention is based on the combination of recent and disruptive technologies in the field of microbiology. The methods of the invention involve combining the technology into three categories; genetics and genomics: targeted sequencing typing of amplicons for species identification, complete sequencing of genomes for the detection of new genes of interest, development of methods for the rapid detection of genes, ... metabolism: identification of key molecules, for example for the control of inter-species competitive growth or for the control of the production of toxins or antibiotic resistance or even for traditional cleaning processes, for example by the formation of protective biofilms. Also, the development of methods for the rapid detection of molecules, ... physicochemical: characterization of the properties of surfaces and ecosystems (eg molecular nature, electrical charge, T °, oxygen concentration, etc.) and their importance in controlling the development of microbial communities and their benefits or drawbacks.
Ainsi, contrairement aux méthodes existantes, il n’est fait pas usage des techniques dépendantes de la culture des microorganismes. Par ce projet, en utilisant des protocoles génétique, métabolique et physico-chimique on peut non seulement identifier tous les microorganismes (également les microorganismes non cultivables) dans les échantillons environnementaux, mais aussi les quantifier. En même temps les gènes de résistance aux antibiotiques et les facteurs de virulence présents dans cet environnement sont détectés et quantifiés par PCR quantitative en temps réel (qPCR). Ces deux types de données pourront être corrélées, notamment pour mettre en évidence les phénomènes de « transfert horizontal de gènes » de résistance et tous les hôtes impliqués. Ces phénomènes sont la principale cause de transmission de gènes permettant à différentes espèces bactériennes d’acquérir une (multi) résistance aux antibiotiques ou d’être vecteurs de maladies et les biofilms sont le lieu par excellence où se réalise ce transfert horizontal des gènes.Thus, unlike existing methods, it is not used techniques dependent on the culture of microorganisms. Through this project, using genetic, metabolic and physicochemical protocols we can not only identify all microorganisms (also non-culturable microorganisms) in the environmental samples, but also quantify them. At the same time antibiotic resistance genes and virulence factors present in this environment are detected and quantified by real-time quantitative PCR (qPCR). These two types of data can be correlated, in particular to highlight the phenomena of "horizontal transfer of genes" of resistance and all the hosts involved. These phenomena are the main cause of gene transfer allowing different bacterial species to acquire (multi) resistance to antibiotics or to be vectors of diseases and biofilms are the place par excellence where this horizontal transfer of genes takes place.
Ces biofilms constituent des réservoirs potentiels pour des pathogènes, qui servent de sources continues d’infections et de contaminations croisées. Les biofilms bactériens et l’émergence de la multi-résistance aux médicaments sont devenus une menace majeure pour le traitement médical courant des infections nosocomiales. On estime qu’environ 65 à 80 % des infections microbiennes dans les pays développés sont associés aux biofilms [Majik MS, Parvatkar PT. Next génération biofilm inhibitors for Pseudomonas aeruginosa: Synthesis and rational design approaches. Curr. Top. Med. Chem. 2014; 14(1): 81-109 (Review)].These biofilms are potential reservoirs for pathogens, which serve as a continuing source of infection and cross-contamination. Bacterial biofilms and the emergence of multi-drug resistance have become a major threat to routine medical treatment of nosocomial infections. It is estimated that about 65-80% of microbial infections in developed countries are associated with biofilms [Majik MS, Parvatkar PT. Next Generation Biofilm Inhibitors for Pseudomonas Aeruginosa: Synthesis and rational design approaches. Curr. Top. Med. Chem. 2014; 14 (1): 81-109 (Review)].
Ces biofilms posent de sérieux problèmes aux hygiénistes cliniciens. En effet, la plupart des directives cliniques pour l’usage des biocides ont été développées pour des microorganismes planctoniques [Cerf O., Carpentier B., Sanders P. Tests for determining in-use concentrations of antibiotics and disinfectants are based on entirely different concepts: “résistance” has different meanings. Int. J. Food Microbiol. 2010 ; 136:247-254], Or les cellules bactériennes vivant au sein de biofilms peuvent être jusqu’à 1000 fois plus résistantes aux produits désinfectants que leurs homologues planctoniques. Par conséquent, les désinfectants commercialisés peuvent avoir une efficacité confirmée sur les cellules planctoniques et souvent ne pas pouvoir éradiquer les cellules des biofilms. Cette tolérance élevée des cellules sessiles aux biocides accroît le risque d’une désinfection ratée conduisant à de graves problèmes de santé et à des pertes économiques [Abdallah M., Benoliel C., Drider D., Dhulster P., Chihib N.E. Biofilm formation and persistence on abiotic surfaces in the context of food and medical environments. Arch. Microbiol. 2014 ; 196 :453-472].These biofilms pose serious problems for clinical hygienists. Indeed, most of the clinical guidelines for the use of biocides have been developed for planktonic microorganisms [Cerf O., Carpentier B., Sanders P. Tests for determining in-use concentrations of antibiotics and disinfectants are based on : "Resistance" has different meanings. Int. J. Food Microbiol. 2010; 136: 247-254], but bacterial cells living within biofilms can be up to 1000 times more resistant to disinfectants than their planktonic counterparts. Therefore, marketed disinfectants may have proven efficacy on planktonic cells and often fail to eradicate cells from biofilms. This high tolerance of sessile cells to biocides increases the risk of failed disinfection leading to serious health problems and economic losses [Abdallah M., Benoliel C., Drider D., Dhulster P., Chihib NE Biofilm formation and persistence on abiotic surfaces in the context of food and medical environments. Arch. Microbiol. 2014 ; 196: 453-472].
Par conséquent l'objectif de cette invention est de fournir des méthodes de surveillance des biofilms sur des surfaces différentes ; des surfaces de locaux (sols, murs, plafonds) ; des surfaces ouvertes (Open Plant Cleaning ou OPC) des équipements, machines et instruments médicaux ; des surfaces non accessibles (Cleaning In Place ou CIP) des équipements, machines et instruments médicaux et autres ; et de mise à disposition de procédures standards (SOP) d’entretien et de désinfection des populations microbiennes en fonction : • du type de local hospitalier (zones à risque classées de 1 à 4). • des points critiques à décontaminer et du type de surface. • du type suspecté de flore microbienne formant le biofilm.Therefore, the purpose of this invention is to provide methods for monitoring biofilms on different surfaces; surfaces of premises (floors, walls, ceilings); Open Plant Cleaning (OPC) equipment, machinery and medical instruments; non-accessible surfaces (Cleaning In Place or CIP) of medical equipment, machinery and instruments and others; and providing standard procedures (SOPs) for the maintenance and disinfection of microbial populations based on: • the type of hospital premises (risk areas ranked from 1 to 4). • critical points to be decontaminated and type of surface. • the suspected type of microbial flora forming the biofilm.
Par le monitoring qui permet d’identifier, de caractériser et de quantifier les micro-organismes, les gènes de résistance aux antibiotiques et les facteurs qui influencent la matrice protectrice de polymères du biofilm, de la présente demande a également pour objectif d’utiliser ce matériel dans de nouvelles méthodes de traitement et en mettant au point de nouvelles méthodes de référence pour monitorer de manière innovante l’efficacité de ces traitements.Through monitoring that identifies, characterizes and quantifies microorganisms, antibiotic resistance genes and factors that influence the protective matrix of biofilm polymers, the present application also aims to use this materials in new treatment methods and by developing new reference methods to innovatively monitor the efficacy of these treatments.
En utilisant les procédés de la présente invention, on obtient une meilleure compréhension des facteurs de régulation de l’équilibre d’une flore saine « anti-pathogène ». On peut utiliser ces données dans des nouvelles méthodes de traitement permettant de mettre en place sur les surfaces traitées une telle flore saine. Par exemple dans l’environnement hospitalier sur les surfaces des locaux et les surfaces des machines et des instruments médicaux.Using the methods of the present invention, a better understanding of the equilibrium regulatory factors of a healthy "anti-pathogenic" flora is obtained. These data can be used in new methods of treatment to establish such healthy flora on treated surfaces. For example in the hospital environment on the surfaces of premises and surfaces of machines and medical instruments.
Dans la cadre de la présente invention, ces nouveaux traitements incluent : des coatings spécifiques anti-adhésion bactérienne sur les surfaces considérées comme les plus à risque dans le cadre de la transmission de pathogènes ; des cocktails enzymatiques pour décrocher les biofilms ; des cocktails complexes, constitués de microorganismes favorisant l’installation durable d’un écosystème luttant par des propriétés intrinsèques sélectionnées contre la contamination par d’autres microorganismes environnementaux dégradant la santé ou le bien-être ; des systèmes d’ultra-sonication et de chélates particuliers pour faciliter la désagrégation des biofilms lors des prélèvements ou le traitement des surfaces ; ou toute combinaison de ceux-ci.In the context of the present invention, these novel treatments include: specific bacterial anti-adhesion coatings on the surfaces considered most at risk in the context of the transmission of pathogens; enzymatic cocktails to get the biofilms; complex cocktails, consisting of microorganisms favoring the sustainable installation of an ecosystem struggling with intrinsic properties selected against contamination by other environmental microorganisms degrading health or well-being; ultra-sonication systems and particular chelates to facilitate the disintegration of biofilms during sampling or surface treatment; or any combination thereof.
REVENDICATONS 1. Un procédé pour caractériser le microbiome dans un environnement sans usage des techniques dépendantes de la culture des microorganismes., ce procédé étant basé sur la combinaison d’une analyse génétique / génomique avec une analyse métabolique et une analyse physico-chimique des échantillons dudit environnement. 2. Procédé selon la revendication 1, dans laquelle l’analyse génétique / génomique inclut le génotypage et le séquençage, par exemple par séquençage cibiés d’amplicons pour Γidentification d'espèces, et séquençage complet de génomes pour la détection de nouveaux gènes d’intérêt. 3. Procédé selon la revendication 2 dans laquelle les gènes de résistance aux antibiotiques et les facteurs de virulence présents dans cet environnement sont détectés et quantifiés par PCR quantitative en temps réel (qPCR), utilisant l’un quelconque des séquenceurs capiiiaires d’une plateforme de génotypage comme Taqman SNP Genoîyping Assay sur 7900 HT (Applied Biosystem); et d’une plateforme Haut débit (NGS) comme GS-FI..X (Roche Diagnostics), HiSeq 2500 (Illumina) ou MiSeq (Illumina) ; ou des combinaisons de ceux-ci. 4. Procédé selon la revendication 1, dans laqueiie i'anaiyse métabolique utilise ia spectrométrie de masse et la résonance magnétique nucléaire pour caractériser l'ensemble des métabolites (sucres, acides aminés, acides gras, protéines, peptides, etc.) présents dans les échantillons d'un environnement donné. 5. Procédé selon la revendication 1, dans laquelle l’analyse physico-chimique utilise i’XPS (spectroscopie électronique induite par rayons X) et l’IRRAS (infra Rouge de Surface par réflexion) pour obtenir des informations sur ia structure et ia composition d’une couche adsorbée ou des bactéries ; ia MATS (Adhésion microbienne aux solvants) pour connaître ies propriétés acido-basiques au sens de Lewis de ia bactérie, et ie nanoSiMS pour obtenir des informations sur ia localisation et i'anaiyse quantitative des complexes d'antigène-anticorps se liant sur une surface. 6. Procédé selon i'une queiconque des revendications précédentes, dans laquelle les environnements et les échantillons sont sélectionnés ; d’environnements des animaux de compagnie ( soins et environnement ) d’environnements d’éievage industriel (ovin, bovin, pisciculture ) d’environnements humains non-médicaux construits d’environnements paramédicaux du milieu hospitalier1. A method for characterizing the microbiome in an environment without the use of microorganism culture dependent techniques, the method being based on the combination of genetic / genomic analysis with metabolic analysis and physicochemical analysis of the samples said environment. The method of claim 1, wherein the genomic / genomic analysis includes genotyping and sequencing, e.g., cibed sequencing of amplicons for species identification, and complete sequencing of genomes for the detection of novel genes. interest. The method of claim 2 wherein the antibiotic resistance genes and virulence factors present in that environment are detected and quantified by real-time quantitative PCR (qPCR) using any of the platform sequencers. genotyping as Taqman SNP Genoyping Assay on 7900 HT (Applied Biosystem); and a Broadband Platform (NGS) such as GS-FI..X (Roche Diagnostics), HiSeq 2500 (Illumina) or MiSeq (Illumina); or combinations thereof. 4. Process according to claim 1, in which the metabolic analysis uses mass spectrometry and nuclear magnetic resonance to characterize all the metabolites (sugars, amino acids, fatty acids, proteins, peptides, etc.) present in the samples of a given environment. The method of claim 1, wherein the physico-chemical analysis utilizes XPS (X-ray electron spectroscopy) and IRRAS (Surface Infrared Reflection) to provide information on structure and composition. an adsorbed layer or bacteria; MAT (Microbial Adhesion to Solvents) for Lewis acid-base properties of the bacterium, and nanoSiMS to obtain information on the localization and quantitative analysis of antigen-antibody complexes binding to a surface. . 6. A method as claimed in any one of the preceding claims, wherein the environments and samples are selected; of animal environments (care and environment) of industrial environments (sheep, cattle, fish farming) of non-medical human environments built of paramedical environments of the hospital environment
Claims (5)
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