BE1022875B1

BE1022875B1 - Compositions pour une immunisation contre staphylococcus aureus

Info

Publication number: BE1022875B1
Application number: BE2015/5177A
Authority: BE
Inventors: Fabio Bagnoli; Guido Grandi
Original assignee: Glaxosmithkline Biologicals S.A.
Priority date: 2014-03-26
Filing date: 2015-03-24
Publication date: 2016-09-30
Also published as: WO2015144691A1

Abstract

L'invention concerne des antigènes de S. aureus qui peuvent être utiles pour une immunisation lorsqu'ils sont utilisés en combinaison et en particulier, une composition pharmaceutique d'au moins deux antigènes choisis parmi (i) un antigène hla, (ii) un antigène sta006, (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa comme étant particulièrement utiles pour une immunisation. Les antigènes peuvent être compris au sein de vésicules de la membrane externe (OMV).

FIG.1 L'invention propose également une OMV à partir d'une bactérie Gram négatif, où l'OMV comprend au moins un antigène de S. aureus. L'antigène/les antigènes peut/peuvent être partiellement présent (s) dans la membrane de l'OMV et partiellement présent (s) dans la lumière de l'OMV ou libres dans la lumière de l'OMV. L'invention propose également un procédé de préparation d'une OMV de l'invention.

Description

COMPOSITIONS POUR UNE IMMUNISATION CONTRE STAPHYLOCOCCUS

AUREUS

Cette demande revendique la priorité de la demande de brevet européen 14161861.1 (déposée le 26 mars 2014), dont l'intégralité est incorporée dans la présente par référence pour tous les objets.

Domaine technique

Cette invention concerne des combinaisons d'antigènes de S. aureus et leur utilisation en immunisation.

Contexte de l'état de l'art

Staphylococcus aureus est une bactérie sphérique Gram positif. Aux Etats-Unis, la mortalité annuelle dépasse celle de toute autre maladie infectieuse, y compris le VIH/SIDA, et S. aureus est la cause majeure d’infections de la circulation sanguine, des voies respiratoires basses, de la peau et des tissus mous. S. aureus provoque tout un éventail de maladies allant des infections mineures de la peau à des maladies menaçant la vie comme la pneumonie, la méningite, l'ostéomyélite, la bactériémie, l'endocardite, le syndrome du choc toxique, les abcès d'organes et la septicémie. La bactérie comporte de multiples facteurs de virulence qui sont exprimés de façon différentielle durant les différentes phases de son cycle de vie, et ainsi un vaccin qui peut prévenir une maladie pourrait ne pas en prévenir une autre. Un objet de l'invention est de proposer un vaccin qui protège contre une maladie provoquée par S. aureus, idéalement contre de multiples maladies provoquées par S. aureus.

Le document WO 2010/119343 divulgue des antigènes de S. aureus qui peuvent être utilisés dans des vaccins pour protéger contre des maladies.

Toutefois, il demeure le besoin d'identifier des antigènes particuliers et des combinaisons d'antigènes pour une utilisation dans des vaccins contre S. aureus. Il existe également le besoin de développer des vaccins contre S. aureus présentant une immunogénicité améliorée chez les mammifères et des procédés de production et d'administration de tels vaccins.

Divulgation de 1'invention

Les inventeurs ont identifié des antigènes particuliers de S. aureus qui peuvent être utiles pour une immunisation lorsqu'ils sont utilisés en combinaison. En particulier, les inventeurs ont identifié des combinaisons d'au moins deux antigènes choisis parmi (i) un antigène hla, (ii) un antigène sta006, (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa comme étant particulièrement utiles pour une immunisation. Généralement, la combinaison est d'au moins trois de ces antigènes, et plus généralement des 4 antigènes.

Par conséquent, l'invention propose une composition pharmaceutique comprenant au moins deux antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa. Généralement, les combinaisons comprennent au moins trois antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa, ou plus généralement les quatre des antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa. Dans un aspect, la composition pharmaceutique comprend un antigène lukE et un antigène choisi dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006, et (iii) un antigène spa. Au moins un antigène peut être compris au sein de vésicules de la membrane externe (OMV) . Lorsqu'ils sont compris au sein d'OMV, 1'antigène/les antigènes peut/peuvent être compris au sein d'OMV distinctes ou au sein de la même OMV. L'invention propose également une composition pharmaceutique comprenant au moins deux antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB. Généralement, les combinaisons comprennent au moins trois antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou plus généralement au moins quatre des antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou plus généralement au moins cinq des antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène staOOô ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou plus généralement les quatre antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène staOOô ; (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa, ou plus généralement les quatre des antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène esxAB et (iv) staOll. Dans un aspect, la composition pharmaceutique comprend un antigène lukE et un antigène choisi dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène spa ; (iv) un antigène staOll ; (v) un antigène esxA et (vi) un antigène esxB. Au moins un antigène peut être compris au sein de vésicules de la membrane externe (OMV). Lorsqu'ils sont compris au sein d'OMV, 1'antigène/les antigènes peut/peuvent être compris au sein d'OMV distinctes ou au sein de la même OMV. L'invention propose également une OMV provenant d'une bactérie Gram négatif, où l'OMV comprend au moins un antigène de S. aureus, où l'antigène est choisi dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB. Les OMV peuvent comprendre au moins deux antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou' elles peuvent comprendre au moins trois antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou elles peuvent comprendre au moins quatre des antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi)'un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou elles peuvent comprendre au moins cinq des antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou elles peuvent comprendre les quatre antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa, ou elles peuvent comprendre les quatre des antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène esxAB et (iv) staOll. L'invention propose également un procédé de préparation d'une OMV de l'invention. L'invention propose également une OMV à partir d'une bactérie Gram négatif, où l'OMV comprend au moins un antigène de S. aureus dans sa membrane où l'antigène est choisi dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB. Généralement, l'OMV comprend au moins deux antigènes dans sa membrane du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou plus généralement au moins trois antigènes dans sa membrane du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou plus généralement au moins quatre des antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène staOOô ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou elle peut comprendre les quatre antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa, ou elle peut comprendre les quatre des antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène esxAB et (iv) staOll. L'invention propose également un procédé de préparation d'une OMV de 1'invention. L'invention propose également une OMV provenant d'une bactérie Gram négatif, où l'OMV comprend au moins un antigène de S. aureus dans sa lumière, où l'antigène est choisi dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB. Généralement, l'OMV comprend au moins deux antigènes dans sa lumière du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou plus généralement au moins trois antigènes dans sa lumière du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou plus généralement au moins quatre des antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou plus généralement les quatre antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa, ou plus généralement les quatre des antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène esxAB et (iv) staOll. L'antigène ou les antigènes peut/peuvent être partiellement présent (s) dans la membrane et partiellement présent (s) dans la lumière de l'OMV. Comme variante, l'antigène ou les antigènes peut/peuvent être libre(s) dans la lumière de l'OMV. L'invention propose également un procédé de préparation d'une OMV de l'invention. Le procédé peut comprendre l'étape d'expression de l'antigène de S. aureus dans le périplasme de la bactérie Gram négatif. Le procédé peut comprendre l'étape d'expression de l'antigène de S. aureus dans le périplasme de la bactérie Gram négatif en utilisant un vecteur d'expression comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour l'antigène liée de façon fonctionnelle à un acide nucléique codant pour une séquence signal d'une protéine périplasmique. La séquence signal native de l'antigène de S. aureus peut être remplacée par la séquence signal d'une protéine périplasmique. L'invention propose également une OMV provenant d'une bactérie Gram négatif, où l'OMV comprend au moins un antigène de S. aureus, où l'antigène est choisi dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, où la bactérie Gram négatif comprend un génome synthétique dans lequel : a) une ou plusieurs séquences non essentielles à la production des vésicules sont absentes de telle façon que, comparativement à la même bactérie sans lesdites séquences absentes, le génome est entre 1 % et 50 % plus petit, et b) une ou plusieurs séquences sont présentes de telle façon que, comparativement à la même bactérie sans lesdites séquences présentes, la bactérie produit des vésicules qui comprennent un ou plusieurs antigènes supplémentaires. Généralement, 1'OMV comprend au moins deux antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou plus généralement au moins trois antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou plus généralement au moins quatre des antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou plus généralement les quatre antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa, ou plus généralement les quatre antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène esxAB et (iv) staOll. L'antigène peut être dans la lumière de l'OMV, et éventuellement libre dans la lumière de l'OMV. L'invention propose également un procédé de préparation d'une OMV de l'invention. L'invention propose également une composition pharmaceutique comprenant (a) au moins une OMV de l'invention et (b) un support pharmaceutiquement acceptable. La composition pharmaceutique peut comprendre au moins une OMV qui comprend au moins deux antigène de S. aureus choisis dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, c'est-à-dire qu'une combinaison d'antigènes est fournie au sein de la même OMV. En variante, la composition pharmaceutique peut comprendre de multiples OMV différentes qui comprennent au moins un antigène de S. aureus choisi dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, c'est-à-dire qu'une combinaison d'antigènes est fournie dans des OMV distinctes.

Les compositions pharmaceutiques et/ou les OMV de 1'invention peuvent comprendre en outre au moins un antigène choisi dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB. L'invention propose également un -procédé de génération d'une réponse immunitaire contre un antigène de S. aureus chez un mammifère, le procédé comprenant l'administration d'une quantité efficace d'une OMV de l'invention, ou d'une composition pharmaceutique de l'invention, au mammifère, où la réponse immunitaire est dirigée contre l'antigène de S. aureus dans l'OMV. L'invention propose également une OMV de l'invention, ou une composition pharmaceutique de l'invention, pour une utilisation en thérapie.

Combinaisons d'antigènes de S. aureus L'invention propose un ou plusieurs antigènes de S. aureus choisis dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa. L'invention peut impliquer en outre un ou plusieurs antigènes de S. aureus choisis dans le groupe constitué de : (i) un antigène staOll ; (ii) un antigène esxA et/ou un antigène esxB et (iii) un antigène,clfA.

Hla L'antigène « Hla » est le « précurseur de l'alpha-hémolysine » également connu comme la « toxine alpha » ou simplement « 1'hémolysine ». Dans la souche NCTC 8325, Hla est SAOUHSC_01121 et a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 (GI : 88194865) . Dans la souche Newman, il est nwmn_1073 (GI : 151221285). Hla est un déterminant de virulence important produit par la plupart des souches de S. aureus, possédant une activité de formation de pores et hémolytique. Les anticorps anti-Hla peuvent neutraliser les effets délétères de la toxine dans des modèles animaux, et Hla est particulièrement utile pour une protection contre la pneumonie.

Les antigènes Hla peuvent déclencher un anticorps (par exemple, lorsqu'ils sont administrés à un être humain) qui reconnaît SEQ ID NO : 1 et/ou peuvent comprendre une séquence d'acides aminés : (a) présentant 50 % ou plus d'identité (par exemple, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec SEQ ID NO : 1 ; et/ou (b) comprenant un fragment d'au moins « n » acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 1, où « n » vaut 7 ou plus (par exemple, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou plus) . Ces protéines Hla comprennent des variants de SEQ ID NO : 1. Les fragments préférés de (b) comprennent un épitope provenant de SEQ ID NO : 1. A d'autres fragments préférés, il manque un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité C-terminale et/ou un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité N-terminale de SEQ ID NO : 1 tout en conservant au moins un épitope de SEQ ID NO : 1. Les 2 6 premiers acides aminés N-terminaux de SEQ ID NO : 1 peuvent être omis de façon utile (par exemple, pour donner SEQ ID NO : 2) . Une troncature à l'extrémité C-terminale peut être également utilisée, par exemple en ne laissant que 50 acides aminés (résidus 27 à 76 de SEQ ID NO : 1) [1] . D'autres fragments omettent un ou plusieurs domaines des protéines.

La toxicité de Hla peut être évitée dans des compositions de l'invention par une inactivation chimique (par exemple, en utilisant du formaldéhyde, du glutaraldéhyde ou d'autres réactifs de réticulation). Toutefois, à la place, il est préférable d'utiliser des formes mutantes de Hla qui éliminent son activité toxique tout en conservant son immunogénicité. De tels mutants détoxifiés sont déjà connus de l'état de l'art. Un antigène Hla utile comporte une mutation au niveau du résidu 61 de SEQ ID NO : 1, qui est le résidu 35 de l'antigène mature (c'est-à-dire, après omission des 26 premiers acides aminés N-terminaux = résidu 35 de SEQ ID NO : 2) . Ainsi, le résidu 61 peut ne pas être l'histidine et peut être à la place, par exemple, Ile, Val ou de préférence Leu. Une mutation His-Arg au niveau de cette position peut être également utilisée. Par exemple, SEQ ID NO : 3 est la séquence du mutant mature Hla-H35L (c'est-à-dire, SEQ ID NO : 2 avec une mutation H35L) et un antigène Hla utile comprend SEQ ID NO : 3. Une autre mutation utile remplace une longue boucle par une courte séquence, par exemple pour remplacer le 39-mer au niveau des résidus 136 à 174 de SEQ ID NO : 1 par un tétramère comme PSGS, comme dans SEQ ID NO : 4 (qui comprend également la mutation H35L) et SEQ ID NO : 5 (qui ne comprend pas la mutation H35L). Une autre mutation utile remplace le résidu Y101, par exemple par une leucine (SEQ ID NO : 6) . Une autre mutation utile remplace le résidu D152, par exemple par une leucine (SEQ ID NO : 7) . Un autre mutant utile remplace les résidus H35 et Y101, par exemple par une leucine (SEQ ID NO : 8). Un autre mutant utile remplace les résidus H35 et D152, par exemple par une leucine (SEQ ID NO : 9). D'autres antigènes utiles de Hla sont divulgués dans les références 2 et 3. SEQ ID NO : 10, 11 et 12 sont trois fragments utiles de SEQ ID NO : 1 ( 'Hla27-76' , 'Hla27-89' et 'Hla27-79' , respectivement) . SEQ ID NO : 13, 14 et 15 sont les fragments correspondants provenant de SEQ ID NO : 3.

Une séquence utile de Hla est SEQ ID NO : 16. Elle comporte une Met N-terminale, puis un dipeptide Ala-Ser provenant du vecteur d'expression, puis SEQ ID NO : 3 (provenant de la souche NCTC8325). Elle est codée par SEQ ID NO : 17.

Dans un mode de réalisation préféré, l'antigène Hla est codé par l'acide nucléique de SEQ ID NO : 121 et/ou a la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 122.

StaOOô L'antigène « StaOOô » est annoté comme « protéine de liaison du ferrichrome », et a été déjà appelé « FhuD2 » dans la littérature [4]. Dans la souche NCTC 8325, StaOOô est SAOUHSC_02554 et a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 18 (GI : 88196199) . Dans la souche Newman, il est nwmn_2185 (GI : 151222397).

StaOOô utilisé dans l'invention peut déclencher un anticorps (par exemple, lorsqu'il est administré à un être humain) qui reconnaît SEQ ID NO : 18 et/ou peut comprendre une séquence d'acides aminés : (a) présentant 50 % ou plus d'identité (par exemple, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec SEQ ID NO : 18, et/ou (b) comprenant un fragment d'au moins « η » acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 18, où « n » vaut 7 ou plus (par exemple, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou plus) . Ces protéines Sta006 comprennent des variants de SEQ ID NO : 18. Les fragments préférés de (b) comprennent un épitope provenant de SEQ ID NO : 18. A d'autres fragments préférés, il manque un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité C-terminale et/ou un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité N-terminale de SEQ ID NO : 18 tout en conservant au moins un épitope de SEQ ID NO : 18. Les 17 premiers acides aminés N-terminaux de SEQ ID NO : 18 peuvent être omis de façon utile (pour fournir SEQ ID NO : 19). D'autres fragments omettent un ou plusieurs domaines des protéines. Des formes mutantes de Sta006 sont rapportées dans la référence 5. Un antigène Sta006 peut être lipidé, par exemple avec une cystéine N-terminale acylée. Une séquence utile de Sta006 est SEQ ID NO : 20, qui comporte une séquence Met-Ala-Ser- à l'extrémité N-terminale. Sta006 peut exister sous la forme d'un monomère ou d'un oligomère (par exemple, dimère) , avec des ions Ca++ favorisant 1'oligomérisation. L'invention peut utiliser des monomères et/ou des oligomères de Sta006. Sta006 peut être un homodimère ou un hétérodimère avec StaOll. L'antigène Sta006 comporte naturellement une cystéine N-terminale sous sa forme mature. Cette cystéine peut être délétée dans l'antigène Sta006 pour stopper la dimérisation et donner une protéine qui est plus facile à caractériser et analyser, sans impacter négativement l'immunogénicité. Les compositions contenant des antigènes Sta006 déficients en cystéine sont plus stables. Ainsi, l'antigène Sta006 peut comprendre une séquence d'acides aminés qui présente au moins 90 % (par exemple, ^ 91 %, ^ 92 %, > 93 %, ^ 94 %, > 95 %, ^ 96 %, > 97 %, > 98 %, > 99 %, ^ 99,5 %) d'identité avec SEQ ID NO : 21, où le polypeptide n'a pas de groupe thiol libre, et peut déclencher des anticorps (par exemple, lorsqu'il est administré à un être humain) qui reconnaissent un antigène StaOOô de type sauvage (par exemple, une protéine de S. aureus constituée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 18) . Le polypeptide ne peut pas former des dimères covalents par l'intermédiaire de liaisons disulfure. SEQ ID NO : 21 correspond aux résidus d'acides aminés 19 à 302 de SEQ ID NO : 18. Comparativement à SEQ ID NO : 21, SEQ ID NO : 22 comporte un résidu d'acide aminé supplémentaire « X » à l'extrémité N-terminale, où « X » est un acide aminé qui ne contient pas de groupe thiol libre. Comparativement à SEQ ID NO : 21, SEQ ID NO : 23 comporte une séquence Met-Ala-Ser- à l'extrémité N-terminale. Comparativement à SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 24 comporte une séquence Met-Ala-Ser- à l'extrémité N-terminale. Un polypeptide Sta006 comprenant l'une quelconque de SEQ ID NO : 21, 22, 23 ou 24 peut être utilisé dans 1'invention.

Une forme variante utile de Sta006 peut comprendre au moins une mutation ponctuelle qui remplace, modifie ou délète le résidu de cystéine présent dans la forme de type sauvage de l'antigène. Par exemple, un polypeptide Sta006 peut comprendre une séquence d'acides aminés ayant SEQ ID NO : 20, où le résidu de cystéine en position 4 de SEQ ID NO : 20 est remplacé, modifié ou délété. De préférence, le remplacement se fait par une sérine ou un résidu d'alanine. En variante, le résidu de cystéine est délété (par exemple, fournissant SEQ ID NO : 23).

Dans un mode de réalisation préféré, l'antigène Sta006 est codé par l'acide nucléique de SEQ ID NO : 123 et/ou a la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 124.

lukE L'antigène « lukE » est annoté comme « leucotoxine lukE ». Dans la souche NCTC 8325, lukE est SAOUHSC_01955 et a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 25 (GI : 88195648).

Les antigènes lukE utiles peuvent déclencher un anticorps (par exemple, lorsqu'ils sont administrés à un être humain) qui reconnaît SEQ ID NO : 25 et/ou peuvent comprendre une séquence d'acides aminés : (a) présentant 50 % ou plus d'identité (par exemple, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec SEQ ID NO : 24 ; et/ou (b) comprenant un fragment d'au moins « n » acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 25, où « n » vaut 7 ou plus (par exemple, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou plus) . Ces protéines lukE comprennent des variants de SEQ ID NO : 25. Les fragments préférés de (b) comprennent un épitope provenant de SEQ ID NO : 25. A d'autres fragments préférés, il manque un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité C-terminale et/ou un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité N-terminale de SEQ ID NO : 24 tout en conservant au moins un épitope de SEQ ID NO : 25. D'autres fragments omettent un ou plusieurs domaines des protéines.

Dans un mode de réalisation préféré, l'antigène lukE est codé par l'acide nucléique de SEQ ID NO : 127 ou SEQ ID NO : 129 et/ou a la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 128 ou SEQ ID NO : 130. spa L'antigène « spa » est annoté « protéine A » ou « SpA ». Dans la souche NCTC 8325, spa est SAOUHSC_00069 et a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 26 (GI : 88193885). Dans la souche Newman, il est nwmn_0055 (GI : 151220267). Toutes les souches de S. aureus expriment le gène structural pour spa, un facteur de virulence bien caractérisé dont le produit de la protéine de surface ancrée à la paroi cellulaire comporte cinq domaines de liaison d'immunoglobulines hautement homologues désignés par E, D, A, B et C [6]. Ces domaines affichent ~80 % d'identité au niveau des acides aminés, ont une longueur de 56 à 61 résidus, et sont organisés sous forme de répétitions en tandem [7]. SpA est synthétisé sous la forme d'une protéine précurseur avec un peptide signal N-terminal et un signal de tri C-terminal [8,9]. Spa ancré à la paroi cellulaire est présenté en grande abondance sur la surface staphylococcique [10,11]. Chacun de ses domaines de liaison d'immunoglobulines est composé d'hélices a antiparallèles qui s'assemblent en un faisceau à trois hélices et peuvent lier le domaine Fc de l'immunoglobuline G (IgG) [12,13], la chaîne lourde VH3 (Fab) de 1'IgM (c'est-à-dire, le récepteur des lymphocytes B) [14], le facteur de von Willebrand au niveau de son domaine Al [15] et/ou le récepteur I du TNF-α (TNFRI) [16] , qui est présenté sur les surfaces des épithéliums des voies respiratoires.

Les antigènes spa utiles peuvent déclencher un anticorps (par exemple, lorsqu'ils sont administrés à un être humain) qui reconnaît SEQ ID NO : 26 et/ou peuvent comprendre une séquence d'acides aminés : (a) présentant 50 % ou plus d'identité (par exemple, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec SEQ ID NO : 2 6 ; et/ou (b) comprenant un fragment d'au moins « n » acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 26, où « n » vaut 7 ou plus (par exemple, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou plus) . Ces protéines spa comprennent des variants de SEQ ID NO : 26. Les fragments préférés de (b) comprennent un épitope provenant de SEQ ID NO : 26. A d'autres fragments préférés, il manque un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité C-terminale et/ou un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité N-terminale de SEQ ID NO : 26 tout en conservant au moins un épitope de SEQ ID NO : 26. Les 35 acides aminés C-terminaux finaux de SEQ ID NO : 26 peuvent être omis de façon utile. Les 36 premiers acides aminés N-terminaux de SEQ ID NO : 26 peuvent être omis de façon utile. D'autres fragments omettent un ou plusieurs domaines des protéines. La référence 17 suggère gue les domaines de liaison d'IgG individuels pourraient être des immunogènes utiles, seuls ou en combinaison. SEQ ID NO : 27 est un fragment utile de SEQ ID NO : 26 ( 'Spa37-325' ) . Ce fragment contient les cinq domaines de liaison d'Ig de SpA (qui sont arrangés naturellement de l'extrémité N-terminale à l'extrémité C-terminale dans l'ordre E, D, A, B, C) et comprend le domaine le plus exposé de SpA. Il réduit également la similarité de l'antigène avec les protéines humaines. D'autres fragments utiles peuvent omettre 1, 2, 3 ou 4 des domaines naturels A, B, C, D et/ou E pour empêcher l'expansion excessive des lymphocytes B et ensuite l'apoptose qui pourrait survenir si spa fonctionne comme un superantigène des lymphocytes B. Comme il est rapporté dans la référence 17, d'autres fragments utiles peuvent comprendre seulement 1, 2, 3 ou 4 des domaines naturels A, B, C, D et/ou E, par exemple, ils peuvent comprendre seulement le domaine SpA(A) mais pas B à E, ou comprendre seulement le domaine SpA(D) mais pas A, B, C ou E, etc. Ainsi, un antigène spa utile pour l'invention peut comprendre 1, 2, 3, 4 ou 5 domaines de liaison d'IgG, mais idéalement il en comprend 4 ou moins.

Si un antigène comprend seulement un type de domaine de spa (par exemple, seulement le domaine SpA(A) ou SpA(D)), il peut comprendre plus d'une copie de ce domaine, par exemple des domaines SpA(D) multiples dans une seule chaîne polypeptidique.

Un domaine individuel au sein de l'antigène peut être muté au niveau de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 acides aminés ou plus par rapport à SEQ ID NO : 26 (par exemple, voir la référence 17, divulguant des mutations au niveau des résidus 3 et/ou 24 du domaine D, au niveau du résidu 46 et/ou 53 du domaine A, etc.). De tels mutants ne devront pas éliminer la capacité de l'antigène à déclencher un anticorps qui reconnaît SEQ ID NO : 26, mais ils peuvent éliminer la liaison de l'antigène aux IgG et/ou d'autres protéines humaines (comme des protéines du sang humain).

Dans certains aspects, un antigène spa comprend (a) une ou plusieurs substitutions d'acides aminés dans un sous-domaine de liaison de Fc d'IgG de domaine SpA A, B, C, D et/ou E, ce qui perturbe ou diminue la liaison au Fc d'IgG, et (b) une ou plusieurs substitutions d'acides aminés dans un sous-domaine de liaison de Vh3 de domaine SpA A, B, C, D et/ou E, ce qui perturbe ou diminue la liaison au Vh3 . Dans certains modes de réalisation, un SpA variant comprend au moins ou au plus 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 peptides de domaine D de SpA variant ou plus.

Dans certains aspects, les résidus d'acides aminés F5, Q9, Q10, Sil, F13, Y14, L17, N28, 131, et/ou K35 du sous-domaine de liaison de Fc d'IgG du domaine D sont modifiés ou substitués, c'est-à-dire les acides aminés 100, 104, 105, 106, 108, 109, 112, 123, 126 et/ou 130 de SEQ ID NO : 26. Dans certains aspects, les résidus d'acides aminés Q26, G29, F30, S33, D36, D37, Q40, N43, et/ou E47 du sous-domaine de liaison de VH3 du domaine D sont modifiés ou substitués de telle façon que la liaison au Fc ou au VH3 est atténuée, c'est-à-dire les acides aminés 121, 124, 125, 128, 131, 132, 135, 138 et/ou 141 de SEQ ID NO : 26. Dans d'autres aspects, des modifications ou des substitutions correspondantes peuvent être créées dans des positions correspondantes du domaine A, B, C et/ou E. Les positions correspondantes sont définies par l'alignement de la séquence d'acides aminés du domaine D avec une ou plusieurs des séquences d'acides aminés provenant d'autres domaines de liaison d'IgG de SpA. Dans certains aspects, la substitution d'acide aminé peut être de l'un quelconque des 20 autres acides aminés. Dans un autre aspect, des substitutions d'acides aminés conservatives peuvent être exclues spécifiquement des substitutions d'acides aminés possibles. Dans d'autres aspects, seules des substitutions non conservatives sont incluses. Dans tous les cas, il est envisagé toute substitution ou combinaison de substitutions qui réduit la liaison du domaine de telle façon que la toxicité de SpA est significativement réduite. La signification de la réduction de liaison se rapporte à un variant qui produit une toxicité minimale ou aucune toxicité lorsqu'il est introduit chez un sujet et elle peut être estimée en utilisant des procédés in vitro décrits dans la présente.

Dans un aspect de l'invention, les résidus de glutamine en position 9 et/ou 10 du domaine D de SpA, c'est-à-dire les acides aminés 104 et/ou 105 de SEQ ID NO : 26 (ou des positions correspondantes dans d'autres domaines) sont mutés. Dans un autre aspect, les résidus d'acide aspartique 36 et/ou 37 du domaine D de SpA, c'est-à-dire les acides aminés 131 et 132 de SEQ ID NO : 26 (ou les positions correspondantes dans d'autres domaines) sont mutés. Dans un autre aspect, les résidus de glutamine 9 et 10, et d'acide aspartique 36 et 37 du domaine D de SpA, c'est-à-dire les acides aminés 104, 105, 131 et 132 de SEQ ID NO : 26 (ou les positions correspondantes dans d'autres domaines) sont mutés.

Dans d'autres aspects, l'acide aminé glutamine (Q) en position 9 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 104 de SEQ ID NO : 2 6 (ou son acide aminé analogue dans d'autres domaines de SpA) peut être remplacé par une alanine (A) , une asparagine (N) , un acide aspartique (D) , une cystéine (C) , un acide glutamique (E) , une phénylalanine (F) , une glycine (G) , une histidine (H) , une isoleucine (I) , une lysine (K) , une leucine (L) , une méthionine (Μ) , une proline (P) , une sérine (S), une thréonine (T) , une valine (V), un tryptophane (W), ou une tyrosine (Y). Dans certains aspects, la glutamine en position 9 peut être substituée par une arginine (R) . Dans un autre aspect, la glutamine en position 9 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 104 de SEQ ID NO : 26, ou son équivalent, peut être substituée par une lysine ou une glycine.

Dans un autre aspect, l'acide aminé glutamine (Q) en position 10 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 105 de SEQ ID NO : 26 (ou son acide aminé analogue dans d'autres domaines de SpA) peut être remplacé par une alanine (A) , une asparagine (N) , un acide aspartique (D) , une cystéine (C) , un acide glutamique (E) , une phénylalanine (F) , une glycine (G) , une histidine (H), une isoleucine (I), une lysine (K), une leucine (L) , une méthionine (M) , une proline (P) , une sérine (S), une thréonine (T), une valine (V), un tryptophane (W), ou une tyrosine (Y). Dans certains aspects, la glutamine en position 10 peut être substituée par une arginine (R). Dans un autre aspect, la glutamine en position 10 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 105 de SEQ ID NO : 26, ou son équivalent, peut être substituée par une lysine ou une glycine.

Dans certains aspects, l'acide aspartique (D) en position 36 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 131 de SEQ ID NO : 26 (ou son acide aminé analogue dans d'autres domaines de SpA) peut être remplacé par une alanine (A) , une asparagine (N), une arginine (R), une cystéine (C), une phénylalanine (F) , une glycine (G) , une histidine (H) , une isoleucine (I), une lysine (K), une leucine (L), une méthionine (M) , une proline (P) , une glutamine (Q) , une sérine (S) , une thréonine (T) , une valine (V) , un tryptophane (W) , ou une tyrosine (Y) . Dans certains aspects, l'acide aspartique en position 36 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 131 de SEQ ID NO : 26 peut être substitué par un acide glutamique (E). Dans certains aspects, un acide aspartique en position 36 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 131 de SEQ ID NO : 26, ou son équivalent, peut être substitué par une alanine ou une sérine.

Dans un autre aspect, l'acide aspartique (D) en position 37 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 132 de SEQ ID NO : 26 (ou son acide aminé analogue dans d'autres domaines de SpA) peut être remplacé par une alanine (A) , une asparagine (N), une arginine (R), une cystéine (C), une phénylalanine (F) , une glycine (G) , une histidine (H) , une isoleucine (I), une lysine (K), une leucine (L), une méthionine (M) , une proline (P) , une glutamine (Q) , une sérine (S) , une thréonine (T) , une valine (V) , un tryptophane (W) , ou une tyrosine (Y). Dans certains aspects, l'acide aspartique en position 37 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 132 de SEQ ID NO : 26 peut être substitués par un acide glutamique (E). Dans certains aspects, un acide aspartique en position 37 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 132 de SEQ ID NO : 26, ou son équivalent, peut être substitué par une alanine ou une sérine.

Dans un mode de réalisation particulier, l'acide aminé en position 9 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 104 de SEQ ID NO : 2 6 (ou un acide aminé analogue dans un autre domaine de SpA) est remplacé par une alanine (A) , une glycine (G), une isoleucine (I), une leucine (L), une proline (P), une sérine (S), ou une valine (V). Dans certains aspects, l'acide aminé en position 9 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 104 de SEQ ID NO : 26 est remplacé par une glycine. Dans un autre aspect, l'acide aminé en position 9 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 104 de SEQ ID NO : 26 est remplacé par une lysine.

Dans un mode de réalisation particulier, l'acide aminé en position 10 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 105 de SEQ ID NO : 2 6 (ou un acide aminé analogue dans un autre domaine de SpA) est remplacé par une alanine (A) , une glycine (G), une isoleucine (I), une leucine (L), une proline (P), une sérine (S), ou une valine (V) . Dans certains aspects, l'acide aminé en position 10 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 105 de SEQ ID NO : 26 est remplacé par une glycine. Dans un autre aspect, l'acide aminé en position 10 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 105 de SEQ ID NO : 26 est remplacé par une lysine.

Dans un mode de réalisation particulier, l'acide aminé en position 36 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 131 de SEQ ID NO : 2 6 (ou un acide aminé analogue dans un autre domaine de SpA) est remplacé par une alanine (A) , une glycine (G), une isoleucine (I), une leucine (L), une proline (P), une sérine (S), ou une valine (V). Dans certains aspects, l'acide aminé en position 36 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 131 de SEQ ID NO : 2 6 est remplacé par une sérine. Dans un autre aspect, l'acide aminé en position 36 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 131 de SEQ ID NO : 26 est remplacé par une alanine.

Dans un mode de réalisation particulier, l'acide aminé en position 37 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 132 de SEQ ID NO : 26 (ou un acide aminé analogue dans un autre domaine de SpA) est remplacé par une alanine (A) , une glycine (G), une isoleucine (I), une leucine (L), une proline (P), une sérine (S), ou une valine (V). Dans certains aspects, l'acide aminé en position 37 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 132 de SEQ ID NO : 26 est remplacé par une sérine. Dans un autre aspect, l'acide aminé en position 37 du domaine D de SpA, c'est-à-dire l'acide aminé 132 de SEQ ID NO : 26 est remplacé par une alanine.

Un variant utile de Spa est SpakkAA5 (SEQ ID NO : 28) qui comprend les cinq domaines de liaison d'immunoglobulines avec quatre substitutions d'acides aminés, correspondant à Gln9Lys, GlnlOLys, Asp36Ala et Asp37Ala du domaine D, c'est-à-dire les acides aminés 104, 105, 131 et 132 de SEQ ID NO : 26, dans chacun de ses cinq domaines de liaison d'immunoglobulines (E, D, A, B et C) .

Dans un mode de réalisation préféré, l'antigène Spa est codé par l'acide nucléique de SEQ ID NO : 125 et/ou a la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 126.

StaOll L'antigène « StaOll » a été annoté à l'origine simplement comme « lipoprotéine ». Dans la souche NCTC 8325, StaOll est SAOUHSC_00052 et a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 41 (GI : 88193872). L'antigène StaOll connu comporte une cystéine N-terminale sous sa forme mature, et il peut être lipidé. StaOll de type sauvage contenant une cystéine peut exister sous la forme d'un monomère ou d'un oligomère (par exemple, dimère covalent), avec des ions Ca++ favorisant 1'oligomérisation.

Il peut être utilisé une forme variante de StaOll qui ne peut pas former des dimères covalents par l'intermédiaire de liaisons disulfure. Dans de tels modes de réalisation, le polypeptide ne contient aucun groupe thiol libre (dans des conditions réductrices). Il peut déclencher des anticorps (par exemple, lorsqu'il est administré à un être humain) qui reconnaissent un antigène StaOll de type sauvage (par exemple, SEQ ID NO : 45, 53, 54 ou 55). Le polypeptide peut comprendre une séquence d'acides aminés présentant 80 % ou plus d'identité (par exemple, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec l'une quelconque de SEQ ID NO : 47 à 52. SEQ ID NO : 47 correspond aux résidus d'acides aminés 26 à 256 de SEQ ID NO . : 41. Comparativement à SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO : 48 comporte un résidu d'acide aminé supplémentaire « X » à l'extrémité N-terminale, où « X » est un acide aminé qui ne contient pas de groupe thiol libre (par exemple, est Ser = SEQ ID NO : 52) . SEQ ID NO : 4 9 comporte une séquence Met-Gly- à l'extrémité N-terminale de SEQ ID NO : 47. SEQ ID NO : 50 comporte une séquence Met-Gly- à l'extrémité N-terminale de SEQ ID NO : 48. SEQ ID NO : 51 a la séquence de SEQ ID NO : 50, dans laquelle « X » est une sérine. Un polypeptide StaOll comprenant l'une quelconque de SEQ ID NO : 47 à 52 peut être utilisé dans l'invention.

Des formes variantes de SEQ ID NO : 41 qui peuvent être également utilisées comprennent, mais n'y sont pas limitées, SEQ ID NO : 42, 43 et 44 avec diverses substitutions Ile/Val/Leu. Comparativement à SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO : 42 a Leu-146 à la place de Ile-146 et Ile-165 à la place de Leu-165. Comparativement à SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO : 43 a Val-146 à la place de Ile-146 et Ile-165 à la place de Leu-165. Comparativement à SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO : 44 a Leu-146 à la place de Ile-146 et Val-165 à la place de Leu-165. Les 23 premiers acides aminés N-terminaux de SEQ ID NO : 41 à 44 (c'est-à-dire, le peptide signal) peuvent être omis de façon utile pour fournir SEQ ID NO : 45, 53, 54 et 55, respectivement. Ainsi, un polypeptide StaOll de l'invention peut comprendre les résidus 26 à 256 de l'une quelconque de SEQ ID NO : 41 à 44, et il peut déclencher des anticorps (par exemple, lorsqu'il est administré à un être humain) qui reconnaissent l'antigène StaOll mature (par exemple, SEQ ID NO : 45, 53, 54 ou 55).

Une forme variante utile de StaOll peut comprendre au moins une mutation ponctuelle qui remplace, modifie ou délète le résidu de cystéine présent dans la forme de type sauvage de l'antigène. Par exemple, un polypeptide StaOll peut comprendre une séquence d'acides aminés ayant SEQ ID NO : 46, dans laquelle le résidu de cystéine en position 3 de SEQ ID NO : 4 6 est remplacé, modifié ou délété. De préférence, le remplacement est réalisé par un résidu de sérine (par exemple, fournissant SEQ ID NO : 51) ou un résidu d'alanine. En variante, le résidu de cystéine est délété.

Dans un mode de réalisation préféré, l'antigène StaOll est codé par l'acide nucléique de SEQ ID NO : 131 et/ou a la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 132.

EsxAB

esxA

Dans la souche NCTC 8325, esxA est SAOUHSC_00257 et a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 56 (GI : 88194063) . SEQ ID NO : 56 n'a aucun résidu de cystéine et ne contient aucun groupe thiol libre. EsxA utilisé dans l'invention ne devra pas non plus avoir de groupe thiol libre.

Les antigènes esxA utiles peuvent déclencher un anticorps (par exemple, lorsqu'ils sont administrés à un être humain) qui reconnaît SEQ ID NO : 56 et/ou peuvent comprendre une séquence d'acides aminés : (a) présentant 50 % ou plus d'identité (par exemple, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec SEQ ID NO : 56 ; et/ou (b) comprenant un fragment d'au moins « n » acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 56, où « n » vaut 7 ou plus (par exemple, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou plus). Ces protéines esxA comprennent des variants de SEQ ID NO : 56. Des fragments préférés de (b) comprennent un épitope provenant de SEQ ID NO : 10. A d'autres fragments préférés, il manque un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité C-terminale et/ou un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité N-terminale de SEQ ID NO : 56 tout en conservant au moins un épitope de SEQ ID NO : 56. D'autres fragments omettent un ou plusieurs domaines des protéines.

EsxA peut être présent sous la forme d'un polypeptide hybride avec EsxB comme il est discuté ci-dessous.

esxB

Dans la souche NCTC 8325, esxB est SAOUHSC_00265 et a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 57 (GI : 88194070). L'invention utilise une forme de EsxB qui ne peut pas former des dimères covalents par l'intermédiaire de liaisons disulfure. Le polypeptide ne contient aucun groupe thiol libre (dans des conditions réductrices).

Les antigènes esxB utiles peuvent déclencher un anticorps (par exemple, lorsqu'ils sont administrés à un être humain) qui reconnaît SEQ ID NO : 57 et/ou peuvent comprendre une séquence d'acides aminés : (a) présentant 50 % ou plus d'identité (par exemple, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec l'une quelconque de SEQ ID NO : 57, 60 à 68 et 77 à 82 ; et/ou (b) comprenant un fragment d'au moins « n » acides aminés consécutifs de l'une quelconque de SEQ ID NO : 57, 60 à 68 et 77 à 82, où « n » vaut 7 ou plus (par exemple, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou plus) . Ces protéines esxB comprennent des variants de SEQ ID NO : 57. Des fragments préférés de (b) comprennent un épitope provenant de SEQ ID NO : 57. A d'autres fragments préférés, il manque un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité C-terminale et/ou un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité N-terminale de SEQ ID NO : 57 tout en conservant au moins un épitope de SEQ ID NO : 57. D'autres fragments omettent un ou plusieurs domaines des protéines. SEQ ID NO : 61 est l'extrémité C-terminale de SEQ ID NO : 57, à partir des acides aminés 32 à 104. Comparativement à SEQ ID NO : 61, SEQ ID NO : 64 comporte un résidu d'acide aminé supplémentaire « X » à l'extrémité N-terminale, où « X » est un acide aminé qui ne contient pas de groupe thiol libre (par exemple, Ala = SEQ ID NO : 10) . Comparativement à SEQ ID NO : 57, SEQ ID NO : 66 ne comporte pas de méthionine N-terminale, et comporte un résidu d'acide aminé « X » à la place de Cys-31, où « X » est un acide aminé qui ne contient pas de groupe thiol libre (par exemple, Ala = SEQ ID NO : 67). Comparativement à SEQ ID NO : 57, Met-1 et Cys-31 sont absents dans SEQ ID NO : 68. SEQ ID NO : 60 correspond aux résidus d'acides aminés 2 à 30 de SEQ ID NO : 57. Comparativement à SEQ ID NO : 60, SEQ ID NO : 62 comporte un résidu d'acide aminé supplémentaire « X » à l'extrémité C-terminale, où « X » est un acide aminé qui ne contient pas de groupe thiol libre (par exemple, Ala, pour donner SEQ ID NO : 63).

Les polypeptides EsxB utiles peuvent comprendre une méthionine N-terminale (par exemple, SEQ ID NO : 77 à 82) .

Un EsxB utile peut comprendre au moins une mutation ponctuelle qui remplace, modifie ou délète le résidu de cystéine présent dans la forme de type sauvage de l'antigène. Par exemple, un polypeptide EsxB peut comprendre une séquence d'acides aminés ayant SEQ ID NO : 57, dans laquelle le résidu de cystéine en position 31 de SEQ ID NO : 57 est remplacé, modifié ou délété. De préférence, le remplacement est réalisé par un résidu de sérine ou par un résidu d'alanine (par exemple, fournissant SEQ ID NO : 80). En variante, le résidu de cystéine est délété (par exemple, fournissant SEQ ID NO : 78).

EsxB peut être présent sous la forme d'un polypeptide hybride avec EsxA comme il est discuté ci-dessous.

Polypeptides hybrides EsxAB et EsxBA

Un antigène hybride EsxAB comprend à la fois les antigènes EsxA et EsxB. Ceux-ci peuvent être dans n'importe quel ordre, de l'extrémité N-terminale à l'extrémité C-terminale. SEQ ID NO : 58 qui comprend SEQ ID NO : 56 et 57 ('EsxAB') ; et 44 qui comprend SEQ ID NO : 57 et 56 ('EsxBA' ) sont des exemples de tels hybrides, les deux comportant des lieurs (« linkers ») hexapeptidiques ASGGGS (SEQ ID NO : 101) . Un autre hybride 'EsxAB' comprend SEQ ID NO : 59, où la méthionine N-terminale de EsxB a été éliminée. Le polypeptide hybride utilisé dans l'invention n'a idéalement aucun groupe thiol libre (dans des conditions réductrices) . SEQ ID NO : 69 à 76 et 83 à 98 sont des hybrides 'EsxAB', avec EsxA en amont de EsxB ; au contraire, SEQ ID NO : 99 et 100 sont des hybrides 'EsxBA', avec EsxB à l'extrémité N-terminale de EsxA. Toutes les SEQ ID NO : 69 à 76 et 83 à 100 comprennent un lieur (« linker ») hexapeptidique ASGGGS (SEQ ID NO : 101) et aucun résidu de cystéine. SEQ ID NO : 87 à 100 comprennent des résidus de méthionine N-terminaux, tandis que les hybrides 'EsxAB' de SEQ ID NO : 69 à 76 et 83 à 86 n'en comprennent pas.

Ainsi, un polypeptide utile comprend une séquence d'acides aminés présentant 80 % ou plus d'identité (par exemple, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec l'une quelconque de SEQ ID NO : 69 à 76 et 84 à 98. Ces polypeptides peuvent déclencher des anticorps (par exemple, lorsqu'ils sont administrés à un être humain) qui reconnaissent à la fois la protéine staphylococcique de type sauvage comprenant SEQ ID NO : 56 et la protéine staphylococcique de type sauvage comprenant SEQ ID NO : 57. Ainsi, la réponse immunitaire reconnaîtra les antigènes staphylococciques à la fois EsxA et EsxB.

De façon utile, ces polypeptides hybrides peuvent déclencher des anticorps (par exemple, lorsqu'ils sont administrés à un être humain) qui reconnaissent chacune des protéines staphylococciques de type sauvage (par exemple, comme il est montré dans le listage de séquences) représentées dans l'hybride, par exemple, qui reconnaissent à la fois EsxA de type sauvage et EsxB de type sauvage.

Dans un mode de réalisation préféré, l'antigène EsxAB est codé par l'acide nucléique de SEQ ID NO : 133 et/ou a la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 134.

Clf A L'antigène « ClfA » est annoté comme « facteur d'agglutination A ». Dans la souche NCTC 8325, clfA est SAOUHSC_00812 et a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 102 (GI : 88194572). Dans la souche Newman, il est nwmn_0756 (GI : 151220968).

Les antigènes clfA utiles peuvent déclencher un anticorps (par exemple, lorsqu'ils sont administrés à un être humain) qui reconnaît SEQ ID NO : 102 et/ou peuvent comprendre une séquence d'acides aminés : (a) présentant 50 % ou plus d'identité (par exemple, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou plus) avec SEQ ID NO : 102 ; et/ou (b) comprenant un fragment d'au moins « n » acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 102, où « n » vaut 7 ou plus (par exemple, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou plus) . Ces protéines clfA comprennent des variants de SEQ ID NO : 102. Les fragments préférés de (b) comprennent un épitope provenant de SEQ ID NO : 102. A d'autres fragments préférés, il manque un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité C-terminale et/ou un ou plusieurs acides aminés (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou plus) à partir de l'extrémité N-terminale de SEQ ID NO : 102 tout en conservant au moins un épitope de SEQ ID NO : 102. Les 368 acides aminés C-terminaux finaux de SEQ ID’NO : 102 peuvent être omis de façon utile. Les 39 premiers acides aminés N-terminaux de SEQ ID NO : 102 peuvent être omis de façon utile. D'autres fragments omettent un ou plusieurs domaines des protéines. SEQ ID NO : 103 est un fragment utile de SEQ ID NO : 102 ( 'ClfA40—559' ) . tç fragment omet la longue région répétitive vers l'extrémité C-terminale de SEQ ID NO : 102.

Dans un mode de réalisation préféré, l'antigène ClfA a la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 135.

OMV

Les OMV sont bien connues de l'état de l'art et sont libérées spontanément dans le milieu de culture par les bactéries. Les « OMV natives » (« NOMV » [18]), les microvésicules (MV [19] ) , les OMV extraites par un détergent (DOMV), les OMV dérivées d'un mutant (m-OMV), et les bourgeons, qui sont des protubérances sur la membrane externe qui demeurent fixées aux bactéries avant la libération sous forme de MV ([20] ; [21]), forment tous une partie de l'invention et sont qualifiés collectivement d'OMV dans la présente.

Les OMV de 1'invention peuvent être obtenues à partir de toute bactérie Gram négatif appropriée. La bactérie Gram négatif est généralement E. coli. Toutefois, à la place d'E. coli, ce peut être une bactérie Gram négatif différente. Les bactéries Gram négatif préférées pour une utilisation dont fait l'invention comprennent des bactéries qui ne sont pas pathogènes chez les êtres humains. Par exemple, les bactéries peuvent être commensales chez les êtres humains. Toutefois, dans certains modes de réalisation, il est utilisé des bactéries qui généralement ne sont pas trouvées du tout chez les hôtes humains.

Les exemples d'espèces pour une utilisation dont fait l'invention comprennent des espèces dans n'importe lequel des genres Escherichia, Shigella, Neisseria, Moraxella, Bordetella, Borrelia, Brucella, Chlamydia Haemophilus, Legionella, Pseudomonas, Yersinia, Helicobacter, Salmonella, Vibrio, etc. En particulier, la bactérie peut être une espèce de Shigella (comme S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii ou S.sonnei). En variante, elle peut être une espèce de Neisseria, particulièrement une espèce non w„pa_thogène comme N. bacilliformis, N. cinerea, N. elongata, N. flavescens, ' N. lactamica, N. macacae, N. mucosa, N. polysaccharea, N. sicca ou N. subflava, et en particulier N. lactamica. En variante, une espèce pathogène de Neisseria peut être utilisée, par exemple N. gonorrhoeae ou N. meningitidis. Dans d'autres exemples, la bactérie peut être Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella melitensis, Brucella ovis, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae (y compris des souches non typables), Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia enterocolitica, Helicobacter pylori, Salmonella enterica (y compris les sérovars typhi et typhimurium, ainsi que les sérovars paratyphi et enteritidis), Vibrio cholerae, Proteus, Citrobacter, Serratia, Erwinia, Pasteurelia etc. Des bactéries Gram négatif photosynthétiques peuvent être également utilisées. Généralement, la bactérie est une souche compétente. Ce caractère facilite la modification génétique de la bactérie.

Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie Gram négatif est une souche « hyperbourgeonnante » de cette bactérie. Des bactéries Gram négatif hyperbourgeonnantes à partir desquelles des bourgeons peuvent être fabriqués plus facilement en rendement supérieur et peuvent être plus homogènes en nature sont décrites dans le document WO 02/062378. Par exemple, les bourgeons peuvent être dérivés de bactéries choisies dans le groupe constitué de Neisseria meningitidis, Neisseria lactamica, Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Vibrio cholerae, Shigella spp., Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Pseudomonas aeruginosa et Moraxella catarrhalis.

La bactérie Gram négatif à partir de laquelle les OMV sont produites peut comprendre une ou plusieurs adaptation(s) pour la production de vésicules. En particulier, comparativement à la même bactérie sans ladite/lesdites adaptation (s), la bactérie comprend un génome dans lequel une ou plusieurs séquences non essentielles à la production des vésicules sont absentes. Les séquences absentes peuvent être totalement absentes du génome, ou elles peuvent être partiellement délétées si bien qu'elles sont sous une forme inactivée. En plus de l'absence d'une ou de plusieurs séquences, une ou plusieurs autres séquences qui ne sont pas essentielles à la production des vésicules peuvent être inactivées par insertion de séquence. L'absence de séquences signifie que, comparativement à la même bactérie sans lesdites séquences absentes, c'est-à-dire, comparativement à la même bactérie avec les séquences), la bactérie comprend généralement un génome de taille réduite. Généralement, le génome est entre 1 % et 50 % plus petit (en nombre total de paires de bases) comparativement à la même bactérie sans les séquences absentes. En particulier, le génome peut être entre 5 % et 50 %, entre 5 % et 40 %, entre 5 % et 30 %, entre 5 % et 20 %, entre 10 % et 30 % ou entre 10 % et 20 % plus petit. Lorsque la bactérie est une bactérie Gram négatif quelconque, il est utile que le gène de l'ARNr 16S soit présent dans le génome parce que les différences dans la séquence de ce gène peuvent être utilisées pour distinguer différentes espèces de bactéries. Il peut être également utile qu'un ou plusieurs gènes qui rendent la bactérie compétente soient présents. Ce caractère facilite la modification génétique de la bactérie. Séquences non essentielles à la production des vésicules

La catégorie des séquences non essentielles à la production des vésicules peut comprendre des gènes pour des processus métaboliques qui ne sont pas nécessaires à la production des vésicules. Par exemple, des gènes pour la biosynthèse de nutriments peuvent être absents lorsque ces nutriments peuvent être fournis de façon artificielle, par exemple, dans des conditions de culture. Par conséquent, la bactérie peut être auxotrophe pour un ou plusieurs nutriments. L'homme du métier connaît le (s) gène (s) qui peut/ peuvent être absent (s) pour produire une auxotrophie donnée. Par exemple, la bactérie peut être auxotrophe pour un ou plusieurs des acides aminés suivants, particulièrement lorsque la bactérie est E. coli (par exemple, en délétant les gènes indiqués) : arginine (argA) ; asparagine (à la fois asnA et asnB) ; acide aspartique (aspC et tyrB) ; cystéine (cysE) ; acide glutamique (à la fois gltB et gdhA) ; glutamine (glnA) ; glycine (glyA) ; histidine (hisB) ; isoleucine (ilvA) ; leucine (leuB) ; lysine (lysA) ; méthionine (metA) ; phénylalanine (pheA) ; proline (proA) ; sérine (serA) ; thréonine (thrC) ; tryptophane (trpC) ; tyrosine (tyrA) ; et valine, isoleucine et leucine (ilvD). Toutefois, dans certains modes de réalisation, la bactérie ne présente pas d'auxotrophie comparativement à la même bactérie sans les séquences absentes. En particulier, la bactérie est capable de se développer sur des milieux minimaux. D'autres processus métaboliques qui ne sont pas requis pour la production des vésicules peuvent comprendre les voies de transport. Par conséquent, les gènes pour des composants de ces voies de transport peuvent être absents. Par exemple, il peut manquer à la bactérie les gènes pour les transporteurs ABC et/ou des composants des systèmes de sécrétion de type I, II, III, IV, V et/ou VI.

La catégorie des séquences non essentielles à la production des vésicules peut également comprendre d'autres séquences. Par exemple, il est préférable que les séquences qui donnent naissance à une instabilité génétique soient absentes, par exemple les éléments transposables, y compris les rétrotransposons, les transposons d'ADN et les séquences d'insertion ; les introns de bactériophages et du groupe II. Par exemple, jusqu'à 50 % du plasmide de virulence de Shigella est constitué d'éléments de séquences d'insertion ; lorsque la bactérie est une espèce de Shigella, ces séquences d'insertion sont de préférence absentes. Les gènes qui codent pour les gènes des systèmes de modifications des restrictions peuvent être également absents (par exemple, les régions hsd dans E. coli), comme le peuvent des gènes codant pour d'autres nucléases endogènes qui détruisent 1'ADN étranger. Ces gènes ne sont pas essentiels à la croissance bactérienne dans des environnements de culture contrôlés, c'est-à-dire les conditions typiques de GM P durant la croissance pour la fabrication de vaccins. Toutefois, il peut être utile de conserver au moins un système de modification de restriction de telle façon que le génome peut être transformé en une cellule hôte déficiente en restriction (voir ci-dessous). Les gènes codant pour des composants du flagelle bactérien peuvent être également absents parce que ceux-ci ne sont pas essentiels. Les éléments Rhs peuvent être également absents. Ceux-ci sont de grandes régions répétées homologues qui facilitent le réarrangement du génome par l'intermédiaire d'une recombinaison homologue et elles peuvent donc mener à une instabilité génomique. Les régions non transcrites peuvent être aussi généralement absentes parce qu'elles ne sont pas nécessaires à la croissance bactérienne. De façon similaire, les prophages et/ou les pseudogènes peuvent être absents, comme le peuvent les gènes des récepteurs des bactériophages.

Des procédés pour identifier les séquences non essentielles sont bien connus de l'état de l'art, par exemple, d'après les références [22] et [23] . Par exemple, un procédé pour identifier les séquences qui ne sont pas essentielles à la croissance consiste à comparer les génomes de deux souches ou plus de la bactérie et à identifier les séquences qui ne sont pas présentes dans la totalité des souches. Ces séquences sont moins susceptibles d'être nécessaires à la croissance bactérienne et sont donc des candidates pour une absence dans l'invention. Toutefois, il est possible qu'une séquence soit essentielle à la croissance d'une souche mais pas d'une autre. Si une séquence est essentielle dans la souche particulière utilisée dans l'invention, alors la séquence devra être présente dans le génome ou remplacée par une autre séquence possédant une fonction complémentaire pour permettre la croissance de la souche. Pour confirmer qu'une séquence n'est pas essentielle à la production des vésicules, la séquence peut être délétée d'une souche productrice de vésicules et l'effet sur la production des vésicules est déterminé. Encore une fois, il est possible qu'une séquence soit essentielle à la production des vésicules dans une souche mais pas dans une autre. Si une séquence est essentielle à la production des vésicules dans au moins une souche, alors elle est de préférence présente dans le génome de l'invention.

La catégorie des séquences non essentielles à la production des vésicules peut également comprendre des séquences qui provoquent la réactogénicité des vésicules, par exemple, des gènes codant pour des composants associés à la membrane qui induisent des réponses immunogènes indésirables et/ou une toxicité. Par exemple, il est préférable que les gènes impliqués dans la production d'endotoxine, par exemple, le lipopolysaccharide (LPS) ou le lipooligosaccharide (LOS), soient absents. Par exemple, dans E. coli, il est préférable que les gènes msbB et pagA soient absents, si bien que la bactérie exprime un lipopolysaccharide détoxifié (LPS penta-acylé). Ceci peut être obtenu en utilisant une procédure d'échange allélique assisté par les recombinases Red portées dans pKD46 [24 ; 25] . pKD3 peut être utilisé comme matrice pour la PCR pour générer des allèles mutés contenant la cassette du chloramphénicol. Ensuite, pCP20 peut être utilisé pour exciser la cassette du chloramphénicol à partir de l'ADN chromosomique du mutant [25]. Afin de provoquer une délétion interne à partir de l'ORF de msb et l'ORF de pagP, des amorces peuvent être conçues pour porter une séquence d'extension homologue et la séquence d'hybridation pour la matrice pKD3 [2 6] . Pour déterminer si une séquence provoque la réactogénicité des vésicules, et par conséquent pour identifier une séquence qui peut être absente dans l'invention, la séquence peut être délétée d'une souche productrice de vésicules et l'effet sur la réactogénicité des vésicules est déterminé. La réactogénicité est généralement déterminée en utilisant des modèles in vitro ou animaux, par exemple, en mesurant la pyrogénicité chez des lapins, la production de cytokines proinflammatoires par les cellules monocytaires humaines, et/ou le degré d'inflammation au niveau du site d'injection chez des souris et des lapins (voir, par exemple, la référence 27) .

La catégorie des séquences non essentielles à la production des vésicules peut également comprendre des séquences qui suppriment la production des vésicules, particulièrement des gènes qui suppriment la libération des bourgeons. Ces gènes sont souvent impliqués dans le maintien de l'intégrité de la membrane externe de la bactérie. Par exemple, de nombreuses bactéries Gram- négatif possèdent un système Tol-Pal qui est constitué des protéines TolA, TolB, TolQ, TolR et Pal. L'absence d'un ou · de plusieurs gènes pour un ou plusieurs composants de ce système peut provoquer la libération par la bactérie de quantités supérieures de bourgeons dans son milieu de culture durant la réplication bactérienne. Par exemple, au moins l'un des cinq gènes de Tol-Pal peut être absent. Ainsi, il peut manquer à la bactérie 1, 2, 3, 4 ou les 5 des gènes tolA, tolB, tolQ, tolR et Pal. De préférence, le gène tolR est absent, particulièrement dans E. coli. Ainsi, la bactérie peut être tolA+ tolB+ tolQ+ TolR~ Pal +. La bactérie peut également libérer des quantités supérieures de bourgeons s'il lui manque la protéine OmpA. Par conséquent, il est également préférable que le gène ompA soit absent du génome de la bactérie, particulièrement dans E. coli. Pour déterminer si une séquence supprime la production des vésicules, et par conséquent pour identifier une séquence qui peut être absente dans l'invention, la séquence peut être délétée d'une souche productrice de vésicules et l'effet sur la production des vésicules est déterminé.

Dans un mode de réalisation spécifique, la bactérie est un mutant ompA d'E. coli et/ou un mutant tolR d'E. coli. Dans certains modes de réalisation, la bactérie est choisie parmi E. coli BL21(DE3)AompA, E. coli BL21(DE3)AompAAtolR, E. coli BL21 (DE3) AtolR, E. coli Δηΐρΐ, ou E. coli AdegP. Le symbole Δ est utilisé dans la présente pour se rapporter à une souche bactérienne à partir de laquelle la séquence codante du gène cité après le symbole Δ a été délétée. Ainsi, une souche bactérienne qui est « AompA » ne comprend pas la séquence codante pour le gène ompA. De la même façon, une souche bactérienne qui est « AtolR » ne comprend pas la séquence codante pour le gène tolR. La séquence codante entière peut être délétée. Toutefois, la séquence codante peut, en variante, être délétée en partie. Par exemple, la moitié N-terminale ou la moitié C-terminale peut être délétée. En variante, les gènes ompA et/ou tolR peuvent être mutés par l'introduction d'une ou de plusieurs substitutions et/ou insertions.

Les souches mutantes d'E. coli AtolR et les souches mutantes d'E. coli AompA surproduisent des OMV par rapport à E. coli de type sauvage. Ainsi, la mutation du gène ompA et/ou d'un ou de plusieurs composants du complexe Tol-Pal se traduit par la bactérie mutante produisant un nombre accru d'OMV comparativement à sa souche respective de type sauvage qui porte un gène ompA et/ou un complexe Tol-Pal de type sauvage. OmpA est une protéine intégrale de la membrane et elle est la plus abondante des protéines de la membrane externe dans E. coli. Par conséquent, il est surprenant qu'un E. coli auquel il manque la protéine OmpA soit viable. En effet, selon Murakami et al. [28], un mutant simple ompA d 'E. coli ne peut pas favoriser la libération des vésicules.

La catégorie des séquences non essentielles à la production des vésicules peut également comprendre des gènes pour des protéines qui ne sont pas requises dans les vésicules, selon leur utilisation prévue. Par exemple, des gènes pour des antigènes indésirables peuvent être éliminés, par exemple des gènes pour des protéines contre lesquelles il n'est pas souhaité d'induire une réponse immunitaire (comme des antigènes non protecteurs, particulièrement des antigènes immunodominants). Les protéines qui ne sont pas requises dans les vésicules peuvent être identifiées en préparant des vésicules à partir d'une bactérie comprenant un génome qui comprend encore les gènes (non encore identifiés) pour ces protéines, et en analysant la teneur en protéines de ces vésicules en utilisant la protéomique basée sur la spectrométrie de masse à haut débit, comme il est décrit ci-dessous. Une fois que les protéines ont été identifiées, les gènes correspondants peuvent être omis du génome de la bactérie de l'invention et par conséquent absents.

De préférence, la catégorie des séquences non essentielles à la production des vésicules ne comprend pas des séquences qui permettent aux vésicules de posséder des propriétés d'adjuvant. Par exemple, il est utile qu'une ou plusieurs séquences qui codent pour des ligands du TLR-2, par exemple des lipoprotéines, soient présentes dans le génome. De façon similaire, il est utile qu'une ou plusieurs séquences qui codent pour des ligands du TLR-4, par exemple des composants du LPS, soient présentes dans le génome. De telles séquences sont utiles parce qu'elles contribuent à l'efficacité des vésicules en tant qu'immunogènes, par exemple, pour une utilisation en tant que vaccins. Pour identifier de telles séquences, la séquence peut être délétée d'une souche productrice de vésicules et l'effet sur 1'adjuvanticité des vésicules est déterminé. L'adjuvanticité est généralement déterminée en comparant la réponse immunitaire à un antigène en présence ou en l'absence de l'adjuvant putatif, par exemple, en mesurant le titre en anticorps dirigés contre 1'antigène.

La bactérie contient de préférence d'autres adaptations pour la production de vésicules. En particulier, la bactérie comprend généralement un génome dans lequel une ou plusieurs séquences sont présentes de telle façon que, comparativement à la même bactérie sans ladite/lesdites séquence(s), la bactérie produit des quantités supérieures de vésicules. Une fois encore, les séquences qui augmentent la production des vésicules peuvent être identifiées en ajoutant ou en délétant la séquence à une souche productrice de vésicules et en déterminant l'effet sur la production des vésicules.

Procédé de fabrication du génome

Les procédés pour produire des génomes bactériens de taille réduite par rapport au génome de type sauvage sont connus de l'état de l'art. Par exemple, la référence 29 décrit diverses approches « descendantes » qui impliquent la délétion des séquences indésirables (décrit dans, par exemple, les références 22 et 23) et des approches « ascendantes » qui impliquent la synthèse du génome de novo, sans les séquences indésirables (décrit dans, par exemple, les références 30 et 31) .

Par conséquent, un procédé de fabrication d'un génome pour une utilisation dans une bactérie pour produire des OMV comprend les étapes suivantes : (a) la fourniture d'un génome provenant d'une bactérie Gram négatif ; et (b) la délétion d'une ou de plusieurs séquences non essentielles à la production des vésicules de telle façon que, comparativement au génome dans l'étape (a), le génome est de taille réduite. Le procédé comprend en outre une étape (c) d'insertion dans le génome d'une ou de plusieurs séquences qui codent pour une protéine choisie dans le groupe constitué de (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa. Les étapes (b) et (c) peuvent être réalisées dans cet ordre ou dans l'ordre (c) puis (b), à condition que la/les séquence (s) insérée(s) dans l'étape (c) demeure(nt) après l'étape (b).

Un autre procédé de fabrication d'un génome pour une utilisation dans une bactérie pour la production d'OMV implique des techniques de génomique synthétique. Ces techniques permettent de préparer des génomes synthétiques par synthèse chimique au moins en partie, par exemple, comme il est divulgué dans la référence 31. Le procédé de synthèse peut impliquer la division théorique de la séquence d'ADN souhaitée du génome en fragments. Ces fragments peuvent à nouveau être divisés de façon théorique en une ou plusieurs fois, parvenant éventuellement à un ensemble de fragments qui sont chacun d'une taille qui peut être préparée par un procédé de synthèse d'ADN choisi, par exemple, par la chimie des phosphoramidites. Ces fragments sont ensuite synthétisés et joints pour donner les fragments plus longs à partir du stade de division théorique, et ces fragments plus longs sont ensuite joints, etc. jusqu'à la préparation éventuelle de la séquence complète. De cette façon, la référence 31 a préparé un génome de 583 kpb par assemblage de ~104 oligonucléotides 50-mer dans divers stades. Les 50-mers ont été assemblés en cassettes d'une longueur de 5 à 7 kb, et ces cassettes ont été ensuite assemblées en fragments de ~24 kpb, qui ont été ensuite 'assemblés en fragments de ~72 kpb, puis de ~144 kpb, donnant ensuite deux constructions de ~290 kpb, qui ont été finalement jointes pour donner le génome complet. Les fragments sont conçus pour se chevaucher, permettant de cette façon de les assembler dans l'ordre correct. Par exemple, les cassettes se sont chevauchées d'au moins 80 pb, permettant de cette façon leur assemblage en fragments de ~24 kpb, etc. Ainsi, le procédé implique la synthèse d'une pluralité de fragments se chevauchant de la molécule d'ADN souhaitée, de telle façon que les fragments se chevauchant couvrent la molécule d'ADN complète. Les deux extrémités de chaque fragment se chevauchent avec un fragment 5’ ou 3' voisin, à l'exception des fragments terminaux d'une molécule linéaire où aucun chevauchement n'est requis (mais pour synthétiser une molécule circulaire, les deux fragments terminaux devront se chevaucher). Les fragments à chaque stade peuvent être maintenus sous la forme d'inserts dans des vecteurs, par exemple, dans des plasmides ou des vecteurs BAC ou YAC. L'assemblage des fragments durant le procédé de synthèse peut impliquer une recombinaison in vitro et/ou in vivo. Pour les procédés in vitro, la digestion avec une exonucléase 3' peut être utilisée pour exposer les extrémités protubérantes d'un fragment, et les extrémités protubérantes complémentaires dans les fragments se chevauchant peuvent être ensuite hybridés, ceci suivi de la réparation des jonctions (méthode de « chew-back assembly »). Pour les procédés in vivo, les clones se chevauchant peuvent être assemblés en utilisant, par exemple, le procédé de clonage TAR divulgué dans la référence 31. Lorsqu'il est préparé par ces procédés, un génome de l'invention peut comprendre une ou plusieurs séquences en « filigrane ». Ce sont des séquences qui peuvent être utilisées pour identifier ou coder des informations dans le génome. Il peut s'agir de séquences soit non codantes soit codantes. Le plus couramment, elles codent des informations au sein des séquences codantes sans modifier les séquences d'acides aminés.

Une fois que le génome a été produit, il peut être introduit dans une cellule hôte par transformation selon le procédé de la référence 32. Dans un procédé, une cellule hôte déficiente en restriction est transformée avec un génome qui code pour un système de restriction qui est exprimé dans la cellule hôte dégradant le génome de la cellule hôte. Le génome adapté peut comprendre une ou plusieurs séquences qui ne sont pas intégrées dans le chromosome bactérien. Cette/ces séquence(s) est/sont présente (s) dans un ou plusieurs éléments génomiques non intégrés, par exemple un ou plusieurs plasmides. Dans ces modes de réalisation, la transformation peut comprendre des sous-étapes, par exemple la transformation de la cellule hôte avec le chromosome bactérien et la transformation de la cellule hôte avec l'élément ou les éléments génomiques non intégrés. Ces sous-étapes peuvent être réalisées dans n'importe quel ordre, bien que généralement la cellule hôte soit transformée avec le chromosome bactérien avant toute(s) autre(s) transformation(s) avec un ou plusieurs éléments génomiques non intégrés.

Procédés de production d'OMV

Les OMV peuvent être préparées à partir d'une bactérie comme il a été décrit ci-dessus. Le procédé comprend une étape d'obtention des vésicules à partir d'une culture de la bactérie. Les vésicules peuvent être obtenues par rupture de ou bourgeonnement à partir de la membrane externe de la bactérie pour former des vésicules à partir de là.

Les OMV sont préparées artificiellement à partir de bactéries, et elles peuvent être préparées en utilisant un traitement par détergent (par exemple, avec du désoxycholate ou du sarkosyl), ou par un moyen non détergent (par exemple, voir la référence 33). Les techniques pour former des OMV comprennent le traitement des bactéries avec un détergent à base de sel d'acide biliaire (par exemple, des sels de l’acide lithocholique, l'acide chénodésoxyçholique, l'acide ursodésoxycholique, l'acide désoxycholique, l'acide cholique, l'acide ursocholique, etc., avec le désoxycholate de sodium [34 et 35] étant préféré pour le traitement de Neisseria) à un pH suffisamment élevé pour ne pas précipiter le détergent [36]. D'autres techniques peuvent être réalisées substantiellement en l'absence de détergent [33] en utilisant des techniques comme la sonication, l'homogénéisation, la microfluidisation, la cavitation, le choc osmotique, le broyage, la presse de French, le mélange, etc. Les procédés utilisant peu ou pas de détergent peuvent retenir des antigènes utiles tels que NspA [33]. Ainsi, un procédé peut utiliser un tampon d'extraction des OMV avec environ 0,5 % de désoxycholate ou moins, par exemple, environ 0,2 %, environ 0,1 %, < 0,05 % ou zéro.

Un procédé utile pour la préparation d'OMV est décrit dans la référence 37 et implique l'ultrafiltration sur des OMV brutes, plutôt qu'une centrifugation à haute vitesse. Le procédé peut impliquer une étape d'ultracentrifugation après que l'ultrafiltration prenne place.

Antigènes dans les OMV

La combinaison d'antigènes choisis dans le groupe constitué de (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa peut être présente dans une seule OMV ou dans des OMV distinctes multiples. Les antigènes peuvent être ciblés sur et exprimés dans le périplasme de la bactérie Gram négatif de telle façon que l'antigène soit dans la lumière de l'OMV. Dans certains modes de réalisation, l'antigène est présent dans la membrane de l'OMV, c'est-à-dire que seulement une partie de l'antigène est présent dans la lumière de l'OMV. Dans certains modes de réalisation, l'antigène est libre dans la lumière de l'OMV.

Le terme « dans la lumière » de l'OMV englobe à la fois des protéines qui sont associées à la membrane mais pas exposées à la surface, et des protéines qui sont libres dans la lumière de l'OMV. L'antigène est généralement libre dans la lumière de l'OMV dans la présente invention. Par « libre dans la lumière », cela signifie que l'antigène n'est pas associé intégralement à la membrane de l'OMV. Une association intégrale à la membrane décrit ces protéines qui nécessitent l'utilisation d'un détergent ou d'un autre solvant apolaire pour dissocier la protéine de la membrane. Une description des ancres membranaires pour une association intégrale à la membrane peut être trouvée dans la référence 38. Une protéine qui est libre dans la lumière de l'OMV peut être associée à la membrane ou à une protéine intégrale de la membrane par des interactions non covalentes ou elle peut ne pas s'associer du tout à la membrane de l'OMV. Par exemple, la protéine peut s'associer de façon lâche ou temporaire à la membrane, par exemple, par l'intermédiaire d'interactions hydrophobes, électrostatiques, ioniques et/ou autres non covalentes avec la bicouche lipidique et/ou à une protéine intégrale.

Un avantage de l'antigène étant dans la lumière de l'OMV, plutôt qu'étant associé à la membrane et exposé, est qu'il peut être protégé contre la dégradation par les protéases in vivo. Cette protection peut à son tour entraîner une activation plus efficace des lymphocytes B. L'OMV est capable de déclencher une réponse immunitaire contre l'antigène lorsqu'elle est administrée à un mammifère. La réponse immunitaire peut être une réponse immunitaire cellulaire ou humorale. Généralement, la réponse immunitaire est une réponse en anticorps.

Dans un mode de réalisation, l'OMV de l'invention est capable de déclencher une réponse immunitaire contre l'agent pathogène à partir duquel l'antigène est dérivé, c'est-à-dire, S. aureus. Par exemple, l'antigène déclenche de préférence une réponse immunitaire des lymphocytes T qui peuvent neutraliser l'infection et/ou la virulence de l'agent pathogène à partir duquel l'antigène est dérivé, c'est-à-dire, S. aureus. Les antigènes préférés pour une utilisation dont fait l'invention sont donc ceux qui sont reconnus par le système immunitaire cellulaire lors d'une infection avec un agent pathogène d'intérêt. Sont davantage préférés, ces antigènes qui déclenchent une réponse immunitaire protectrice des lymphocytes T contre un agent pathogène d'intérêt.

Dans un mode de réalisation, l'OMV de l'invention est capable de déclencher des anticorps qui reconnaissent un agent pathogène à partir duquel l'antigène est dérivé, c'est-à-dire, S. aureus. Par exemple, l'antigène déclenche de préférence des anticorps qui peuvent se lier à, et de préférence neutralisent l'infection et/ou la virulence de l'agent pathogène à partir duquel l'antigène est dérivé, c'est-à-dire, S. aureus. Les antigènes préférés pour une utilisation dont fait l'invention sont donc ceux qui sont reconnus par des antisérums lors d'une infection avec l'agent pathogène. Sont davantage préférés, ces antigènes qui déclenchent une réponse immunitaire protectrice contre un agent pathogène d'intérêt. L'antigène peut présenter une immunogénicité accrue lorsqu'il est présenté dans l'OMV comparativement à lorsqu'il est administré sous forme purifiée.

Dans un mode de réalisation, les antigènes de l'invention sont fonctionnellement actifs dans la lumière de l'OMV et/ou lors de la libération à partir de la lumière de l'OMV (par exemple, par une rupture médiée par un détergent de l'OMV). L'activité fonctionnelle est un indicateur que l'antigène est replié correctement et a la même ou substantiellement la même structure tertiaire et quaternaire que la même protéine dans son état natif. Par « fonctionnellement actif », cela signifie que l'antigène conserve au moins 50 % ou plus d'au moins une activité biologique de la même protéine lorsqu'il est exprimé dans son environnement natif (par exemple, dans l'organisme à partir duquel il est dérivé). Par exemple, l'antigène peut être considéré comme fonctionnellement actif s'il conserve au moins 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou plus d'au moins une activité biologique de la même protéine lorsqu'il est exprimé dans son environnement natif.

Dans des modes de réalisation dans lesquels l'antigène comprend ou est constitué d'un fragment d'une protéine de type sauvage ou de l'un de ses variants, le fragment ou le variant peut être fonctionnellement actif. Par « fragment d'une protéine de type sauvage », cela signifie que l'antigène comprend ou est constitué d'au moins 7 acides aminés consécutifs provenant de la protéine de type sauvage. Dans certains modes de réalisation, le fragment est constitué d'au moins 7, 8, 9, 10, 20, 30, 4 0 acides aminés ou plus provenant de la protéine de type sauvage. Le fragment peut être constitué d'au moins 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % de la protéine de type sauvage.

De préférence, le fragment est un fragment immunogène de l'antigène. Par « fragment immunogène », cela signifie que le fragment a au moins un épitope en commun avec l'antigène. Le terme « épitope » englobe toutes sortes d'épitopes et comprend des épitopes à la fois des lymphocytes B et des lymphocytes T, et des épitopes à la fois linéaires et discontinus. Dans un mode de réalisation, un anticorps qui se lie spécifiquement à l'antigène se lie aussi spécifiquement au fragment immunogène, c'est-à-dire que l'antigène et son fragment immunogène contiennent tous les deux l'épitope auquel cet anticorps se lie.

Par « se lie spécifiquement », cela signifie que les anticorps se lient à l'antigène de l'invention avec une affinité substantiellement supérieure à la BSA. De préférence, l'affinité est au moins 100 fois, 103 fois, 104 fois, 105 fois, 106 fois, etc. supérieure pour l'antigène de l'invention que pour la BSA.

Les épitopes présents dans les antigènes peuvent être déterminés et/ou prédits en utilisant tous les procédés connus de l'état de l'art. Par exemple, le logiciel de prédiction d'épitopes comme EpiToolKit, qui est un serveur Internet pour 1'immunomique informatique [39]. Ce logiciel de prédiction d'épitopes fournit plusieurs procédés pour prédire des épitopes potentiels de lymphocytes T, des épitopes de liaison à la fois du CMH de classe I et du CMH de classe II.

La présence d'épitopes des lymphocytes B peut être également prédite en utilisant tous les procédés connus de l'état de l'art, par exemple, tels que décrits dans les références [40, 41 et 42] . La présence d'épitopes linéaires continus et/ou d'épitopes discontinus peut être prédite en utilisant les procédés décrits dedans.

Par « variant d'une protéine de type sauvage », cela signifie que l'antigène comprend ou est constitué d'une protéine pleine longueur, par exemple, une protéine avec le même nombre d'acides aminés que la protéine de type sauvage, ou un fragment de la protéine de type sauvage qui contient une ou plusieurs variations dans la séquence d'acides aminés comparativement à la séquence de type sauvage. Un variant peut présenter au moins 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou plus d'identité de séquence avec la protéine de type sauvage. Dans certains modes de réalisation, le variant est également fonctionnellement actif. L'antigène peut être fusionné à un partenaire de fusion, c'est-à-dire que l'antigène peut faire partie d'une protéine de fusion. Les protéines de fusion peuvent comprendre une séquence -X-Y- ou -Y-X-, dans laquelle : -X- est un antigène tel que défini ci-dessus, et -Y- est une séquence polypeptidique supplémentaire. Dans un mode de réalisation particulier, -Y- est un marqueur protéinique qui aide à la détection de l'antigène comme 6xHIS, FLAG, HA, GST, GFP ou une autre protéine fluorescente, et/ou la luciférase ou n'importe quel polypeptide approprié qui aide à la fonction de l'antigène. Lorsque l'antigène fait partie d'une protéine de fusion, la protéine de fusion entière sera dans la lumière de l'OMV. Dans certains modes de réalisation, la protéine de fusion sera libre dans la lumière de l'OMV.

Compositions pharmaceutiques L'invention propose une composition pharmaceutique comprenant (a) au moins deux des antigènes choisis dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa et (b) un support pharmaceutiquement acceptable. L'invention propose également une composition pharmaceutique comprenant (a) au moins une OMV comprenant au moins l'un des antigènes choisis dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB et (b) un support pharmaceutiquement acceptable. Généralement, la composition pharmaceutique comprend une OMV qui comprend au moins deux antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou plus généralement au moins trois antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou plus généralement au moins quatre des antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, ou plus généralement les quatre antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa, ou plus généralement les quatre des antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) esxAB et (iv) staOll. L'invention propose également une composition pharmaceutique comprenant (a) au moins deux OMV différentes, où chaque OMV comprend au moins l'un des antigènes choisis dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB dans sa lumière et (b) un support pharmaceutiquement acceptable.

La composition pharmaceutique peut comprendre au moins une OMV qui comprend au moins deux antigènes de S. aureus choisis dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, c'est-à-dire qu'une combinaison d'antigènes est fournie au sein de la même OMV. En variante, la composition pharmaceutique peut comprendre de multiples OMV différentes qui comprennent au moins un antigène de S. aureus choisi dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, c'est-à-dire qu'une combinaison d'antigènes est fournie dans des OMV distinctes. La composition pharmaceutique peut comprendre (a) au moins une OMV de l'invention et (b) un support pharmaceutiquement acceptable. La composition pharmaceutique peut comprendre au moins deux, au moins trois ou au moins quatre OMV de l'invention. L'invention propose également un procédé de préparation d'une telle composition, comprenant l'étape de mélange des OMV de l'invention avec un support pharmaceutiquement acceptable. L'invention propose également un récipient (par exemple, un flacon) ou un dispositif d'administration (par exemple, une seringue) prérempli avec une composition pharmaceutique de l'invention. L'invention propose également un procédé de fourniture d'un tel récipient ou dispositif, comprenant l'introduction dans le récipient ou le dispositif d'une composition contenant des vésicules de l'invention.

La composition immunogène peut comprendre un support pharmaceutiquement acceptable, qui peut être toute substance qui n'induit pas elle-même la production d'anticorps nocifs pour le patient recevant la composition, et qui peut être administrée sans toxicité excessive. Les supports pharmaceutiquement acceptables peuvent comprendre des liquides comme l'eau, le sérum physiologique, le glycérol et l'éthanol. Des substances auxiliaires, comme des agents de mouillage ou d'émulsification, des substances tampons de pH, et analogues, peuvent être également présentes dans de tels véhicules. Une discussion complète portant sur les supports appropriés est disponible dans la référence 43.

Les bactéries peuvent affecter diverses zones du corps et ainsi les compositions de l'invention peuvent être préparées sous des formes variées. Par exemple, les compositions peuvent être préparées sous la forme d'un injectable, soit sous la forme de solutions liquides soit sous la forme de suspensions. Des formes solides appropriées pour une solution, ou une suspension, dans des véhicules liquides avant l'injection peuvent être également préparées. La composition peut être préparée pour une administration topique, par exemple, sous la forme d'une pommade, d'une crème ou d'une poudre. La composition peut être préparée pour une administration orale, par exemple, sous la forme d'un comprimé ou d'une capsule, ou sous la forme d'un sirop (éventuellement aromatisé). La composition peut être préparée pour une administration pulmonaire, par exemple, sous la forme d'un inhalateur, en utilisant une poudre fine ou une pulvérisation. La composition peut être préparée sous la forme d'un suppositoire ou d'un ovule. La composition peut être préparée pour une administration nasale, auriculaire ou oculaire, par exemple, sous la forme de gouttes.

Un support pharmaceutique peut comprendre un agent protecteur contre la température, et ce composant peut être particulièrement utile dans les compositions adjuvées (particulièrement celles contenant un adjuvant minéral, comme un sel d'aluminium). Comme il est décrit dans la référence 44, un agent protecteur contre la température liquide peut être ajouté à une composition vaccinale aqueuse pour abaisser son point de congélation, par exemple, pour réduire le point de congélation en-dessous de 0 °C. Ainsi, la composition peut être stockée en-dessous de 0 °C, mais au-dessus de son point de congélation, pour inhiber la dégradation thermique. L'agent protecteur contre- la température permet également de congeler la composition tout en protégeant les adjuvants à base de sels minéraux contre l'agglomération ou la sédimentation après la congélation et la décongélation, et il peut également protéger la composition à des températures élevées, par exemple, au-dessus de 40 °C. Un vaccin aqueux de départ et l'agent protecteur contre la température liquide peuvent être mélangé de telle façon que l'agent protecteur contre la température liquide forme de 1 à 80 % en volume du mélange final. Les agents protecteurs contre la température appropriés devront être sans risque pour une administration à un être humain, facilement miscibles/solubles dans l'eau, et ils ne devront pas endommager les autres composants (par exemple, l'antigène et l'adjuvant) dans la composition. Les exemples comprennent la glycérine, le propylène glycol, et/ou le polyéthylène glycol (PEG). Les PEG appropriés peuvent avoir un poids moléculaire moyen situé dans la plage de 200 à 20 000 Da. Dans un mode de réalisation préféré, le polyéthylène glycol peut avoir un poids moléculaire moyen d'environ 300 Da (« PEG-300 »).

La composition est de préférence stérile. Elle est de préférence apyrogène. Elle est de préférence tamponnée, par exemple, entre pH 6 et pH 8, généralement autour de pH 7. Les compositions de l'invention peuvent être isotoniques par rapport aux êtres humains.

Les compositions immunogènes comprennent une quantité immunologiquement efficace d'antigène ou de vésicules immunogènes, ainsi que de tout autre des autres composants spécifiés, selon les besoins. Par « quantité immunologiquement efficace », cela signifie que l'administration de cette quantité à un individu, soit dans une dose unique soit faisant partie d'une série, est efficace pour le traitement ou la prévention. Cette quantité varie selon la condition de santé et physique de l'individu à traiter, l'âge, le groupe taxonomique de l'individu à traiter (par exemple, un primate non humain, un primate, etc.), la capacité du système immunitaire de l'individu à synthétiser des anticorps, le degré de protection souhaité, la formulation du vaccin, l'estimation du médecin traitant de la situation médicale, et d'autres facteurs pertinents. On s'attend à ce que la quantité se situe au sein d'une plage relativement large qui peut être déterminée par l'intermédiaire d'essais de routine.

Des travaux antérieurs avec des vaccins à base de vésicules (par exemple, pour le méningocoque) offrent des indications pharmaceutiques, posologiques et de formulation pour les compositions de l'invention. La concentration des vésicules dans les compositions de l'invention sera généralement entre 10 et 500 μg/ml, de préférence entre 25 et 200 μς/ηιΐ, et de manière davantage préférée environ 50 μ9/ιη1 ou environ 100 μ9/ιη1 (exprimée en termes de protéines totales dans les vésicules). Un volume de dosage de 0,5 ml est typique pour une injection.

La composition peut être administrée conjointement avec d'autres agents immunorégulateurs.

Les adjuvants qui peuvent être utilisés dans les compositions de l'invention comprennent, mais n'y sont pas limités : A. Compositions contenant des minéraux

Les compositions contenant des minéraux appropriés pour une utilisation en tant qu'adjuvants dans l'invention comprennent des sels minéraux, comme des sels d'aluminium et des sels de calcium. L'invention comprend des sels minéraux comme des hydroxydes (par exemple, des oxyhydroxydes), des phosphates (par exemple, des hydroxyphosphates, des orthophosphates), des sulfates, etc. [par exemple, voir les chapitres 8 & 9 de la référence 48], ou des mélanges de différents composés minéraux, avec les composés prenant toute forme appropriée (par exemple, gels, cristalline, amorphe, etc.), et avec l'adsorption étant préférée. Les compositions contenant des minéraux peuvent être également formulées sous la forme d'une particule de sel de métal.

Les adjuvants connus comme « 1'hydroxyde d'aluminium » sont généralement des sels d'oxyhydroxyde d'aluminium, qui sont habituellement au moins partiellement cristallins. L'oxyhydroxyde d'aluminium, qui peut être représenté par la formule AIO(OH), peut se distinguer d'autres composés d'aluminium, comme 1'hydroxyde d'aluminium Al(OH)3, par la spectroscopie infrarouge (IR), en particulier par la présence d'une bande d'adsorption à 1070 cm-1 et un fort épaulement à 3090 à 3100 cm-1 [chapitre 9 de la référence 48] . Le degré de cristallinité d'un adjuvant d'hydroxyde d'aluminium est reflété par la largeur de la bande de diffraction à mi-hauteur (WHH), avec les particules faiblement cristallines présentant un élargissement de ligne supérieur dû aux tailles plus petites des cristallites. La surface spécifique augmente lorsque la WHH augmente, et il a été observé que les adjuvants avec des valeurs de WHH supérieures présentent une capacité supérieure d'adsorption d'antigène. Une morphologie fibreuse (par exemple, comme il est observé sur les micrographies électroniques à transmission) est typique des adjuvants d'hydroxyde d'aluminium. Le pi des adjuvants d'hydroxyde d'aluminium est généralement d'environ 11, c'est-à-dire que l'adjuvant lui-même possède une charge de surface positive à pH physiologique. Des capacités d'adsorption entre 1,8 et 2,6 mg de protéine par mg de Al+++ à pH 7,4 ont été rapportées pour les adjuvants d'hydroxyde d'aluminium.

Les adjuvants connus comme le « phosphate d'aluminium » sont généralement des hydroxyphosphates d'aluminium, contenant souvent aussi une petite quantité de sulfate (c'est-à-dire, hydroxyphosphate sulfate d'aluminium). Ils peuvent être obtenus par précipitation, et les conditions réactionnelles et les concentrations durant la précipitation influencent le degré de substitution du phosphate à l'hydroxyle dans le sel. Les hydroxyphosphates présentent généralement un rapport molaire PO4/AI entre 0,3 et 1,2. Les hydroxyphosphates peuvent se distinguer du AIPO4 strict par la présence de groupes hydroxyle. Par exemple, une bande de spectre IR à 3164 cm-1 (par exemple, à 200 °C) indique la présence d'hydroxyles structuraux [chapitre 9 de la référence 48].

Le rapport molaire P04/A13+ d'un adjuvant de phosphate d'aluminium se situera généralement entre 0,3 et 1,2, de préférence entre 0,8 et 1,2, et de manière davantage préférée 0,95 ± 0,1. Le phosphate d'aluminium sera généralement amorphe, particulièrement pour les sels d1hydroxyphosphate. Un adjuvant type est 1'hydroxyphosphate d'aluminium amorphe avec un rapport molaire PCh/Al entre 0,84 et 0,92, y compris à 0,6 mg de Al3+/ml. Le phosphate d'aluminium sera généralement particulaire (par exemple, une morphologie de type plaque comme il est observé sur les micrographies électroniques à transmission). Les diamètres types des particules se situent dans la plage de 0,5 à 20 pm (par exemple, environ 5 à 10 μπι) après l'adsorption d'un antigène quelconque. Des capacités d'adsorption entre 0,7 et 1,5 mg de protéine par mg de Al+++ à pH 7,4 ont été rapportées pour les adjuvants de phosphate d'aluminium.

Le point de charge zéro (PZC) du phosphate d'aluminium est inversement proportionnel au degré de substitution du phosphate à l'hydroxyle, et ce degré de substitution peut varier selon les conditions réactionnelles et la concentration des réactifs utilisés pour préparer le sel par précipitation. Le PZC est également modifié en changeant la concentration des ions phosphate libres en solution (plus de phosphate = PZC plus acide) ou en ajoutant un tampon comme un tampon histidine (rend le PZC plus basique). Les phosphates d'aluminium utilisés selon l'invention auront généralement un PZC entre 4,0 et 7,0, de manière davantage préférée entre 5,0 et 6,5, par exemple environ 5,7 .

Les suspensions de sels d'aluminium utilisées pour préparer des compositions de l'invention peuvent contenir un tampon (par exemple, un tampon phosphate ou un tampon histidine ou un tampon Tris), mais celui-ci n'est pas toujours nécessaire. Les suspensions sont de préférence stériles et apyrogènes. Une suspension peut comprendre des ions phosphate aqueux libres, par exemple, présents à une concentration entre 1,0 et 20 mM, de préférence entre 5 et 15 mM, et de manière davantage préférée environ 10 mM. Les suspensions peuvent également comprendre du chlorure de sodium.

Dans un mode de réalisation, un composant adjuvant comprend un mélange à la fois d'un hydroxyde d'aluminium et d'un phosphate d'aluminium. Dans ce cas, il peut y avoir plus de phosphate d'aluminium que d'hydroxyde, par exemple, un rapport pondéral d'au moins 2/1, par exemple, ^ 5/1, ^ 6/1, ^ 7/1, ^ 8/1, ^ 9/1, etc.

La concentration de Al+++ dans une composition pour une administration à un patient est de préférence inférieure à 10 mg/ml, par exemple, ^ 5 mg/ml, ^ 4 mg/ml, ^ 3 mg/ml, ^ 2 mg/ml, ^ 1 mg/ml, etc. Une plage préférée est entre 0,3 et 1 mg/ml. Un maximum de < 0,85 mg/dose est préféré. B. Emulsions huileuses

Les compositions d'émulsions huileuses appropriées pour une utilisation en tant qu'adjuvants dans l'invention comprennent des émulsions squalène-eau, comme le MF59 [chapitre 10 de la référence 48 ; voir également la référence 45] (5 % de squalène, 0,5 % de Tween 80, et 0,5 % de Span 85, formulés dans des particules submicroniques en utilisant un microfluidiseur). De l'adjuvant complet de Freund (CFA) et de l'adjuvant incomplet de Freund (IFA) peuvent être également utilisés.

Diverses émulsions huile dans l'eau appropriées sont connues, et elles comprennent généralement au moins une huile et au moins un tensioactif, avec l'huile/les huiles et le(s) tensioactif (s) étant biodégradable (s) (métabolisable (s)) et biocompatible (s) . Les gouttelettes d'huile dans l'émulsion ont généralement un diamètre inférieur à 5 μπι, et de façon avantageuse l'émulsion comprend des gouttelettes d'huile avec un diamètre submicronique, avec ces petites tailles étant obtenues avec un microfluidiseur pour fournir des émulsions stables. Les gouttelettes avec une taille inférieure à 220 nm sont préférées car elles peuvent être soumises à une stérilisation par filtration. L'invention peut être utilisée avec des huiles telles que celles de source animale (comme de poissons) ou végétale. Les sources pour les huiles végétales comprennent des noix, des graines et des grains. L'huile d'arachide, l'huile de soja, l'huile de noix de coco, et l'huile d'olive, la plus couramment disponible, exemplifient les huiles de noix. L'huile de jojoba peut être utilisée, par exemple, obtenue à partir de la fève de jojoba. Les huiles de graines comprennent l'huile de carthame, l'huile de graines de coton, l'huile de graines de tournesol, l'huile de graines de sésame et analogues. Dans le groupe des grains, l'huile de maïs est la plus facilement disponible, mais l'huile d'autres grains de céréales comme le blé, l'avoine, le seigle, le riz, le teff, le triticale et analogues peut être également utilisée. Des esters d'acides gras à 6 à 10 carbones de glycérol et de 1,2-propanediol, tout en n'existant pas naturellement dans les huiles de graines, peuvent être préparés par hydrolyse, séparation et estérification des matériaux appropriés en démarrant à partir des huiles de noix et de graines. Les graisses et les huiles de laits de mammifères sont métabolisables et peuvent donc être utilisées dans la pratique de cette invention. Les procédures pour la séparation, la purification, la saponification et d'autres moyens nécessaires pour obtenir des huiles pures de sources animales sont bien connus de l'état de l'art. La plupart des poissons contiennent des huiles métabolisables qui peuvent être facilement récupérées. Par exemple, l'huile de foie de morue, les huiles de foie de requin, et l'huile de baleine comme le spermaceti exemplifient plusieurs des huiles de poissons qui peuvent être utilisées dans la présente. Un certain nombre d'huiles à chaîne ramifiée sont synthétisées par biochimie en unités d'isoprène à 5 carbones et elles sont généralement appelées terpénoïdes. L'huile de foie de requin contient un terpénoïde insaturé, ramifié connu sous le nom de squalène, 2,6,10,15,19,23-hexaméthyl-2,6,10,14,18,22-tétracosahexaène. D'autres huiles préférées sont les tocophérols (voir ci-dessous). Les émulsions huile dans l'eau comprenant du squalène sont particulièrement préférées. Des mélanges d'huiles peuvent être utilisés.

Les tensioactifs peuvent être classés par leur « BHL » (balance hydrophile/lipophile). Les tensioactifs préférés de l'invention ont une BHL d'au moins 10, de préférence au moins 15, et de manière davantage préférée au moins 16. L'invention peut être utilisée avec des tensioactifs comprenant, mais n'y étant pas limités, les tensioactifs d'esters de sorbitane polyoxyéthylène (couramment appelés Tween), spécialement le polysorbate 20 et le polysorbate 80 ; des copolymères d'oxyde d'éthylène (EO), d'oxyde de propylène (PO), et/ou d'oxyde de butylène (BO), vendu sous le nom commercial de DOWFAX™, comme les copolymères séquencés EO/PO linéaires, les octoxynols, qui peuvent varier dans le nombre des groupes éthoxy répétitifs (oxy-1,2-éthanediyle), avec l'octoxynol 9 (Triton X-100, ou t-octylphénoxypolyéthoxyéthanol) étant d'un intérêt particulier ; 1'(octylphénoxy)polyéthoxyéthanol (IGEPAL CA-630/NP-40) ; les phospholipides comme la phosphatidyl-choline (lécithine) ; les éthers gras de polyoxyéthylène dérivés des alcools laurylique, cétylique, stéarylique et oléylique (connus comme les tensioactifs Brij), comme l'éther monolaurylique de triéthylène glycol (Brij 30) ; et les esters de sorbitane (couramment connus comme les SPAN) , comme le trioléate de sorbitane (Span 85) et le monolaurate de sorbitane. Les tensioactifs préférés pour une inclusion dans l'émulsion sont le Tween 80 (monooléate de sorbitane polyoxyéthylène), le Span 85 (trioléate de sorbitane), la lécithine et le Triton X-100. Comme il a été susmentionné, des détergents comme le Tween 80 peuvent contribuer à la stabilité thermique observée dans les exemples ci-dessous.

Des mélanges de tensioactifs peuvent être utilisés, par exemple, des mélanges de Tween 80/Span 85. Une combinaison d'un ester de sorbitane polyoxyéthylène comme le monooléate de sorbitane polyoxyéthylène (Tween 80) et d'un octoxynol comme le t-octylphénoxypolyéthoxyéthanol (Triton X-100) est également appropriée. Une autre combinaison utile comprend du laureth 9 plus un ester de sorbitane polyoxyéthylène et/ou un octoxynol.

Les quantités préférées des tensioactifs (% en poids) sont : esters de sorbitane polyoxyéthylène (tel que Tween 80) 0,01 à 1 %, en particulier environ 0,1 % ; octyl- ou nonyl-phénoxypolyoxyéthanols (tel que Triton X-100, ou d'autres détergents dans la série Triton) 0,001 à 0,1 %, en particulier 0,005 à 0,02 % ; éthers de polyoxyéthylène (tel que laureth 9) 0,1 à 20 %, de préférence 0,1 à 10 % et en particulier 0,1 à 1 % ou environ 0,5 %.

Les adjuvants à base d'émulsions huile dans l'eau spécifiques utiles pour l'invention comprennent, mais n'y sont pas limités : • une émulsion submicronique de squalène, Tween 80, et

Span 85. La composition de l'émulsion en volume peut être environ 5 % de squalène, environ 0,5 % de polysorbate 80 et environ 0,5 % de Span 85. En termes de poids, ces rapports deviennent 4,3 % de squalène, 0,5 % de polysorbate 80 et 0,48 % de Span 85. Cet adjuvant est connu sous le nom de « MF59 » [45-47], tel que décrit plus en détail dans le chapitre 10 de la référence 48 et le chapitre 12 de la référence 49. L'émulsion MF59 comprend de façon avantageuse des ions citrate, par exemple, ' 10 mM de tampon citrate de sodium. • Une émulsion comprenant du squalène, un a-tocophérol, et du polysorbate 80. Ces émulsions peuvent avoir de 2 à 10 % de squalène, de 2 à 10 % de tocophérol et de 0,3 à 3 % de Tween 80, et le rapport pondéral du squalène/tocophérol est de préférence ^ 1 (par exemple, 0,90) car ceci fournit une émulsion plus stable. Le squalène et le Tween 80 peuvent être présents dans un rapport de volume d'environ 5/2, ou dans un rapport pondéral d'environ 11/5. Une telle émulsion peut être fabriquée en dissolvant du Tween 80 dans du PBS pour donner une solution à 2 %, puis en mélangeant 90 ml de cette solution avec un mélange de (5 g de DL-a-tocophérol et 5 ml de squalène), puis en microfluidisant le mélange. L'émulsion résultante peut avoir des gouttelettes d'huile submicroniques, par exemple, avec un diamètre moyen entre 100 et 250 nm, de préférence environ 180 nm. •Une émulsion de squalène, d'un tocophérol et d'un détergent Triton (par exemple, Triton X-100). L'émulsion peut également comprendre un 3d-MPL (voir ci-dessous). L'émulsion peut contenir un tampon phosphate. • Une émulsion comprenant un polysorbate (par exemple, polysorbate 80) , un détergent Triton (par exemple, Triton X-100) et un tocophérol (par exemple, un succinate d'a-tocophérol). L'émulsion peut comprendre ces trois composants dans un rapport en masse d'environ 75/11/10 (par exemple, 750 μg/ml de polysorbate 80, 110 μg/ml de Triton X-100 et 100 μg/ml de succinate d'a-tocophérol), et ces concentrations devront comprendre toute contribution de ces composants à partir des antigènes. L'émulsion peut également comprendre du squalène. L'émulsion peut également comprendre un 3d-MPL (voir ci-dessous). La phase aqueuse peut contenir un tampon phosphate. • Une émulsion de squalane, de polysorbate 80 et de poloxamer 401 (« Pluronic™ L121 ») . L'émulsion peut être formulée dans de la solution tampon phosphate, pH 7,4. Cette émulsion est un véhicule d'administration utile pour les muramyl-dipeptides, et a été utilisée avec du thréonyl-MDP dans l'adjuvant « SAF-1 » [50] (0,05 à 1 % de Thr-MDP, 5 % de squalane, 2,5 % de Pluronic L121 et 0,2 % de polysorbate 80) . Elle peut être également utilisée sans le Thr-MDP, comme dans l'adjuvant « AF » [51] (5 % de squalane, 1,25 % de Pluronic L121 et 0,2 % de polysorbate 80). Une microfluidisation est préférée. • Une émulsion comprenant du squalène, un solvant aqueux, un tensioactif non ionique hydrophile d'éther alkylique de polyoxyéthylène (par exemple, l'éther cétostéarylique de polyoxyéthylène (12)) et un tensioactif non ionique hydrophobe (par exemple, un ester de sorbitane ou un ester de mannide, comme le monooléate de sorbitane ou « Span 80 ») . L'émulsion est de préférence thermoréversible et/ou a au moins 90 % des gouttelettes d'huile (en volume) avec une taille inférieure à 200 nm [52]. L'émulsion peut également comprendre un ou plusieurs parmi : un alditol ; un agent cryoprotecteur (par exemple, un sucre, comme le dodécylmaltoside et/ou le saccharose) ; et/ou un alkylpolyglycoside. De telles émulsions peuvent être lyophilisées. • Une émulsion ayant de 0,5 à 50 % d'une huile, 0,1 à 10 % d'un phospholipide, et 0,05 à 5 % d'un tensioactif non ionique. Comme il est décrit dans la référence 53, les composants phospholipides préférés sont la phosphatidylcholine, la phosphatidyl-éthanolamine, la phosphatidylsérine, le phosphatidylinositol, le phosphatidylglycérol, l'acide phosphatidique, la sphingomyéline et le cardiolipide. Des tailles de gouttelettes submicroniques sont avantageuses. • Une émulsion huile dans l'eau submicronique d'une huile non métabolisable (comme une huile minérale légère) et d'au moins un tensioactif (comme la lécithine, le Tween 80 ou le Span 80) . Des additifs peuvent être inclus, comme la saponine QuilA, le cholestérol, un conjugué saponine-lipophile (comme GPI-0100, décrit dans la référence 54, produit par addition d'une amine aliphatique à une désacyl- saponine par l'intermédiaire du groupe carboxyle de l'acide glucuronique), le bromure de diméthyl- dioctadécylammonium et/ou la N,N-dioctadécyl-N,N-bis(2-hydroxyéthyl)propanediamine. • Une émulsion comprenant une huile minérale, un alcool gras éthoxylé lipophile non ionique, et un tensioactif hydrophile non ionique (par exemple, un alcool gras éthoxylé et/ou un copolymère séquencé de polyoxyéthylène-polyoxypropylène) [55]. • Une émulsion comprenant une huile minérale, un alcool gras éthoxylé hydrophile non ionique, et un tensioactif lipophile non ionique (par exemple, un alcool gras éthoxylé et/ou un copolymère séquencé de polyoxyéthylène-polyoxypropylène) [55]. • Une émulsion dans laquelle une saponine (par exemple,

QuilA ou QS21) et un stérol (par exemple, un cholestérol) sont associés sous la forme de micelles hélicoïdales [56].

Les antigènes et les adjuvants dans une composition seront généralement en mélange au moment de l'administration à un patient. Les émulsions peuvent être mélangées avec l'antigène durant la fabrication, ou extemporanément, au moment de l'administration. Ainsi, l'adjuvant et l'antigène peuvent être gardés séparément dans un vaccin conditionné ou distribué, prêts pour la formulation finale au moment de l'utilisation. L'antigène sera généralement sous une forme aqueuse, de telle façon que le vaccin est finalement préparé en mélangeant deux liquides. Le rapport en volume des deux liquides pour le mélange peut varier (par exemple, entre 5/1 et 1/5) mais il est généralement d'environ 1/1. C. Formulation de saponines [chapitre 22 de la référence 48]

Des formulations de saponines peuvent être également utilisées en tant qu'adjuvants dans l'invention. Les saponines sont un groupe hétérogène de glycosides de stérol et de glycosides de triterpénoïde qui se trouvent dans l'écorce, les feuilles, les tiges, les racines et même les fleurs d'un large éventail d'espèces de plantes. La saponine issue de l'écorce de l'arbre Quillaia saponaria Molina a été largement étudiée en tant qu'adjuvant. La saponine peut être également obtenue commercialement à partir de Smilax ornata (salsepareille), Gypsophilla paniculata (voile de la mariée), et Saponaria officianalis (racine savon). Les formulations d'adjuvants à base de saponines comprennent des formulations purifiées, comme QS21, ainsi que des formulations lipidiques, comme les ISCOM. QS21 est commercialisé sous le nom de Stimulon™.

Les compositions de saponines ont été purifiées en utilisant la CLHP et la RP-CLHP. Des fractions purifiées spécifiques en utilisant ces techniques ont été identifiées, y compris QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B et QH-C. De préférence, la saponine est QS21. Un procédé de production de QS21 est divulgué dans la référence 57. Les formulations de saponines peuvent également comprendre un stérol, comme le cholestérol [58] .

Des combinaisons de saponines et de cholestérols peuvent être utilisées pour former des particules uniques appelées complexes immunostimulants (ISCOM ; voir le chapitre 23 de la référence 48 ; également les références 59 et 60) . Les ISCOM comprennent aussi généralement un phospholipide comme la phosphatidyléthanolamine ou la phosphatidylcholine. Toute saponine connue peut être utilisée dans les ISCOM. De préférence, 1'ISCOM comprend un ou plusieurs de QuilA, QHA et QHC. Eventuellement, les ISCOM peuvent être dépourvus de détergent supplémentaire [61].

Une description du développement d'adjuvants à base de saponines peut être trouvée dans les références 62 et 63. D. Dérivés bactériens ou microbiens

Des adjuvants appropriés pour une utilisation dont fait l'invention comprennent des dérivés bactériens ou microbiens comme des dérivés non toxiques du lipopolysaccharide entérobactérien (LPS), des dérivés du lipide A, des oligonucléotides immunostimulants et des toxines ADP-rybosylantes et leurs dérivés détoxifiés.

Les dérivés non toxiques du LPS comprennent le monophosphoryl-lipide A (MPL) et le MPL 3-O-désacylé (3dMPL). Le 3dMPL est un mélange de monophosphoryl-lipide A 3-dés-O-acylé avec 4, 5 ou 6 chaînes acylées. Une forme préférée de « petites particules » de monophosphoryl-lipide A 3-dés-O-acylé est divulguée dans la référence 64. De telles « petites particules » de 3dMPL sont suffisamment petites pour être stérilisées par filtration à travers une membrane de 0,22 pm [64]. D'autres dérivés non toxiques du LPS comprennent des mimétiques du monophosphoryl-lipide A, comme des dérivés d'aminoalkyl-glucosaminide phosphate, par exemple, RC-529 [65,66].

Les dérivés du lipide A comprennent des dérivés du lipide A provenant d'Escherichia coli comme OM-174. OM-174 est décrit par exemple dans les références 67 et 68.

Des oligonucléotides immunostimulants appropriés pour une utilisation en tant qu'adjuvants dans l'invention comprennent des séquences nucléotidiques contenant un motif CpG (une séquence dinucléotidique contenant une cytosine non méthylée liée par une liaison phosphate à une guanosine) . Il a été également montré que des ARN double brin et des oligonucléotides contenant des séquences palindromiques ou poly(dG) sont immunostimulants.

Les CpG peuvent comprendre des modifications/analogues de nucléotides comme des modifications de phosphorothioate et ils peuvent être double brin ou simple brin. Les références 69, 70 et 71 divulguent des substitutions analogues possibles, par exemple, le remplacement de la guanosine par la 2'-désoxy-7-déazaguanosine. L'effet adjuvant des oligonucléotides CpG est en outre discuté dans les références 72 à 77.

La séquence CpG peut être dirigée contre le TLR9, comme le motif GTCGTT ou TTCGTT [78] . La séquence CpG peut être spécifique pour induire une réponse immunitaire Thl, comme un ODN CpG-A, ou elle peut être plus spécifique pour induire une réponse des lymphocytes B, comme un ODN CpG-B. Des ODN CpG-A et CpG-B sont discutés dans les références 79 à 81. De préférence, le CpG est un ODN CpG-A.

De préférence, l'oligonucléotide CpG est construit de telle façon que l'extrémité 5' est accessible pour la reconnaissance des récepteurs. Eventuellement, deux séquences d'oligonucléotides CpG peuvent être fixées à leurs extrémités 3' pour former des « immunomères ». Voir, par exemple, les références 82 à 84.

Un adjuvant particulièrement utile basé autour d'oligonucléotides immunostimulants est connu sous le nom de IC-31™ [85-87]. Ainsi, un adjuvant utilisé dans l'invention peut comprendre un mélange de (i) un oligonucléotide (par exemple, entre 15 et 40 nucléotides) y compris au moins (et de préférence de multiples) motif(s) Cpl (c'est-à-dire, une cytosine liée à une inosine pour former un dinucléotide) , et (ii) un polymère polycationique, comme un oligopeptide (par exemple, entre 5 et 20 acides aminés) y compris au moins un (de préférence de multiples) séquence(s) tripeptidique(s) Lys-Arg-Lys. L'oligonucléotide peut être un désoxynucléotide comprenant une séquence 26-mer 5'-(IC)i3-3' (SEQ ID NO : 2). Le polymère polycationique peut être un peptide comprenant une séquence d'acides aminés 11-mer KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO : 3) . Cette combinaison de SEQ ID NO : 6 et 7 fournit l'adjuvant IC-31™.

Des toxines bactériennes ADP-rybosylantes et leurs dérivés détoxifiés peuvent être utilisés en tant qu'adjuvants dans l'invention. De préférence, la protéine est dérivée d'E. coli (entérotoxine thermolabile « LT » d 'E. coli), du choléra (« CT ») , ou de pertussis (« PT ») . L'utilisation de toxines ADP-rybosylantes détoxifiées en tant qu'adjuvants mucosaux est décrite dans la référence 88 et en tant qu'adjuvants parentéraux dans la référence 89. La toxine ou l'anatoxine est de préférence sous la forme d'une holotoxine, comprenant des sous-unités à la fois A et B. De préférence, la sous-unité A contient une mutation détoxifiante ; de préférence la sous-unité B est non mutée. De préférence, l'adjuvant est un mutant de LT détoxifié comme LT-K63, LT-R72, et LT-G192. L'utilisation de toxines ADP-rybosylantes et de leurs dérivés détoxifiés, particulièrement LT-K63 et LT-R72, en tant qu'adjuvants peut être trouvée dans les références 90 à 97. Un mutant de CT utile est CT-E29H [98]. La référence numérique pour les substitutions d'acides aminés est basée de préférence sur les alignements des sous-unités A et B des toxines ADP-rybosylantes présentées dans la référence 99, incorporée spécifiquement dans la présente par référence dans son intégralité. E. Immunomodulateurs humains

Des immunomodulateurs humains appropriés pour une utilisation en tant qu'adjuvants dans l'invention comprennent des cytokines, comme des interleukines (par exemple, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [100], etc.) [101], des interférons (par exemple, 1'interféron-γ) , le facteur de stimulation des colonies de macrophages, et le facteur de nécrose tumorale. Un immunomodulateur préféré est 1'IL-12. F. Bioadhésifs et mucoadhésifs

Des bioadhésifs et des mucoadhésifs peuvent être également utilisés en tant qu'adjuvants dans l'invention. Les bioadhésifs appropriés comprennent des microsphères d'acide hyaluronique estérifié [102] ou des mucoadhésifs comme des dérivés réticulés de poly(acide acrylique), polyalcool vinylique, polyvinylpyrrolidone, des polysaccharides et la carboxyméthylcellulose. Le chitosane et ses dérivés peuvent être utilisés en tant qu'adjuvants dans l'invention [103]. G. Microparticules

Des microparticules peuvent être également utilisées en tant qu'adjuvants dans l'invention. Des microparticules (c'est-à-dire, une particule d'un diamètre de ~100 nm à -150 nm, de manière davantage préférée d'un diamètre de -200 nm à -30 μτη, et de manière préférée entre toutes d'un diamètre de -500 nm à -10 μτη) formées à partir de matériaux qui sont biodégradables et non toxiques (par exemple, un poly(acide a-hydroxylé), un polyacide hydroxybutyrique, un polyorthoester, un polyanhydride, une polycaprolactone, etc.), avec un poly(lactide-co-glycolide) sont préférées, éventuellement traitées pour avoir une surface chargée négativement (par exemple, avec du SDS) ou une surface chargée positivement (par exemple, avec un détergent cationique, comme le CTAB). H. Liposomes (chapitres 13 et 14 de la référence 48)

Des exemples de formulations de liposomes appropriées pour une utilisation en tant qu'adjuvants sont décrits dans les références 104 à 106. I. Composés d1imidazoquinolone

Des exemples de composés d'imidazoquinolone appropriés pour une utilisation en tant qu'adjuvants dans l'invention comprennent Imiquamod et ses homologues (par exemple, « Resiquimod 3M »), décrits en outre dans les références 107 et 108. L'invention peut également comprendre des combinaisons d'aspects d'un ou de plusieurs des adjuvants identifiés ci-dessus. Par exemple, les compositions d'adjuvants suivantes peuvent être utilisées dans l'invention : (1) une saponine et une émulsion huile dans l'eau [109] ; (2) une saponine (par exemple, QS21) + un dérivé non toxique du LPS (par exemple, 3dMPL) ; (3) une saponine (par exemple, QS21) + un dérivé non toxique du LPS (par exemple, 3dMPL) + un cholestérol ; (4) une saponine (par exemple, QS21) + 3dMPL + IL-12 (éventuellement + un stérol) [111] ; (5) des combinaisons de 3dMPL avec, par exemple, du QS21 et/ou des émulsions huile dans l'eau [112] ; (6) SAF, contenant 10 % de squalane, 0,4 % de Tween 80™, 5 % de polymère séquencé Pluronic L121, et du thr-MDP, soit microfluidisé en une émulsion submicronique soit passé au vortex pour générer une émulsion à plus grosse taille de particule ; (7) le système d'adjuvant Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem) contenant 2 % de squalène, 0,2 % de Tween 80, et un ou plusieurs composants de la paroi de la cellule bactérienne du groupe constitué de monophosphoryl-lipide A (MPL), dimycolate de tréhalose (TDM), et squelette de la paroi cellulaire (CWS), de préférence MPL + CWS (Detox™) ; et (8) un ou plusieurs sels minéraux (comme un sel d'aluminium) + un dérivé non toxique du LPS (comme le 3dMPL). D'autres substances qui aqissent comme des agents immunostimulants sont divulguées dans le chapitre 7 de la référence 48.

Un adjuvant d'hydroxyde d'aluminium est utile, et les antigènes sont généralement adsorbés sur ce sel. Des émulsions huile dans l'eau comprenant du squalène, avec des gouttelettes d'huile submicroniques, sont également préférées, particulièrement chez les personnes âgées. Des combinaisons d'adjuvants utiles comprennent des combinaisons d'adjuvants Thl et Th2 comme les CpG et un sel d'aluminium, ou le résiquimod et un sel d'aluminium. Une combinaison d'un sel d'aluminium et de 3dMPL peut être utilisée.

Immunisation

En plus de fournir des compositions immunogènes telles que décrites ci-dessus, l'invention propose également un procédé pour soulever une réponse immunitaire chez un mammifère, comprenant l'administration d'une composition immunogène de l'invention au mammifère. Généralement, la réponse immunitaire est une réponse en anticorps. La réponse en anticorps est de préférence une réponse en anticorps protecteurs. L'invention propose également des compositions de l'invention pour une utilisation dans de tels procédés. L'invention propose également un procédé de protection d'un mammifère contre une infection et/ou maladie bactérienne, comprenant l'administration au mammifère d'une composition immunogène de l'invention.

L'invention propose des compositions de l'invention pour une utilisation en tant que médicaments (par exemple, sous la forme de compositions immunogènes ou sous la forme de vaccins). Elle propose également l'utilisation des combinaisons ou des OMV de l'invention dans la fabrication d'un médicament pour la prévention d'une infection bactérienne chez un mammifère.

Le mammifère est de préférence un être humain. L'être humain peut être un adulte ou, de préférence, un enfant. Lorsque le vaccin est pour une utilisation prophylactique, l'être humain est de préférence un enfant (par exemple, un jeune enfant ou un nourrisson) ; lorsque le vaccin est pour une utilisation thérapeutique, l'être humain est de préférence un adulte. Un vaccin prévu pour des enfants peut être également administré à des adultes, par exemple, pour estimer l'innocuité, le dosage, l'immunogénicité, etc. L'efficacité du traitement thérapeutique peut être testée en suivant l'infection bactérienne après l’administration de la composition de l'invention. L'efficacité du traitement prophylactique peut être testée en suivant les réponses immunitaires contre les protéines immunogènes dans les vésicules ou d'autres antigènes après l'administration de la composition. L'immunogénicité des compositions de l'invention peut être déterminée en les administrant à des sujets à tester (par exemple, des enfants âgés de 12 à 16 mois) et ensuite en déterminant les paramètres sérologiques classiques. Ces réponses immunitaires seront généralement déterminées environ 4 semaines après l'administration de la composition, et comparées à des valeurs déterminées avant l'administration de la composition. Lorsque plus d'une dose de la composition est administrée, il peut être réalisé plus d'une détermination après 1'administration.

Les compositions de l'invention seront généralement administrées directement à un patient. Une administration directe peut être accomplie par injection parentérale (par exemple, par voie sous-cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse, intramusculaire, ou dans l'espace interstitiel d'un tissu), ou par administration rectale, orale, vaginale, topique, transdermique, intranasale, oculaire, auriculaire, pulmonaire ou une autre administration mucosale. L'administration intramusculaire dans la cuisse ou le haut du bras est préférée. L'injection peut être effectuée à l'aide d'une aiguille (par exemple, une aiguille hypodermique), mais une injection sans aiguille peut être utilisée en variante. Une dose intramusculaire type est d'environ 0,5 ml. L'invention peut être utilisée pour déclencher une immunité systémique et/ou mucosale.

Le traitement posologique peut être un calendrier de dose unique ou un calendrier de doses multiples. Les doses multiples peuvent être utilisées dans un calendrier d'immunisation de sensibilisation et/ou dans un calendrier d'immunisation de rappel. Un calendrier de dose de sensibilisation peut être suivi d'un calendrier de dose de rappel. Les temps appropriés entre les doses de sensibilisation (par exemple, entre 4 et 16 semaines), et entre la sensibilisation et le rappel, peuvent être déterminés en routine. Généralités

Le terme « comprenant » englobe « incluant » ainsi que « constitué de », par exemple, une composition « comprenant » X peut être constituée exclusivement de X ou elle peut comprendre quelque chose d'autre, par exemple, X + Y.

Le terme « substantiellement » n'exclut pas « complètement », par exemple, une composition qui est « substantiellement dépourvue » de Y peut être complètement dépourvue de Y. Lorsque c'est nécessaire, le terme « substantiellement » peut être omis de la définition de 1'invention.

Le terme « environ » en relation avec une valeur numérique x est facultatif et signifie, par exemple, x ± 10 %. L'identité entre des séquences polypeptidiques est déterminée de préférence par l'algorithme de recherche d'homologie de Smith-Waterman tel que mis en œuvre dans le programme MPSRCH (Oxford Molecular), utilisant une recherche de brèche affine avec les paramètres, pénalité d'ouverture de brèche = 12 et pénalité d'extension de brèche = 1.

Brève description des figures

Figure 1 - Carte du plasmide pET-OmpA. pET-OmpA est dérivé du plasmide pET21b et contient la séquence d'acide nucléique codant pour la séquence signal (SS) d'E. coli OmpA (SS) fusionnée à un gène d'intérêt (GOI) codant pour une protéine hétérologue. La SS OmpA SS cible la protéine codée par le GOI dans la lumière des OMV.'

Figure 2 - Analyse par SDS-PAGE des lysats bactériens totaux issus de souches BL21(DE3)AompA et BL21(DE3)AtolR exprimant des antigènes staphylococciques. Les bactéries ont été analysées avant (-) et après (+) induction avec 1 mM d'IPTG pendant 3 heures. (A) Analyse de souches BL21(DE3)AompA exprimant des antigènes staphylococciques. Les bandes correspondant à HlaH35L, Sta006, LukE (-LP) et LukE (+LP) sont signalées par des flèches. (B) Analyse de souches BL21 (DE3)AtolR exprimant des antigènes staphylococciques. Les bandes correspondant à HlaH35L et Sta006 sont signalées par des flèches.

Figure 3 - Analyse par immunoblot sur des souches BL21(DE3)AompA et BL21(DE3)AtolR exprimant des antigènes staphylococciques. (A) L'expression de HlaH35L a été évaluée en utilisant un antisérum anti-Hla. (B) L'expression de Sta006 a été évaluée en utilisant un antisérum anti-Sta006. (C) L'expression de SpA_DEABC a été évaluée en utilisant un antisérum anti-SpA. Les bandes correspondant à HlaH35L et SpA_DEABC sont signalées par des flèches.

Figure 4 - Analyse par SDS-PAGE des fractions totales (T) et solubles (S) de lysats bactériens issus de souches BL21(DE3MompA exprimant des antigènes staphylococciques. Les fractions ont été préparées et analysées après 2 heures d'induction avec 1 mM d'IPTG. Les bandes correspondant à Sta006, SpA_DEABC, LukE (-LP) et LukE (+LP) sont signalées par des flèches.

Figure 5 - Quantification des antigènes staphylococciques libérés dans le milieu de culture par immunoblot. La quantité d'antigène libéré dans le surnageant de la culture par des souches BL21 (DE3) ΔοιτιρΑ exprimant des protéines staphylococciques a été déterminée par comparaison des signaux chimioluminescents des échantillons de surnageant avec ceux émanant de quantités connues de protéine recombinante purifiée. (A) 0,7, 7 et 7 0 μΐ de surnageant de culture provenant de BL21(DE3)AompA exprimant LSSOmpA-Sta006 ont été analysés. 10, 20, 40, 80 et 160 ng de Sta006 recombinant purifié ont été chargés en tant que références. 7 μΐ de surnageant contenaient approximativement 20 ng de SSOmpA-Sta006. (B) 0,7, 7 et 70 μΐ de surnageant de culture provenant de BL21 (DE3) ΔοπιρΑ exprimant SSOmpA—SpA_DEABC ont été analysés. 10, 20, 40, 80 et 160 ng de la protéine recombinante purifiée SpA_DEABC ont été chargés en tant que références. 7 μΐ de surnageant contenaient approximativement 40 ng de SSOmpA-SpA_DEABC. (C) 7, 70 et 700 μΐ de surnageant de culture provenant de deux souches BL21(DE3)AompA exprimant SSOmpA-HlaH35L ont été analysés. 20, 40, 80 et 160 ng de la protéine recombinante purifiée HlaH35L ont été chargés en tant que références. Dans les deux souches, 700 μΐ de surnageant contenaient approximativement 10 ng de SSOmpA-HlaH35L.

Modes de réalisation de l'invention Génération de mutants d'E. coli BL21(DE3) AtolR et AompA knock-out

Des cellules BL21(DE3) enclines à la recombinaison ont été produites en utilisant le système de recombinaison homologue hautement efficace (opéron « red ») [113] . En bref, des cellules bactériennes électrocompétentes ont été transformées avec 5 μς de plasmide pAJD434 par électroporation (5,9 ms à 2,5 kV). Les bactéries ont été ensuite cultivées pendant 1 h à 37 °C dans 1 ml de bouillon SOC et ensuite déposées sur des plaques Luria-Bertani (LB) contenant du triméthoprime (100 pg/ml). L'expression des gènes « red » portés par pAJD434 a été induite en ajoutant 0,2 % de L-arabinose au milieu.

Des souches mutantes d'E. coli BL21 AtolR et AompA, qui sont connues pour produire spontanément une grande quantité d'OMV, ont été produites en remplaçant les séquences codantes de ompA et tolR par des cassettes de résistance à la kanamycine (kmr) et au chloramphénicol (cmr), respectivement. Un protocole de PCR en trois étapes a été utilisé pour fusionner les régions en amont et en aval de ompA et tolR aux gènes kmr et cmr, respectivement. En bref, les régions en amont et en aval des gènes tolR et ompA ont été amplifiées à partir de l'ADN génomique de BL21(DE3) avec les paires d'amorces spécifiques tolR-l/tolR- 2 et tolR-3/tolR-4 ; ompA-1/ ompA-2 et ompA-3/ompA-4, respectivement (tableau 1) . La cassette kmr a été amplifiée à partir du plasmide pUC4K en utilisant les amorces PUC4K-rev et PUC4K-for et la cassette cmr a été amplifiée en utilisant les amorces CMR-for/CMR-rev. Finalement, 100 ng de chacun des trois fragments amplifiés ont été fusionnés ensemble par mélange dans une PCR contenant les amorces 1/4.

Les fragments linéaires dans lesquels le gène de résistance à l'antibiotique était flanqué par les régions en amont et en aval de tolR / ompA ont été utilisés pour transformer la souche d'E. coli BL21(DE3) encline à la recombinaison, qui a été rendue électrocompétente par trois étapes de lavage dans de l'eau froide. La transformation a été réalisée par une électroporation de 5,9 ms à 2,5 kV. Les transformants ont été sélectionnés en déposant les cellules sur des plaques LB contenant 30 pg/ml de kanamycine ou 20 pg/ml de chloramphénicol. La délétion des gènes tolR et ompA a été confirmée par amplification par PCR de 1'ADN génomique en utilisant les paires d'amorces tolR-Ι / PUC4K-rev et PUC4K-for /tolR-4 ; ompA-1/CMR-rev et CMR-for/ompA-4.

Tableau 1

Amorces oligonucléotidiques

Construction de plasmides pour l'expression d'antigènes staphylococciques dans des OMV d'E. coli

Quatre antigènes provenant de Staphylococcus aureus ont été choisis pour une expression dans des OMV d'E. coli : (i) HlaH35L, un mutant inactif de 1'a-hémolysine (Hla) de la souche de Staphylococcus aureus NCTC8325 ; (ii) Sta006, un transporteur ABC de composés de fer provenant de la souche de Staphylococcus aureus NCTC8325 ; (iii) SpA_DEABC, une forme mutée de la protéine A (SpA) provenant de la souche NCTC8325, qui est incapable de lier les immunoglobulines ; (iv) LukE, l'une des deux sous-unités de la leucotoxine LukED provenant de la souche de Staphylococcus aureus NCTC8325.

La séquence codante d'acide nucléique de chaque protéine a été clonée dans le plasmide pET-OmpA en utilisant le procédé de clonage d'extension incomplète de l'amorce par la polymérase (PIPE) [114] . pETOmpA (figure 1) est un dérivé de pET21b qui permet l'expression de protéines dans l'espace périplasmique d'E. coli par l'intermédiaire d'une fusion traductionnelle entre une séquence signal d'E. coli (séquence signal de OmpA) et la forme mature de la protéine d'intérêt.

Le plasmide pET-OmpA a été amplifié par PCR en utilisant les amorces omprev/nohisflag (tableau 2). HlaH35L a été amplifié par PCR à partir du plasmide pET15TEV-HlaH35L en utilisant les amorces OmpA-Hla fl et Hla rl (tableau 2) , qui excluent la séquence signal N-terminale de Hla prédite par le logiciel SignalP 4.1. La séquence de OmpA-HlaH35L qui est produite est représentée par SEQ ID NO : 121. Sta006 a été amplifié à partir du plasmide pET15TEV-Sta006 en utilisant les amorces OmpA-Sta006 fl et Sta006 rl (tableau 2), qui excluent la partie N-terminale de la séquence codante jusqu'au motif de lipoboîte LXXC, afin d'éviter l'ancrage membranaire. La séquence de OmpA-Sta006 qui est produite est représentée par SEQ ID NO : 123. SpA_DEABC a été amplifié par PCR à partir du plasmide pET15TEV-SpA_DEABC en utilisant les amorces OmpA-SpA_DEABC fl et SpA_DEABC rl (tableau 2). La séquence de OmpA-SpA_DEABC qui est produite est représentée par SEQ ID NO : 125. LukE a été amplifié par PCR à partir du plasmide pET15TEV-LukE dans deux formes : la première, excluant la séquence signal N-terminale prédite par le logiciel SignalP 4.1 et nommée « LukE (-LP) » , a été amplifiée en utilisant les amorces OmpA-LukE fl et LukE rl (tableau 2) ; la seconde, comprenant la séquence codante entière et nommée « LukE(+LP) », a été amplifiée en utilisant les amorces OmpA-

LukE f2 et LukE rl (tableau 2) . La séquence de OmpA-LukE (-LP) qui est produite est représentée par SEQ ID NO : 127. La séquence de OmpA-LukE(+LP) qui est produite est représentée par SEQ ID NO : 129. StaOll a été amplifié par PCR à partir du plasmide pET15TEV-Sta011 en utilisant les amorces OmpA-StaOll fl et StaOll rl (tableau 2). La séquence de OmpA-StaOll qui est produite est représentée par SEQ ID NO : 131. EsxAB a été amplifié par PCR à partir du plasmide pET15TEV-EsxAB en utilisant les amorces OmpA-EsxAB fl et EsxAB rl (tableau 2). La séquence de OmpA-EsxAB qui est produite est représentée par SEQ ID NO : 133. ClfA a été amplifié à partir du plasmide pET15TEV-ClfA en utilisant les amorces OmpA-ClfA fl et ClfA rl (tableau 2) . La séquence de OmpA-ClfA qui est produite est représentée par SEQ ID NO : 135.

De cette manière, les plasmides pET21-SSOmpA-HlaH35L, pET21-SSOmpA-StaOO 6, pET21-SSOmpA -SpA_DEABC, pET21-SSOmpA-LukE(-LP), pET21-SSOmpA-LukE (+LP) , pET21-SSOmpA-StaOH, pET21-SSOmp-EsxAB et pET21-SSOmp-ClfA ont été générés.

Tableau 2

Expression d'antigènes dans des mutants AompA et AtolR et analyse de l'expression des antigènes dans des lysats bactériens totaux, des fractions bactériennes solubles et des fractions de surnageant de culture

Des mutants d'E. coli BL21(DE3) AompA ont été transformés avec les plasmides pET21-SSOmpA-HlaH35L, pET21-SSOmpA-Sta006, pET21-SS0mpA-SpA_DEABC, pET21-SS0mpA-LukE(-LP), pET21-SS0mpA-LukE(+LP), pET21-SS0mpA-esxAB et pET21-SSOmpA-Sta011 et des mutants d'E. coli BL21 (DE3) AtolR ont été transformés avec les plasmides pET21-SSOmpA-HlaH35L, pET21-SSOmpA-StaOO6, pET21-S S OmpA-SpA_DEABC, pET21-SSOmpA-esxAB et pET21-SSOmpA-Sta011. Comme témoin négatif, des souches d'E. coli BL21 (DE3) AtolR et AompA ont été transformées avec le vecteur vide pET-OmpA.

Toutes les souches ont été cultivées dans du milieu liquide jusqu'à la phase logarithmique, lorsque l'expression des antigènes a été induite par l'addition de 1 mM d'IPTG (isopropyl-bêta-D-thiogalactopyranoside) . Pour tester les souches recombinantes pour l'expression des antigènes, les lysats bactériens totaux ont été analysés (avant et après 3 heures d'induction avec l'IPTG) par électrophorèse sur gel de polyacrylamide avec du SDS (SDS-PAGE) (figure 2) . Les bandes correspondant à HlaH35L, Sta006, LukE(-LP) et LukE(+LP) ont été détectables dans les échantillons induits dans AompA (figure 2A) , alors que les bandes correspondant à HlaH35L et Sta006 ont été détectables dans les échantillons induits dans AtolR (figure 2B) , indiquant que l'expression de ces antigènes a été induite avec succès dans E. coli. Les bandes correspondant à staOll et EsxAB ont été également détectables dans les échantillons induits dans AompA (non présenté). Les souches AompA et AtolR transformées avec le vecteur vide pET-OmpA ont été utilisées en tant que témoins négatifs (figure 2) . La démonstration de l'expression de SpA_DEABC et la confirmation de l'expression de HlaH35L (figure 3), Sta006 (figure 3), EsxAB (non présenté) et StaOll (non présenté) dans les lysats totaux ont été obtenues par immunoblot).

Pour tester si les antigènes hétérologues sont solubles, des fractions solubles ont été préparées à partir de souches AompA induites pendant 2 heures avec de l'IPTG et analysées par SDS-PAGE (figure 4) . Une souche AompA transformée avec le vecteur vide pET-OmpA a été utilisée en tant que témoin négatif. Cette analyse a montré que Sta006, SpA_DEABC, LukE(-LP) et LukE(+LP) sont tous solubles.

Quantification des protéines hétérologues dans les fractions de surnageant de culture

Afin de quantifier la quantité de protéines hétérologues libérées dans les surnageants des cultures durant la croissance, une analyse par immunoblot a été réalisée (figure 5) . La quantité d'antigène libéré dans le surnageant de culture par des souches BL21(DE3)AompA exprimant des protéines staphylococciques a été déterminée par comparaison des signaux de chimioluminescence des échantillons de surnageants (préparés par précipitation des protéines avec de l'acide trichloroacétique) avec ceux de quantités connues de protéines recombinantes purifiées. Cette analyse a montré que 7 μΐ de surnageant provenant de la souche AompA exprimant SSOmpA-StaOOô contenaient approximativement 20 ng d'antigène (figure 5A) , 7 μΐ de surnageant provenant de la souche AompA exprimant SSOmpA-SpA_DEABC contenaient approximativement 40 ng d'antigène (figure 5B) et 700 μΐ de surnageant provenant de la souche AompA exprimant SSOmpA-HlaH35L contenaient approximativement 10 ng d'antigène (figure 5C).

Les OMV peuvent être ensuite utilisées pour former une composition pharmaceutique qui peut être utilisée pour immuniser un mammifère.

Modèle d'abcès rénal murin et expériences d'immunisation

Des souris CD1 âgées de quatre ou cinq semaines ont été immunisées par voie intramusculaire (IM) avec des injections de sensibilisation-rappel avec un intervalle de 14 jours de 100 μΐ (IM) contenant 10 μg de chaque protéine purifiée ou d'OMV (voir les détails de la combinaison testée dans le tableau 3) adsorbés sur un adjuvant d'hydroxyde d'aluminium (alun, 2 mg/ml). Des souris témoins ont reçu des quantités égales d'adjuvant alun seul. Les animaux immunisés ont été stimulés (« challengés ») au jour 24 par une injection intraveineuse d'une dose sous-létale de la souche Newman de S. aureus (~2 à 6 x 107 CFU). Au jour 28, les souris ont été euthanasiées et les reins ont été prélevés et homogénéisés dans 2 ml de PBS et déposés sur du milieu de gélose en double pour la détermination des unités formant une colonie (CFU). Les reins ont été également traités pour une histopathologie.

Tableau 3 Détails des compositions utilisées pour les expériences d'immunisation

L'efficacité protectrice des formulations vaccinales candidates contre une infection par S. aureus dans un modèle d'abcès rénal murin est présentée dans le tableau 4 ci-dessous.

Tableau 4

Afin d'évaluer l'efficacité protectrice de formulations vaccinales candidates contre une infection par S. aureus, un modèle d'abcès murin a été utilisé. Des souris (N = 16 par groupe, deux expériences séparées) ont été immunisées avec de l'alun seul, ou avec les vaccins suivants formulés avec de l'alun (Composition 1) , un vaccin combiné contenant les antigènes recombinants purifiés suivants : HlaH35L, Sta006, StaOll, EsxAB (Composition 2), un mélange d'OMV contenant les quatre antigènes HlaH35L, Sta006, StaOll, EsxAB (Composition 3) , et un mélange d'OMV contenant les quatre antigènes HlaH35L, StaOOô, LukE, SpA (Composition 4). Après avoir été immunisées, les souris ont été ensuite stimulés (« challengés ») avec la souche Newman de S. aureus et les nombres de CFU dans les reins ont été mesurés 4 jours après la stimulation (« challenge ») . Les nombres moyens de CFU mesurés dans le groupe témoin ont été de 6,92 Log, chez les souris vaccinées avec le vaccin de la composition 2, les CFU étaient de 5.87 et chez les souris qui ont reçu les compositions d'OMV 3 et 4, de 1,69. De façon importante, la plupart des souris immunisées avec la formulation contenant des OMV ont montré des taux indétectables de nombres de CFU. En outre, l'efficacité protectrice générée par la formulation des OMV a été statistiquement supérieure à celle associée au vaccin de la composition 1.

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Claims

REVENDICATIONS

1. Composition pharmaceutique comprenant au moins trois antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB.
2. Composition pharmaceutique selon la revendication 1, comprenant les quatre des antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa.
3. Composition pharmaceutique selon la revendication. 1, comprenant au moins quatre des antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB.
4. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, dans laquelle ledit au moins un antigène est compris au sein d'OMV provenant d'une bactérie Gram négatif.
5. OMV provenant d'une bactérie Gram négatif, où l'OMV comprend au moins un antigène de S. aureus, où l'antigène est choisi dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB.
6. OMV selon la revendication 5, où l'OMV comprend au moins deux antigènes de S. aureus, où les antigènes sont choisis dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène staOOô ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB.
7. OMV selon la revendication 5, où l'OMV comprend au moins trois antigènes de S. aureus, où les antigènes sont choisis dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène staOOô ; (iii) un antigène lukE ; (iv)' un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) ün antigène esxB.
8. OMV selon la revendication 5, où l'OMV comprend quatre antigènes de S. aureus, où les antigènes sont (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa.
9. OMV selon la revendication 5, où l'OMV comprend quatre antigènes de S. aureus, où les antigènes sont (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène esxAB et (iv) un antigène staOll.
10. OMV selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, où l'OMV comprend en outre au moins un, au moins deux ou les trois antigènes du groupe constitué de (i) un antigène stall ; (ii) un antigène esxAB et (iii) un antigène elfA.
11. Procédé de préparation d'une OMV selon l'une quelconque des revendications 5 à 9.
12. OMV provenant d'une bactérie Gram négatif, où l'OMV comprend au moins un antigène de S. aureus dans sa lumière, où l'antigène est choisi dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB.
13. OMV selon la revendication 12, où l'OMV comprend au moins deux antigènes de S. aureus dans sa lumière, où l'antigène est choisi dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB.
14. OMV selon la revendication 12, où l'OMV comprend au moins trois antigènes de S. aureus dans sa lumière, où l'antigène est choisi dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB.
15. OMV selon la revendication 12, où l'OMV comprend quatre antigènes de S. aureus, où les antigènes sont (i) un antigène hla ; (ii) un antigène staOOô ; (iii) un antigène lukE et (iv) un antigène spa.
16. OMV selon la revendication 12, où l'OMV comprend quatre antigènes de S. aureus, où les antigènes sont (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène esxAB et (iv) un antigène staOll.
17. OMV selon l'une quelconque des revendications 12 à 16, où l'OMV comprend en outre dans sa lumière au moins un, au moins deux ou les trois des antigènes du groupe constitué de : (i) un antigène staOll ; (ii) un antigène esxAB et (iii) un antigène elf A.
18. OMV selon l'une quelconque des revendications 12 à 17, dans laquelle 1'antigène/les antigènes est/sont libre(s) dans la lumière de l'OMV.
19. Procédé de préparation d'une OMV selon l'une quelconque des revendications 12 à 18.
20. Procédé selon la revendication 19, comprenant l'étape d'expression de l'antigène dans le périplasme de la bactérie Gram négatif.
21. Procédé selon la revendication 20, dans lequel l'antigène est exprimé dans le périplasme de la bactérie Gram négatif en utilisant un vecteur d'expression comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour l'antigène liée à un acide nucléique codant pour une séquence signal d'une protéine périplasmique.
22. Procédé selon la revendication 21, dans lequel la séquence signal native de l'antigène est remplacée par la séquence signal d'une protéine périplasmique.
23. OMV provenant d'une bactérie Gram négatif, où l'OMV comprend au moins un antigène de S. aureus, où l'antigène est choisi dans le groupe constitué de : (i) un antigène hla ; (ii) un antigène sta006 ; (iii) un antigène lukE ; (iv) un antigène spa ; (v) un antigène staOll ; (vi) un antigène esxA et (vii) un antigène esxB, où la bactérie Gram négatif comprend un génome synthétique dans lequel : a)-une ou plusieurs séquences non essentielles à la production des vésicules sont absentes de telle façon que, comparativement à la même bactérie sans lesdites séquences absentes, le génome est entre 1 % et 50 % plus petit ; et b) une ou plusieurs séquences sont présentes de telle façon que, comparativement à la même bactérie sans lesdites séquences présentes, la bactérie produit des vésicules qui comprennent un ou plusieurs antigènes supplémentaires.
24. OMV ou procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 23, où la bactérie Gram négatif est choisie dans le groupe constitué d'E. coli, N. meningitidis, Salmonella sp., et Shigella sp.
25. OMV ou procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 23, où la bactérie Gram négatif est une souche hyperbourgeonnante de la bactérie Gram négatif.
26. OMV ou procédé selon la revendication 25, où la bactérie Gram négatif est une souche d'E. coli AtolR ou une souche d’E. coli AompA.
27. Composition pharmaceutique comprenant (a) au moins une OMV selon l'une quelconque des revendications 4 à 9 ou 12 à 17 et (b) un support pharmaceutiquement acceptable.
28. Composition pharmaceutique selon la revendication 27, comprenant au moins deux OMV différentes selon l'une quelconque des revendications 4 à 9 ou 12 à 17.