AT501194A1

AT501194A1 - METHOD FOR ISOLATING CELLS AND VIRUSES

Info

Publication number: AT501194A1
Application number: AT0220104A
Authority: AT
Inventors: Thomas Dr Schlederer
Original assignee: Thomas Dr Schlederer
Priority date: 2004-12-30
Filing date: 2004-12-30
Publication date: 2006-07-15
Also published as: WO2006069413A3; WO2006069413A2

Description

- 1 ···· ···· ·· ··· ····- 1 ···· ···· ·· ··· ····

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Zellen und Viren.The present invention relates to a method for isolating cells and viruses.

Die Isolierung von Zellen und Viren unterschiedlichster Art (z.B. Erythrozyten, Mikroorganismen) erfolgt in der Praxis in einer Vielzahl von verschiedenen Methoden, wobei der Großteil dieser Methoden auf eine Trennung aufgrund der physikalischen oder biologischen Eigenschaften der zu isolierenden Zellen, Zellfragmenten (z.B. Mikroorganismen, Mikroorganismenfragmenten) oder Viren abzielt (z.B. Zentrifugation, Anreicherung von Mikroorganismen und Viren in Anreicherungsmedien bzw. Zellkulturen). Die Entwicklung von magnetischen, insbesondere von superparamagnetischen Partikeln, die zur Isolierung von Zellen und Viren jeglicher Art aus biologischen Proben herangezogen werden können, führte zu einer Vereinfachung der Isolierungsmethoden, da die magnetischen Eigenschaften dazu verwendet werden können, an diesen Partikeln gebundene Zellen aus einer Flüssigkeit bzw. Suspension zu isolieren. Die dabei verwendeten Partikel werden mit spezifischen Bindungspartnern, die an der Oberfläche von Zellen befindliche Strukturen zu binden vermögen, funktio-nalisiert, wodurch die magnetischen Partikel eine hohe Spezifi-zität gegenüber den zu isolierenden Zellen aufweisen. Derartige Bindungspartner können beispielsweise Antikörper oder Lektine sein, die Oberflächenepitope bzw. Kohlenhydratstrukturen binden können. Durch die Entwicklung von superparamagnetischen Partikeln, die eine hohe magnetische Suszeptibilität aufweisen und rasch die magnetischen Eigenschaften verlieren, sobald ein angelegtes Magnetfeld entfernt wird, konnte schließlich der Sprung zur wirtschaftlichen Nutzung derartiger Methoden erfolgen, da derartige Partikel bei Anlegen eines Feldes selbst magnetische Eigenschaften erlangen, wodurch ein stärkere magnetische Wirkung zwischen den einzelnen Partikeln und dem Magneten erfolgen kann.The isolation of cells and viruses of various kinds (eg erythrocytes, microorganisms) is carried out in practice in a variety of different methods, the majority of these methods to a separation due to the physical or biological properties of the cells to be isolated, cell fragments (eg microorganisms, microorganism fragments ) or viruses (eg centrifugation, accumulation of microorganisms and viruses in enrichment media or cell cultures). The development of magnetic, in particular superparamagnetic, particles which can be used to isolate cells and viruses of any kind from biological samples has led to a simplification of the isolation methods, since the magnetic properties can be used for cells bound to these particles from a liquid or isolate suspension. The particles used in this case are functionalized with specific binding partners capable of binding structures located on the surface of cells, whereby the magnetic particles have a high specificity with respect to the cells to be isolated. Such binding partners may be, for example, antibodies or lectins capable of binding surface epitopes or carbohydrate structures. The development of superparamagnetic particles, which have a high magnetic susceptibility and rapidly lose the magnetic properties as soon as an applied magnetic field is removed, finally led to the economic exploitation of such methods since such particles themselves acquire magnetic properties when a field is created, whereby a stronger magnetic effect between the individual particles and the magnet can take place.

In der US 4 910 148 wird die Verwendung von magnetisierbaren Partikeln zur Isolierung von Zellen aus einer biologischen Probe offenbart. Dabei wird zunächst ein Probenbehälter mit einer biologischen Flüssigkeit mit suspendierten, magnetisierbaren, funktionalisierten Partikeln in Kontakt gebracht und für eine definierte Zeit inkubiert. Um nach der Inkubation die an den magnetisierbaren Partikeln gebundenen Zellen zu isolieren, wird ein Magnetfeld an den Behälter mittels einer magnetischen Vor- - 2 - 2 ···· ···· ·· ·· > · · richtung aufgebaut und der Überstand der biologischen Flüssigkeit entfernt. Anschließend können die an der Wand des Behältnisses befindlichen magnetisierbaren Partikel weiterverarbeitet werden. Die in dieser Patentschrift offenbarten Partikel umfassen ein magnetisierbares Material und weisen daher selbst keine magnetischen Eigenschaften auf.US 4,910,148 discloses the use of magnetizable particles to isolate cells from a biological sample. In this case, first a sample container is brought into contact with a biological fluid with suspended, magnetizable, functionalized particles and incubated for a defined time. In order to isolate the cells bound to the magnetisable particles after incubation, a magnetic field is applied to the container by means of a magnetic device. 2 - 2 ···· ···· ···· > · Direction constructed and removed the supernatant of the biological fluid. Subsequently, the magnetizable particles located on the wall of the container can be further processed. The particles disclosed in this patent comprise a magnetizable material and therefore themselves have no magnetic properties.

In der US 6 020 210 wird die Isolierung von biologischen Zellorganellen und anderen biologischen Materialien aus einer biologischen Probe beschrieben. Dabei wird eine Probe, enthaltend superparamagnetische Partikel, an denen sich das zu isolierende Material befindet, über eine magnetisierbare Säulenmatrix geführt, an der nach dem Aufbau eines Magnetfeldes die superparamagnetischen Partikel immobilisiert werden. Nachdem die restliche nicht an den Partikeln gebundene Probenflüssigkeit aus der Säule entfernt wurde, können die Partikel von der Säulenmatrix nach der Entfernung des Magnetfeldes eluiert werden.US 6 020 210 describes the isolation of biological cell organelles and other biological materials from a biological sample. In this case, a sample containing superparamagnetic particles, on which the material to be isolated is located, is passed over a magnetizable columnar matrix on which the superparamagnetic particles are immobilized after the formation of a magnetic field. After the remaining sample-bound liquid sample has been removed from the column, the particles can be eluted from the column matrix after removal of the magnetic field.

Es ist somit Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dessen Hilfe Zellen, beispielsweise eukaryotische Zellen, wie Pilze, insbesondere Hefen, tierische und pflanzliche Zellen, und prokaryo,tische Zellen, wie Bakterien oder sonstige Mikroorganismen, aus komplexen Proben isoliert und gegebenenfalls bestimmt bzw. charakterisiert werden können.It is thus an object of the present invention to provide a method by means of which cells, for example eukaryotic cells, such as fungi, in particular yeasts, animal and plant cells, and prokaryotic cells, such as bacteria or other microorganisms, from complex samples isolated and optionally determined or characterized.

Daher betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Isolierung von mindestens einer Zelle, insbesondere von einer eukaryotischen und prokaryotischen Zelle, oder eines Virus aus einer Probe umfassend die Schritte: - Bereitstellen einer Probe, - Inkontaktbringen der Probe mit ferromagnetischen Partikeln, und - Abtrennen der Partikel aus der Proben-Partikel-Suspension.Therefore, the present invention relates to a method for isolating at least one cell, in particular a eukaryotic and prokaryotic cell, or a virus from a sample, comprising the steps of: providing a sample, contacting the sample with ferromagnetic particles, and separating the particles from the sample particle suspension.

Vorzugsweise wird (werden) die auf den ferromagnetischenPreferably, the ferromagnetic

Partikeln gebundene(n) Zelle(n) oder Virus(-en) durch - Inkontaktbringen der Partikel mit Zell- oder Virus-spezifischen Primern, - Unterwerfen der Partikel einer Nukleinsäureamplifikationstechnik und - qualitativen und/oder quantitativen Detektieren mindestens eines Nukleinsäureamplifikationsprodukts die Anwesenheit von Zellen oder Viren in der Probe bestimmt.Particle-bound cell (s) or virus (s) by: contacting the particles with cell- or virus-specific primers, subjecting the particles to a nucleic acid amplification technique, and qualitatively and / or quantitatively detecting at least one nucleic acid amplification product the presence of cells or viruses in the sample.

Unter dem Begriff „Zelle" gemäß der vorliegenden Erfindung werden u.a. Mikroorganismen, eukaryotische und prokaryotische Zellen, insbesondere pflanzliche und tierische Zellen, Bakterien, Pilze und dergleichen verstanden, wobei auch Zellfragmente, wie beispielsweise Zellwände, Zellwandbestandteile (Peptidogly-kan, S-Schichten, Lipopolysaccharid usw.), Zellmembrane, Zellmembranbestandteile (Transmembranproteine usw.)mit umfasst sein sollen. Vorzugsweise werden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren vollständige Zellen isoliert. Vorzugsweise werden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren pathogene, insbesondere human- und tierpathogene, Mikroorganismen, isoliert. „Viren" umfassen alle bekannten Viren, für die es möglich ist, Bindungspartner (z.B. Antikörper) zur Verfügung zu stellen, wobei die Viren vorzugsweise an deren Oberfläche zugängliche Epitope oder sonstige Bindungspartner aufweisen. Das erfindungsgemäße Verfahren weist aber vor allem im Hinblick auf Zellen, insbesondere eukaryotische und prokaryotische Zellen, die herausragenden Vorteile gegenüber dem Stand der Technik auf.Under the term "cell " According to the present invention, i.a. Microorganisms, eukaryotic and prokaryotic cells, in particular plant and animal cells, bacteria, fungi and the like understood, whereby also cell fragments, such as cell walls, cell wall components (Peptidogly-kan, S-layers, lipopolysaccharide, etc.), cell membranes, cell membrane components (transmembrane proteins, etc. ) should be included. Preferably, complete cells are isolated by the method according to the invention. Preferably, pathogenic, in particular human and animal pathogenic, microorganisms are isolated by the method according to the invention. "Viruses " include all known viruses for which it is possible to provide binding partners (e.g., antibodies), which viruses preferably have epitopes or other binding partners accessible on their surface. However, the method according to the invention has the outstanding advantages over the prior art, especially with regard to cells, in particular eukaryotic and prokaryotic cells.

Vorzugsweise werden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eukaryotische Zellen isoliert, die in biologischen Flüssigkeiten (z.B. Blut) bzw. Geweben Vorkommen. Derartige Zellen sind beispielsweise T-Zellen, B-Zellen, Krebszellen und dgl., wobei in einem derartigen Fall die biologische Probe von einem Säuger (Mensch oder Tier) bereitgestellt wird.Preferably, the method of the present invention isolates eukaryotic cells present in biological fluids (e.g., blood) or tissues. Such cells are, for example, T cells, B cells, cancer cells and the like, in which case the biological sample is provided by a mammal (human or animal).

Die "ferromagnetische" Eigenschaft eines Partikels ist dadurch charakterisiert, dass die elementaren magnetischen Momente der Partikel eine parallele Ordnung aufweisen. Ferromagnetische Ordnung bei Raumtemperatur zeigen die Metalle Eisen, Nickel und Kobalt sowie diverse Legierungen davon. Hierbei ist es unerheblich, ob die Metalle kristallin oder amorph vorliegen. Die magnetische Ordnung wird bei hohen Temperaturen aufgebrochen, die Ferromagneten werden dann paramagnetisch. Die Temperatur, ab der die ferromagnetische Ordnung verschwindet, wird als Curie-Temperatur Tc bezeichnet. Bei tiefen Temperaturen beobachtet man ferromagnetische Ordnung auch bei Stoffen, die bei Raumtemperatur paramagnetisch oder superparamagnetisch sind, wie z.B. bei den Lanthanoiden Gadolinium und Dysprosium. Ferromagnetische Eigenschaften einer Substanz bzw. eines Partikels, die von Partikelgröße, Material und Temperatur abhängen, können beispielsweise durch die Aufnahme von Hysteresekurven bestimmt - 4 - 4 ·· • · ·4·« ·· ·· • · · · • · · • · · • · · «· ···· werden (siehe beispielsweise Abstract-Book "Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers", May 20-22,2004 Lyon, France). Dadurch wird es ermöglicht im gewünschten Temperaturbereich (z.B. zwischen 4 und 90°C) die Partikelgröße und das Material der zu verwendenden Partikel in einfacher Weise zu bestimmen, so dass diese auch tatsächlich ferromagnetische Eigenschaften aufweisen. Erfindungswesentlich ist dabei immer, dass bei der Durchführung des Verfahrens die Partikel ferromagnetisch sind, dass also z.B. Temperatur, Größe der Teilchen und Natur der Teilchen (beispielsweise die exakte Zusammensetzung der Partikel) immer so eingestellt werden, dass die Partikel im Rahmen der Bindung an den Magneten ferromagnetische Eigenschaften aufweisen. Diese Einstellung ist für den Fachmann ohne Weiteres auf Basis seines Fachwissens und der hier beschriebenen Offenbarung für den individuellen Verfahrensansatz möglich.The " ferromagnetic " Property of a particle is characterized by the fact that the elementary magnetic moments of the particles have a parallel order. Ferromagnetic order at room temperature show the metals iron, nickel and cobalt and various alloys thereof. It does not matter whether the metals are crystalline or amorphous. The magnetic order is broken at high temperatures, the ferromagnets then become paramagnetic. The temperature at which the ferromagnetic order disappears is called the Curie temperature Tc. At low temperatures, ferromagnetic ordering is also observed for substances which are paramagnetic or superparamagnetic at room temperature, e.g. in the lanthanides gadolinium and dysprosium. Ferromagnetic properties of a substance or a particle, which depend on particle size, material and temperature, can be determined, for example, by recording hysteresis curves - 4 - 4 ·· · · · 4 ·· ·· ·· · · · · · · · ··························· (see, for example, Abstract-Book " Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers ", May 20-22, 24004 Lyon, France). This makes it possible in the desired temperature range (for example, between 4 and 90 ° C) to easily determine the particle size and the material of the particles to be used, so that they actually have ferromagnetic properties. It is always essential to the invention that in carrying out the method the particles are ferromagnetic, that is, e.g. Temperature, size of the particles and nature of the particles (for example, the exact composition of the particles) are always adjusted so that the particles in the context of binding to the magnet have ferromagnetic properties. This setting is readily apparent to one of ordinary skill in the art based on his or her expertise and disclosure of the individual method approach described herein.

In Molday RS und MacKenzie D (J Immunol Methods (1982), 52:353-367) wird die Markierung und Isolierung von Zellen mit ferromagnetischen Eisen-Dextran-Partikeln, deren Kern eine Größe von 15 nm aufweist, beschrieben. In Molday RS und Molday LL (FEBS Lett (1984), 170:232-238) werden rote Blutkörperchen mittels Dextran-SPIO ("superparamagnetic iron oxide")-Partikel markiert und durch Anlegen eines Hochgradientenfeldes getrennt. Derartige Dextran-SPIO Partikel wurden nach der Methode von Molday (1982) von Dodd et al. (Biophys J (1999), 76:103-109) gereinigt und als superparamagnetisch beschrieben. Die in Molday (1982) beschriebenen Partikel mit einer Kerngöße von 15 nm können bei einer Temperatur >273 K nicht ferromagnetisch sein.In Molday RS and MacKenzie D (J Immunol Methods (1982), 52: 353-367), the labeling and isolation of cells with ferromagnetic iron-dextran particles whose core has a size of 15 nm is described. In Molday RS and Molday LL (FEBS Lett (1984), 170: 232-238) red blood cells are labeled by means of dextran SPIO ("superparamagnetic iron oxide") particles and separated by applying a high gradient field. Such dextran-SPIO particles were prepared by the method of Molday (1982) by Dodd et al. (Biophys J (1999), 76: 103-109) and described as superparamagnetic. The particles with a core size of 15 nm described in Molday (1982) can not be ferromagnetic at a temperature of> 273 K.

Die Probe, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bereitgestellt wird, kann entweder direkt im Verfahren eingesetzt werden oder einer entsprechenden Probenvorbereitung unterzogen werden. Diese Probenvorbereitung hängt dabei jeweils von der verwendeten Probe ab. So kann beispielsweise eine Nahrungsmittelprobe zunächst homogenisiert oder suspendiert werden oder aber auch eine Blutprobe kann entsprechend in Fraktionen geteilt werden. Entscheidend bei der Probenvorbereitung ist jedenfalls, dass die Aufbereitungsschritte keinen Einfluss auf das spätere Bindungsverhalten des zu isolierenden Materials mit gegebenenfalls funktionalisierten Partikeln haben. Überraschenderweise wurde festgestellt, dass sich besonders ferromagnetische Partikel zur Isolierung von Zellen oder Viren besonders gut eignen. Ferromagnetische Partikel wirken selbst magnetisch und weisen dadurch eine hohe Affinität gegenüber anderen magnetisch wirkenden Materialien auf. Vor allem in Anbetracht der Tatsache, dass beispielsweise in der US 6 020 210 darauf hingewiesen wird, dass sich ferromagnetische Partikel mit einer dauerhaften Magnetisierung nicht zur Isolierung von Zellen aus biologischen Proben eignen, da Suspensionen mit ferromagnetischen Partikeln zür Aggregation tendieren, zeigt die überraschende Wirkung ferromagnetischer Partikel bei Zellisolierungen auf. Die ferromagnetischen Partikel können erfindungsgemäß zur Gänze oder, in einer bevorzugten Ausführungsform, nur teilweise aus mindestens einem ferromagnetischen Material bestehen, vorausgesetzt, dass die ferromagnetischen Eigenschaften des gesamten Partikels erhalten bleiben. Deshalb können die Zell-Partikel-Komplexe mit einem Magneten aus Suspensionen in kürzester Zeit isoliert werden, wohingegen mit superparamagnetischen Partikeln eine Isolierung sich langwierig gestaltet. Bei viskosen Proben (z.B. Käseschmelzen) beispielsweise kann eine Zell-Isolierung mit superparamagnetischen Partikel^ in kurzer Zeit nicht erfolgen, wobei viele dieser Partikel in der Probenmatrix selbst haften bleiben würden.The sample provided by the method according to the invention can either be used directly in the method or subjected to a corresponding sample preparation. This sample preparation depends on the sample used. For example, a food sample can first be homogenized or suspended, or a blood sample can be divided into fractions accordingly. In any case, it is crucial for the sample preparation that the treatment steps have no influence on the later binding behavior of the material to be isolated with optionally functionalized particles. Surprisingly, it has been found that particularly ferromagnetic particles are particularly well suited for the isolation of cells or viruses. Ferromagnetic particles themselves act magnetically and thus have a high affinity for other magnetically acting materials. Especially in view of the fact that it is pointed out, for example, in US Pat. No. 6,020,210 that ferromagnetic particles with permanent magnetization are not suitable for the isolation of cells from biological samples, since suspensions with ferromagnetic particles tend to aggregate, the surprising effect appears ferromagnetic particles in cell isolations. According to the invention, the ferromagnetic particles may consist entirely or, in a preferred embodiment, only partially of at least one ferromagnetic material, provided that the ferromagnetic properties of the entire particle are retained. Therefore, the cell-particle complexes can be isolated with a magnet from suspensions in a very short time, whereas with superparamagnetic particles, isolation takes a long time. For example, with viscous samples (e.g., cheese melts), cell isolation with superparamagnetic particles can not occur in a short time, with many of these particles sticking to the sample matrix itself.

Nach dem Inkontaktbringen der Probe mit den ferromagnetischen Partikeln wird die daraus resultierende Suspension für mindestens 1 Minute, mindestens 5 Minuten, mindestens 10 Minuten, inkubiert, wobei die bevorzugte Inkubationstemperatur maximal 80°C, vorzugsweise maximal 60°C, noch mehr bevorzugt maximal 40°C, insbesondere maximal 30°C, beträgt. Höhere Inkubationstemperaturen können beispielsweise für bei Raumtemperatur zähflüssige Proben verwendet werden (z.B. Käseproben), wobei aber berücksichtigt werden muss, dass die höhere Temperatur die Bindung der Zellen an die Partikel nicht negativ beeinflusst oder sogar verhindert. Dennoch wird Raumtemperatur (16° bis 26° C) als Inkubationstemperatur bevorzugt. Die Inkubationszeit hängt vor allem von der Konzentration der zu isolierenden Zellen oder Viren in der Probe und von der Bindungsstärke zwischen diesen und den gegebenenfalls funktionalisierten Partikeln ab. Daher kann die Inkubationszeit je nach Proben und Partikeleigenschaften variieren. Nach Ablauf der Inkubation werden die Partikel aus der Probenpartikelsuspension abgetrennt und gege- benenfalls einer weiteren Bearbeitung unterzogen. Die Abtrennung der Partikel kann dabei, entweder aufgrund der magnetischen Eigenschaften dieser Partikel oder durch herkömmliche Methoden, sofern dies die Probe erlaubt, z.B. durch Filtration, Dekantation oder Zentrifugation erfolgen. Erfolgt die Abtrennung der Partikel aus der Proben-Partikel-Suspension nicht aufgrund der magnetischen Eigenschaften, weist das erfindungsgemäße Verfahren dennoch viele Vorteile auf, denn eine weitere Verarbeitung der Zellen bzw. der Viren, die an den Partikeln gebunden sind, wird um ein vielfaches erleichtert. So können beispielsweise die abzentrifugierten Partikel vom Probenüberstand durch einfaches Abpipettieren abgetrennt werden und anschließend in einer Vorrichtung wie in der US 5,770,459 oder in der US 5,744,367 beschrieben weiter untersucht werden.After contacting the sample with the ferromagnetic particles, the resulting suspension is incubated for at least 1 minute, at least 5 minutes, at least 10 minutes, with the preferred incubation temperature being at most 80 ° C, preferably at most 60 ° C, more preferably at most 40 ° C, in particular at most 30 ° C, is. Higher incubation temperatures may be used, for example, for viscous samples at room temperature (e.g., cheese samples), but it must be kept in mind that the higher temperature does not adversely affect or even prevent the binding of the cells to the particles. Nevertheless, room temperature (16 ° to 26 ° C) is preferred as the incubation temperature. The incubation time depends above all on the concentration of the cells or viruses to be isolated in the sample and on the bond strength between these and the optionally functionalized particles. Therefore, the incubation time may vary depending on the samples and particle properties. After the incubation, the particles are separated from the sample particle suspension and, if appropriate, subjected to further processing. The separation of the particles may thereby, either due to the magnetic properties of these particles or by conventional methods, if the sample allows, e.g. by filtration, decantation or centrifugation. If the separation of the particles from the sample-particle suspension does not take place on account of the magnetic properties, the method according to the invention nevertheless has many advantages, since a further processing of the cells or of the viruses bound to the particles is facilitated many times , Thus, for example, the centrifuged particles can be separated from the sample supernatant by simply pipetting off and then further investigated in a device as described in US Pat. No. 5,770,459 or in US Pat. No. 5,744,367.

Nach der Isolierung der Zellen bzw. der Viren können diese direkt am Partikel oder nach der Abtrennung von diesem mittels einer Nukleinsäureamplifikation analysiert werden. Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass die Zell-/Viren-Partikel-Suspensionen direkt einer Nukleinsäureamplifikation unterworfen werden können, ohne dass.die Anwesenheit von .ferromagnetischen Partikeln diese Reaktion in irgendeiner Weise beeinträchtigt.After isolation of the cells or of the viruses, these can be analyzed directly on the particle or after the separation thereof by means of a nucleic acid amplification. It has surprisingly been found that the cell / viral particle suspensions can be directly subjected to nucleic acid amplification without the presence of .ferromagnetic particles interfering with this reaction in any way.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die Probe eine Nahrungsmittelprobe, Fäcesprobe, Blutprobe, Serumprobe, Probe biologischen Ursprungs, Umweltprobe oder industrielles Zwischenoder Endprodukt.In a preferred embodiment, the sample is a food sample, faeces sample, blood sample, serum sample, biological origin sample, environmental sample, or industrial intermediate or final product.

Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass sich das erfindungsgemäße Verfahren für jegliche Art von Proben eignet, wobei ferner festgesteilt wurde, dass dieses Verfahren vor allem bei sehr zähflüssigen und inhomogenen Proben einsetzbar ist. Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Veifahren zum-Isolieren von Zellen oder Viren aus Fäcesproben oder aus Käseschmelzen bzw. Käsesuspensionen, Milch und dergleichen verwendet werden. Industrielle Prozesse, wie z.B. die Produktion von Lebensmitteln, erfordern unter Umständen eine regelmäßige Kontrolle der Zwischen- und Endprodukte auf mögliche Kontaminationen.It has surprisingly been found that the method according to the invention is suitable for any type of samples, it being further noted that this method can be used above all for very viscous and inhomogeneous samples. For example, the method of isolating cells or viruses from feces samples, or from cheese or cheese suspensions, milk, and the like can be used. Industrial processes, such as The production of food may require regular monitoring of the intermediate and final products for possible contamination.

Selbstverständlich kann das erfindungsgemäße Verfahren auch dazu verwendet werden Zellen und Viren aus einer Probe zu isolieren, um beispielsweise die Zellzahl bzw. den Virustiter in der Probe zu reduzieren. Somit wird erfindungsgemäß unter "isolieren” nicht nur ein analytischer bzw. präparativer Verfahrens- 7 ···· • ··· ···· • · • ·Of course, the inventive method can also be used to isolate cells and viruses from a sample, for example, to reduce the cell count or the virus titer in the sample. Thus, according to the invention, the term "isolate" does not just mean an analytical or preparative process. 7 ···· · ··· ···· · · · ·

• I • · • · · ···· • · · • ·· schritt definiert.• I • · • · · ···· • · · • ·· step defined.

Vorzugsweise umfassen die Partikel ein ferromagnetisches Material, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Eisen, insbesondere Magnetit und Maghemit, Eisenlegierungen, Nickel, Nickellegierungen, Kobalt, Kobaltlegierungen und Kombinationen davon. Je nach Zusammensetzung des Materials (von z.B. Fe75Co25 über Fe, zu Fe304 erhöht sich die magnetophoretische Mobilität bei gegebenem Partikeldurchmesser. Um den ferromagnetischen Zustand bei angesprochenen Temperaturen zu erhalten, müssen entsprechende Partikeldurchmesser gewählt werden, weil selbst Co- oder CoFe-Nanokristalle hervorragende magnetische Momente aufweisen, jedoch wegen ihrer Kleinheit superparamagnetisch sind. Eine umfassende Darstellung der Herstellung, Eigenschaften und Anwendungen findet sich im Abstract-Book "Scientific and Clini-cal Applications of Magnetic Carriers" (May 20-22,2004 Lyon, France), insbesondere die Abhängigkeit der ferromagnetischen Temperatur von der Partikelgröße, die Mobilität, abhängig von Größe und Material, und der hydrodynamische Durchmesser.Preferably, the particles comprise a ferromagnetic material selected from the group consisting of iron, especially magnetite and maghemite, iron alloys, nickel, nickel alloys, cobalt, cobalt alloys, and combinations thereof. Depending on the composition of the material (eg Fe75Co25 over Fe, Fe304, the magnetophoretic mobility increases for a given particle diameter.) To obtain the ferromagnetic state at the given temperatures, appropriate particle diameters have to be chosen, because even Co or CoFe nanocrystals have excellent magnetic moments For a full account of their fabrication, properties, and applications, see the abstract book "Scientific and Clini-cal Applications of Magnetic Carriers" (May 20-22, 24004 Lyon, France), in particular US Pat Dependence of ferromagnetic temperature on particle size, mobility, depending on size and material, and hydrodynamic diameter.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die ferromagnetischen Partikel mit Silizium oder Silizj-umver-bindungen, Gold, Glas, Polysacchariden, insbesondere Dextran, Kunststoff, Proteinen, Nukleinsäuren oder Kombinationen davon beschichtet. Weitere Materialien für die Beschichtung bzw. Beschichtungsverfahren können im Abstract-Book "Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers" (May 20-22,2004 Lyon, France) gefunden werden.According to a further preferred embodiment, the ferromagnetic particles are coated with silicon or silicon compounds, gold, glass, polysaccharides, in particular dextran, plastic, proteins, nucleic acids or combinations thereof. Further materials for the coating or coating processes can be found in the abstract book "Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers". (May 20-22,2004 Lyon, France).

Eine mögliche Funktionalisierung der ferromagnetischen Partikel setzt voraus, dass die Oberfläche dieser Partikel de-rivatisiert werden kann. Ferromagnetische Materialien können direkt derivatisiert bzw. funktionalisiert werden oder aber vorzugsweise mit einer entsprechenden Oberfläche versehen, die beispielsweise aus Silizium oder Siliziumverbindungen, Kunststoff, Gold, Glas oder Polysacchariden, wie Dextran, besteht. Dabei kann das ferromagnetische Material den Kern der Partikel bilden oder in eine Matrix bestehend aus den oben angeführten Beschichtungsmaterialien eingebettet werden, wobei bei einer derartigen Ausführungsform auch mehrere ferromagnetische „Kerne" in ein Partikel eingebracht werden können. Um schließlich funktionelle Gruppen an die Oberfläche der ferromagnetischen Partikel effizient zu binden, werden daran Carboxy-, Amin-,A possible functionalization of the ferromagnetic particles requires that the surface of these particles can be de-privatized. Ferromagnetic materials can be directly derivatized or functionalized or preferably provided with a corresponding surface, which consists for example of silicon or silicon compounds, plastic, gold, glass or polysaccharides, such as dextran. In this case, the ferromagnetic material may form the core of the particles or be embedded in a matrix consisting of the above-mentioned coating materials, wherein in such an embodiment, also several ferromagnetic "cores". can be introduced into a particle. Finally, to efficiently bind functional groups to the surface of the ferromagnetic particles, carboxy-, amine-,

Tosyl-, Epoxy-, Hydroxy- und Hydrazidgruppen, Streptavidin und His-tag gebunden, wie diese bereits bei paramagnetischen und superparamagnetischen Partikeln erfolgt.Tosyl, epoxy, hydroxy and hydrazide groups, streptavidin and His-tag bound, as already done in paramagnetic and superparamagnetic particles.

Vorzugsweise weisen die Partikel einen Durchmesser von 50 nm bis 20 μπι, vorzugsweise von 200 nm bis 5 μπι, insbesondere von 400 nm bis 2,5 μπι auf. Vorzugsweise wird eine Partikelgröße gewählt, welche vom verwendeten magnetischen Material abhängt, so dass die magnetophoretische Mobilität möglichst hoch ist, aber das magnetische Moment noch klein genug ist, die gebildeten Aggregate durch Bewegen der Suspension, z.B. durch Pipettieren, Drehen am Rotamix oder im Ultraschallbad zumindest teilweise aufzulösen.Preferably, the particles have a diameter of 50 nm to 20 μπι, preferably from 200 nm to 5 μπι, in particular from 400 nm to 2.5 μπι on. Preferably, a particle size is chosen which depends on the magnetic material used, so that the magnetophoretic mobility is as high as possible, but the magnetic moment is still small enough, the aggregates formed by moving the suspension, e.g. by pipetting, rotating the Rotamix or in the ultrasonic bath at least partially dissolve.

In diesem Zusammenhang wird unter „Durchmesser" die größte Entfernung zwischen den Schnittpunkten eines Körpers mit einer Geraden, die durch den Körpermittelpunkt (Körperzentrum) verläuft .In this context, under "Diameter " the greatest distance between the intersections of a body with a straight line passing through the body center (body center).

Vorzugsweise sind die ferromagnetischen Partikel funktio-nalisiert, insbesondere mit mindestens einem Zell- oder Virenspezifischen Bindungspartner.Preferably, the ferromagnetic particles are functionalized, in particular with at least one cell- or virus-specific binding partner.

Die auf den Partikeln vorgesehenen Bindungspartner weisen eine Spezifizität gegenüber den zu isolierenden Zellen bzw. Viren auf. Dabei ist jedenfalls darauf zu achten, dass der Bindungspartner spezifisch jene Teile erkennt, die auch tatsächlich in der Probe zugänglich sind. Hierzu eignen sich beispielsweise an der Zelloberfläche befindliche Liganden bzw. Epi-tope (z.B. Kohlehydratstrukturen, Antigene).The binding partners provided on the particles have a specificity with respect to the cells or viruses to be isolated. In any case, it must be ensured that the binding partner specifically recognizes those parts that are actually accessible in the sample. For example, cell surface ligands or epitopes (e.g., carbohydrate structures, antigens) are useful herein.

Vorzugsweise ist der mindestens eine Bindungspartner ein Antikörper oder Antikörperfragment, Protein A, Protein G, ein Lektin, ein Peptid, eine Nukleinsäure oder eine Kombination davon .Preferably, the at least one binding partner is an antibody or antibody fragment, protein A, protein G, a lectin, a peptide, a nucleic acid or a combination thereof.

Dennoch ist es aber durchaus möglich Zellen, die selbst magnetische Eigenschaften aufweisen, aus einer Probe direkt mit ferromagnetischen Beads zu isolieren, ohne dass diese funktio-nalisiert werden müssen. Zu derartigen Zellen zählen Mikroorganismen wie z.B. Magnetospirillum magneticum oder Aquaspiril-lum magnetotacticum.Nevertheless, it is quite possible to isolate cells, which themselves have magnetic properties, from a sample directly with ferromagnetic beads, without these having to be functionalized. Such cells include microorganisms such as e.g. Magnetospirillum magneticum or Aquaspiril-lum magnetotacticum.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann die Abtrennung mittels einer magnetischen Vorrichtung erfolgen.According to a preferred embodiment, the separation can be effected by means of a magnetic device.

Die Abtrennung der Partikel aus der Proben-Partikel-Suspension kann entweder durch, wie bereits zuvor erwähnt, Me- thoden wie Zentrifugation oder durch das Anbringen eines magnetischen Feldes mit Hilfe einer magnetischen Vorrichtung erfolgen. Dabei wird zu dem gewünschten Zeitpunkt ein Magnetfeld an den Behälter angelegt, wodurch die ferromagnetischen Partikel an der Wand des Gefäßes immobilisiert werden. Anschließend kann der Überstand in einfacher Weise entfernt werden.The separation of the particles from the sample-particle suspension can be carried out either by means, as already mentioned, methods such as centrifugation or by the application of a magnetic field by means of a magnetic device. In this case, a magnetic field is applied to the container at the desired time, whereby the ferromagnetic particles are immobilized on the wall of the vessel. Subsequently, the supernatant can be easily removed.

Vorzugsweise ist die magnetische Vorrichtung als Magnet, insbesondere als Elektro- oder Permanentmagnet, ausgebildet.Preferably, the magnetic device is designed as a magnet, in particular as an electric or permanent magnet.

Die Verwendung eines Elektomagneten zur Abtrennung der Partikel weist vor allem den Vorteil auf, dass die Stärke des Magnetfeldes durch das Anlegen eines Stromflusses beeinflusst werden kann. Dadurch wird es ermöglicht, den Elektromagneten dauerhaft an eine Vorrichtung (z.B. Behältnis, Schlauch) anzubringen und das Magnetfeld je nach Bedarf zu steuern. Im Gegensatz dazu ist das Magnetfeld gänzlich unabhängig vom Vorhandensein eines Stromflusses, wodurch aber zur Variation der Magnetfeld-Stärke der Magnet selbst entfernt werden muss. Für Einzelproben können beispielsweise Elektromagneten, für Automaten mit hohem Probendurchsatz Permanentmagneten, Anwendung finden.The use of an electromagnet for separating off the particles has the particular advantage that the strength of the magnetic field can be influenced by the application of a current flow. This allows the electromagnet to be permanently attached to a device (e.g., container, tube) and the magnetic field to be controlled as needed. In contrast, the magnetic field is completely independent of the presence of a current flow, whereby, however, for the variation of the magnetic field strength of the magnet itself must be removed. For example, electromagnets, for machines with high sample throughput permanent magnets, can be used for individual samples.

Das,erfindungsgemäße Verfahren kann auch .dazu verwendet werden, Zellen oder Viren zunächst aus einer Probe zu isolieren, um diese dann anschließend in einem Detektionsschritt zu detek-tieren und gegebenenfalls deren Konzentration in der Probe zu bestimmen. Auch hierbei wird zunächst die Probe mit funktio-nalisierten ferromagnetischen Partikeln in Kontakt gebracht. Dadurch wird es ermöglicht, dass die so isolierenden Zellen oder Viren an diese Partikel immobilisiert werden können. Im Anschluss an diesen Bindungsschritt werden die Partikel aus der Probepartikelsuspension abgetrennt, wobei eine Abtrennung durch Methoden wie Zentrifugation oder Filtration erfolgen kann oder aber durch das Anlegen eines magnetischen Feldes. Um schließlich die vorhandenen Zellen bzw. Viren qualitativ und quantitativ zu bestimmen, werden die Partikel, an denen sich die Zellen oder Viren bzw. Fragmente davon befinden, mit entsprechenden spezifischen Primern versetzt. Nach dem Durchführen einer Nukleinsäureamplifikation wird gegebenenfalls qualitativ und/oder quantitativ die Anwesenheit von Zellen oder Viren in der Probe durch die Detektion mindestens eines Amplifikationsprodukts bestimmt. Ein (oder mehrere) durch die Nukleinsäureamplifikationstechnik erzeugtes, für eine Zelle bzw. einen Virus spezifisches, Frag- ment kann durch bekannte Verfahren, wie z.B. Southern-Blot, Gel-Elektrophorese (mit Silber- oder Coomassie-Färbung), Photometrie, bestimmt werden.The method according to the invention can also be used to first isolate cells or viruses from a sample in order subsequently to detect them in a detection step and, if appropriate, to determine their concentration in the sample. Again, the sample is first brought into contact with functionalized ferromagnetic particles. This makes it possible that the thus insulating cells or viruses can be immobilized on these particles. Following this binding step, the particles are separated from the sample particle suspension, which can be separated by methods such as centrifugation or filtration or by the application of a magnetic field. Finally, in order to qualitatively and quantitatively determine the existing cells or viruses, the particles on which the cells or viruses or fragments thereof are located are mixed with corresponding specific primers. After performing a nucleic acid amplification, the presence of cells or viruses in the sample is optionally qualitatively and / or quantitatively determined by the detection of at least one amplification product. One (or more) fragment specific to a cell or virus produced by the nucleic acid amplification technique may be prepared by known methods, such as the method described in U.S. Pat. Southern blot, gel electrophoresis (with silver or Coomassie staining), photometry.

Die in diesem Verfahren zu verwendenden von Zell- oder Vi-ren-spezifischen Primer können beispielsweise aus bereits bekannten Nukleinsäuredaten abgeleitet werden.The cell- or Vi-specific primers to be used in this method can be derived, for example, from already known nucleic acid data.

Vorzugsweise werden zwischen der Abtrennung der Partikel und dem Inkontaktbringen der Partikel mit Zell- oder Viren-spezi-fischen Primern die an den Partikeln gebundenen Zellen zumindest teilweise lysiert werden.Preferably, between the separation of the particles and the contacting of the particles with cell- or virus-specific primers, the cells bound to the particles will be at least partially lysed.

Durch das Lysieren der an den Partikeln gebundenen Zellen wird die in diesen Zellen vorhandene Nukleinsäuren (u.a. DNA, RNA, mRNA) den Primern zugänglich gemacht. Die Lyse der Zellen erfolgt dabei durch im Stand der Technik bekannte Methoden, insbesondere durch einen Hitzeschock (z.B. 95°C) oder durch chemische bzw. biochemische Reagenzien, wie z.B. Lysozym. Um mögliche Inhibitoren oder Enyzme, insbesondere Proteasen und Restriktionsenzyme, die die Nukleinsäureamplifikation stören könnten, zu entfernen, können die Partikel nach deren Abtrennung mit entsprechenden Lösungen (z.B. Guanidinthiocyanat umfassende Lösungen) behandelt werden.By lysing the cells bound to the particles, the nucleic acids present in these cells (including DNA, RNA, mRNA) are made available to the primers. The lysis of the cells is carried out by methods known in the art, in particular by heat shock (e.g., 95 ° C) or by chemical or biochemical reagents, e.g. Lysozyme. In order to remove potential inhibitors or enzymes, in particular proteases and restriction enzymes, which might interfere with nucleic acid amplification, the particles, after separation, may be treated with appropriate solutions (e.g., solutions comprising guanidine thiocyanate).

Vorzugsweise ist die Nukleinsäureamplifikationstechnik eine Kettenreaktionstechnik (PCR-Technik), wobei diese ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Echtzeit PCR, insbesondere TaqMan PCR (mit Sybr Green markierte Primer/Sonden), verschachtelte PCR („nested PCR"), inverser PCR, Multiplex PCR, asymmetrische PCR, reverse Transkriptase PCR und Kombinationen davon, ist.Preferably, the nucleic acid amplification technique is a chain reaction technique (PCR technique) selected from the group consisting of real-time PCR, in particular TaqMan PCR (Sybr Green-labeled primers / probes), nested PCR ("PCR"), inverse PCR, multiplex PCR, asymmetric PCR, reverse transcriptase PCR and combinations thereof.

Im Prinzip können alle dem Fachmann bekannten Nukleinsäureamplifikationstechniken erfindungsgemäß verwendet werden.In principle, all nucleic acid amplification techniques known to the person skilled in the art can be used according to the invention.

Sollte jedoch auch eine quantitative Aussage über Zellen bzw. Viren in den Proben getroffen werden, eignen sich besonders gut Echtzeit-PCR-Techniken (z.B. TaqMan-PCR). Bei derartigen Techniken, kann bereits im Zuge der PCR eine Aussage getroffen werden, ob und in welcher Konzentration ein spezifisches Fragment, welches durch die Anlagerung einer fluoreszierenden Sonde detektiert wird, in der Probe vorhanden ist.However, should a quantitative statement about cells or viruses be made in the samples, real-time PCR techniques (e.g., TaqMan PCR) are particularly well-suited. With such techniques, a statement can already be made in the course of the PCR as to whether and in which concentration a specific fragment which is detected by the attachment of a fluorescent probe is present in the sample.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können vorzugsweise pathogene Zellen, insbesondere pathogene Mikroorganismen, wie z.B. Mykobakterien, und Viren in einer Probe bestimmt werden.With the method according to the invention, preferably pathogenic cells, in particular pathogenic microorganisms, such as e.g. Mycobacteria, and viruses are determined in a sample.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die ··· #··· - 11Another aspect of the present invention relates to ··· # ··· - 11

·· ·*····· * ··

f »f »

Verwendung von zumindest teilweise ferromagnetischen Partikeln, die gegebenenfalls funktionalisiert sind, zur Isolierung von Zellen oder Viren.Use of at least partially ferromagnetic particles, which are optionally functionalized, for the isolation of cells or viruses.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von ferromagnetischen Partikeln, die gegebenenfalls funktionalisiert sind, zur kombinierten Isolierung und Bestimmung von Zellen oder Viren.Another aspect of the present invention relates to the use of ferromagnetic particles, optionally functionalized, for the combined isolation and detection of cells or viruses.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Kit zur kombinierten Isolierung und Bestimmung von Zellen oder Viren in einer Probe umfassend - funktionalisierte oder funktionalisierbare ferromagnetische Partikel und - Zell- oder Viren-spezifische Primer.Another aspect of the present invention relates to a kit for the combined isolation and determination of cells or viruses in a sample comprising - functionalized or functionalizable ferromagnetic particles and - cell- or virus-specific primers.

Ein erfindungsgemäßer Kit kann sowohl funktionalisierte als auch funktionalisierbare ferromagnetische Partikel umfassen.A kit according to the invention may comprise both functionalized and functionalizable ferromagnetic particles.

Durch das Bereitstellen von funktionalisierbaren ferromagnetischen Partikeln, kann der Benützer dieses Kits beliebige Bindungspartner auf die Partikel aufbringen. Beispielsweise weisen die zu funktionalisierenden Partikel Epoxy-Gruppen an der Oberfläche auf, die direkt mit. Aminogruppen eines Antikörpers reagieren können, um diesen dadurch an den Partikel zu binden.By providing functionalizable ferromagnetic particles, the user of this kit can apply any binding partners to the particles. For example, the particles to be functionalized on the surface of epoxy groups that directly with. Amino groups of an antibody can react to thereby bind this to the particles.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolation und Detektion von Mycobacterium paratu-berculosis, durch die Verwendung eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung.Another aspect of the present invention relates to a method for isolating and detecting Mycobacterium paratuberculosis by the use of a method according to the present invention.

Dabei werden zunächst funktionalisierte ferromagnetische Partikel, die mit M. paratuberculosis zu binden vermögen, mit einer Probe in Kontakt gebracht und isoliert. Der isolierte Zell-Partikel-Komplex wird anschließend direkt oder nach dem Lysieren der Zellen an den Partikeln mit spezifischen Primern versetzt (z.B. P.H. Vary, Journal of Clinical Microbiology (1990) 933-937). Vorzugsweise werden dabei folgenden Primer eingesetzt: forward Primer: MP139U24 5'-CCGCTAATTGAGAGATGCGATTGG-3'; reverse Primer: MP 221L22 5'-GTGCCACAACCACCTCCGTAAC-3', MP219L24: 5'-GTGCCACAACCACCTCCGTAACCG-3'; Sonde für real time PCR: MP204L17: 5'-CGTCATTGTCCAGATCA-3', 5'-TCATTGTCCAGATCA-3'.In this case, first functionalized ferromagnetic particles, which are able to bind with M. paratuberculosis, brought into contact with a sample and isolated. The isolated cell-particle complex is then spiked with specific primers directly or after lysing the cells to the particles (e.g., P.H. Vary, Journal of Clinical Microbiology (1990) 933-937). Preferably, the following primers are used: forward primer: MP139U24 5'-CCGCTAATTGAGAGATGCGATTGG-3 '; reverse primer: MP221L22 5'-GTGCCACAACCACCTCCGTAAC-3 ', MP219L24: 5'-GTGCCACAACCACCTCCGTAACCG-3'; Real time PCR probe: MP204L17: 5'-CGTCATTGTCCAGATCA-3 ', 5'-TCATTGTCCAGATCA-3'.

Die Erfindung wird ferner durch die folgenden Figuren und das folgende Beispiel exemplarisch beschrieben, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein.The invention will be further described by way of example by the following figures and the following example, but without being limited thereto.

Figur 1 zeigt ein Agarose-Gel, auf dem 10μ1 PCR-Amplikon von • · 12 ·· • ··# · PCR's mit den aus Punkt 4 (Beispiel) resultierenden Partikeln (nur gelagert 040813-2, aktiviert 040813-1 und beschichtet 040811-1) durchgeführt wurden.Figure 1 shows an agarose gel on which 10μl PCR amplicon of • · 12 ··· ·· # PCRs with the resulting from item 4 (example) particles (stored only 040813-2, activated 040813-1 and coated 040811 -1) were carried out.

Figur 2 zeigt ein Agarose-Gel: 10μ1 des Amplikons werden am Gel analysiert, wobei eine spezifische Bande in beiden Ansätzen zu sehen ist: Spur 1 ist Isolierung wie unter Punkt 4, Spur 3 wie in Punkt 5 beschrieben; für Spur 2 und Spur 4 wurden die Partikel wie in Punkt 4 und 5 gewaschen, allerdings war die Ausgangsmilch 1:10 mit Cell-Lyse-Puffer verdünnt.Figure 2 shows an agarose gel: 10μl of the amplicon are analyzed on the gel showing a specific band in both batches: lane 1 is isolation as in point 4, lane 3 as described in point 5; for lane 2 and lane 4, the particles were washed as in items 4 and 5, but the starting milk was diluted 1:10 with cell lysis buffer.

Figur 3 zeigt ein Amplifikations-Plot einer Echtzeit-PCR mit SybrGreen (Punkt 11, Beispiel).FIG. 3 shows an amplification plot of a real-time PCR with SybrGreen (point 11, example).

Beispiel: Isolierung, Nachweis und Quantifizierung von Mycobacterium paratuberculosis 1. Allgemeine Reagenzien TPBS: 8g NaCl (Sigma, #S9625), 1,15g Na2HP04x2H20 (Merck, #106580), 0,2g KCl (Merck, #104936), 0,2g KH2P04 (Merck, #104873), 100μ1 Tween20 (Merck, #822184) wurden in Wasser auf 11 aufgefüllt. MES-Puffer: 9,76g MES (Sigma, #M3023) mit 10N NaOH auf pH=5,5 stellen, und auf 11 auffüllen. MOPS-Puffer: 5,23g MOPS (Sigma, #M1254) mit 10N NaOH auf pH=7,5 stellen und auf 11 auffüllen.Example: Isolation, Detection and Quantification of Mycobacterium paratuberculosis 1. General Reagents TPBS: 8g NaCl (Sigma, # S9625), 1.15g Na2 HPOx2H20 (Merck, # 106580), 0.2g KCI (Merck, # 104936), 0.2g KH2PO4 (Merck, # 104873), 100μl Tween20 (Merck, # 822184) were made up to 11 in water. MES Buffer: Set 9.76g MES (Sigma, # M3023) to pH = 5.5 with 10N NaOH and make up to 11. MOPS Buffer: Set 5.23g MOPS (Sigma, # M1254) to pH = 7.5 with 10N NaOH and make up to 11.

Denaturierungspuffer: 560mM NaOH in Wasser.Denaturation buffer: 560 mM NaOH in water.

Hybridisierungspuffer: 0,1N NaH2P04 x H20 in Wasser. CT-Waschpuffer: 20Mm Tris, 150mM NaCl in Wasser pH=7,4.Hybridization Buffer: 0.1N NaH 2 PO 4 x H 2 O in water. CT wash buffer: 20 mM Tris, 150 mM NaCl in water pH = 7.4.

Inhibitor-Removal-Puffer: 2,5M Guanidinthiocyanat, lOmM Tris, ImM EDTA in Wasser, pH=7,0 mit Ethanol auf 70% Ethanol.Inhibitor Removal Buffer: 2.5M guanidine thiocyanate, 10 mM Tris, ImM EDTA in water, pH = 7.0 with ethanol to 70% ethanol.

Cell-Lysis-Puffer: 8g NaCl , 1,15g Na2HP04x2H20 , 0,2g KCl , 0,2g KH2P04 , 100μ1 Tween20, 0,508g MgCl2x6H20, 0,788g vCell Lysis Buffer: 8g NaCl, 1.15g Na 2 H PO 4 x 2 H 2 O, 0.2g KCl, 0.2g KH 2 PO 4, 100μl Tween 20, 0.508g MgCl 2 x 6 H 2 O, 0.788g v

TrisHCl, 0,605g TrisBase, 5ml Triton X-100, 54,75 Saccharose werden mit dH20 auf 500ml aufgefüllt. 2. Ferromagnetische Partikel SIMAG-MP/Carboxyl (Chemicell,Berlin), wässerige Dispersion von magnetischem Silikat, Kern ist Magnetit, Matrix ist nicht poröses Silikat, Größe lpm, Oberfläche ~25m2/g, ~1,5 x 108 Partikel/g, Dichte ~2,25g/cm3, Magnetisierung ist ferromagnetisch, Carboxyl ist funktionelle Gruppe mit 12 Atomen Spacer, Carboxylierungsgrad ist 350μπιο1 COOH/g, Lagerpuffer ist ddH20. 2.1. Partikel-Lagerung 0,8 ml Ferromagnetische Partikel (ChemiCell, SIMAG-MP/TCL) - 13 ·· ► Ψ Φ ► Φ Φ ΦΦ ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ ···♦ • · • · • · *·TrisHCl, 0.655 g TrisBase, 5 ml Triton X-100, 54.75 saccharose are made up to 500 ml with dH20. 2. Ferromagnetic particles SIMAG-MP / Carboxyl (Chemicell, Berlin), aqueous dispersion of magnetic silicate, core is magnetite, matrix is non-porous silicate, size lpm, surface area ~ 25m2 / g, ~ 1.5 x 108 particles / g, Density ~ 2.25g / cm3, magnetization is ferromagnetic, carboxyl is functional group with 12 atoms spacer, degree of carboxylation is 350μπιο1 COOH / g, storage buffer is ddH20. 2.1. Particle storage 0.8 ml ferromagnetic particles (ChemiCell, SIMAG-MP / TCL) - 13 ·· ► Ψ Φ ► Φ Φ ΦΦ ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ ··· ♦ • · • · • · * ·

Suspension werden am Magneten (MagnetOn 4T, Aureon Biosystems, #M010104) abgeschieden, mit 4ml StabilZyme AP (Surmodics, SA01-100) gewaschen, in 20 ml StabilZyme aufgenommen (Endkonzentration von 10mg Partikel/mL) und im Kühlschrank gelagert. 2.2. Partikel-Aktivierung 0,8 ml Ferromagnetische Partikel (ChemiCell, SIMAG-MP/TCL) Suspension werden am Magneten (MagnetOn 4T, Aureon Biosystems, #M010104) abgeschieden, in 1ml MES resuspendiert, am Magneten der Überstand abgenommen und mit 25mg Carbodiimid (Sigma, #E7750) in 1ml MES-Puffer 15 Minuten am Rotamix (RM1 bei 15rpm) aktiviert. Die Partikel werden mit 1ml MOPS-Puffer gewaschen und mit 900μ1 MOPS-Puffer 2 Stunden am RMl gedreht. Danach werden 4ml StabilZyme AE—-(-Surmodics, SA01-100) zugesetzt und über Nacht am RMl gedreht. Durch Abscheiden der Partikel am Magneten, Resuspendieren und erneutes Abscheiden werden die Partikel 2x mit 1ml TPBS und lx mit 1ml StabilZyme gewaschen. Zuletzt werden die Partikel in 20 ml StabilZyme aufgenommen (Endkonzentration von 10mg Partikel/mL) und im Kühlschrank gelagert. 2.3. Antikörperbeschichtung 0,8 ml Ferromagnetische Partikel (ChemiCell, SIMAG-MP/TCL) Suspension werden am Magneten (MagnetOn 4T, Aureon Biosystems, #M010104) abgeschieden, in 1ml MES resuspendiert, am Magneten der Überstand abgenommen und mit 25mg Carbodiimid (Sigma, #E7750) in 1ml MES-Puffer 15 Minuten am Rotamix (RMl bei 15rpm) aktiviert. Die Partikel werden mit 1ml MOPS-Puffer gewaschen und mit 900μ1 Antikörper in MOPS-Puffer (QED Bioscience, 18101-18104) 2 Stunden am RMl gedreht. Danach werden 4ml StabilZyme AP (Surmodics, SA01-100) zugesetzt und über Nacht am RMl gedreht. Durch Abscheiden der Partikel am Magneten, Resuspendieren und erneutes Abscheiden werden die Partikel 2x mit 1ml TPBS und lx mit 1ml StabilZyme gewaschen. Zuletzt werden die Partikel in 20 ml StabilZyme aufgenommen (Endkonzentration von 10mg Partikel/mL) und im Kühlschrank gelagert. 3. Herstellung der Microplatten für Hvbridisierunasassav Streptavidin von Roche wird in Carbonat-Beschichtungspuffer auf eine Konzentration von 2pg/ml verdünnt und die Näpfchen von Weißen -MaxiSorp Microplatten (Nunc, Art-N°437-591) über Nacht bei 4°C mit 100μ1 beschichtet. Die Microplatten werden 4x mit TPBS gewaschen und 100μ1 der Probe Bio-TCATTGTCCAGATCA in TPBS (30pmol/mL) über Nacht bei 4°C gebunden. Nach 4x Waschen mit TPBS werden die Platten getrocknet und eingeschweißt. 4. Isolierung von M. paratuberculosis aus Milch lml einer Suspension von M. paratuberculosis in Rohmilch (Andiatec, Stuttgart) wird mit 10μ1 einer Partikel-Suspension versetzt und 30 Minuten unter zeitweiligem Schütteln inkubiert. Danach werden die Partikel am Magneten abgeschieden und 4 Mal mit CT-Waschlösung durch jeweiliges Abscheiden am Magneten gewaschen. Der Partikel-BaJiterien-Komplex steht nun für weitere Analysen zur Verfügung. 5. Isolierung von M. paratuberculosis DNA aus Milch mittels Inhibitor-Removal-Puffer lml einer Suspension von M. paratuberculosis in Rohmilch (Andiatec, Stuttgart) wird mit 10μ1 der Partikel-Suspension versetzt und 30 Minuten unter zeitweiligem Schütteln inkubiert. Danach werden die Partikel am Magneten abgeschieden und 2 Mal mit Inhibitor-Removal-Puffer, 1 Mal mit CT-Waschlösung/70% EtOH und 1 Mal mit CT-Waschlösung durch jeweiliges Abscheiden am Magneten gewaschen. Der Partikel-DNA-Komplex steht nun für weitere Analysen zur Verfügung. 6. Herstellung von M. paratuberculosis DNA aus Milch lml einer Suspension von M. paratuberculosis in Rohmilch (Andiatec, Stuttgart) wird mit 10μ1 der Partikel-Suspension versetzt und 30 Minuten unter zeitweiligem Schütteln inkubiert. Danach werden die Partikel am Magneten abgeschieden und 4 Mal mit CT-Waschlösung durch jeweiliges Abscheiden am Magneten gewaschen. Der Partikel-Bakterien-Komplex wird in 50μ1 dest. Wasser resuspendiert, 10 min. bei 95°C erhitzt, danach die Partikel am Magneten abgeschieden und der der Überstand in ein frisches Röhrchen übertragen. 7. Herstellung von hochreiner M. paratuberculosis DNA lml einer Suspension von M. paratuberculosis in Rohmilch (Andiatec, Stuttgart) wird mit 10μ1 der Partikel-Suspension versetzt und 30 Minuten unter zeitweiligem Schütteln inkubiert. Danach werden die Partikel am Magneten abgeschieden und 2 Mal mit Inhibitor-Removal-Puffer, 1 Mal mit CT-Waschlösung/70% EtOH und 1 Mal mit CT-Waschlösung durch jeweiliges Abscheiden am Magneten gewaschen. Der Partikel-DNA-Komplex wird in 50μ1 dest. Wasser resuspendiert, 10 min. bei 95°C erhitzt, danach die Partikel am Magneten abgeschieden und der Überstand in ein frisches Röhrchen übertragen. 8. PCR mit PartikelSuspensions are deposited on the magnet (MagnetOn 4T, Aureon Biosystems, # M010104), washed with 4 ml of StabilZyme AP (Surmodics, SA01-100), taken up in 20 ml of StabilZyme (final concentration of 10 mg of particles / ml) and stored in the refrigerator. 2.2. Particle activation 0.8 ml ferromagnetic particles (ChemiCell, SIMAG-MP / TCL) suspension are deposited on the magnet (MagnetOn 4T, Aureon Biosystems, # M010104), resuspended in 1 ml MES, the supernatant is removed from the magnet and mixed with 25 mg carbodiimide (Sigma , # E7750) in 1ml MES buffer for 15 minutes on Rotamix (RM1 at 15rpm). The particles are washed with 1 ml of MOPS buffer and rotated with RMI for 2 hours with 900 μl of MOPS buffer. Then add 4 ml of StabilZyme AE - (- Surmodics, SA01-100) and turn overnight on the RMl. By depositing the particles on the magnet, resuspending and reprecipitating, the particles are washed 2x with 1 ml TPBS and 1x with 1 ml StabilZyme. Finally, the particles are taken up in 20 ml of StabilZyme (final concentration of 10 mg of particles / mL) and stored in the refrigerator. 2.3. Antibody coating 0.8 ml Ferromagnetic particles (ChemiCell, SIMAG-MP / TCL) suspension are deposited on the magnet (MagnetOn 4T, Aureon Biosystems, # M010104), resuspended in 1 ml MES, the supernatant is removed from the magnet and incubated with 25 mg carbodiimide (Sigma, # E7750) in 1ml MES buffer for 15 minutes on rotamix (RMl at 15rpm). The particles are washed with 1 ml of MOPS buffer and rotated for 2 hours at RM1 with 900 μl antibody in MOPS buffer (QED Bioscience, 18101-18104). Then add 4 ml of StabilZyme AP (Surmodics, SA01-100) and turn overnight on the RMl. By depositing the particles on the magnet, resuspending and reprecipitating, the particles are washed 2x with 1 ml TPBS and 1x with 1 ml StabilZyme. Finally, the particles are taken up in 20 ml of StabilZyme (final concentration of 10 mg of particles / mL) and stored in the refrigerator. 3. Preparation of microplates for hybridization Assay Streptavidin from Roche is diluted to a concentration of 2 μg / ml in carbonate coating buffer, and the wells of white -MaxiSorp microplates (Nunc, Art. N ° 437-591) overnight at 4 ° C with 100μl coated. The microplates are washed 4x with TPBS and 100 μl of the Bio-TCATTGTCCAGATCA sample in TPBS (30 pmol / ml) is bound overnight at 4 ° C. After 4x washing with TPBS, the plates are dried and sealed. 4. Isolation of M. paratuberculosis from milk 1 ml of a suspension of M. paratuberculosis in raw milk (Andiatec, Stuttgart) is mixed with 10 μl of a particle suspension and incubated for 30 minutes with occasional shaking. Thereafter, the particles are deposited on the magnet and washed 4 times with CT wash solution by respective deposition on the magnet. The particle-BaJiterien complex is now available for further analysis. 5. Isolation of M. paratuberculosis DNA from milk by means of inhibitor removal buffer 1 ml of a suspension of M. paratuberculosis in raw milk (Andiatec, Stuttgart) is mixed with 10 μl of the particle suspension and incubated for 30 minutes with occasional shaking. Thereafter, the particles are deposited on the magnet and washed twice with Inhibitor Removal Buffer, once with CT Wash Solution / 70% EtOH, and once with CT Wash Solution by respective deposition on the magnet. The particle-DNA complex is now available for further analysis. 6. Preparation of M. paratuberculosis DNA from milk 1 ml of a suspension of M. paratuberculosis in raw milk (Andiatec, Stuttgart) is mixed with 10 μl of the particle suspension and incubated for 30 minutes with occasional shaking. Thereafter, the particles are deposited on the magnet and washed 4 times with CT wash solution by respective deposition on the magnet. The particle-bacterial complex is distilled in 50 μl. Water resuspended, 10 min. heated at 95 ° C, then the particles deposited on the magnet and transferred the supernatant into a fresh tube. 7. Preparation of Highly Pure M. paratuberculosis DNA 1 ml of a suspension of M. paratuberculosis in raw milk (Andiatec, Stuttgart) is mixed with 10 μl of the particle suspension and incubated for 30 minutes with occasional shaking. Thereafter, the particles are deposited on the magnet and washed twice with Inhibitor Removal Buffer, once with CT Wash Solution / 70% EtOH, and once with CT Wash Solution by respective deposition on the magnet. The particle-DNA complex is distilled in 50 μl. Water resuspended, 10 min. heated at 95 ° C, then the particles deposited on the magnet and transfer the supernatant into a fresh tube. 8. PCR with particles

Die aus Punkt 4 resultierenden Partikel (nur gelagert 040813-2, aktiviert 040813-1 und beschichtet 040811-1) werden mit 50μ1 PCR Amplifizierungsmix (Andiatec, Stuttgart) versetzt und lt. Angaben des Herstellers amplifiziert. 10μ1 des Amplikons werden am Gel analysiert, wobei eine spezifische Bande in allen drei Ansätzen zu sehen war (Figur 1). 9. PCR mit Bakterien-Partikel-Komplex und Bakterien-DNA-Kom- plexThe particles resulting from point 4 (stored 040813-2 only, activated 040813-1 and coated 040811-1) are mixed with 50 μl PCR amplification mix (Andiatec, Stuttgart) and amplified according to the manufacturer's instructions. 10μl of the amplicon are analyzed on the gel showing a specific band in all three lanes (Figure 1). 9. PCR with bacterial particle complex and bacterial DNA complex

Die aus Punkt 4 bzw. Punkt 5 resultierenden Partikel wurden mit 50μ1 PCR Amplifizierungsmix (Andiatec, Stuttgart) versetzt und lt. Angaben des Herstellers amplifiziert. 10μ1 des Amplikons werden am Gel analysiert, wobei eine spezifische Bande in beiden Ansätzen zu sehen ist. Spur 1 ist Isolierung wie unter Punkt 4, Spur 3 wie in Punkt 5 beschrieben. Für Spur 2 und Spur 4 wurden die Partikel wie in Punkt 4 und 5 gewaschen allerdings war die Ausgangsmilch 1:10 mit Cell-Lyse-Puffer verdünnt (Figur 2).The particles resulting from point 4 or point 5 were mixed with 50 μl PCR amplification mix (Andiatec, Stuttgart) and amplified according to the manufacturer's instructions. 10μl of the amplicon are analyzed on the gel showing a specific band in both approaches. Lane 1 is insulation as in point 4, lane 3 as described in point 5. For lane 2 and lane 4, the particles were washed as in items 4 and 5, however, the starting milk was diluted 1:10 with cell lysis buffer (Figure 2).

10. Asymmetrische PCR mit DNA10. Asymmetric PCR with DNA

Der Forward Primer wurde aus der Literatur direkt übernommen (P.H. Vary, Journal of Clinical Microbiplogy (1990) 933-937). Dieser Primer wird als MP139U24 (5 *-CCGCTAATTGAGAGATG-CGATTGG-3') bezeichnet. Da jedoch das in diesem Dokument beschriebene Primer-Paar eine nicht ausreichende Spezifität aufwies (aufgrund von Clustal X (1.81) Multiple Sequence Align-ment-Analysen), wurde der Reverse Primer an eine andere Stelle gesetzt. Dies hat den Vorteil, dass das Amplifizierungsprodukt sehr kurz wurde (104bp), bei 95°C nur eine Sekunde denaturiert werden musste und damit die normale wie Real-time PCR sehr schnell und effizient wurde. Zudem kann eine Zwei-stufen-PCR durchgeführt werden, weil die Primer eine hohe Schmelztemperatur aufwiesen.The forward primer was taken directly from the literature (P.H. Vary, Journal of Clinical Microbiplogy (1990) 933-937). This primer is referred to as MP139U24 (5 * -CCGCTAATTGAGAGATG-CGATTGG-3 '). However, because the primer pair described in this document did not have sufficient specificity (due to Clustal X (1.81) Multiple Sequence Alignment analyzes), the reverse primer was placed elsewhere. This has the advantage that the amplification product became very short (104 bp), had to be denatured at 95 ° C for only one second and thus the normal as well as real-time PCR was very fast and efficient. In addition, a two-step PCR can be performed because the primers have a high melting temperature.

Im Anschluss an den Reverse Primer wurde die Probe konzipiert, um den kooperativen Effekt an hybridisierter DNA zu nutzen, falls alle Basenpaare entsprechen. Diese Kumulierung der Unterschiede in den Sequenzen der Capture Probe plus dem sequenzspezifischen Primer sorgt für sehr gute Spezifität der PCR.Following the reverse primer, the sample was designed to exploit the cooperative effect of hybridized DNA if all base pairs match. This accumulation of differences in the sequences of the capture probe plus the sequence-specific primer provides for very good PCR specificity.

Es wurde festgestellt, dass die Reverse Primer MP 221L22 (51-GTGCCACAACCACCTCCGTAAC-3’) und MP219L24 (5'-GTGCCACAACCACCT-CCGTAACCG-3') gemeinsam mit dem oben angeführten Forward Primer und den Sonden MP204L17 (5'-CGTCATTGTCCAGATCA) und 5'-TCATTGTC- - 16 • · ·· ···♦ ···· • · • • · « • · • • · • · ··♦ · ·· CAGATCA die besten Ergebnisse zeigten. Ιμΐ einer Verdünnungsreihe der aus Punkt 6 isolierten DNA-Lösung wurde mit 4pmol/20pl mit dem Fluorescein gelabeltem Primer MP139U24: 5'-F-CCGCTAATTGAGAGATGCGATTGG-31 und 2pmol/20μl mit dem Primer MP219L24: 5·-GTGCCACAACCACCTCCGTAACCG-31 in lx SybrGreen Supermix von BioRad am Biometra TGradient Zyklusr in Gesamtvolumen von 20μ1 asymmetrisch amplifiziert. PCR-Parameter:It was found that the reverse primers MP221L22 (51-GTGCCACAACCACCTCCGTAAC-3 ') and MP219L24 (5'-GTGCCACAACCACCT-CCGTAACCG-3') together with the above-mentioned forward primer and probes MP204L17 (5'-CGTCATTGTCCAGATCA) and 5 '-TCATTGTC- - 16 • ········································································································································································································· Ιμΐ of a dilution series of the DNA solution isolated from point 6 was amplified with 4 pmol/20 μl with the fluorescein labeled primer MP139U24: 5'-F-CCGCTAATTGAGAGATGCGATTGG-31 and 2 pmol/20μl with the primer MP219L24: 5 · -GTGCCACAACCACCTCCGTAACCG-31 in SyxGreen Supermix BioRad amplified asymmetrically on the Biometra TGradient cycle in a total volume of 20μ1. PCR parameters:

Zyklus 1 Wiederholungen 1 3 min 95°C Zyklus 2 Wiederholungen 50 1 sek 95°C 30 sek 65°C Zyklus 3 Wiederholungen 1 - 4 °C 5μ1 der Amplikons wurden entweder 10 min mit 10μ1 Denaturierungspuffer inkubiert und mit 95μ1 Hybridisierungspuffer auf die Platte aufgetragen. Alternativ werden 5μ1 Amplikon mit 95μ1 TPBS auf die Microplatte aufgetragen. 15min bei Raumtemperatur mit Schütteln inkubieren, 4x mit TPBS waschen,.ΙΟΟμΙ anti-Fluo-rescein-AP (Roche) 1:10.000 in StabilZyme bei Raumtemperatur mit Schütteln inkubieren, 4x mit TPBS waschen, ΙΟΟμΙ LumiPhos Plus (Lumigen) 15min bei Raumtemperatur inkubieren und am Luminometer (Mediators PhL) mit 1 sek Integrationszeit messen.Cycle 1 repeats 1 3 min 95 ° C Cycle 2 repeats 50 1 sec 95 ° C 30 sec 65 ° C Cycle 3 repeats 1-4 ° C 5μl of the amplicons were either incubated for 10 min with 10μl denaturation buffer and applied to the plate with 95μl hybridization buffer , Alternatively, 5 μl amplicon with 95 μl TPBS are applied to the microplate. Incubate at room temperature with shaking for 15 min, wash 4x with TPBS, incubate. InμΙ anti-fluorescein-AP (Roche) 1: 10,000 in StabilZyme at room temperature with shaking, wash 4x with TPBS, incubate ΙΟΟμΙ LumiPhos Plus (Lumigen) for 15 min at room temperature and on the luminometer (Mediators PhL) with 1 sec integration time.

Signal (RLU) Mit Denaturierung Ohne Denaturierung Negativ-Kontrolle 0,838 0,761 10"10 Verdünnung 1,002 0,935 10"9 Verdünnung 122,144 153,412 10'8 Verdünnung 152,140 174,279 10"7 Verdünnung 124,972 161,843 11. Echtzeit-PCR mit SybrGreen und DNA Lösung Ιμΐ von Verdünnungen der aus Punkt 6 isolierten DNA-Lösung wurde mit 4pmol/20pl mit dem Primer MP139U24: 5'-CCGCTAATT-GAGAGATGCGATTGG-3' und 4pmol/20pl mit dem Primer MP219L24: 5'-GTGCCACAACCACCTCCGTAACCG-3' in lx SybrGreen Supermix von Bio- ·· ·♦ ··♦♦ Μ«· • · · t ♦ · • · · > · • · ♦ · ··· #··* • * ♦ · # • · · I · · ·· ···· ♦ »·Signal (RLU) Denaturation None Denaturation Negative Control 0.838 0.761 10 "10 Dilution 1.002 0.935 10" 9 Dilution 122.144 153.412 10'8 Dilution 152.140 174.279 10 "7 Dilution 124.982 161.843 11. Real-time PCR with SybrGreen and DNA Solution Ιμΐ of dilutions the DNA solution isolated from item 6 was incubated with 4 pmol / 20 μl with the primer MP139U24: 5'-CCGCTAATT-GAGAGATGCGATTGG-3 'and 4 pmol / 20 μl with the primer MP219L24: 5'-GTGCCACAACCACCTCCGTAACCG-3' in SybGreen Supermix® of ··· ♦ ·· ♦♦ Μ «· · · · t ♦ · · · · > ················································· ·

Rad am iZyklusr in 20μ1 Gesamtvolumen amplifiziert. PCR-Parameter (Ergebnisse in Figur 3):Rad at the iCycle in 20μ1 total volume amplified. PCR parameters (results in FIG. 3):

Zyklus 1 Wiederholungen 1 3 min 95°C A3 Negativ-Kontrolle Zyklus 2 Wiederholungen 50 1 sek 95°C A4 Negativ-Kontrolle 30 sek 67 °C A5 IO'10 Verdünnung Zyklus 3 Wiederholungen 1 - 25 °C A6 10'9 Verdünnung 12. Echtzeit-PCR mit Svbr Green mit und ohne Partikel Ιμΐ der 10'7 Verdünnung aus Punkt 6 isolierten DNA-Lösung wurde mit 4ριηο1/20μ1 mit dem Primer MP139U24: 5'-CCGCTAATT-GAGAGATGCGATTGG-3' und 4ρπιο1/20μ1 mi1* dem Primer MP219L24: 5'-GTGCCACAACCACCTCCGTAACCG-3’ in lx SybrGreen Supermix und lOOpg ferromagnetischen Partikel am iZyklusr mit 20μ1 Gesamtvolumen amplifiziert. Die Partikel wurden vorher mit Milch inkubiert und wie unter Punkt 4 und 5 angegeben gewaschen.Cycle 1 repeats 1 3 min 95 ° C A3 Negative Control Cycle 2 repeats 50 1 sec 95 ° C A4 Negative Control 30 sec 67 ° C A5 IO'10 Dilution Cycle 3 repeats 1 - 25 ° C A6 10'9 Dilution 12 Real-time PCR with Svbr Green with and without particles Ιμΐ of the 10'7 dilution of point 6 isolated DNA solution was performed with 4ριηο1 / 20μ1 with the primer MP139U24: 5'-CCGCTAATT-GAGAGATGCGATTGG-3 'and 4ρπιο1 / 20μ1 mi1 * the Primer MP219L24: 5'-GTGCCACAACCACCTCCGTAACCG-3 'amplified in 1x SybrGreen Supermix and lOOpg ferromagnetic particles on iCycle with 20μl total volume. The particles were previously incubated with milk and washed as indicated under items 4 and 5.

Ergebnisse (Schwellenwertzyklus - „threshold cycle"): Ohne Partikel Zusatz Mit Partikel Zusatz Punkt 4 26,4 26,7 Punkt 5 25,7 26,1 1 PCR-Parameter:Results (Threshold Cycle - "threshold cycle"): Without Particle Supplement With Particle Supplement Point 4 26.4 26.7 Point 5 25.7 26.1 1 PCR Parameter:

Zyklus 1 Wiederholungen 1 3 min 95°C Zyklus 2 Wiederholungen 50 1 sek 95°C 30 sek 65°C Zyklus 3 Wiederholungen 1 Hold 4 °C 13. Echtzeit-PCR mit SybrGreen und DNA Lösung Ιμΐ eine Verdünnungsreihe der aus Punkt 6 isolierten DNA-Lö-sung wurde mit 4pmol/20pl MP139U24: 5’-CCGCTAATTGAGAGATGCGATTGG-3' und 4pmol/20pl mit dem Primer MP219L24: 5'-GTGCCACAACCACCTCCGTAACCG-3' in lx SybrGreen Supermix von Bio-Rad am iZyklusr mit 20μ1 Gesamtvolumen amplifiziert und realtime analysiert.Cycle 1 repeats 1 3 min 95 ° C cycle 2 repeats 50 1 sec 95 ° C 30 sec 65 ° C cycle 3 repeats 1 hold 4 ° C 13. Real-time PCR with SybrGreen and DNA solution Ιμΐ a dilution series of the DNA isolated from point 6 Solution was amplified in real time with 4 pmol/20 μl MP139U24: 5'-CCGCTAATTGAGAGATGCGATTGG-3 'and 4 pmol/20pl with the primer MP219L24: 5'-GTGCCACAACCACCTCCGTAACCG-3' in SybrGreen Supermix from Bio-Rad on iCycle with 20 μl total volume analyzed.

Um die Robustheit zu demonstrieren, wurde zudem zur Probe - 18 ·· • · · • · • · • · ···♦ *·«« ♦··· Ψ · • · • · · • ·· • ♦· ·· · · • ♦ • · • · ··· ·##·In order to demonstrate the robustness, the sample was also tested - 18 ··································································································. · · • ♦ • · • · ··· · ## ·

Hering Sperma DNA zugesetzt. PCR-Parameter:Herring sperm DNA added. PCR parameters:

Zyklus 1 Wiederholungen 1 3 min 95°C Zyklus 2 Wiederholungen 70 1 sek 95°C 30 sek o 0 O Verminderung der Temperatur bei jeder 7. Wiederholung innerhalb des Zyklus um 1°C Zyklus 3 Wiederholungen 1 - 25°CCycle 1 repetitions 1 3 min 95 ° C Cycle 2 repetitions 70 1 sec 95 ° C 30 sec o 0 O Reduction of the temperature at each 7th repetition within the cycle by 1 ° C Cycle 3 repetitions 1 - 25 ° C

Ergebnisse (Schwellenwertzyklus - „threshold cycle"):Results (Threshold Cycle - "threshold cycle"):

Ohne DNA Zusatz Mit 200ng Hering Sperma DNA 10~10 Verdünnung 34,4 40,8 10“9 Verdünnung 31,9 35,8 IO-8 Verdünnung 28,5 32,2 10~7 Verdünnung 25,5 29,2Without DNA Addition With 200ng of herring sperm DNA 10 ~ 10 Dilution 34.4 40.8 10 "9 Thinner 31.9 35.8 IO-8 Dilution 28.5 32.2 10 ~ 7 Dilution 25.5 29.2

Die Schmelzkurve ergab eine Schmelztemperatur von 79°C für das Produkt der Internen Kontrolle und 86°C für das Produkt der M. paratuberculosis PCR. 14. Vergleich der Geschwindigkeit des Fanaens ferromagnetischer Partikel mit suoerparamaanetischen Partikeln 20pg von Alkalischer Phosphatase beschichteten Partikeln (Streptavidin-Partikel mit Überschuss biotin-AP inkubiert und gewaschen mit TPBS) wurden in 1 ml TPBS in 1,5ml Eppendorf Cups suspendiert und mit 2 Sekunden Inkubationszeit mit dem Aureon Separation Pen (M020101, Aureon, Wien) aus der Suspension gewonnen und danach in 1ml TPBS resuspendiert. 10μ1 der Ausgangssuspension sowie der isolierten Beads wurden in einer weißen Mi-croplatte nach 15 Minuten Inkubatioszeit mit ΙΟΟμΙ LumiPhos Plus (Lumigen, USA) am mediators PhL mit 1 Sekunde Integrationszeit gemessen. - 19 ·· ·· • t · · • · · • · · • · · ·· ···· • ·· ·· · * • · • · • · ··· ···· • •Μ #··· • · • · RLU Rest-Suspension Isolierte Partikel aus der Suspension Prozent isoliert Ferromagnetisch (SAB031104-1) 2,073 - 20,727 90,9 Aureon A-Beads (SAB030320-1) 4347 1730 28,5 Dynabeads (112.06) 4880 1402 22,3 15. DiskussionThe melting curve gave a melting temperature of 79 ° C for the product of Internal Control and 86 ° C for the product of M. paratuberculosis PCR. 14. Comparison of the Speed of Fanning Ferromagnetic Particles with Suoerparamaanetischen Particles 20pg of alkaline phosphatase coated particles (streptavidin particles with excess biotin-AP incubated and washed with TPBS) were suspended in 1 ml TPBS in 1.5 ml Eppendorf cups and incubated for 2 seconds recovered from the suspension with the Aureon Separation Pen (M020101, Aureon, Vienna) and then resuspended in 1 ml TPBS. 10 μl of the starting suspension and the isolated beads were measured in a white microplate after 15 minutes incubation time with ΙΟΟμΙ LumiPhos Plus (Lumigen, USA) on the mediators PhL with 1 second integration time. - 19 ·· ·· · t · · · · · · · · · · · · ··················· ························································································································································································································································································ Common fl uids of the suspension percent isolated Ferromagnetic (SAB031104-1) 2.073 - 20.727 90.9 Aureon A-Beads (SAB0303 , 3 15. Discussion

Entgegen der Vorbehalte aus der Literatur wurden ferromagnetische Partikel für die Isolierung von Zellen verwendet und überraschender Weise wurde festgestellt, dass derartige Partikel sehr wohl für die Zellisolierung geeignet sind. Dies ist deshalb von großer Bedeutung, weil nur ferromagnetische Partikel in akzeptabler Zeit aus schwierigem Probenmaterial, wie Rohmilch, Kot oder Proben mit hohem Feststoffanteil, mit einem Magneten aus der Probensuspension an die Gefäßwand abgeschieden werden können.Contrary to the reservations from the literature, ferromagnetic particles have been used for the isolation of cells and, surprisingly, it has been found that such particles are very well suited for cell isolation. This is of great importance because only ferromagnetic particles can be deposited in an acceptable time from difficult sample material, such as raw milk, feces or high solids samples, with a magnet from the sample suspension to the vessel wall.

Im Beispiel wurden ferromagnetische Partikel verwendet, die unspezifisch Bakterien binden können, sowie ferromagnetische Partikel, die mit einem Antikörper funktionalisiert sind. Ferner konnte gezeigt werden, dass der Partikel-Zellkomplex direkt in der PCR verwendet werden kann. Um Substanzen, die die PCR negativ beeinflussen bzw. die Ergebnisse -Verfälschen könnten, zu entfernen, wurde ein Inhibitor-Entfernungs Puffer verwendet und gezeigt, dass die DNA in diesem Fall an den Partikeln gebunden bleibt und der DNA-Partikel-Komplex in der PCR verwendet werden kann.In the example ferromagnetic particles were used, which can nonspecifically bind bacteria, as well as ferromagnetic particles, which are functionalized with an antibody. Furthermore, it could be shown that the particle-cell complex can be used directly in the PCR. In order to remove substances that could adversely affect the PCR or -I could falsify the results, an inhibitor-removal buffer was used and it was shown that the DNA remains bound to the particles in this case and the DNA-particle complex in the PCR can be used.

Um die Auswertung der PCR zu vereinfachen, wurde gezeigt, dass das Produkt einer asymmetrischen PCR ohne Denaturierung hybridisiert werden kann.To simplify the evaluation of the PCR, it has been shown that the product can be hybridized to an asymmetric PCR without denaturation.

Die Echtzeit-PCR ist heute für Quantifizierungen sehr wichtig, wobei gezeigt werden konnte, dass ferromagnetische Partikel in derartigen Anwendungen eingesetzt werden können.Real-time PCR is very important for quantification today, and it has been shown that ferromagnetic particles can be used in such applications.

Ferner konnte somit eine hochsensitive und hochspezifische PCR zum Nachweis von M. paratuberculosis DNA entwickelt und gezeigt werden, dass auch nach 80 Durchläufen keine Primerdimere auftreten. Die Spezifität wurde weiters mit denselben Primern in - 20 ·· ·· ··*♦ ···· • • · • · • · 9 • · • · ·· • • · • · ·· • • ···· : · · • ·· • • ··· ·· • · *··· einer Touch-Down-PCR erhöht.Furthermore, it was possible to develop a highly sensitive and highly specific PCR for the detection of M. paratuberculosis DNA and to show that even after 80 runs no primer dimers appear. The specificity was further determined using the same primers in - 20 ··································································: ············································································································

Claims

21 21 • · · · · · «· · · · · · · · · ····································

Claims 1. A method for isolating at least one cell, in particular a eukaryotic and prokaryotic cell, or a virus from a sample, comprising the steps of: providing a sample, contacting the sample with ferromagnetic particles, and - separating the particles from the sample-particle suspension.

2. The method according to claim 1, characterized in that the bound on the ferromagnetic particles (s) cell or virus (s) by - contacting the particles with cell or virus-specific primers, - subjecting the particles of a nucleic acid amplification technique and qualitatively and / or quantitatively detecting at least one nucleic acid amplification product, the presence of cells or viruses in the sample is determined.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the sample is a food sample, Fäcesprobe, blood sample, serum sample, sample of biological origin, environmental sample or industrial intermediate or final product.

4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the particles comprise a ferromagnetic material selected from the group consisting of iron, in particular magnetite and maghemite, iron alloys, nickel, nickel alloys, cobalt, cobalt alloys and combinations thereof.

5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the ferromagnetic particles are coated with silicon or silicon compounds, gold, glass, polysaccharides, in particular dextran, plastic or combinations thereof.

6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the particles have a diameter of 50nm to 20pm, preferably from 200nm to 5pm, especially from 400nm to - 22 ·· ·· ···· ···· • ·· •··················································································································································································································· ,

7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the ferromagnetic particles are functionalized.

8. The method according to claim 7, characterized in that the ferromagnetic particles are functionalized with at least one cell or virus-specific binding partner.

9. The method according to claim 7 or 8, characterized in that the binding partner is an antibody or antibody fragment, protein A, protein G, a lectin, a peptide, a nucleic acid or a combination thereof.

10. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that the separation takes place by means of a magnetic device.

11. The method according to claim 10, characterized in that the magnetic device is designed as a magnet, in particular as an electric or permanent magnet.

12. The method according to any one of claims 2 to 11, characterized in that between the separation of the particles and the contacting of the particles with cell or virus-specific primers bound to the particles cells or viruses are at least partially lysed.

13. The method according to any one of claims 2 to 12, characterized in that the nucleic acid amplification technique is a polymerase chain reaction technique (PCR technique).

14. The method according to claim 13, characterized in that the polymerase chain reaction technique (PCR technique) selected from the group consisting of real-time PCR, in particular TaqMan PCR, nested PCR ("nested PCR"), inverse PCR, multiplex PCR, asymmetric PCR , reverse transcriptase PCR and combinations thereof.

- 23 ···· 9999 • • 99 • · • 1 • • • • 1 • • • • • • • • • • • • 9 9999 • 99 • ·· • I • »• ♦ • • • 9 «·· ·« ··

15. The method according to any one of claims 1 to 14, characterized in that the cells selected from the group consisting of mycobacteria, Listeria, Salmonella, Campylobacter, and combinations thereof, are.

16. The method according to any one of claims 1 to 15, characterized in that the viruses are selected from the group consisting of enteroviruses, CMV, hepatitis, HIV and combinations thereof.

17. Use of at least partially ferromagnetic, optionally functionalized, particles for the isolation of cells or viruses.

18. Use of at least partially ferromagnetic, optionally functionalized, particles for the combined isolation and determination of cells or viruses.

19. Kit for the combined isolation and determination of cells, or viruses in a Pr.obe comprising - ferromagnetic, optionally functionalized or functionalizable, particles and - cell or virus-specific primers. AP / R