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Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Detektion von Kohlendioxid.
Gemäss Stand der Technik werden flüssige Medien, wie Emulsionen, Lösungen und flüssige filtrierbare Gemische, zur Untersuchung ihrer Sterilität über für Mikroorganismen undurchdringbare Membranfilter filtriert und diese Filter anschliessend in entsprechenden Nährmedien zur Anzucht und Visualisierung eventuell vorhandener Mikroorganismen inkubiert.
Zur Vermeidung der bei derartigen Untersuchungen häufig vorkommenden Sekundärkontami- nationen, welche weitestgehend durch die vielfältigen Manipulationsschritte zur Durchführung, vor allem aber durch das Einbringen des Filters in die Nährlösung bedingt sind, wird in der US-A - 4,036,698 ein integriertes Filtrationssystem für eine kontaminationsfreie Sterilitätsprüfung von filtrierbaren Sterilprodukten vorgeschlagen. Die Filtration, die Spülung der Filter, das Einbrin- gen der Nährlösungen und die anschliessende Bebrütung zum Nachweis eventuell vorhandener mikrobieller Kontaminanten werden dabei in einer Anordnung einer Filtrationseinheit mit Zufüh- rungs- und Auslassöffnungen sowie den entsprechenden Verbindungsschläuchen derart durchge- führt, dass deren Kombination ein nach aussen abgeschottetes, geschlossenes System bildet.
Das Membranfilter befindet sich gemäss US-A - 4,036,698 in einem geschlossenen, sterilen Ge- fäss, welches gleichzeitig für die Aufnahme der Nährlösung für die Inkubation vorgesehen ist.
Prüflösung und gegebenenfalls Spüllösungen werden mittels geeigneter Pumpen in das Gefäss gebracht und über das Membranfilter filtriert. Das Filtrat wird dabei auf der unsterilen, stromabwärts gelegenen Seite des Filters in einem Auffangbehälter gesammelt. Die Nährlösung wird abschlie- #end ebenfalls über das Schlauch- und Pumpensystem in den Filtrationsbehälter eingebracht und das Membranfilter damit überschichtet.
Unabhängig davon, ob für die Probenvorbereitung ein integriertes System, wie gemäss US-A - 4,036,698, verwendet wurde oder ob die Filter nach der Probenfiltration in die entsprechen- den Nährlösungen überführt wurden, kommt es im Fall einer mikrobiellen Kontamination zum Anwachsen der Keime in den Nährlösungen während einer 7-14 tägigen Bebrütung bei 20-37 C.
Diese ist mit freiem Auge über die Trübung der Nährlösungen feststellbar. Die Nährlösungen werden zu diesem Zweck während der Bebrütungsdauer mehrmals visuell kontrolliert.
Hierbei kommt es jedoch zu Problemen, wenn der Charakter der Prüflösung bedingt, dass das Nährmedium primär getrübt wird. Eine visuelle Auswertung ist dann nicht mehr möglich. In diesen Fällen muss die Auswertung durch einen zusätzlichen Untersuchungsschritt am Ende der vorge- schriebenen Inkubationszeit mittels Subkultur auf festen Nährböden erfolgen.
Sind in der Prüflösung keimwachstumshemmende Substanzen (Antibiotika oder Konservie- rungsmittel, sogenannte Hemmstoffe) wird das Membranfilter vor der Inkubation mit dem Nährme- dium gewaschen. So wird ausgeschlossen, dass durch die antimikrobielle Wirkung von Hemmstof- fen eine Sterilität vorgetäuscht wird. Die europäische Pharmakopoe schreibt für diesen Zweck neben der Verwendung von Filtern mit einer maximalen Porenweite von 0,45 um auch die Validie- rung der Inaktivierung von vorhandenen Hemmstoffen unter Verwendung von Referenzkeimen mit definierter Inokulationsdichte vor. Die ausschliesslich visuelle Auswertung ermöglicht aber auch im Rahmen der Validierung nur bedingte Aussagen über die Wirkung des Inaktivierungsprozesses.
Die Produktion von CO2 als terminales Stoffwechselprodukt gilt für sämtliche aerob und mikro- aerophil wachsende Mikroorganismen als wissenschaftlich gesichert und wird auch bereits vielfach zum Nachweis von Mikroorganismen kommerziell eingesetzt.
Das Prinzip der Detektion von CO2 über die indirekte konduktimetrische Bestimmung nach Ab- sorption in stark alkalischen Lösungen wurde für die analytische Mikrobiologie unter Standardkul- turbedingungen in verschiedenen Nährlösungen durch Owens (GB 9 711 429) bereits 1987 be- schrieben und wird technisch auch in mehreren kommerziellen Systemen eingesetzt (BacTrac, Malthus und Rabit).
Andere Nachweissysteme wiederum nützen die durch das gebildete CO2 hervorgerufene Ände- rung der spektroskopischen Eigenschaften des Nährmediums oder den dadurch hervorgerufenen
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Ltd. (EP-A - 0 124 193) nützt die Zunahme des Drucks durch das gebildete CO2 um Kulturflüssig- keit in ein separates, dem Kulturmedium überlagertes Gefäss zu pressen, und bietet dadurch eine Indikation für eine Kontamination.
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Weitere Detektionssysteme für den Nachweis von Mikroorganismen unter Verwendung des mikrobiell gebildeten CO2 basieren auf der kolorimetrischen Detektion der Änderung des pH-Werts von alkalischen Lösungen nach Absorption von CO2 Die US-A - 5,094,955 beschreibt einen im
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verschiedener pH-Indikatoren nach C02-Aufnahme beruht, die über ein transparentes Fenster von aussen reflektometrisch gemessen werden kann.
Während das System gemäss US-A - 5,094,955 nur für Flüssigkeiten offenbart ist, wird ein der- artiges System gemäss US-A - 5,976,827 für den Nachweis vereinzelter Mikroorganismenkolonien durch Zugabe von Gelierungsmittel zu mit Nährmedium versetzten Proben verwendet. Auch hierbei liegt das Sensorsystem im Inneren des Probengefässes und das Detektionssystem ist ähnlich wie das in der US-A - 5,094,955 beschriebene System (Farbänderung eines durch eine semipermeable Membran vom Nährmedium abgetrennten Sensorsystems nach CO2-Aufnahme und reflektometri- sche Detektion von aussen über ein transparentes Fenster).
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Membran abgetrenntes, flüssiges Sensorsystem, welches direkt in den dicht verschlossenen Kulturgefässen liegt, für den kolorimetrischen Nachweis der C02-Aufnahme von aussen.
Die US-A - 4,376,681 beschreibt einen Sensor zur Messung der C02-Konzentration in Gasen und Flüssigkeiten, bei dem die Messsubstanz, z. B. eine Na-Bicarbonatlösung, vom CO2-hâltigen Medium durch eine gasdurchlässige Membran getrennt ist.
In der DE-A - 20 23 584 ist ein perkutaner CO2-F#hler beschrieben, welcher eine Messkammer umfasst, die eine mit gasdurchlässigem, flüssigkeitsdichtem Material abgeschlossene Öffnung aufweist.
In der FR-A - 1 604 408 ist eine Miniatursonde zur Messung des pH-Werts und des CO2- Partialdrucks von Flüssigkeiten gezeigt, wobei die Mess- oder Indikatorsubstanz durch eine gas- permeable Membran von der Flüssigkeit getrennt ist.
Gemäss DE-A-2 2 51 726 ist ein Kohlendioxid-Sensor von einer äusseren Umhüllung aus CO2- durchlässigem, ionenundurchlässigen Diffusionsbarrierenmaterial umgeben, das die elektroche- misch aktiven Bereiche und den Elektrolyten einkapselt.
Die WO-A - 00/04386 beschreibt einen C02-Sensor, der eine geschlossene Kammer mit einer
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wird der CO2-Gehalt über eine Leitfähigkeitsmessung bestimmt.
Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, eine Vorrichtung zur Detektion von CO2 bereitzustellen, die unter Ausnutzung einer bekannten Messtechnik eine wesentlich vereinfachte, automatisierte und objektivierte Auswertung ermöglicht. Insbesondere soll die Vorrichtung bei der Sterilitätsprü- fung flüssiger Medien einsetzbar sein, wobei die Integrität des dafür eingesetzten Systems erhalten bleibt und trotzdem eine Verwendung in Verbindung mit handelsüblichen Filtrationseinheiten mög- lich ist.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss durch die Kombination folgender Merkmale gelöst : - eine Einlassöffnung zur Aufnahme von Kohlendioxid in das Innere der Vorrichtung, welche Öffnung für Flüssigkeiten undurchlässig, aber für Kohlendioxid durchlässig ist und welche so gestaltet ist, dass sie an eine Filtrationseinheit, stromabwärts des Filters der Filtrations- einheit, angeschlossen werden kann, und - ein Mittel zum Nachweis von Kohlendioxid, welches Mittel sich im Inneren der Vorrichtung befindet.
Vorzugsweise weist die Einlassöffnung eine Membran auf, die für Flüssigkeiten undurchlässig, aber für Kohlendioxid durchlässig ist.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform ist diese Membran eine Folie aus Polyethylen.
Das Mittel zum Nachweis von Kohlendioxid ist bevorzugt eine KOH-, NaOH- oder Bicarbonat- pufferlösung, die pH-Indikatoren zum indirekten Nachweis von Kohlendioxid enthält.
In einer anderen bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung steht das Mittel zum Nachweis von Kohlendioxid mit Messelektroden, z. B. zur Messung der Impedanz, in Verbindung.
Der Vorteil der Erfindung liegt darin, dass die Vorrichtung nachträglich und, ohne die Integrität des Systems zu verletzen, an Filtrationseinheiten angeschlossen werden kann, und dadurch die Auswertung automatisiert, objektiviert und wesentlich vereinfacht wird. Der dazu erforderliche Kontakt zur inneren Atmosphäre der Filtrationseinheit wird über das vorhandene Membranfilter
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gewährleistet, welches die Penetration des CO2 nach aussen zur Sensoreinheit, d. h. Detektionsvorrichtung, ermöglicht, gleichzeitig jedoch das Eindringen von Mikroorganismen in die Nährlösung von aussen verhindert. Das Austreten von Nährlösung in die erfindungsgemässe Vorrichtung wird dabei z. B. durch die CO2-durchlässige Membran verhindert.
Die Untersuchung auf Sterilität wird somit in einer kombinierten Einheit aus Filterzelle und erfindungsgemässer Detektionsvorrichtung z. B. über die kontinuierliche Registrierung der Änderung der Impedanzeigenschaften des in der Vorrichtung enthaltenen Mittels zum Nachweis des CO2, beispielsweise eines Elektroden enthaltenden Detektorgels, durchgeführt.
Durch Verwendung der erfindungsgemässen Vorrichtung gemeinsam mit dem z. B. in der US-A - 4,036,698 beschriebenen integrierten Filtrationssystem kann die Bebrütung und automatische Registrierung eines eventuell vorhandenen Keimwachstums im selben Behältnis vorgenommen werden, ohne dessen Integrität zu verletzen. Die Ermittlung des Keimwachstums erfolgt dabei beispielsweise, wie oben erwähnt, über eine automatisierte Impedanzmessung, welche die Zunahme des durch den mikrobiellen Stoffwechsel gebildeten Kohlendioxids registriert. Auch Ansätze mit den eingangs erwähnten Primärtrübungen können damit direkt über eine Impedanzmessung ausgewertet werden, da bei dieser keine Beeinflussung über die Trübung erfolgt und eine Subkultur nicht mehr erforderlich ist.
Letztlich wird durch die kontinuierliche und objektive Messwerterfassung auch die Aussagekraft der erforderlichen Validierungsstudien für die vollständige Entfernung von Hemmstoffen erstmals objektiv möglich und vergleichbar.
Obwohl die erfindungsgemässe Vorrichtung im Zusammenhang mit bekannten Filtrationseinheiten bei der Sterilitätsprüfung flüssiger Medien besonders vorteilhaft ist, kann sie auch auf anderen Gebieten der Technik, bei denen die Detektion von Kohlendioxid eine Rolle spielt, mit Vorteil eingesetzt werden.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Zeichnung näher erläutert, wobei Fig. 1 eine Ausführungsform der Erfindung und Fig. 2 die in Fig. 1 gezeigte Ausführungsform in Verbindung mit einer Filtrationseinheit des Standes der Technik in schematischer Darstellung veranschaulichen.
Die erfindungsgemässe Vorrichtung weist eine Einlassöffnung 1 zur Aufnahme von Kohlendioxid auf, die zum Anschluss an die Auslassöffnung einer bekannten Filtrationseinheit angepasst ist. In der Einlassöffnung 1 ist eine Membran 3 angeordnet, die für CO2 durchlässig, für Flüssigkeiten, wie das Nährmedium, jedoch impermeabel ist. Im Inneren 4 der Vorrichtung befindet sich ein Mittel 2 zum Nachweis von CO2, welches eine Schicht eines Detektorgels und zwei Elektroden umfasst.
Das der Detektionsvorrichtung zugrundeliegende Detektionsprinzip ist dabei die Änderung der elektrochemischen Eigenschaften des in der Vorrichtung enthaltenen Detektorgels, bedingt durch die Produktion von CO2 der in der Probe vorhandenen Mikroorganismen. Das Detektionssystem, d. h. das Mittel 2, besteht aus zwei Elektroden, die mit dem Detektorgel über oder durch die äussere Hülle der Vorrichtung verbunden sind, und einem (nicht dargestellten) Gerät zur Registrierung der Änderung der elektrischen Eigenschaften des Detektorgels, vorzugsweise der Änderung der Impedanz, infolge der Aufnahme von CO2 Die Messung kann hierbei kontinuierlich bei konstanter Temperatur oder als Endpunktbestimmung nach Abgleich gegen einen Referenzwert und Berücksichtigung der Probentemperatur erfolgen.
In Fig. 2 ist die Vorrichtung in Verbindung mit einer Filtereinheit 5 dargestellt, die einen Aufnahmeraum 7 für das flüssige Medium bzw. das Nährmedium, ein Filter 6 und eine Auslassöffnung 8 aufweist, über welche die erfindungsgemässe Detektionsvorrichtung an die Filtereinheit angeschlossen ist. Die Einlässe 9 und 10 der Filtereinheit 5 dienen dem Befüllen des Aufnahmeraums 7 mit dem flüssigen Medium bzw. dem Nährmedium sowie dem Ent- und Belüften. Das in Fig. 2 dargestellte System ist bevorzugt zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens geeignet.
Genaue Beschreibung einer Ausführungsform der Erfindung
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung ist die Filtrationseinheit so gestaltet, dass das Membranfilter in den Boden der Einheit integriert ist. Die Filtrationszelle ist mit einem Druckanschluss versehen, der den Anschluss an handelsübliche Pumpen erlaubt und über den die Prüf-, Spül- und Nährlösung in die Filtrationszelle verbracht wird. Die Filtrationszelle zeichnet sich weiters dadurch aus, dass sie primär steril ist und auch über den Druckanschluss nach erfolgter Filtration kein Zugang zum Inneren der Zelle besteht. Der Ausgleich der bei der Filtration und Befüllung
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sowie während der Bebrütung entstehenden Druckdifferenzen erfolgt über eine mit einem separa- ten Filter (Porengrösse 0,45 um) verschlossene Öffnung.
Unterhalb des Membranfilters befindet sich eine Auslassöffnung, über die mittels einen Steckadapters die erfindungsgemässe Detektions- vorrichtung angeschlossen wird.
Damit das in der Filtereinheit gebildete C02 in der Sensoreinheit, d. h. Detektionsvorrichtung, nachgewiesen werden kann, letztere aber nicht durch aus der Filtereinheit austretendes Nährme- dium beeinflusst werden kann, ist die Einlassöffnung der Sensoreinheit mit einer CO2-permeablen, aber flüssigkeitsdichten Membran, wie z. B. einer dünnen Folie aus Polyethylen, Polypropylen, Polytetrafluorethylen oder dergleichen, verschlossen.
Die Sensoreinheit enthält das Detektionsmittel, welches im Wesentlichen aus einer Lösung von Kaliumhydroxid (KOH), Natriumhydroxid (NaOH) oder einem alkalischen Bikarbonatpuffersystem besteht und dem zur Verfestigung Gelierungsmittel, wie Agar-Agar, Agarose, Gelatine, Hydroxy- methylcellulose und dergleichen zugegeben wurden. Nach aussen ist das Detektionsmittel durch eine nicht elektrisch leitende, gasdichte Kapsel umgeben, die transparent oder opak sein kann.
Über oder durch diese äussere Kapsel stehen zwei Elektroden, die aus einem elektrisch leitenden Material (z.B. Metall) oder einer elektrisch leitenden Folie bestehen können, mit dem Detektions- mittel in Kontakt. Darüber hinaus können dem Detektionsmittel Farbindikatoren, wie Phenolphtha- lein, Thymolphthalein, Thymolblau, Bromthymolblau, Bromxylenolblau, 4-Nitrophenol, 3-Nitrophe- nol, Alizarin, Phenolrot, Kresolrot, Lackmus, Xylenolblau, Orthokresolphthalein oder Alpha-Naphtol- benzene zur optischen Visualisierung der C02-Absorption zugegeben werden. In diesem Fall muss die äussere, das Detektionsmittel umgebende Kapsel allerdings transparent ausgeführt sein.
Das elektrische Detektionssystem besteht im Wesentlichen aus einem Impedanzmessgerät, über welches die beiden Elektroden kontaktiert werden und die Impedanzänderungen (Zunahme der Impedanz) infolge der Aufnahme von CO2 durch das Detektionsmittel registriert werden. Be- vorzugt wird dabei unmittelbar nach dem Beginn der Messung ein Referenzwert bestimmt, welcher vom Gerät registriert wird und als Vergleichswert für alle nachfolgenden Messungen dient. Wird bei späteren Messungen eine bestimmte nährmedienabhängige und vordefinierte Differenz der Mess- werte (Schwellenwert) überschritten, so ist dies ein sicheres Indiz für das Wachstum von Mikroor- ganismen in der Probe.
Die Messungen können aber auch automatisch (online) in konstanten Intervallen über einen bestimmten Zeitraum aufgezeichnet und die dabei registrierten Messkurven ausgewertet werden.
Anstelle der Änderungen in der Impedanz können auch die Änderung der Leitfähigkeit, der Admit- tanz oder des pH-Werts registriert werden. Bei den Ablesegeräten kann es sich um einfache Hand- messgeräte oder aber um integrierte Automaten zur Online-Messwerterfassung handeln.
Bei Verwendung von Farbindikatoren für die C02-Detektion ist eine Änderung der Farbe (ab- hängig vom verwendeten Farbstoff) für den Fall, dass Mikroorganismen in der Probe angewachsen sind, mit freiem Auge feststellbar.
Beispiel 1: Detektionsvorrichtung mit impedanzmessung
Eine 500 ml sterile sowie eine sterile aber künstlich mit 10 KBE einer Übernachtkultur von Escherichia coli beimpfte Ringerlösung, wurden jeweils mittels des Steritest-Systems von Millipore filtriert. Die Filter wurden anschliessend mit je 100 ml Caso-Bouillon (Merck, Darmstadt) überschich- tet, die Ansaugschläuche abgeklemmt und abgeschnitten. Über die Auslassöffnung auf der Unter- seite wurde mittels Luer-Lock die Detektionsvorrichtung angeschlossen. Die Vorrichtung bestand aus einer Polystyrolkapsel mit einem Durchmesser von 2 cm, einer Wandstärke von 1 mm und einer lichten Höhe von ca. 6 cm, deren Oberteil als Luer-Adapter ausgeführt war, wobei die Ein- lassöffnung mit einer Membran verschlossen war.
Im Boden der Kapsel waren zwei Edelstahlelek- troden mit einem Abstand von 10 mm eingegossen, die von aussen kontaktiert werden konnten. Die Elektroden waren von 1 ml Sensorgel, bestehend aus 0,2 % (w/v) Kaliumhydroxid und 15 g/1 Agar- Agar, gelöst in destilliertem Wasser, umgeben. Die Elektroden ragten durch die Polystyrolwand ca.
5 mm in den Gelkern hinein. Die Elektroden wurden aussen mit einem Impedanzmessgerät (BacTrac 4300, Fa. SY-LAB) kontaktiert. Die mit den Detektionsvorrichtungen versehenen Filtrati- onseinheiten wurden bei 25 C in einem Brutschrank bebrütet. Über das Impedanzmessgerät wurden die Änderungen der Impedanz im Sensorgel, bedingt durch die Absorption des durch das Wachstum der Bakterien gebildeten C02, über einen Zeitraum von ca. 70 Stunden registriert und
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über eine geeignete Auswertesoftware ausgewertet. Die Aufzeichnung erfolgte dabei als relative Änderung (Abnahme der Leitfähigkeit) in Bezug auf den zu Beginn der Messung ermittelten Refe- renzwert.
Der Schwellenwert von-10% M (M = Impedanzwert), der in Vorversuchen als signifikanter Wert zur Unterscheidung von sterilen und nicht sterilen Produkten ermittelt wurde, wurde bereits nach 29,67 Stunden erreicht und die Kontamination des Produkts somit nachgewiesen. Ein signifikanter Wendepunkt in der Signalkurve war dabei bereits nach ca. 8 Stunden feststellbar. Bei der sterilen Probe wurde der Schwellenwert innerhalb der Messzeit hingegen nicht durchschritten. Das Mess- signal zeigte einen beinahe waagrechten Verlauf ohne Wendepunkt.
Beispiel 2: Detektionsvorrichtung mit Farbdetektion der pH-Änderung
Das in Beispiel 1 beschriebene Experiment wurde unter identischen Bedingungen wiederholt, allerdings wurde das KOH-Sensorgel zusätzlich noch mit 0,002% Bromthymolblau versetzt und somit blau eingefärbt. Das Wachstum der Mikroorganismen in der verkeimten Probe war in diesem Fall durch die Änderung des pH-Werts im Detektorgel und den Farbumschlag des Indikators Bromthymolblau von blau nach gelb feststellbar (Umschlagpunkt von Bromthymolblau blau/gelb: pH=6,0).
Nach Ablauf der 70-stündigen Inkubationszeit war das Sensorgel bei der künstlich kontaminier- ten Probe vollständig gelb, während die sterile Probe keine Änderung der Farbe des Detektorgels zeigte.
PATENTANSPRÜCHE:
1. Vorrichtung zur Detektion von Kohlendioxid, gekennzeichnet durch die Kombination fol- gender Merkmale - eine Einlassöffnung (1) zur Aufnahme von Kohlendioxid in das Innere (4) der Vorrich- tung, welche Öffnung (1) für Flüssigkeiten undurchlässig, aber für Kohlendioxid durch- lässig ist und welche so gestaltet ist, dass sie an eine Filtrationseinheit (5), stromab- wärts des Filters (6) der Filtrationseinheit (5), angeschlossen werden kann, und - ein Mittel (2) zum Nachweis von Kohlendioxid, welches Mittel (2) sich im Inneren (4) der Vorrichtung befindet.
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The invention relates to a device for detecting carbon dioxide.
According to the prior art, liquid media, such as emulsions, solutions and liquid filterable mixtures, are filtered to examine their sterility via membrane filters impenetrable to microorganisms and these filters are then incubated in appropriate nutrient media for growing and visualizing any microorganisms present.
In order to avoid the secondary contamination frequently occurring in such examinations, which are largely due to the various manipulation steps for carrying out, but above all due to the introduction of the filter into the nutrient solution, US Pat. No. 4,036,698 describes an integrated filtration system for a contamination-free sterility test of filterable sterile products. The filtration, the rinsing of the filters, the introduction of the nutrient solutions and the subsequent incubation for the detection of any microbial contaminants that may be present are carried out in an arrangement of a filtration unit with feed and outlet openings and the corresponding connecting tubes in such a way that their combination forms a closed system sealed off from the outside.
According to US Pat. No. 4,036,698, the membrane filter is located in a closed, sterile vessel which is at the same time intended for the absorption of the nutrient solution for the incubation.
Test solution and, if necessary, rinsing solutions are brought into the vessel by means of suitable pumps and filtered through the membrane filter. The filtrate is collected in a collection container on the non-sterile, downstream side of the filter. Finally, the nutrient solution is also introduced into the filtration container via the hose and pump system, and the membrane filter is covered with it.
Regardless of whether an integrated system was used for the sample preparation, such as according to US-A-4,036,698, or whether the filters were transferred to the appropriate nutrient solutions after the sample filtration, microbial contamination leads to an increase in the germs in the Nutrient solutions during a 7-14 day incubation at 20-37 C.
This can be determined with the naked eye about the turbidity of the nutrient solutions. For this purpose, the nutrient solutions are visually checked several times during the incubation period.
Problems arise, however, if the nature of the test solution means that the nutrient medium is primarily clouded. A visual evaluation is then no longer possible. In these cases, the evaluation must be carried out by an additional test step at the end of the prescribed incubation period using a subculture on solid nutrient media.
If there are substances that inhibit germ growth in the test solution (antibiotics or preservatives, so-called inhibitors), the membrane filter is washed with the nutrient medium before incubation. This prevents sterility from being simulated by the antimicrobial effect of inhibitors. For this purpose, the European pharmacopoeia prescribes not only the use of filters with a maximum pore size of 0.45 µm, but also the validation of the inactivation of existing inhibitors using reference germs with a defined inoculation density. However, the exclusively visual evaluation also allows only limited statements about the effect of the inactivation process, even within the scope of the validation.
The production of CO2 as a terminal metabolic product is scientifically proven for all aerobically and micro-aerophilically growing microorganisms and is already being used commercially for the detection of microorganisms.
The principle of detection of CO2 via indirect conductimetric determination after absorption in strongly alkaline solutions was already described for analytical microbiology under standard culture conditions in various nutrient solutions by Owens (GB 9 711 429) in 1987 and is technically also used in several commercial systems used (BacTrac, Malthus and Rabit).
Other detection systems, in turn, use the change in the spectroscopic properties of the nutrient medium caused by the CO2 formed, or the changes caused thereby
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Ltd. (EP-A - 0 124 193) uses the increase in pressure caused by the CO2 formed to press culture fluid into a separate vessel superimposed on the culture medium, and thus offers an indication of contamination.
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Further detection systems for the detection of microorganisms using the microbially formed CO2 are based on the colorimetric detection of the change in the pH value of alkaline solutions after absorption of CO2. US Pat. No. 5,094,955 describes an im
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various pH indicators based on C02 absorption, which can be measured reflectometrically from the outside via a transparent window.
While the system according to US Pat. No. 5,094,955 is only disclosed for liquids, such a system according to US Pat. No. 5,976,827 is used for the detection of isolated colonies of microorganisms by adding gelling agent to samples mixed with nutrient medium. Here, too, the sensor system is located inside the sample vessel and the detection system is similar to the system described in US Pat. No. 5,094,955 (color change of a sensor system separated from the nutrient medium by a semipermeable membrane after CO2 absorption and reflectometric detection from the outside via a transparent one Window).
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Membrane-separated, liquid sensor system, which lies directly in the tightly closed culture vessels, for the colorimetric detection of the CO 2 uptake from outside.
US-A-4,376,681 describes a sensor for measuring the CO 2 concentration in gases and liquids, in which the measuring substance, e.g. B. a Na bicarbonate solution is separated from the CO2-containing medium by a gas-permeable membrane.
DE-A-20 23 584 describes a percutaneous CO2 sensor which comprises a measuring chamber which has an opening closed with a gas-permeable, liquid-tight material.
FR-A-1 604 408 shows a miniature probe for measuring the pH value and the CO2 partial pressure of liquids, the measurement or indicator substance being separated from the liquid by a gas-permeable membrane.
According to DE-A-2 2 51 726, a carbon dioxide sensor is surrounded by an outer covering made of CO2-permeable, ion-impermeable diffusion barrier material, which encapsulates the electrochemically active areas and the electrolyte.
WO-A - 00/04386 describes a C02 sensor which has a closed chamber with a
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the CO2 content is determined using a conductivity measurement.
The object of the invention is to provide a device for the detection of CO2 which, using a known measurement technique, enables a significantly simplified, automated and objectified evaluation. In particular, the device should be able to be used in the sterility test of liquid media, while maintaining the integrity of the system used for this and nevertheless being able to be used in conjunction with commercially available filtration units.
This object is achieved according to the invention by combining the following features: an inlet opening for receiving carbon dioxide into the interior of the device, which opening is impermeable to liquids but permeable to carbon dioxide and which is designed in such a way that it connects to a filtration unit, downstream of the filter the filtration unit, and - a means for detecting carbon dioxide, which means is located inside the device.
The inlet opening preferably has a membrane which is impermeable to liquids but permeable to carbon dioxide.
According to a preferred embodiment, this membrane is a film made of polyethylene.
The agent for the detection of carbon dioxide is preferably a KOH, NaOH or bicarbonate buffer solution which contains pH indicators for the indirect detection of carbon dioxide.
In another preferred embodiment of the invention, the means for the detection of carbon dioxide with measuring electrodes, for. B. for measuring the impedance in connection.
The advantage of the invention is that the device can be subsequently connected to filtration units without violating the integrity of the system, and the evaluation is thereby automated, objectified and significantly simplified. The contact with the internal atmosphere of the filtration unit required for this is made via the membrane filter
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ensures that the penetration of the CO2 to the outside of the sensor unit, d. H. Detection device, allows, but at the same time prevents the entry of microorganisms into the nutrient solution from the outside. The emergence of nutrient solution in the device according to the invention is z. B. prevented by the CO2-permeable membrane.
The examination for sterility is thus carried out in a combined unit consisting of a filter cell and the detection device according to the invention, e.g. B. on the continuous registration of the change in the impedance properties of the means contained in the device for detecting the CO2, for example an electrode-containing detector gel.
By using the device according to the invention together with the z. B. in the integrated filtration system described in US-A-4,036,698, the incubation and automatic registration of any bacterial growth that may be present can be carried out in the same container without violating its integrity. The microbial growth is determined, for example, as mentioned above, via an automated impedance measurement, which registers the increase in the carbon dioxide formed by the microbial metabolism. Approaches with the primary opacities mentioned at the outset can also be evaluated directly via an impedance measurement, since there is no influence on the opacification and a subculture is no longer required.
Ultimately, the meaningfulness of the necessary validation studies for the complete removal of inhibitors becomes objectively possible and comparable for the first time thanks to the continuous and objective recording of measured values.
Although the device according to the invention is particularly advantageous in connection with known filtration units in the sterility test of liquid media, it can also be used with advantage in other fields of technology in which the detection of carbon dioxide plays a role.
The invention is explained in more detail below with reference to the drawing, in which Fig. 1 shows an embodiment of the invention and Fig. 2 the embodiment shown in Fig. 1 in connection with a filtration unit of the prior art in a schematic representation.
The device according to the invention has an inlet opening 1 for receiving carbon dioxide, which is adapted for connection to the outlet opening of a known filtration unit. A membrane 3 is arranged in the inlet opening 1 and is permeable to CO2, but impermeable to liquids such as the nutrient medium. Inside the device 4 there is a means 2 for detecting CO2, which comprises a layer of a detector gel and two electrodes.
The detection principle on which the detection device is based is the change in the electrochemical properties of the detector gel contained in the device, due to the production of CO2 by the microorganisms present in the sample. The detection system, i.e. H. the means 2 consists of two electrodes connected to the detector gel via or through the outer shell of the device and a device (not shown) for registering the change in the electrical properties of the detector gel, preferably the change in impedance, as a result of the recording of CO2 The measurement can be carried out continuously at constant temperature or as an end point determination after comparison with a reference value and consideration of the sample temperature.
2 shows the device in connection with a filter unit 5, which has a receiving space 7 for the liquid medium or the nutrient medium, a filter 6 and an outlet opening 8, via which the detection device according to the invention is connected to the filter unit. The inlets 9 and 10 of the filter unit 5 serve to fill the receiving space 7 with the liquid medium or the nutrient medium and to vent and aerate. The system shown in FIG. 2 is preferably suitable for carrying out the method according to the invention.
Detailed description of an embodiment of the invention
In a preferred embodiment of the invention, the filtration unit is designed such that the membrane filter is integrated in the bottom of the unit. The filtration cell is equipped with a pressure connection, which allows connection to commercially available pumps and through which the test, rinsing and nutrient solution is brought into the filtration cell. The filtration cell is also characterized by the fact that it is primarily sterile and that there is no access to the interior of the cell even after the filtration has taken place via the pressure connection. The balance in the filtration and filling
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as well as pressure differences that occur during incubation take place via an opening closed with a separate filter (pore size 0.45 µm).
There is an outlet opening below the membrane filter, via which the detection device according to the invention is connected by means of a plug adapter.
So that the C02 formed in the filter unit in the sensor unit, i. H. Detection device that can be detected, but the latter cannot be influenced by nutrient medium emerging from the filter unit, is the inlet opening of the sensor unit with a CO2-permeable but liquid-tight membrane, such as, for example, B. a thin film made of polyethylene, polypropylene, polytetrafluoroethylene or the like, closed.
The sensor unit contains the detection agent, which essentially consists of a solution of potassium hydroxide (KOH), sodium hydroxide (NaOH) or an alkaline bicarbonate buffer system and to which gelling agents such as agar-agar, agarose, gelatin, hydroxymethyl cellulose and the like have been added for solidification. To the outside, the detection means is surrounded by a non-electrically conductive, gas-tight capsule, which can be transparent or opaque.
Above or through this outer capsule, two electrodes, which can be made of an electrically conductive material (e.g. metal) or an electrically conductive film, are in contact with the detection means. In addition, color indicators such as phenolphthalein, thymolphthalein, thymol blue, bromothymol blue, bromxylenol blue, 4-nitrophenol, 3-nitrophenol, alizarin, phenol red, cresol red, litmus, xylenol blue, orthocresolphthalein or alpha-naphthol benzene can be used for optical visualization the CO 2 absorption can be added. In this case, however, the outer capsule surrounding the detection means must be transparent.
The electrical detection system essentially consists of an impedance measuring device, via which the two electrodes are contacted and the changes in impedance (increase in impedance) due to the absorption of CO2 by the detection means are registered. A reference value is preferably determined immediately after the start of the measurement, which is registered by the device and serves as a comparison value for all subsequent measurements. If a certain nutrient medium-dependent and predefined difference in the measured values (threshold value) is exceeded during later measurements, this is a reliable indication of the growth of microorganisms in the sample.
The measurements can also be recorded automatically (online) at constant intervals over a certain period of time and the recorded measurement curves can be evaluated.
Instead of changes in impedance, changes in conductivity, admittance or pH can also be registered. The reading devices can be simple handheld measuring devices or integrated automats for online measurement value acquisition.
When using color indicators for C02 detection, a change in color (depending on the dye used) in the event that microorganisms have grown in the sample can be detected with the naked eye.
Example 1: Detection device with impedance measurement
A 500 ml sterile and a sterile Ringer's solution, which was artificially inoculated with 10 CFU of an overnight culture of Escherichia coli, were each filtered using the Steritest system from Millipore. The filters were then overlaid with 100 ml Caso broth (Merck, Darmstadt), the suction hoses disconnected and cut off. The detection device was connected via the outlet opening on the underside using a Luer lock. The device consisted of a polystyrene capsule with a diameter of 2 cm, a wall thickness of 1 mm and a clear height of approx. 6 cm, the upper part of which was designed as a Luer adapter, the inlet opening being closed with a membrane.
Two stainless steel electrodes were cast into the base of the capsule at a distance of 10 mm, which could be contacted from the outside. The electrodes were surrounded by 1 ml sensor gel consisting of 0.2% (w / v) potassium hydroxide and 15 g / 1 agar agar, dissolved in distilled water. The electrodes protruded through the polystyrene wall approx.
5 mm into the gel core. The electrodes were contacted on the outside with an impedance measuring device (BacTrac 4300, SY-LAB). The filtration units provided with the detection devices were incubated at 25 ° C. in an incubator. The changes in the impedance in the sensor gel, caused by the absorption of the CO 2 formed by the growth of the bacteria, were recorded over a period of about 70 hours via the impedance measuring device
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evaluated using suitable evaluation software. The recording was made as a relative change (decrease in conductivity) with respect to the reference value determined at the start of the measurement.
The threshold value of -10% M (M = impedance value), which was determined in preliminary tests as a significant value to distinguish between sterile and non-sterile products, was reached after just 29.67 hours and the contamination of the product was thus demonstrated. A significant turning point in the signal curve was already detectable after about 8 hours. In the sterile sample, however, the threshold was not exceeded within the measurement time. The measurement signal showed an almost horizontal course without a turning point.
Example 2: Detection device with color detection of the pH change
The experiment described in Example 1 was repeated under identical conditions, but the KOH sensor gel was additionally mixed with 0.002% bromothymol blue and thus colored blue. In this case, the growth of the microorganisms in the contaminated sample was detectable by changing the pH in the detector gel and changing the color of the indicator bromothymol blue from blue to yellow (change point of bromothymol blue / yellow: pH = 6.0).
After the 70-hour incubation period, the sensor gel in the artificially contaminated sample was completely yellow, while the sterile sample showed no change in the color of the detector gel.
CLAIMS:
1. Device for the detection of carbon dioxide, characterized by the combination of the following features - an inlet opening (1) for receiving carbon dioxide into the interior (4) of the device, which opening (1) is impermeable to liquids, but to carbon dioxide - Casual and which is designed so that it can be connected to a filtration unit (5), downstream of the filter (6) of the filtration unit (5), and - A means (2) for the detection of carbon dioxide, which means (2) is inside (4) of the device.