AR131405A1 - Ligasas modificadas y usos de las mismas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al campo de la biotecnología, en particular a ligasas de ARN bicatenario (ARNds) modificadas y a su aplicación en la biocatálisis industrial. La presente invención además se refiere a un proceso de producción de una ligasa de ARNds modificada, y a un método para producir un oligonucleótido poniendo en contacto fragmentos de oligonucleótidos con una ligasa de ARNds modificada. Reivindicación 1: Un polipéptido de ligasa de ARN bicatenario (ARNds) modificado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 85% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID Nº 666, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468, 470, 472, 474, 476, 478, 480, 482, 484, 486, 488, 490, 492, 494, 496, 498, 500, 502, 504, 506, 508, 510, 512, 514, 516, 518, 520, 522, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 536, 538, 540, 542, 544, 546, 548, 550, 552, 554, 556, 558, 560, 562, 564, 566, 568, 570, 572, 574, 576, 578, 580, 582, 584, 586, 588, 590, 592, 594, 596, 598, 600, 636, 638, 640, 642, 644, 646, 648, 650, 652, 654, 656, 658, 660, 662, 664, y 668; en donde el polipéptido de ligasa de ARNds modificado: (a) tiene actividad de ligasa de ARNds; y (b) no comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº 302. Reivindicación 3: Un polipéptido de ligasa de ARNds modificado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID Nº 302, que produce por lo menos 5% más producto de oligonucleótido que un polipéptido de ligasa de ARNds que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº 302 bajo las mismas condiciones de la reacción de ligación, en donde el polipéptido de ligasa de ARNds modificado no comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº 302. Reivindicación 7: Un polipéptido inmovilizado sobre un material sólido mediante enlace químico o un método de adsorción física, en donde el polipéptido comprende un polipéptido de ligasa de ARNds modificado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6. Reivindicación 9: Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 8; opcionalmente en donde el vector de expresión comprende un plásmido, un cósmido, un bacteriófago o un vector viral. Reivindicación 10: Una célula huésped que comprende el polinucleótido de la reivindicación 8 o el vector de expresión de la reivindicación 9, opcionalmente en donde la célula huésped es E. coli. Reivindicación 11: Un método de preparación de un polipéptido de ligasa de ARNds modificado, que comprende los pasos de cultivar la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 10 y obtener un polipéptido de ligasa de ARNds modificado del cultivo. Reivindicación 12: Un catalizador de ligasa de ARNds modificado que puede obtenerse cultivando las células huésped de acuerdo con la reivindicación 10, o de acuerdo con el método de la reivindicación 11, en donde dicho catalizador de ligasa de ARNds modificado comprende células o líquido de cultivo que contiene los polipéptidos de ligasa de ARNds modificados, o un artículo procesado con los mismos, en donde el artículo se refiere a un extracto obtenido del cultivo de célula huésped, un producto aislado obtenido aislando o purificando una ligasa de ARNds modificado a partir del extracto, o un producto inmovilizado obtenido mediante la inmovilización de una célula huésped, un extracto de la misma o un producto aislado del extracto. Reivindicación 13: Un método para producir un oligonucleótido a partir de dos o más fragmentos de oligonucleótidos, en donde el método comprende poner en contacto: (i) dos o más fragmentos de oligonucleótidos; (ii) un polipéptido de ligasa de ARNds modificado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6; (iii) una fuente de ATP; y (iv) un catión divalente; para obtener un oligonucleótido; opcionalmente en donde: (a) el método además comprende un paso de purificación del oligonucleótido; y/o (b) el método se lleva a cabo utilizando una concentración subestequiométrica de AMP y/o ATP; y/o (c) el método se lleva a cabo con una concentración de catión divalente de 5 - 100 mM, opcionalmente 30 - 50 mM. Reivindicación 16: Una composición que comprende: i. el polipéptido de ligasa de ARNds modificado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6; ii. una fuente de ATP; y iii. un catión divalente; opcionalmente en donde la composición además comprende dos o más fragmentos de oligonucleótidos.