AR112454A2

AR112454A2 - METHOD FOR THE PRODUCTION OF POLYPEPTIDES

Info

Publication number: AR112454A2
Authority: AR
Original assignee: Pfizer Ireland Pharmaceuticals
Priority date: 2004-08-27
Filing date: 2018-07-16
Publication date: 2019-10-30
Also published as: UA93859C2

Abstract

Se provee un sistema mejorado para la producción a gran escala de proteínas y a-b en cultivo de células, en particular, en medios caracterizados por una o más de las siguientes características: 1) una concentración acumulada de aminoácidos mayor que aproximadamente 70 mM; 2) una relación molar de glutamina acumulada a asparagina acumulada inferior a aproximadamente 2; 3) una relación molar de glutamina acumulada a aminoácidos totales acumulados inferior a aproximadamente 0,2; 4) una relación molar de ión inorgánico acumulado a aminoácidos totales acumulados de entre alrededor de 0,4 y 1; o 5) una concentración combinada de glutamina acumulada y asparagina acumulada de entre aproximadamente 16 y 36 mM. El uso de dicho sistema permite altos niveles de producción de a-b, y disminuye la acumulación de ciertos factores indeseables, tales como amonio y lactato. Adicionalmente, se proveen métodos de cultivo que incluyen un cambio de temperatura, que habitualmente comprende una disminución en la temperatura cuando el cultivo ha alcanzado alrededor de 20% - 80% de su densidad celular máxima. Alternativa o adicionalmente, la presente provee métodos tales que, después de alcanzar un pico, los niveles de lactato y amonio en el cultivo disminuyen con el transcurso del tiempo. Reivindicación 1: Un método para producir Etanercept en un cultivo de células de producción a gran-escala, caracterizado porque comprende los pasos de: proporcionar un cultivo celular que comprende; células de ovario de hámster chino (CHO) que contienen un gen que codifica Etanercept, donde dicho gen se expresa bajo condiciones de cultivo celular; y un medio que contiene glutamina, que tiene una cantidad acumulada de amino ácidos por unidad de volumen mayor de 70 mM, una relación molar de glutamina acumulativa a asparagina acumulativa de menos de 2 y una relación molar de glutamina acumulativa respecto de los amino ácidos acumulativos totales de menos de 0,2, donde la cantidad acumulativa total de histidina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, tirosina, y prolina por unidad de volumen en dicho medio es mayor que 25 mM; donde la concentración inicial de glutamina de dicho medio es menor que o igual a 13 mM; manteniendo dicho cultivo en una fase de crecimiento inicial bajo un primer conjunto de condiciones donde dicho primer conjunto de condiciones comprende una temperatura entre 30 - 42ºC; cambiando la temperatura, de manera que se aplica un segundo conjunto de condiciones de cultivo donde el segundo conjunto de condiciones de cultivo comprende un segundo rango de temperaturas que es 25 a 41ºC y donde la temperatura es menor que la temperatura anterior; manteniendo a dicho cultivo durante un segundo período de tiempo bajo el segundo conjunto de condiciones durante un segundo periodo de tiempo de manera que el polipéptido se acumula en el cultivo celular donde el cultivo de células de producción a gran-escala es al menos 500 L.An improved system is provided for the large-scale production of proteins and a-b in cell culture, in particular, in media characterized by one or more of the following characteristics: 1) a cumulative concentration of amino acids greater than about 70 mM; 2) a cumulative glutamine to cumulative asparagine molar ratio of less than about 2; 3) a molar ratio of cumulative glutamine to cumulative total amino acids of less than about 0.2; 4) a molar ratio of accumulated inorganic ion to accumulated total amino acids of between about 0.4 and 1; or 5) a combined accumulated glutamine and accumulated asparagine concentration of between approximately 16 and 36 mM. The use of such a system allows high levels of a-b production, and reduces the accumulation of certain undesirable factors, such as ammonium and lactate. Additionally, culture methods are provided that include a change in temperature, which usually comprises a decrease in temperature when the culture has reached about 20% - 80% of its maximum cell density. Alternatively or additionally, the present provides methods such that, after reaching a peak, lactate and ammonium levels in the culture decrease over time. Claim 1: A method for producing Etanercept in a large-scale production cell culture, characterized in that it comprises the steps of: providing a cell culture comprising; Chinese hamster ovary (CHO) cells containing a gene encoding Etanercept, where said gene is expressed under cell culture conditions; and a medium containing glutamine, which has a cumulative amount of amino acids per unit volume greater than 70 mM, a cumulative glutamine to cumulative asparagine molar ratio of less than 2, and a cumulative glutamine to cumulative amino acid molar ratio totals less than 0.2, where the total cumulative amount of histidine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, tryptophan, tyrosine, and proline per unit volume in said medium is greater than 25 mM; where the initial glutamine concentration of said medium is less than or equal to 13 mM; maintaining said culture in an initial growth phase under a first set of conditions wherein said first set of conditions comprises a temperature between 30-42 ° C; changing the temperature, so that a second set of culture conditions is applied where the second set of culture conditions comprises a second range of temperatures that is 25 to 41 ° C and where the temperature is lower than the previous temperature; maintaining said culture for a second period of time under the second set of conditions for a second period of time so that the polypeptide accumulates in the cell culture where the large-scale production cell culture is at least 500 L.