NO913965L

NO913965L - PROCEDURE FOR REDUCING A TETRAZOLIUM COMPOUND AND USING THE PROCEDURE FOR ANALYSIS OF ALBUMIN AND OTHER REDUCING AGENTS

Info

Publication number: NO913965L
Application number: NO91913965A
Authority: NO
Inventors: Anthony Atkinson; Peter Hammond; Roger James Hinton; Julie Miller; Christopher Philip Price
Original assignee: Health Lab Service Board
Priority date: 1989-04-12
Filing date: 1991-10-10
Publication date: 1991-12-12
Also published as: NO913965D0

Description

ANALYSER SOM ANVENDER INTERAKSJON ALBUMIN-TETRAZOLIUMANALYZES USING ALBUMIN-TETRAZOLIUM INTERACTION

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en forbedret fremgangsmåte for reduksjon av tetrazoliumforbindelser til fargede formazaner og anvendelse av denne fremgangsmåte ved analyser (dvs. deteksjon og/eller kvantitativ analyse) av analytter, spesielt albumin. The present invention relates to an improved method for the reduction of tetrazolium compounds to colored formazans and the use of this method in analyzes (ie detection and/or quantitative analysis) of analytes, especially albumin.

Tetrazoliumsalter inneholder den kationiske tetrazoliumkjerne: som åpnes ved reduksjon til å frembringe et formazan inneholdende den ringåpnede gruppe: Dannelsen av et formazan vil frembringe en fargeendring, ettersom formazangruppen er en sterkt farget kromofor, og tetrazoliumsaltene er ofte fargeløse. Nærværet og/eller mengden av formazan som frembringes kan derfor fordelaktig detekteres visuelt eller kolorimetrisk, f.eks. ved å iaktta endringen i absorbens i området mellom 505 og 660 nm, særlig omtrent 59 0 nm. Tetrazolium salts contain the cationic tetrazolium nucleus: which opens upon reduction to produce a formazan containing the ring-opened group: The formation of a formazan will produce a color change, as the formazan group is a strongly colored chromophore, and the tetrazolium salts are often colourless. The presence and/or amount of formazan produced can therefore advantageously be detected visually or colorimetrically, e.g. by observing the change in absorbance in the range between 505 and 660 nm, particularly around 590 nm.

Generelt kan svake reduksjonsmidler bare redusere tetrazodium-salter til formazaner i nærvær av det proteinholdige materiale. Denne fargeendring ved reduksjon kan anvendes ved analysemetoder som f.eks. beskrevet i WO88/08882. In general, weak reducing agents can only reduce tetrasodium salts to formazans in the presence of the proteinaceous material. This color change upon reduction can be used with analysis methods such as e.g. described in WO88/08882.

Albumin er et protein, i en form med en relativ molekylmasse på 67000 og bestående av en enkelt kjede med 584 aminosyrer. Det er tilstede i human serum ved en høyere konsentrasjon enn noe annet enkelt protein. De primære funksjoner av albumin i serum inkluderer opprettholdelse av osmotisk trykk og virkning som et bærerprotein for metabolitter som bilirubin, fettsyrer, uorganiske forbindelser som kalsiumforbindelser, hormoner og mange medisiner og kan også tilveiebringe en kilde for aminosyrer. Albumin is a protein, in a form with a relative molecular mass of 67,000 and consisting of a single chain of 584 amino acids. It is present in human serum at a higher concentration than any other single protein. The primary functions of serum albumin include maintenance of osmotic pressure and acting as a carrier protein for metabolites such as bilirubin, fatty acids, inorganic compounds such as calcium compounds, hormones and many drugs and may also provide a source for amino acids.

Av mange grunner blir albumin ofte i det kliniske biokjemi-laboratoriet analysert. Det anvendes f.eks. som en indikator på leversykdom, det er en vesentlig faktor ved albuminerstat-ningsterapi, det kan videre indikere nivåer av ubundet (ukonjugert) bilirubin, det kan indikere tilfeller av myelom og kan anvendes innen ernæringsmessige behandlingsopplegg (Whicher og Spencer, Ann. Clin. Biochem. 24 572 (1987)). For many reasons, albumin is often analyzed in the clinical biochemistry laboratory. It is used e.g. as an indicator of liver disease, it is an important factor in albumin replacement therapy, it can further indicate levels of unbound (unconjugated) bilirubin, it can indicate cases of myeloma and can be used in nutritional treatment plans (Whicher and Spencer, Ann. Clin. Biochem .24,572 (1987)).

Det er flere kjente metoder for kvantitativ måling av serum-albumin. Det kan måles ved elektroforese, eller ved hjelp av immunologiske metoder. En av de mest vanlig anvendte metoder er imidlertid basert på fargestoffbinding under anvendelse av enten bromkresolgrønt (BCG) (Rodkey, F.L., Clin Chem. 11 478 There are several known methods for the quantitative measurement of serum albumin. It can be measured by electrophoresis, or by immunological methods. However, one of the most commonly used methods is based on dye binding using either bromocresol green (BCG) (Rodkey, F.L., Clin Chem. 11 478

(1965)) eller bromkresolpurur (BCP) (Louderback, A., Mealey, E.H.,&Taylor, N.A. Clin. Chem. 14 793 (1968)). Bromkresol-grønt-metoder gir lave gjengivelser ved høye albuminkonsentrasjoner og høye gjengivelser ved lave albuminkonsentrasjoner (Webster, D. Bignell, A.H.C. & Atwood, E.C., Clin. Chim. Acta. 53 101 (1974)), og er generelt ikke spesifikke (Slater, L., Carter, P.M.&Hobbs, J.R., Ann. Chim. Biochim. 12 33 (1975)). Metoder basert på bromkresolpurpur er generelt mere spesifikke (Pinell, A.E.&Northam, B.E., Clin. Chem. 24 80 (1978)). Bromkresolpurpur har imidlertid ikke albumin-interspecies-spesifisitet. Mange kalibratorer inneholder enten albumin-standarder av storfe eller hester som gir en absorbens for langt under absorbensen av humant albumin til at de kan være av verdi. Heparin er videre angitt å forstyrre (Perry, B.W. & Douman, B.T. Clin.Chem. 25 1520 (1979)), og dette utelukker bruk av heparinisert blod. Bilirubin er også antatt å forstyrre. En fremgangsmåte basert på dannelse av et farget produkt i respons til nærvær og konsentrasjon av albumin og som ikke lider av forstyrrelser fra andre komponenter som kan være tilstede i prøven ville derfor være av stor praktisk nytte. Det er et formål for den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en ny fremgangsmåte som ikke lider av de beskrevne ulemper og som kan anvendes for kvantitering av albumin ved hjelp av en prosedyre som utvikler et farget produkt. Andre formål og fordeler ved oppfinnelsen vil fremgå av den etterfølgende beskrivelse. (1965)) or bromocresol purure (BCP) (Louderback, A., Mealey, E.H., & Taylor, N.A. Clin. Chem. 14 793 (1968)). Bromcresol green methods give low yields at high albumin concentrations and high yields at low albumin concentrations (Webster, D. Bignell, A.H.C. & Atwood, E.C., Clin. Chim. Acta. 53 101 (1974)), and are generally not specific (Slater , L., Carter, P. M. & Hobbs, J. R., Ann. Chim. Biochim. 12 33 (1975)). Methods based on bromocresol purple are generally more specific (Pinell, A.E. & Northam, B.E., Clin. Chem. 24 80 (1978)). However, bromcresol purple does not have albumin interspecies specificity. Many calibrators contain either bovine or equine albumin standards that give an absorbance too far below that of human albumin to be of value. Heparin is further indicated to interfere (Perry, B.W. & Douman, B.T. Clin.Chem. 25 1520 (1979)), and this precludes the use of heparinized blood. Bilirubin is also thought to interfere. A method based on the formation of a colored product in response to the presence and concentration of albumin and which does not suffer from interference from other components which may be present in the sample would therefore be of great practical use. It is an object of the present invention to provide a new method which does not suffer from the described disadvantages and which can be used for the quantification of albumin by means of a procedure which develops a colored product. Other purposes and advantages of the invention will be apparent from the following description.

I henhold til et første aspekt av den foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for reduksjon av en tetrazoliumforbindelse inneholdende den kationiske kjerne: for fremstilling av en ringåpnet formazanforbindelse inneholdende gruppen: According to a first aspect of the present invention, a method for the reduction of a tetrazolium compound containing the cationic nucleus: for the preparation of a ring-opened formazan compound containing the group:

karakterisert vedtrinnet med å bevirke at tetrazoliumforbindelsen reagerer med albumin og tetrazoliumforbindelse - albumininteraksjonsproduktet reduseres med et reduksjonsmiddel i en vandig løsning ved pH mellom 6 og 10. characterized by the step of causing the tetrazolium compound to react with albumin and the tetrazolium compound - albumin interaction product being reduced with a reducing agent in an aqueous solution at a pH between 6 and 10.

Oppfinnelsen beror på den uventede erkjennelse at selv om svake reduksjonsmidler bare kan redusere mange tetrazoliumsalter ved pH over 10 og i fravær av albumin, blir reduksjonen av tetrazoliumsalter ved det lavere pH-område i samsvar med oppfinnelsen vesentlig påskyndet ved interaksjon med albumin. Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er særlig anvendelig for reduksjon av leukoformen av 2-(2'-benzotiazolyl)-5-styryl-3-(4<1->ftalhydrazidyl)tetrazolium, (forkortet heri til "BSPT"), særlig hydrokloridet. The invention is based on the unexpected realization that although weak reducing agents can only reduce many tetrazolium salts at pH above 10 and in the absence of albumin, the reduction of tetrazolium salts at the lower pH range in accordance with the invention is substantially accelerated by interaction with albumin. The method according to the invention is particularly applicable for the reduction of the leucoform of 2-(2'-benzothiazolyl)-5-styryl-3-(4<1->phthalhydrazidyl)tetrazolium, (abbreviated herein to "BSPT"), especially the hydrochloride.

BSPT inneholder tetrazoliumkationet:BSPT contains the tetrazolium cation:

Interaksjonen mellom tetrazoliumsaltet og albuminet er av en type som resulterer i økning, påskynding eller katalyse av reduksjonen av tetrazoliumsaltet til det fargede farmazan-fargestoff. Selv om den nøyaktige natur av interaksjonen mellom tetrazoliumsaltet og albuminet ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen ikke er fullstendig forstått antas det at interaksjonen kan involvere dannelse av en kompleks mellom saltet og albuminet. Interaksjonen og/eller kompleks-dannelsen kan resultere fra dannelse av substituentgrupper på tetrazoliumkjernen. Etter som fremgangsmåten i samsvar med oppfinnelsen kan være spesielt anvendbar for tetrazoliumsalter hvori kjernen er substituert med en eller flere av substituentene tilstede i BSPT, nemlig benzotiazolyl, styryl eller ftalhydrazidylgrypper som selv kan bære substituent(r) på deres ringsystemer, eller en kombinasjon av slike grupper. The interaction between the tetrazolium salt and the albumin is of a type which results in the enhancement, acceleration or catalysis of the reduction of the tetrazolium salt to the colored farmazan dye. Although the exact nature of the interaction between the tetrazolium salt and the albumin in the process of the invention is not fully understood, it is believed that the interaction may involve the formation of a complex between the salt and the albumin. The interaction and/or complex formation may result from the formation of substituent groups on the tetrazolium nucleus. As the method according to the invention can be particularly applicable for tetrazolium salts in which the nucleus is substituted with one or more of the substituents present in BSPT, namely benzothiazolyl, styryl or phthalhydrazidyl groups which can themselves carry substituent(s) on their ring systems, or a combination of such groups.

Mange reduksjonsmidler er egnet for bruk ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen, men foretrukket anvendes et svakt reduksjonsmiddel. Eksempler på midler som er funnet brukbare inkluderer ditiotreitol ("DTT"), merkaptoetanol og p-merkaptoetanol, cystein, nikotinamidadenindinukleotid og aminofenol. Et særlig foretrukket reduksjonsmiddel er NADH (redusert form av nikotinamidadenindinukleotid). Many reducing agents are suitable for use in the method according to the invention, but preferably a weak reducing agent is used. Examples of agents found useful include dithiothreitol ("DTT"), mercaptoethanol and p-mercaptoethanol, cysteine, nicotinamide adenine dinucleotide, and aminophenol. A particularly preferred reducing agent is NADH (reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide).

En elektronbærer kan anvendes i reaksjonsmediet for fremgangsmåten for å øke hastigheten av elektronoverføringen mellom reduksjonsmidlet og tetrazoliumsaltet. En foretrukket elektronbærer er et fenaziniumsalt, dvs. forbindelser inneholdende den kationiske kjerne: hviri R er hydrogen eller alkyl. Et foretrukket fenazoinium-salt er metoksy-N-metylfenazinium-metylsulfat ("MPMS"), dvs. An electron carrier can be used in the reaction medium for the process to increase the rate of electron transfer between the reducing agent and the tetrazolium salt. A preferred electron carrier is a phenazinium salt, i.e. compounds containing the cationic core: where R is hydrogen or alkyl. A preferred phenazoinium salt is methoxy-N-methylphenazinium methyl sulfate ("MPMS"), i.e.

selv om andre egnede men mindre foretrukne fenaziniumsalter inkluderer fenaziniummetosulfat ("PMS") og fenaziniumetosulfat although other suitable but less preferred phenazinium salts include phenazinium methosulfate ("PMS") and phenazinium methosulfate

("PES").("PES").

En hvilken som helst buffer som er i stand til å opprettholde pH mellom 6 og 10 kan anvendes idet en foretrukket buffer er trishydroksymetylaminometan HC1 ("Tris-HCl"). En foretrukket pH i oppløsningen er 8,5. Any buffer capable of maintaining a pH between 6 and 10 can be used, with a preferred buffer being trishydroxymethylaminomethane HCl ("Tris-HCl"). A preferred pH in the solution is 8.5.

Det foretrekkes også å inkludere et overflateaktivt middel i reaksjonsoppløsningen ved fremgangsmåten ettersom dette fremmer oppløseliggjøringen av det dannede formazan. Et foretrukket overflateaktivt middel er et ikke-ionisk overflateaktivt middel særlig en polyoksyetylen-sorbitolester, spesielt "Tween" 80. It is also preferred to include a surfactant in the reaction solution in the process as this promotes the solubilization of the formazan formed. A preferred surfactant is a non-ionic surfactant especially a polyoxyethylene sorbitol ester, especially "Tween" 80.

Reduksjonsgraden av tetrazoliumforbindelsen og etterfølgende dannelse av formazanet er kvantitativt relatert til mengden av albumin og/eller reduksjonsmiddel tilstede i reaksjonsopp-løsningen og når en av disse to er den begrensende faktor ved reaksjonen, dvs. alle de andre reaksjonskomponenter er tilstede i overskudd, kan derfor fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen anvendes som basis for analyse for albumin eller reduksj onsmidler. The degree of reduction of the tetrazolium compound and subsequent formation of the formazan is quantitatively related to the amount of albumin and/or reducing agent present in the reaction solution and when one of these two is the limiting factor in the reaction, i.e. all the other reaction components are present in excess, can therefore the method according to the invention is used as a basis for analysis for albumin or reducing agents.

Ved et ytterligere aspekt av oppfinnelsen tilveiebringer denne en fremgangsmåte for analyse av humant eller mammalt albumin i en prøve ved å omsette et tetrazoliumsalt som er istand til interaksjon med albumin, med et reduksjonsmiddel for å frembringe et formazan i en vandig oppløsning ved pH mellom 6 og 10 i nærvær av prøven, og relatere nærvær og/eller mengden av fremstilt formazan til nærvær og/eller mengde av albumin i prøven. In a further aspect of the invention, it provides a method for the analysis of human or mammalian albumin in a sample by reacting a tetrazolium salt capable of interacting with albumin with a reducing agent to produce a formazan in an aqueous solution at a pH between 6 and 10 in the presence of the sample, and relate the presence and/or amount of produced formazan to the presence and/or amount of albumin in the sample.

Selv om andre tetrazoliumsalter som bare kan reduseres signifikant (i løpet av en tidsperiode som r aksepterbar ved klinisk analyse) ved hjelp av svake reduksjonsmidler i pH området 6 til 10 etter interaksjon med albumin kan anvendes, er foretrukne tetrazoliumsalter salter av BSPT, særlig hydrokloridet, eller andre tetrazoliumsalter hvori kjernen er substituert med en eller flere av substituentene til stede i BSPT som nevnt i det foregående, som selv kan bære substituenter på deres ringsystemer eller en kombinasjon av slike grupper. Although other tetrazolium salts which can only be significantly reduced (within a time period acceptable by clinical analysis) by weak reducing agents in the pH range 6 to 10 after interaction with albumin may be used, preferred tetrazolium salts are salts of BSPT, particularly the hydrochloride, or other tetrazolium salts in which the nucleus is substituted with one or more of the substituents present in BSPT as mentioned above, which may themselves bear substituents on their ring systems or a combination of such groups.

Fremgangsmåten for analyse av albumin er egnet for bruk ved en hvilken som helst prøve som antas å inneholde albumin betinget av at minst en andel av mulig albumin inneholdt deri kan oppløses til å danne den nødvendige vandige oppløsning hvis oppløsningen ikke allerede omfatter en vandig oppløsning. Fremgangsmåten er derfor mest egnet for analyse av vandige prøver som antas å inneholde albumin, spesielt biologiske prøver som kroppsvæsker, og spesielt blodserum, som kan anvendes direkte uten noen forbehandling, eller urin etc. The method for the analysis of albumin is suitable for use with any sample believed to contain albumin provided that at least a proportion of possible albumin contained therein can be dissolved to form the required aqueous solution if the solution does not already comprise an aqueous solution. The method is therefore most suitable for the analysis of aqueous samples that are assumed to contain albumin, especially biological samples such as body fluids, and especially blood serum, which can be used directly without any pretreatment, or urine etc.

Ved gjennomføring av analysefremgangsmåten er det ønskelig at mengden av tetrazoliumsalt og reduksjonsmiddel tilstede i reaksjonsblandingen bør være i overskudd utover de mengder som ventes å interagere med albuminet i prøven slik at mengden av tilstedeværende albumin er den begrensende faktor. When carrying out the analysis procedure, it is desirable that the amount of tetrazolium salt and reducing agent present in the reaction mixture should be in excess beyond the amounts expected to interact with the albumin in the sample so that the amount of albumin present is the limiting factor.

Egnede og foretrukne reaksjonsbetingelser og reagenser for albuminanalysefremgangsmåten i samsvar med oppfinnelsen er som drøftet i det foregående med henvisning til det første aspekt av oppfinnelsen, dvs. valget av reduksjonsmiddel, bruken av en elektronbærer, buffere og pH, og bruk av et overflateaktivt middel, etc. Disse parametere er oppsummert i den etter-følgende tabell i. Suitable and preferred reaction conditions and reagents for the albumin analysis method according to the invention are as discussed above with reference to the first aspect of the invention, i.e. the choice of reducing agent, the use of an electron carrier, buffers and pH, and the use of a surfactant, etc. These parameters are summarized in the following table i.

Under disse betingelser foregår reduksjon av tetrazoliumsaltet hurtig nok til at analysen kan gjennomføres i løpet av noen få minutter som er en tidsskala passende for klinisk bruk. Under these conditions, reduction of the tetrazolium salt takes place rapidly enough that the analysis can be carried out within a few minutes, which is a time scale suitable for clinical use.

Fremgangsmåten er sensitiv for albuminnivåer lavere enn dem som har klinisk signifikans og den kolorimetriske analyse har et lineært forhold med initiale albuminnivåer opp til omtrent 10 0 mg/ml i en opprinnelig serumprøve. Serum i seg selv absorberer ikke signifikant over det bølgelengdeområdet som anvendes for målinger og en blindprøve er derfor ikke vanlig nødvendig. Fremgangsmåten synes å være spesifikk for albumin, krever ingen forbehandling av en serumprøve og er ikke særlig utsatt for forstyrrelser. Fremgangsmåten for å anslå albumin i samsvar med oppfinnelsen vil ha mange anvendelser, men vil være særlig nyttig hvis en hurtig og rutinemessig analyse-metode er nødvendig, særlig på området klinisk kjemi. Andre anvendelser kan inkludere kvalitetskontroll målinger ved albuminfremstilling, bedømmelse av albumininnhold i andre blodprodukter og strukturundersøkelser av albumin. The method is sensitive to albumin levels lower than those of clinical significance and the colorimetric assay has a linear relationship with initial albumin levels up to approximately 100 mg/ml in an original serum sample. Serum in itself does not absorb significantly above the wavelength range used for measurements and a blank sample is therefore not usually necessary. The method appears to be specific for albumin, requires no pretreatment of a serum sample and is not particularly prone to interference. The method for estimating albumin in accordance with the invention will have many applications, but will be particularly useful if a rapid and routine analysis method is required, particularly in the field of clinical chemistry. Other applications may include quality control measurements in albumin production, assessment of albumin content in other blood products and structural investigations of albumin.

Ved et tredje aspekt av oppfinnelsen tilveiebringer denne fremgangsmåte for analyse av reduksjonsmidler i en prøve som omfatter at en tetrazoliumsalt som er istand til interaksjon med albumin, omsettes med prøven i nærvær av albumin i en vandig oppløsning ved pH mellom 6 og 10 og nærværet og/eller mengden av formazan som frembringes relateres til nærvær og/eller mengde av reduksjonsmiddel i prøven, idet mengden av tetrazoliumsalt som anvendes er i overskudd utover den mengde som ventes å bli redusert med reduksjonsmidlet i prøven. In a third aspect of the invention, this method provides for the analysis of reducing agents in a sample which comprises that a tetrazolium salt which is capable of interacting with albumin is reacted with the sample in the presence of albumin in an aqueous solution at a pH between 6 and 10 and the presence and/ or the amount of formazan produced is related to the presence and/or amount of reducing agent in the sample, the amount of tetrazolium salt used being in excess beyond the amount expected to be reduced by the reducing agent in the sample.

Egnede og foretrukne reaksjonsbetingelser og reagenser for denne fremgangsmåte for analyse av reduksjonsmidler er som drøftet i det foregående med henvisning til det første og annet aspekt, nemlig valget av tetrazoliumsalt, bruk av en elektronbærer, buffere og pH, og bruk av et overflateaktivt middel etc. Det er ønskelig å ordne det slik at parameterne i reaksjonsoppløsningen ved fremgangsmåten er innenfor de områder som er gjengitt i tabell 1 hvis den omtrentlige konsentrasjon av reduksjonsmiddel i prøven kan aproksimeres på forhånd. En albuminkonsentrasjon på opp til 100 mg/ml synes å være egnet. Suitable and preferred reaction conditions and reagents for this method of analysis of reducing agents are as discussed above with reference to the first and second aspects, namely the choice of tetrazolium salt, use of an electron carrier, buffers and pH, and use of a surfactant, etc. It is desirable to arrange it so that the parameters in the reaction solution in the method are within the ranges given in table 1 if the approximate concentration of reducing agent in the sample can be approximated in advance. An albumin concentration of up to 100 mg/ml seems to be suitable.

Denne fremgangsmåte for analyse av reduksjonsmidler kan anvendes for analyse av mange forskjellige kjemiske reduksjonsmidler. Den er særlig egnet for analyse av reduksjonsmidler som er av biokjemisk klinisk eller diagnostisk betydning, som aminofenoler, NADH eller ko-enzym A (CO-A) og ved anvendelse av denne metode kan de analyseres i prøver av kroppsvæsker som serum, urin, etc. This method for the analysis of reducing agents can be used for the analysis of many different chemical reducing agents. It is particularly suitable for the analysis of reducing agents that are of biochemical clinical or diagnostic importance, such as aminophenols, NADH or co-enzyme A (CO-A) and by using this method they can be analyzed in samples of body fluids such as serum, urine, etc. .

Som en ytterligere modifisering kan fremgangsmåten for analyse av reduksjonsmidlene anvendes for analyse av forbindelser som kan delta i en kjemisk reaksjon hvori et reduksjonsmiddel dannes og som kan analyseres ved hjelp av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen og relateres til nærvær og/eller mengde av forbindelse. As a further modification, the method for analyzing the reducing agents can be used for the analysis of compounds which can participate in a chemical reaction in which a reducing agent is formed and which can be analyzed using the method according to the invention and related to the presence and/or quantity of the compound.

Ved en slik reaksjon kan forbindelsen som skal analyseres i seg selv omdannes til reduksjonsmidlet. F.eks. kan den aktive forbindelse paracetamol (p-hydroksyacetanilid) kvantitativt omdannes til reduksjonsmidlet para-aminofenol under anvendelse av f.eks. et arylacylamidase-enzym ved en velkjent reaksjon. Den dannede para-aminofenol kan så analyseres og relateres til mengden av paracetamol. In such a reaction, the compound to be analyzed can itself be converted into the reducing agent. E.g. can the active compound paracetamol (p-hydroxyacetanilide) be quantitatively converted to the reducing agent para-aminophenol using e.g. an arylacylamidase enzyme by a well-known reaction. The para-aminophenol formed can then be analyzed and related to the amount of paracetamol.

Alternativt kan ved en slik reaksjon en eller flere av de andre deltagende reagenser enn forbindelsen omdannes til et reduksjonsmiddel i en mengde relatert til mengden av tilstedeværende forbindelse. Alternatively, in such a reaction, one or more of the participating reagents other than the compound can be converted into a reducing agent in an amount related to the amount of compound present.

F.eks. kan de antibiotiske midler kloramfenicol og tiamfeni-col, eller gentaminciner acetyleres i en reaksjon hvori acetyl Co-A anvendes som et acetylerende middel og som deretter omdannes til Co-A. Slike reaksjoner foregår lettere under innvirkning av enzymene kloramfenikol acetyltransferase ("CAT") henholdsvis gentanicinacetyltransferase ("GAT"). I hver tilfelle kan nærvær og/eller menge av Co-A som fremstilles kvantitativt relateres til nærvær og/eller mengde av antibiotisk middel. E.g. the antibiotic agents chloramphenicol and thiamphenicol, or gentamicin can be acetylated in a reaction in which acetyl Co-A is used as an acetylating agent and which is then converted to Co-A. Such reactions take place more easily under the influence of the enzymes chloramphenicol acetyltransferase ("CAT") and gentanicin acetyltransferase ("GAT"). In each case, the presence and/or amount of Co-A produced can be quantitatively related to the presence and/or amount of antibiotic agent.

Disse analysefremgangsmåter i samsvar med oppfinnelsen kan gjennomføres enten manuelt eller automatisk på en rekke måter. F.eks. kan det tildannes en vandig oppløsning inneholdende i det minste prøven, tetrazoliumsaltet og reduksjonsmidlet eller albumin som passende ved den indikerte pH, eventuelt også inneholdende de andre reagenser som er omhandlet i det foregående, og inkubering derav ved en passende temperatur. Fargen som blir frembringes blir så detektert og f.eks. sammenlignet med en standard eller målt kolorimetrisk. Selv om reaksjonsoppløsningen er vandig kan det være nødvendig å inkludere ytterligere vannblandbare løsningsmidler for å fremme oppløsningen av alle reagensene, spesielt tetrazolium saltet. Et foretrukket eksempel på et slik løsningsmiddel er dimetylformamid ("DMF"). Når fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen utgjøres på denne måte synes rekkefølgen hvormed reagensene og prøven blandes ikke å være kritisk. These analysis methods in accordance with the invention can be carried out either manually or automatically in a number of ways. E.g. an aqueous solution containing at least the sample, the tetrazolium salt, and the reducing agent or albumin as appropriate at the indicated pH, optionally also containing the other reagents referred to above, may be prepared and incubated thereof at an appropriate temperature. The color that is produced is then detected and e.g. compared to a standard or measured colorimetrically. Although the reaction solution is aqueous, it may be necessary to include additional water-miscible solvents to promote dissolution of all the reagents, especially the tetrazolium salt. A preferred example of such a solvent is dimethylformamide ("DMF"). When the method according to the invention is constituted in this way, the order in which the reagents and the sample are mixed does not seem to be critical.

Alternativt kan passende reagenser som tetrazoliumsalter, reduksjonsmiddel eller albumin som det passer, buffere, etc. immobiliseres på en fast bærer ved f.eks. impregnering, adsorpsjon eller absorpsjon. Eksponering for en oppløsnings-prøve inneholdende albumin eller reduksjonsmiddel etter behov vil da bevirke en fargeendring i bæreren som kan detekteres. Alternatively, suitable reagents such as tetrazolium salts, reducing agent or albumin as appropriate, buffers, etc. can be immobilized on a solid support by e.g. impregnation, adsorption or absorption. Exposure to a solution sample containing albumin or reducing agent as required will then cause a color change in the carrier that can be detected.

For å gjennomføre analysefremgangsmåten i samsvar med oppfinnelsen passende for laboratoriebruk og klinisk bruk tilveiebringer oppfinnelsen også et analysesett som inkluderer i kombinasjon en eller flere ferdigfremstilte reagenser som beskrevet i det foregående for gjennomføring av fremgangsmåten. F.eks. kan et sett omfatte separate oppløsninger inneholdende henholdsvis tetrazoliumsaltet som er istand til interaksjon med albuminet, buffer og reduksjonsmiddel eller albumin som passende, ved konsentrasjoner egnet for å gjøre dem istand lett anvendelse ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen, eventuelt sammen med de andre reagenser, f.eks. overflateaktivt middel, elektronbærer som er omhandlet i det foregående. Et slikt sett kan alternativt omfatte et fast substrat med passende reagenser immobilisert derpå. Settet kan også inkludere standarder og instruksjoner som kan inkludere et fargesammenligningskart. I et slikt testsett er reagensene blitt funnet å være stabile ved lagring i minst 3 0 døgn, men det er ønskelig å tildanne oppløsningen av tetrazoliumsaltet i en sur oppløsning, f.eks. 0,01 til 0,2M salt-syre, eplesyre eller spesielt sitronsyre, ved pH 3 - 6 for stabilitet ved langtidslagring. Fremgangsmåte for fremstilling av slike sett som muliggjør fremgangsmåten i samsvar med oppfinnelsen vil være klar for fagfolk på området. In order to carry out the analysis method in accordance with the invention suitable for laboratory use and clinical use, the invention also provides an analysis kit which includes in combination one or more ready-made reagents as described above for carrying out the method. E.g. a set may comprise separate solutions containing respectively the tetrazolium salt which is capable of interacting with the albumin, buffer and reducing agent or albumin as appropriate, at concentrations suitable to enable them to be easily used in the method according to the invention, possibly together with the other reagents, f .ex. surfactant, electron carrier referred to above. Such a kit may alternatively comprise a solid substrate with appropriate reagents immobilized thereon. The kit may also include standards and instructions which may include a color comparison chart. In such a test kit, the reagents have been found to be stable when stored for at least 30 days, but it is desirable to form the solution of the tetrazolium salt in an acidic solution, e.g. 0.01 to 0.2M hydrochloric acid, malic acid or especially citric acid, at pH 3 - 6 for stability during long-term storage. Procedures for the production of such sets which enable the method in accordance with the invention will be clear to those skilled in the art.

Eksempler som illustrerer oppfinnelsen skal nå beskrives med henvisning til: Fig. 1 som viser det hyperkromiske skift ved reduksjon av Examples illustrating the invention will now be described with reference to: Fig. 1 which shows the hyperchromic shift when reducing

et BSPT-albumin interaksjonsprodukta BSPT-albumin interaction product

Fig. 2 som viser absorbens ved 590 nm versus albuminkon sentrasjon for fremgangsmåten i eks. 1 Fig. 3 som viser stabiliteten av reagensene ved lagring Fig. 4 som viser sammenligning mellom fremgangsmåten i samsvar med oppfinnelsen og en konvensjonell metode som anvendes manuelt Fig. 5 som viser sammenligning mellom fremgangsmåten i samsvar med oppfinnelsen og en konvensjonell metode anvendt på et automatisert apparat Fig. 6 som viser sammenligning mellom fremgangsmåten i samsvar med oppfinnelsen og en konvensjonell immunologisk metode Fig. 7 som viser absorbens versus Co-A konsentrasjon Fig. 8 som viser absorbens versus paracetamolkonsentrasjon Fig. 2 showing absorbance at 590 nm versus albumin cone centration for the procedure in ex. 1 Fig. 3 showing the stability of the reagents during storage Fig. 4 showing a comparison between the method according to the invention and a conventional method used manually Fig. 5 showing a comparison between the method according to the invention and a conventional method used on an automated apparatus Fig. 6 showing comparison between the method according to the invention and a conventional immunological method Fig. 7 showing absorbance versus Co-A concentration Fig. 8 showing absorbance versus paracetamol concentration

og and

Fig. 9 som viser absorbens versus kloramfenikolkonsentra-sjon. Fig. 9 showing absorbance versus chloramphenicol concentration.

EKSEMPEL 1. DIAGNOSTISK SETT FOR ALBUMIN ( I)EXAMPLE 1. DIAGNOSTIC KIT FOR ALBUMIN ( I)

REAGENSERREAGENTS

Reagens A:Reagent A:

Utgangsoppløsning av tetrazoliumsalt:Starting solution of tetrazolium salt:

(i) BSPT-hydroklorid: 10 mg opplost i 10,5 ml dimetylformamid (i) BSPT hydrochloride: 10 mg dissolved in 10.5 ml dimethylformamide

(ii) 9,4 ml 12 mmol/L sitronsyre.(ii) 9.4 ml of 12 mmol/L citric acid.

arbeidsoppløsning av tetrazoliumsalt:working solution of tetrazolium salt:

et 18 ml volum av utgangsoppløsningen fortynnes ved tilsetning av 76 ml 12 mmol/L sitronsyre, 4 ml 15 % (vekt/ volum) "Tween" 80 og 2 ml lmml/L MPMS. an 18 mL volume of the stock solution is diluted by adding 76 mL of 12 mmol/L citric acid, 4 mL of 15% (w/v) "Tween" 80 and 2 mL of 1 mmol/L MPMS.

Reagens B:Reagent B:

20mmol/L tris HCl, pH 8,520mmol/L tris HCl, pH 8.5

Reagens C:Reagent C:

5mmol/L nikotinamidadenin-dinukletid (redusert form). 5mmol/L nicotinamide adenine dinucletide (reduced form).

FREMGANGSMÅTEAPPROACH

1. Til 0,5 ml reagens A tilsettes 0,5 ml reagens B og 1. To 0.5 ml of reagent A, add 0.5 ml of reagent B and

40 yl reagens C.40 µl reagent C.

2. Blandingen ekvilibreres i 3 min. ved romtemperatur. 2. The mixture is equilibrated for 3 min. at room temperature.

3. 50 ul prøve tilsettes og blandingen blandes godt.3. 50 ul sample is added and the mixture is mixed well.

4. Absorbens ved 590nm avleses etter 1 min. 4. Absorbance at 590nm is read after 1 min.

Resultatene for A590nm gitt for forskjellige initiale konsentrasjoner av albumin er gitt i kalibreringskurven i fig. 2. Den frembragte farge er stabil i minst en time. The results for A590nm given for different initial concentrations of albumin are given in the calibration curve in fig. 2. The color produced is stable for at least one hour.

EKSEMPEL 2 DIAGNOSESETT FOR ALBUMIN ( II)EXAMPLE 2 DIAGNOSIS KIT FOR ALBUMIN (II)

REAGENSERREAGENTS

Reagens A:Reagent A:

12,0 mmol/L sitronsyre12.0 mmol/L citric acid

0,18 mmol/LBSPT hydroklorid0.18 mmol/LBSPT hydrochloride

0. 5 mmol/L MPMS0.5 mmol/L MPMS

Reagens B:Reagent B:

200 mmol/L tris HCl, pH 8,5200 mmol/L tris HCl, pH 8.5

35 % volum/volum "Tween" - 8035% volume/volume "Tween" - 80

Reagens C:Reagent C:

2,5 mmol/L NADH2.5 mmol/L NADH

FREMGANGSMÅTEAPPROACH

1. Det fremstilles et arbeidsreagens ved å blande 5 0 ml reagens A, 5 0 ml reagens B og 4,0 ml reagens C. 1. A working reagent is prepared by mixing 50 ml of reagent A, 50 ml of reagent B and 4.0 ml of reagent C.

Denne blanding er stabil i minst 12 timer.This mixture is stable for at least 12 hours.

2. Til 1,0 ml arbeidsreagens tilsettes 5ul serum (eller en prøve inneholdende albumin). Absorbens avleses ved 59 0 nm mot en reagensblindprøve etter 1 min. 2. To 1.0 ml of working reagent, add 5ul of serum (or a sample containing albumin). Absorbance is read at 590 nm against a reagent blank after 1 min.

Reagensene A, B og C som fremstilt og lagret separat er stabile i minimum 30 døgn som påvist i fig. 3 ved stabilieten av absorpsjonen ved 590nm som skriver seg fra tilsetning av forskjellige albuminkonsentrasjoner til et arbeidsreagens fremstilt fra reagenser lagret i de angitte perioder. Reagents A, B and C as prepared and stored separately are stable for a minimum of 30 days as shown in fig. 3 by the stability of the absorption at 590nm which is written from the addition of different concentrations of albumin to a working reagent prepared from reagents stored for the indicated periods.

EKSEMPEL 3. ALBUMINANALYSE MED ANDRE REDUKSJONSMIDLEREXAMPLE 3. ALBUMIN ANALYSIS WITH OTHER REDUCING AGENTS

Tabell 2 i det følgende viser bruken av andre reduksjonsmidler enn NADH ved indikerte konsentrasjoner. Området av albuminkonsentrasjoner hvorover forholdet mellom formazanfremstilling og albuminkonsentrasjoner er lineært er også vist, med NADH anvendt som en sammenligningsstandard. I hvert tilfelle var tetrazoliumsaltet BSPT hydroklorid. Table 2 below shows the use of reducing agents other than NADH at indicated concentrations. The range of albumin concentrations over which the relationship between formazan production and albumin concentrations is linear is also shown, with NADH used as a comparison standard. In each case the tetrazolium salt was BSPT hydrochloride.

EKSEMPEL 4 FORSTYRRELSER VED ALBUMINANALYSE EXAMPLE 4 DISTURBANCES IN ALBUMIN ANALYSIS

Forstyrrelser med albuminanalyser under anvendelse av settet i eks. 1 eller 2 ble undersøkt ved sammenligning av testprøver inneholdende forskjellige potensielle forstyrrende materialer. Resultatene er angitt i tabell 3. Disturbances with albumin analyzes using the kit in ex. 1 or 2 was investigated by comparing test samples containing different potential interfering materials. The results are shown in table 3.

Som vist i det foregående ga ingen av blodbestanddelene noen forstyrrelse. De undersøkte konsentrasjoner var over de normale områder som finnes i blodet. Heparin ble tilsatt blodet for å stanse koagulasjon ved en konsentrasjon på 6,7 enheter/ml. As shown above, none of the blood components produced any interference. The investigated concentrations were above the normal ranges found in the blood. Heparin was added to the blood to stop coagulation at a concentration of 6.7 units/ml.

Den eneste merkbare forstyrrelse ble oppnådd med urea. The only noticeable interference was obtained with urea.

EKSEMPEL 5 KORRELASJON MED " KONVENSJONELLE" ALBUMINANALYSE-METODER EXAMPLE 5 CORRELATION WITH "CONVENTIONAL" ALBUMIN ANALYSIS METHODS

BSPT-metoden med albuminbestemmelse ble sammenlignet med andre metoder som vanlig anvendes i sykehus. Disse var en farge-bindende metode basert på bromkresolgrønt (BCG) og en immunologisk metode. Totalt 71 patologiske serumprøver ble testet manuelt under anvendelse av BSPT-metoden og sammenlignet med en automatisert BCG-metode. I disse prøver varierte mengden av albumin mellom omtrent 15 og 60 mg/ml. Disse data ble så statistisk analysert for å gi en regresjons-ligning med Y = 9,268 + 0,7X, som indikerte en god korrelasjon mellom BSPT og BCG-metodene. Disse data relaterer til bruk av BSPT og BCG-metodene manuelt og resultatene er vist i fig. 4. The BSPT method with albumin determination was compared with other methods commonly used in hospitals. These were a dye-binding method based on bromocresol green (BCG) and an immunological method. A total of 71 pathological serum samples were tested manually using the BSPT method and compared with an automated BCG method. In these samples, the amount of albumin varied between approximately 15 and 60 mg/ml. This data was then statistically analyzed to give a regression equation with Y = 9.268 + 0.7X, which indicated a good correlation between the BSPT and BCG methods. These data relate to using the BSPT and BCG methods manually and the results are shown in fig. 4.

Metodene anvendt i det foregående (BSPT og BCG) kan også anvendes i automatiserte instrumenter. Lignende analyser ble gjennomført under anvendelse av BSPT og BCG-metoder som automatiserte prosedyrer på "Multistat III plus" og resultatene er illustrert i fig. 5. The methods used in the preceding (BSPT and BCG) can also be used in automated instruments. Similar analyzes were carried out using BSPT and BCG methods as automated procedures on "Multistat III plus" and the results are illustrated in fig. 5.

BSPT-metoden korrelerer også godt med den immunologiske teknikk som vist i fig. 6 (resultater er ikke vist). The BSPT method also correlates well with the immunological technique as shown in fig. 6 (results not shown).

EKSEMPEL 6. ANALYSE AV KOENZYM- AEXAMPLE 6. ANALYSIS OF COENZYME-A

En oppløsning ble fremstilt inneholdende BSPT-hydroklorid, albumin, MPMS, Tris-HCl buffer og "Tween"-80 ved konsentrasjoner i området indikert i tabell 1. Til delprøver derav ble tilsatt Co-A over konsentrasjonsområdet 0,25 mM av Co-A endelig konsentrasjon. Fig. 7 viser at over dette området var absorbens ved 590 nm lineært reletert til Co-A konsentra-sj onen. A solution was prepared containing BSPT hydrochloride, albumin, MPMS, Tris-HCl buffer and "Tween"-80 at concentrations in the range indicated in Table 1. Co-A was added to subsamples thereof over the concentration range 0.25 mM of Co-A final concentration. Fig. 7 shows that over this range absorbance at 590 nm was linearly related to the Co-A concentration.

EKSEMPEL 7. ANALYSE AV PARASETAMOLEXAMPLE 7. ANALYSIS OF PARACETAMOL

Parasetamol ble kvantitativt fjernet under dannelse av p-aminofenol under anvendelse av enzymet arylacylamidase ved en kjent reaksjon. En oppløsning ble fremstilt inneholdende BSPT hydroklorid, albumin. MPMS, Tris-HCl buffer og "Tween" 80 ved konsentrasjoner i områdene angitt i tabell 1. Til delprøver derav ble det tilsatt p-aminofenol. Grafen av 4-aminofenol-konsentrasjon mot absorbens ved 590 nm viser en absorbensendring opp til en konsentrasjon på 3,0 mM endelig konsentrasjon av p-aminofenol. Dette kunne relateres til parasetamolkonsentrasjon versus absorbens ved 590 nm som viste et godt lineært forhold opp til en konsentrasjon på 2,0 mM som vist i fig. 8. Paracetamol was quantitatively removed to form p-aminophenol using the enzyme arylacylamidase in a known reaction. A solution was prepared containing BSPT hydrochloride, albumin. MPMS, Tris-HCl buffer and "Tween" 80 at concentrations in the ranges indicated in table 1. To subsamples thereof p-aminophenol was added. The graph of 4-aminophenol concentration versus absorbance at 590 nm shows a change in absorbance up to a concentration of 3.0 mM final concentration of p-aminophenol. This could be related to paracetamol concentration versus absorbance at 590 nm which showed a good linear relationship up to a concentration of 2.0 mM as shown in fig. 8.

EKSEMPEL 8. ANALYSE AV KLORAMFENIKOLEXAMPLE 8. ANALYSIS OF CHLORAMPHENICOL

Kloramfenikol ble acetylisert under anvendelse av acetyl Co-A og enzymet CAT ved en kjent reaksjon. Dette resulterte i dannelse av en mengde Co-A som ble kvantitativt relatert til mengden av kloramfenikol opprinnelig tilstede. Det Co-A som ble fremstilt ble analysert under anvendelse av prosedyren i eks. 6. Absorbens ved 590 nm mot kloramfenikol-konsentrasjon var lineær over kloramfenikol-området 10 - 200 um som vist i fig. 9. Chloramphenicol was acetylated using acetyl Co-A and the enzyme CAT in a known reaction. This resulted in the formation of an amount of Co-A that was quantitatively related to the amount of chloramphenicol originally present. The Co-A produced was analyzed using the procedure in Ex. 6. Absorbance at 590 nm versus chloramphenicol concentration was linear over the chloramphenicol range 10 - 200 µm as shown in fig. 9.

Claims

1. Process for the reduction of a tetrazolium compound containing the cationic nucleus:

to form a ring-opened formazan compound containing the group:

characterized in that the tetrazolium compound is brought into interaction with albumin and the tetrazolium compound-albumin interaction product is reduced with a reducing agent in an aqueous solution at a pH between 6 and 10.

2. Method as stated in claim 1, characterized in that the core is substituted with one or more substituent groups selected from benzothiazolyl, styryl or phthalhydrazidyl, the groups themselves can carry substituents on their ring systems, or a combination of such groups.

3. Method as stated in claim 2, characterized in that the tetrazolium compound is a salt of the leucoform of 2-(2'-benzothiazolyl)-5-styryl-3-(4'-phthalhydrazidyl)tetrazolium, ("BSPT").

4. Procedure for the analysis of human or mammalian albumin in a sample, characterized by reacting a tetrazolium salt capable of interacting with albumin with a reducing agent to form a formazan in an aqueous solution at a pH between 6 and 10 in the presence of the sample, and relating the presence and/or amount of formazan formed to the presence and/or amount of albumin in the sample.

5. Method for the analysis of reducing agents in a sample, characterized by reacting a tetrazolium salt which is capable of interacting with albumin, with the sample in the presence of albumin in an aqueous solution at pH between 6 and 10 and relating the presence and/or amount of prepared formazan with the presence and/or amount of reducing agent in the sample, the amount of tetrazolium salt used being in excess beyond the amount expected to be reduced by the reducing agent in the sample.

6. Method as stated in claim 5, characterized in that the reducing agent is aminophenol, NADH or coenzyme-A.

7. Method for the analysis of a compound that participates in a chemical reaction in which a reducing agent is formed, characterized in that the formed reducing agent is analyzed using a method as stated in claim 5 and is then quantitatively related to the presence and/or quantity of the compound.

8. Method as stated in claim 7, characterized in that the compound to be analyzed is itself converted into a reducing agent.

9. Method as stated in claim 8, characterized in that the compound analyzed is paracetamol (p-hydroxyacetanilide) which is converted into the reducing agent p-aminophenol.

10. Method as stated in claim 7, characterized in that one or more of the participating reagents other than the compound to be analyzed is converted into the reducing agent.

11. Method as stated in claim 10, characterized in that the compound analyzed is chloramphenicol or thiamphenicol or a gentamicin, which is acetylated by a reaction in which acetyl Co-A participates and is converted into the reducing agent Co-A.

12. Method as stated in claim 4, characterized in that the reducing agent is NADH.

13. Method as stated in claim 4, characterized in that the reducing agent is dithiothreitol, mercaptoethanol, cysteine or aminophenol.

14. Method as stated in claim 4, characterized in that the concentration of tetrazolium salt is in the range 10uM to lOOuM and that the concentration of the reducing agent is lUM to lOOmM.

15. Procedure as specified in one or more of claims 4 - 14, characterized in that the tetrazolium salt is a salt with a nucleus substituted with one or more substituent groups selected from benzothiazolyl, styryl or phthalhydrazidyl, the groups themselves can carry substituents on their ring systems, or a combination of such groups.

16. Method as stated in claim 15, characterized in that the tetrazolium salt is a salt of BSPT.

17. Procedure as specified in one or more of claims 4 - 14, characterized in that the albumin, reducing agent or compound (as appropriate) to be analyzed is contained in a body fluid.

18. Method as stated in claim 10, characterized in that the body fluid is blood serum.

19. Procedure as specified in one or more of claims 4-14, characterized in that the tetrazolium salt, the reducing agent or albumin (as appropriate) and a pH buffer are immobilized on a solid support which is exposed to a solution sample containing albumin or reducing agent (as appropriate).

20. A solid substrate, characterized in that there is immobilized on it a tetrazolium salt, reducing agent or albumin (as appropriate) and a pH buffer and which is suitable for use in a method as stated in claim 19.

21. Analysis set for the analysis of albumin using a method as stated in claim 4, characterized in that separate solutions are included in combination containing (i) a tetrazolium salt capable of interacting with albumin, (ii) a pH buffer solution and (iii) a reducing agent.

22. Analysis kit as stated in claim 21, characterized in that the tetrazolium salt is a salt with a nucleus that is substituted with one or more substituent groups selected from benzothiazolyl, styryl or phthalhydrazidyl, the groups themselves can carry substituents on their ring systems, or a combination of such groups.

23. Analysis kit as stated in claim 22, characterized in that the tetrazolium salt is a salt of BSPT.

24. Analysis kit for the analysis of a reducing agent or a compound (as appropriate) using a method as set forth in claim 5 or 7, characterized in that it includes in combination separate solutions containing (i) a tetrazolium salt capable of interacting with albumin (ii) a buffer solution and (iii) albumin.