NO891485L - Fremgangsmaate til fremstilling av 22 kd sgh-protein og lineaer genevektor. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår området rekorabinant-DNA-bioteknologi. En side ved oppfinnelsen angår en fremgangsmåte til ekspresjon av lakseveksthormon (sGH) i metylotrof gjær av slekten Pichia. En annen side ved oppfinnelsen angår en ny gjærstamme transformert med nye vektorer inneholdende en DNA-sekvens som koder for lakseveksthormonet.

Lakseveksthormon (sGH) er blitt isolert og klonet i E. coli

av Sekine et al. (Proe. Nati. Acad. Sei. 82, (1985) 4306-4310). Det sGH som ble produsert i E. coli ble vist å være biologisk aktivt til å stimulere veksten av regnbueørret.

Anvendelsen av dette hormon i fiskefSr og agn for kommersiell fiskeoppdrett er omfattende. En rekke kommersielt viktige sorter fisk såsom laks og ørret reagerer på dette hormon og oppviser øket vekst når de behandles med sGH.

Uheldigvis har E. coli vist seg å være en uegnet vert for produksjonen av sGH. For eksempel produserer E. coli endotoksiner som er tilbøyelige til å forurense det sGH som produseres. Disse endotoksiner er uønskede forurensninger som må fjernes ved kostbare rensetrinn. Dessuten er mesteparten av det 25 kD sGH-protein som produseres i E. coli i en inaktiv form som må oppløseliggjøres og behandles for å denaturere og deretter renaturere proteinet. E. coli produserer også

bare en begrenset mengde av det mer ønskelige biologisk aktive 22 kD sGH-protein, idet det i stedet er tilbøyelig til å produsere nesten utelukkende det inaktive 25 kD sGH-protein.

Forsøk er også blitt gjort på å fremstille sGH i Saccharomyces cerevisiae slik som det er beskrevet i EP-søknad nr. 87104321.2. Den eneste form av protein som ble uttrykt, var imidlertid det inaktive 25 kD sGH-protein.

Det vil således være et betydelige bidrag til faget å skaffe en fremgangsmåte og vertsstammer til å fremme produksjonen

av 22 kD-formen av sGH som vil overflødiggjøre behovet for ytterligere behandling av 25 kD sGH-proteinet.

Det er følgelig en hensikt med oppfinnelsen å skaffe en fremgangsmåte til forbedret produksjon av 22 kD sGH i metylotrofe gjærstammer av slekten Pichia.

En annen hensikt med oppfinnelsen er å skaffe nye vektorer inneholdende en DNA-sekvens som koder for sGH.

Nok en hensikt' med oppfinnelsen er å skaffe nye lineære integrative setespesifikke vektorer inneholdende en DNA-sekvens som koder for et sGH.

Det er dessuten en hensikt med oppfinnelsen å skaffe ny metylotrofe gjærstammer av slekten Pichia transformert med en eller flere vektorer som kan fremme produksjonen av det 22 kD sGH som er egnet til industriell fermentering.

Andre hensikter, sider og ytterligere fordeler ved oppfinnelsen vil fremgå fra beskrivelsen, kravene og tegningene.

I henhold til den foreliggende oppfinnelse er der funnet en forbedret fremgangsmåte til fremstilling av 22 kD sGH-protein omfattende å transformere metylotrof gjær av slekten Pichia med kompatible vektorer inneholdende det sGH strukturelle gen som inneholdes inne i en ekspresjonskassett. Fig. IA er en representasjon av pUC18 og det universelle kloningssete som ble digerert med EcoRI og Hindlll under prepareringen for dets innsetting i EcoRI-setet av pAO804. Fig. IB er en representasjon av pAO804 som skal digereres med EcoRI og har polylinkerfragmentet fra pUC18 innsatt deri. Fig. 1C er en representasjon av pHIL201 som er produktet av innsettingen av pUC18 polylinkerfragmentet i EcoRI-setet av pAO804, idet ikke alle restriksjonssetene av EcoRI-fragmentet er vist på denne figur, skjønt de foreligger. Fig. 2A er en representasjon av psGHIB2 som skal digereres med Hindlll. Fig. 2B er en representasjon av pHIL201 som skal kløyves ved Smal-setet for innsettingen av HindIII-fragmentet inneholdende det sGH strukturelle gen, idet ikke alle restriksjonssetene på EcoRI-fragmentet er vist på denne figur, skjønt de foreligger. Fig. 2C er en representasjon av pHIL51 som er produktet avPHIL201 med det sGH strukturelle gen innsatt i Smal-setet. Dette plasmid skal deretter benyttes som lineær vektor ved

at dette plasmid delvis digereres med Bglll.

I henhold til den foreliggende oppfinnelse er der skaffet en fremgangsmåte til forbedret produksjon av 22 kD sGH i metylotrofe gjærstammer av slekten Pichia.

Videre er der i henhold til oppfinnelsen skaffet nye vektorer inneholdende en DNA-sekvens som koder for sGH.

Oppfinnelsen skaffer også nye lineære integrative setespesifikke vektorer inneholdende en DNA-sekvens som koder for sGH.

Dessuten skaffer oppfinnelsen nye metylotrofe gjærstammer

av slekten Pichia transformert med en eller flere vektorer som kan fremme produksjonen av det 22 kD sGH som er egnet til industriell fermentering.

Det gen som koder for sGH, kan utvinnes direkte fra laks i henhold til de teknikker som anvendes av Sekine et al. Proe. Nati. Acad. Sei. Vol. 82, pp. 4306-4310, juli 1985. Andre strategier som anvender rekombinant DNA-teknologi kan også benyttes til å isolere dette gen, såsom en kunstig konstruksjon av nukleotidsekvensene. For utførelse av den foreliggende oppfinnelse er det imidlertid foretrukket å isolere sGH-genet fra de plasmider som er deponert i forbindelse med US-PS

4 689 402, nemlig plasmid pSGHl, E. coli ESGH1 (FERM BP-551) deponert 23. juni 1984; pSGH14, E. coli ESGH14 (FERM BP-611) deponert 20. september 19 84; pSGHIB2, E. coli ESGHIB2

(FERM BP-612) deponert 20. september 1984; pSGHIIB9. E. coli ESGHIIB9 (FERM BP-707) deponert 8. februar 1985 og pSGHIIC2,

E. coli ESGHIIC2 (FERM BP-708) deponert 8. februar 1985.

Alle deponeringer ble gjort hos FRI.

Isolering av sGH-genet fra de ovenfor angitte plasmider kan oppnås ved en hvilken som helst egnet teknikk eller kombinasjon av teknikker. For eksempel etter dyrking av en E. coli-stamme inneholdende pSGHIIC2 kan plasmid-DNA utvinnes ved bruk av fremgangsmåten i henhold til Birnboim og Doby, Nucl. Acid Res. 7 (1979) 1513-1523. Plasmidet kan deretter renses ved anvendelse av CsCl-EtBr densitetssentrifugering. Og til slutt kan genet utvinnes ved endonuklease-digerering med Hindlll og Xbal, gelelektroforese og elektroeluering av det mindre HindIII/XbaI-fragment inneholdende sGH-genet.

Dyrking av de E. coli-stammer som er listet opp ovenfor, kan utføres ved hvilke som helst egnede fremgangsmåter. Generelle teknikker for dyrking av E. coli er allerede kjent i faget og en hvilken som helst tilpasning av disse metoder til de spesielle behov av de stammer som inneholder sGH-genet, ligger godt innenfor en fagmanns evner.

Utvinning av plasmid-DNA fra E. coli kan oppnås ved forskjellige teknikker på grunn av dets kompakte størrelse og lukkede sfæriske superspiralform. For eksempel etter høsting kan vertsceller pelleteres ved sentrifugering og deretter resuspenderes og lyseres. Lysatet bør sentrifugeres for å fjerne celleavfall og supernatanten som inneholder DNA be-holdes. En fenolekstråksjon kan deretter utføres for å fjerne de fleste andre forurensninger fra DNA. Det fenolekstraherte DNA kan deretter behandles ytterligere ved bruk av en densi-tetgradientsentrifugering eller en gelfiltreringsteknikk for å separere plasmid DNA fra bakterielt DNA. Teknikkene for oppnåelse av separasjonen som det hentydes til ovenfor, er velkjente i faget, og en rekke forskjellige fremgangsmåter til utførelse av disse teknikker er kjent.

Nukleasedigerering av plasmidet inneholdende sGH-genet kan utføres ved valg av passende endonukleaser som vil kappe det plasmid som velges på en slik måte at det letter utvinningen av det intakte sGH-gen. Endonukleasene som benyttes vil avhenge av den kilde fra hvilken sGH-genet skal kuttes ut. For eksempel, sGH-genet som inneholdes i plasmid psGHIIC2 kan utvinnes som et HindIII/XbaI-fragment. Gelelektroforese eller en annen egnet teknikk vil være nødvendig for å separere det fra det andre fragment som foreligger.

Gelelektroforese av DNA kan utføres ved bruk av en rekke forskjellige teknikker. Se P.G. Sealy og E. M. Southern, Gel Electrophoresis of Nucleic Acids - A Practical Approach

(D. Rickwood og B. D. Hames, eds.) p. 39 (1982). Eluering kan også oppnås ved bruk av en rekke forskellige teknikker som er passende for den gel som er involvert såsom elektroeluering, diffusjon, geloppløsning (agarosegeler) eller fysisk ekstru-dering (agarosegeler). Det er dessuten anerkjent at eluering ikke nødvendigvis er påkrevet for visse geler såsom agarose av høy kvalitet som smelter ved lav temperatur.

Når fragmentet inneholdende sGH-genet er isolert, kan fragmentet muligens trenge ytterligere manipulering før det innsettes i vektoren. Disse manipuleringer kan innbefatte, men er ikke begrenset til tilføyelsen av linkere eller å gi fragmentet en butt ende (blunt-ending).

Etter isoleringen av sGH-genet blir dette innsatt i en egnet vektor såsom et plasmid eller en lineær transformasjonsvektor som er kompatibel med Pichia.

Plasmider har lenge vært et av de grunnleggende elementer

som anvendes i rekombinant-DNA-teknologi. Plasmider er sirku-lært ekstrakromosomalt dobbelttrådet DNA som finnes i mikro-

organismer. Plasmider er funnet å opptre som enkelte eller flere kopier pr. celle. Innbefattet i plasmid DNA er den informasjon som er nødvendig for plasmidreproduksjon, dvs. en autonom replikasjonssekvens eller ARS (et opprinnelsessted for replikasjon kan innlemmes for bakteriell replikasjon).

En eller flere måter til fenotypisk utvelgelse av plasmidet

i transformerte celler kan også innlemmes i den informasjon som er kodet inn i plasmidet. Fenotypiske markører eller seleksjons-markører såsom antibiotisk resistens eller gener som komplementerer defekte vert-biokjemiske veier, tillater at kloner av de vertceller som er blitt transformert gjen-kjennes, utvelges og opprettholdes.

For å uttrykke sGH-genet i Pichia må genet være operabelt forbundet med et Pichia-kompatibelt regulatorisk område og 3<1->endesekvensen som danner den ekspresjonskassett som skal innsettes i verten via en vektor.

De følgende uttrykk er her definert for klarhets skyld.

sGH - polypeptid som fås som et resultat av

ekspresjonen av sGH-genet.

Operabelt forbundet - betegner en sammenstilling hvor kompo-nentene er konfigurert slik at de utfører sin funksjon.

Regulatorisk område - betegner heterogene DNA-sekvenser som reagerer på forskjellige stimuli og virker inn på hyppigheten av mRNA-tran-skripsj on.

3'-endesekvens - sekvenser 3' til stoppkodonet som bevirker stabilisering av mRNA såsom sekvenser som bevirker polyadenylering eller stamløkke-strukturer.

"Pichia-kompatibel" betegner DNA-sekvenser som vil utføre deres normale funksjon i Pichia såsom regulatoriske områder og 3'-endesekvenser avledet fra Pichia eller nær beslektede

gjærsorter såsom Saccharomyces cerevisiae og Hansenula polymorpha.

For utførelse av den foreliggende oppfinnelse foretrekkes integrative vektorer såsom den lineære sete-spesifikke integrative vektor ifølge Cregg som beskrevet i EP-søknad nr. '86114700.7 (publisert 1. juli 1987). Slike vektorer omfatter minst 1) et første innsettbart DNA-fragment, 2) et selekterbart markørgen og 3) et annet innsettbart DNA-fragment.

De første og andre innsettbare DNA-fragmenter er hver minst ca. 200 nukleotider lange og har nukleotidsekvenser som er homologe med partier av det genomiske DNA av arter av slekten Pichia. De forskjellige komponenter av den integrative vektor er arrangert i serie for dannelse av et lineært fragment av DNA slik at ekspresjonskassetten og det selekterbare markørgen er anordnet mellom 3'-enden av det første innsettbare DNA-fragment og 5'-enden av det annet innsettbare DNA-fragment.

De første og andre innsettbare DNA-fragmenter er orientert i forhold til hverandre i det i serie arrangerte lineære fragment på samme måte som de er orientert i genomet av Pichia.

Nukleotidsekvenser som er nyttige som de første og andre innsettbare DNA-fragmenter, er nukleotidsekvenser som er homologe med separate partier av det native Pichia genomiske sete hvor genomisk modifikasjon skal finne sted. For eksempel, dersom genomisk modifikasjon skal finne sted ved lokuset av alkoholoksidasegenet, vil de første og andre innsettbare DNA-fragmenter som anvendes, være sekvenser som er homologe med separate partier av alkoholoksidasegen-lokuset. For at genomisk modifikasjon i henhold til den foreliggende oppfinnelse skal finne sted, må de to innsettbare DNA-fragmenter være orientert i forhold til hverandre i det lineære fragment med den samme relative orientering med hvilken de eksisterer i Pichia-genomet. Eksempler på nukleotidsekvenser som kan benyttes som første og andre innsettbare DNA-fragmenter er nukleotidsekvenser valgt fra gruppen bestående av alkoholoksidase-genet (A0X1), dihydroksyacetonsyntase-genet (DHAS1), p40-genet og HIS4-genet. AOXl-genet, DHASl-genet, p40-genet og HIS4-genet er angitt i EP-A-183 071.

Det første innsettbare DNA-fragment kan inneholde et operabelt regulatorisk område som kan omfatte det regulatoriske område som benyttes i ekspresjonskassetten. Bruken av det første innsettbare DNA-fragment som det regulatoriske område for en ekspresjonskassett er en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen. Fig'. 2C viser et diagram av en vektor som benytter det første innsettbare DNA-fragment som et regulatorisk område for en kassett.

Eventuelt som vist på fig. 2C kan ett eller flere innsetnings-seter og en 3'-endesekvens anbringes umiddelbart 3' til det første innsettbare DNA-fragment. Denne konformasjon av den lineære setespesifikke integrative vektor har den ytterligere fordel at det skaffer et ferdig sete for innsetting av et strukturelt gen uten at det nødvendiggjør tilføyelsen av en kompatibel 3'-endesekvens.

De tallrike kløyvingsseter som er skaffet i pHIL201-vektoren mellom den første innsettbare sekvens og 3'-endesekvensen,

er også fordelaktige, da færre linkere vil være nødvendige for å innsette det strukturelle gen i vektoren.

Det er også nødvendig å innlemme i det minste ett selekterbart markørgen i det DNA som benyttes til å transformere verts-stammen. Dette letter seleksjonen og isoleringen av de orga-nismer som har innlemmet det transformerende DNA. Markørgenet meddeler den transformerte organisme et fenotypisk trekk som verten ikke hadde, f.eks. gjenopprettelse av evnen til å produsere en spesiell aminosyre hvor den utransformerte verts-stamme har en defekt i den spesielle aminosyrebiosyntetiske vei eller resistens overfor antibiotika og lignende.

Selekterbare markørgener som kan anvendes kan velges fra gruppen bestående av HIS4-genet og ARG4-genet fra Pichia pastoris og Saccharomyces cerevisiae, invertasegenet (SUC2) fra Saccharomyces cerevisiae, G418-fosfotransferasegenet fra de E. coli overførbare (transposable) elementer Tn601 eller Tn903.

Fagfolk vil innse at ytterligere DNA-sekvenser også kan innlemmes i vektorene som anvendes til utførelse av den foreliggende oppfinnelse, som f.eks. bakterielt plasmid-DNA, bakteriofag-DNA og lignende. Slike sekvenser tillater ampli-fikasjon og opprettholdelse av disse vektorer i bakterieverter.

Dersom det første innsettbare DNA-fragment ikke inneholder

et regulatorisk område, vil det være nødvendig å innsette et egnet Pichia-kompatibelt regulatorisk område operabelt forbundet med det strukturelle gen for å skaffe en operabel ekspresjonskassett. Tilsvarende, dersom ingen 3'-endesekvens er skaffet ved innsettingssetet for å komplettere ekspresjonskassetten, må en 3'-endesekvens som er operabelt forbundet med det strukturelle gen, innsettes.

Fagfolk er oppmerksom på en rekke regulatoriske områder som

er blittkarakterisertog kan anvendes i forbindelse med Pichia-slekten. Eksempler på Pichia-kompatible regulatoriske områder innbefatter, men er ikke begrenset til gjær-regulatoriske-områder valgt fra gruppen bestående av sur fosfatase, galaktokinase, alkoholdehydrogenase, cytokrom c, alfa-paringsfaktor og glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenase regulatoriske områder isolert fra Saccharomyces cerevisiae; den primære alkoholoksidase (A0X1), dihydroksyacetonsyntase (DHAS1), p40-regulatoriske områder og det HIS4-regulatoriske område som fås fra Pichia pastoris og lignende. For tiden foretrukne regulatoriske områder som anvendes til utførelse av den foreliggende oppfinnelse er de som er kjennetegnet ved deres evne til å reagere på metanolholdige media såsom regulatoriske områder valgt fra gruppen bestående av A0X1, DHAS1, p40 og HIS4 som angitt i det ovenfor nevnte patentskrift EP-A-183 071.

Det mest foretrukne regulatoriske område for utførelse av oppfinnelsen er det AOXl-regulatoriske område.

3'-endesekvensene kan benyttes i ekspresjonskassetten eller være en del av vektoren som angitt ovenfor. 3'-endesekvensene kan funksjonere for å avslutte, polyadenylatisere og/eller stabilisere messenger-RNA som er kodet for ved det strukturelle gen når det er operabelt forbundet med et gen. Noen eksempler som belyser, men ikke begrenser kildene for 3'-endesekvensene for utførelse av oppfinnelsen, innbefatter Saccharomyces cerevisiae-, Hånsenula polymorpha- og Pichia 3'-endesekvenser. Spesielt foretrukket er de som fås fra Pichia pastoris såsom de som er valgt fra gruppen bestående av 3'-endesekvensene av AOXl-genet, DHASl-genet, p40-genet og HIS4-genet.

For utførelse av den foreliggende oppfinnelse er det for tiden foretrukket å benytte lineære transformasjonsvektorer såsom BglII-fragmentene av de konstruerte stykker vist på fig. IB og 1C.

Innsettingen av sGH-genet i egnede vektorer kan utføres ved en hvilken som helst egnet teknikk som kløyver den valgte vektor ved ett eller flere passende seter og fører til at minst én operabel ekspresjonskassett inneholdende sGH-genet foreligger i vektoren.

Ligasjon av sGH-genet kan utføres ved en hvilken som helst ligasjonsteknikk såsom anvendelse av T4 DNA-ligase.

Den opprinnelige seleksjon, formering og eventuell amplifika-sjon av ligasjonsblandingen av sGH-genet og en vektor utføres fortrinnsvis ved transformasjon av blandingen inn i en bakte-rievert såsom E. coli (skjønt ligasjonsblandingen kan trans-formeres direkte inn i en gjærvert). Egnede transformasjonsteknikker for E. coli er velkjente i faget. Dessuten er selek-sjonsmarkører og bakterielle opprinnelsessteder for replikasjon som er nødvendig for opprettholdelsen av en vektor i en bak-terievert også velkjent i faget.

Isolering og/eller rensing av det ønskede plasmid som inneholder sGH-genet i et ekspresjonssystem kan oppnås ved en hvilken som helst egnet metode til separering av plasmid-DNA fra verts-DNA.

På lignende måte kan vektorene som dannes ved ligasjon utprøves fortrinnsvis etter formering for å bekrefte nærværet av sGH-genet og dets operable binding til et regulatorisk område og en 3'-endesekvéns. Dette kan oppnås ved en rekke forskjellige teknikker som innbefatter, men ikke er begrenset til endo-nukleasedigerering, gelelektroforese eller endonukleasedige-rering/Southern hybridisering.

Transformasjon av plasmider eller lineære vektorer inn i gjærverter kan oppnås ved egnede transformasjonsteknikker som innbefatter, men ikke er begrenset til de som er angitt av Hinnen et al, Proe. Nati. Acad. Sei. 75, (1978) 1929; Ito et al, J. Bacteriol 153, (1983) 163; Cregg et al Mol. Cell Biol. 5 (1985) p. 3376 eller Sreekrishna et al, Gene, 59

(1987) p. 115. For utførelse av den foreliggende oppfinnelse foretrekkes transformasjonsteknikkene i henhold til Cregg eller Sreekrishna. Det er ønskelig for utførelse av den foreliggende oppfinnelse å benytte et overskudd av lineære vektorer og selektere for multiple innsettinger ved Southern hybridisering .

Gjærverten for transformasjon kan være en hvilken som helst egnet metylotrof Pichia-vert. For tiden foretrukne Pichia-verter er auksotrofe Pichia-stammer så som GS115 (NRRL Y-15851). Man innser imidlertid at ville typer stammer kan anvendes med like stort hell dersom SUC2 eller en egnet antibiotikaresistens-markør anvendes såsom G418.

Transformerte Pichia-celler kan selekteres for ved bruk av egnede teknikker som innbefatter, men ikke er begrenset til dyrking av tidligere auksotrofe celler etter transformasjon i fravær av et biokjemisk produkt som er nødvendig (på grunn av cellenes auksotrofi), seleksjon ved påvisning av en ny fenotype ("metanol-langsom") eller dyrking i nærvær av et antibiotikum som er giftig overfor Pichia i fravær av et resistensgen som inneholdes i transformanten.

Isolerte transformerte Pichia-celler dyrkes ved passende fermenteringsteknikker såsom ristekolbe-fermentering eller fermenteringsteknikker som anvender høy tetthet som beskrevet i US-PS 4 414 329.

Ekspresjon kan utføres ved fremgangsmåter som er passende

for det regulatoriske område som anvendes. Fortrinnsvis, dersom på metanol reagerende regulatoriske områder anvendes, kan indusering av ekspresjon oppnås ved den teknikk som er skissert i eksempel V.

Etter ekspresjon av sGH-genet ble nærvær av både 22 kD- og

25 kD-protein påvist ved et Western blott. Den samlede sGH-proteinproduksjon ble anslått til mellom 1% og 3% av det samlede celleprotein. Den prosentvise del av det samlede sGH som forelå i 22 kD-formen, ble anslått til å være 5-20% av det samlede sGH som forelå som bestemt ved det modifiserte Western blott.

De følgende ikke-begrensende eksempler er vist for ytterligere å belyse oppfinnelsen.

Eksempler

Generell informasjon som angår eksemplene:

Stammer

Pichia pastoris GS115 (his4) [NRRL Y-15851] var den gjærstamme som ble benyttet i disse eksempler.

E. coli DG75' (hsdl, leu-6, lacY, thr-1, supE44, tonA21 lambda

[-] eller JM107 (endAl, gyrA96, thil, hsdR 17, SupE44, relA, lambda (-), * (lac-ProAB), [F°, traD36, ProAB, lacI^Z^MlS1]

ble benyttet til plasmidkonstruksjoner samt til formering av plasmid-DNAer.

Buffere, oppløsninger og medier

De buffere og oppløsninger som ble anvendt i de følgende eksempler, hadde de sammensetninger som er angitt nedenfor:

Eksempel I

Dannelse avPHIL201

pAO804-plasmidet er tilgjengelig i en E. coli-vert fra the Northern Regional Research Center ved De forente staters landbruksdepartement, Peoria, Illinois (aksesjonsnr. B-18021). Plasmid pHIL201 ble konstruert idet man startet fra pAO804 som følger: pAO804 (ca. 4 ug) ble digerert fullstendig i to porsjoner med 20 enheter EcoRI-restriksjonsenzym i 25 ul av meget saltholdig buffer (10 mM magnesiumklorid, 50 mM Tris-HCl - pH 7,5, 1 mM ditiotreitol, 100 mM natriumklorid og 100 ug/ml bovinserumalbumin. Digereringen ble utført i 1,5 h ved 37°C.

Denne blanding ble deretter varmet ved 7 0°C i 6 min i et vannbad og deretter overført til et isvannbad. Det DNA som forelå i oppløsning, ble utfelt ved tilsetning av 3 pl 3M natriumacetat og 80 ul absolutt etanol. DNA-utfellingen ble gjort lettere ved inkubasjon ved -20°C i 135 min. DNA-utfellingen ble samlet opp ved sentrifugering i 3 0 min ved 4°C i en mikrosentrifuge (microfuge). DNA-pelleten ble tørket under vakuum. Hver DNA-pellet ble oppløst i 78 ul alkalisk fosfa-tasebuffer (50' mM Tris-HCl, pH 9,0 og 1 mM magnesiumklorid) og inkubert med 0,5 enheter alkalisk fosfatase fra kalvetarm i 30 min ved 37°C. Ytterligere 0,5 enheter alkalisk fosfatase ble tilsatt, og inkubering i 30 min ved 37°C ble gjentatt. Etter dette ble reaksjonsblandingen ekstrahert tre ganger med en fenol/kloroform-blanding, to ganger med kloroform og fire ganger med 500 ul eter. Residualeteren ble fordampet i vakuum. Porsjonene ble kombinert og DNA ble utfelt som beskrevet ovenfor. DNA-pelleten ble oppløst i 20 ul vann og lagret ved -20°C inntil videre bruk. Dette DNA ble betegnet som "vektor".

Plasmid pUC18 (ca. 10 ug) ble digerert med Bgll (20 enheter) og HindiII (10 enheter) i 20 ul buffer med høyt saltinnhold (beskrevet ovenfor) ved 37°C i 1 h. Bgll-digerering bidrar til å redusere bakgrunnen på grunn av regenerering av pUC18 i løpet av ligasjonen. Natriumklorid og Tris ble tilsatt for å bringe bufferkonsentrasjonen til høye saltbetingelser som beskrevet ovenfor, og EcoRI (20 enheter) ble tilsatt for å frigjøre det universelle kloningssete ved inkubering ved 37°C i 60 min. Etter digerering ble DNA utfelt som beskrevet ovenfor. DNA-utfellingen ble oppløst i 20 ul vann og lagret ved -20°C inntil senere bruk. Dette DNA ble betegnet som "passasj er".

Vektor- og passasjer-DNAer ble blandet ved et vektforhold på 1:2,5 i 20 ul DNA-ligasjonsbuffer (50 mM Tris-HCl - pH 7,4, 10 mM magnesiumklorid, 10 mM ditiotreitol, 1 mM ATP og 100 \ ig/ ml bovinserumalbumin) ved en endelig DNA-konsentrasjon på 70 \ ig/ ml og inkubert over natten ved 4°C og 2 enheter T4DNA-ligase. Halvparten av den ligatiserte prøve ble benyttet til å transformere E. coli-stamme JM107 ved anvendelse av fremgangsmåten i henhold til Dagert og Ehrlich ( Gene 6, 23

(1979)). En rekke ampicillinresistente kloner ble oppnådd og de ble utprøvet på minimalt medium med ampicillin, X-gal og IPTG. En blanding av hvite og blå kolonier ble oppnådd. De blå kolonier representerer pUC18-bakgrunn. Således tillot bruken av JM107 som en vert eliminering av pUC18-holdige bakgrunnskloner. En rekke hvite kloner ble underkastet lyse i liten skala og EcoRI-BamHI restriksjonsanalyse, hvilket førte til identifisering av kloner inneholdende pHIL201 (se fig. 1C). Fremstilling av plasmid i stor skala ble utført fra en slik klon for oppnåelse av en tilstrekkelig mengde pHIL201 for det neste trinn (se eksempel III).

Eksempel II

Utvinning av sGH- gen fra psGHIB2

sGH-genet svarende til ca. 0,9 kb (nukleotidsammensetningen av dette fragment er angitt nedenfor) ble frigjort fra psGHIB2 ved Hindlll-digerering. Ca. 10 ug av plasmid psGHIB2 (beskrevet hos Sekine et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA. vol. 82, pp. 4306-4310, juli 1985) ble digerert ved 37°C i 4 h med 10 enheter Hindlll i 40 ul middels salt buffer (10 mM Tris-HCl

- pH 7,5, 10 mM magnesiumklorid, 1 mM ditiotreitol, 50 mM natriumklorid og 4 ug bovinserumalbumin). Etter digerering ble 8 ul (ca. 2 ug DNA) av reaksjonsblandingen underkastet elektroforese på 0,9% agarose. Mer enn 5 0% av plasmidet ble funnet å være kløyvet av Hindlll under disse betingelser. Gelelektroforese-mønsteret viste klart nærværet av et DNA-fragment på

ca. 0,9 kb svarende til sGH-genet.

De kohesive ender av DNA-fragmentene som var et resultat av Hindlll-kløyvingen av psGHBI2, ble gjort til butte ender ved bruk av Klenow-fragment av E. coli DNA-polymerase I som følger: 32 yl Hindlll-kløyvet psGHIB2 (ca. 8 pg DNA) ble blandet med 2,5 ul dNTP-blanding (en blanding av 2 mM av hver av dATP, dTTP, dCTP og dGTP), 5 ul av 10x nicktranslasjonsbuffer (0,5 M

Tris-HCl - pH 7,2, 0,1 M magnesiumsulfat, 1 mM ditiotreitol

og 500 ug/ml bovinserumalbumin), 10 pl dobbeltdestillert vann og 0,5 ul (10 enheter) Klenow-fragment av DNA-polymerase I. Reaksjonsblandingen ble inkubert ved 22°C i 30 min, og reaksjonen ble avsluttet ved oppvarming til 70°C i 5 min. Etter dette ble hele prøven underkastet elektroforese på

0,9% agarosegel og det parti av gelen som inneholdt DNA-fragmentet svarende til sGH-genet (ca. 0,9 kb) ble kuttet fra resten av gelen og det DNA som forelå i gelstykket, ble elek-troeluert i en dialysepose inn i 400 ul 5 mM EDTA (pH 8,0). Det eluerte DNA ble fenol/kloroform-ekstrahert, utfelt, vasket, tørket og oppløst i 50 ul dobbeltdestillert vann som beskrevet i eksempel I ovenfor. Utbyttet av sGH-DNA-fragmentet var ca. 1 ug. Dette ble benyttet som en kilde til sGH-genfragmentet for konstruksjonen av pHIL51 (se eksempel III).

Eksempel III

Dannelse av pHIL51- plasmid

Det butte (blunt ended) sGH-fragment fra psGHIB2 oppnådd som beskrevet i eksempel II, ble innsatt i Smal-setet (butt ende) av pHIL201-plasmid (beskrevet i eksempel I) som følger:

Plasmid pHIL201 (2 ug) i 20 ul middels salt buffer (beskrevet

i eksempel II) ble kløyvet med 5 enheter Smal ved inkubering ved 37°C i 2 h. Etter dette ble 200 ng av det digererte DNA underkastet elektroforese på 0,9% agarosegel, hvilket indikerte at mesteparten av DNAet var kløyvet av Smal. Det Smal-digererte plasmid ble behandlet med alkalisk fosfatase fra kalvetarm som beskrevet i eksempel I. Det Smal-kappede og det alkalisk fosfatase-behandlede pHIL201 ble oppløst i 100 ul vann. For ligasjon ble 100 ng pHIL201 som var kløyet med Smal og behandlet med alkalisk fosfatase, blandet med 200 ng butt sGH-genfragment (eksempel II) i 20 ul volum salt ligasjonsbuffer (beskrevet i eksempel I) og ligatisert over natten ved 4°C

med T4-DNA-ligase. Etter dette ble ligasjonsreaksjonen avsluttet ved inkubering ved 65°C i 5 min. Den ligatiserte

prøve ble digerert med 5 enheter Smal i 30 min ved 37°C som beskrevet tidligere. Smal-digereringen etter ligasjon reduserer forstyrrelsen i transformasjonen ved selvligatisert pHIL201. Den Smal-digererte ligasjonsblanding ble benyttet til å transformere E. coli DG75'. Flere ampicillinresistente kloner ble oppnådd, og de ble analysert ved alkalisk lyse for å identifisere de kloner som inneholdt det ønskede pHIL51-plasmid. Fremstilling av plasmid i stor skala ble utført fra en slik klon og benyttet til transformasjon av P. pastoris GS115.

Eksempel IV

Transformasjon av Pichia pastoris

A. Vektorpreparering

100 ug plasmid pHIL51 oppnådd fra E. coli DG75' ble underkastet partiell digerering med Bglll. Et 6,1 kb BglII-fragment ble oppnådd, se fig. 2C. Fordi sGH inneholder et internt Bglll-sete kunne en fullstendig digerering ikke utføres, da dette ville ha ført til utvinning av inoperative og ufullstendige integrative vektorer.

De fragmenter som ble oppnådd ved den partielle digerering

av pHIL51, ble underkastet agarosegelelektroforese. 1 ug av

lineære seteselektive integrative sGH-vektorer forurenset med mindre BglII-fragmenter ble oppnådd ved denne fremgangsmåte. Denne blanding av DNA-fragmenter ble benyttet til å transformere Pichia pastoris stamme GS115 (his4-) som er deponert hos the Northern Regional Research Center, De forente staters landbruksdepartement, med aksesjonsnr. NRRL Y-15851. Transformasjon med vektorer inneholdende histidinol-dehydro-genasegenet komplementerer denne defekt i histidinveien,

idet de GS115-transformerte celler forandres til His<+>. Screening for transformanter kan derfor lett utføres ved dyrking av cellene etter transformasjon i et vekstmiljø som mangler histidin og utvinning av de celler som kan vokse under denne betingelse.

B. Celledyrking

Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) ble podet inn i ca.

10 ml YPD-medium og ristedyrket ved 30°C i 12-20 h. 100 ml YPD-medium ble podet med startkultur (seed culture) for å gi en OD500på ca. 0,001. Mediet ble dyrket i en ristekolbe ved 30°C i 12-20 h.

Kulturen ble høstet når ODggg var 0,2-0,3 (etter tilnærmet 16-20 h) ved sentrifugering ved 1500 g i 5 min ved anvendelse av en Sorvall RC5C.

C. Preparering av sfæroplaster

Cellene ble vasket en gang i 10 ml sterilt vann og deretter sentrifugert ved 1500 g i 5 min. (Sentrifugering utføres etter hver cellevask ved 1500 g i 5 min ved bruk av "Sorvall RT6000B" med mindre noe annet er angitt). Cellene ble deretter vasket en gang i 10 ml nylig fremstilt SED, en gang i 10 ml sterilt 1 M sorbitol, og til slutt resuspendert i 10 ml SCE-buffer. 7,5 ul av 3 mg/ml Zymolyase (100 00 enheter pr. g fra Miles Laboratories) ble satt til celleoppløsningen. Cellene ble deretter inkubert ved 30°C i ca. 10 min. (En reduksjon på 60% i ODgQQkan anvendes som en riktig tids- og konsentra- sjonsmarkør). Sfæroplastene ble vasket en gang i 10 ml sterilt 1 M sorbitol ved sentrifugering i 700 g i 5-10 min. (Tiden og hastigheten for sentrifugeringen kan variere. Der bør sentrifugeres tilstrekkelig til å pelletere sfæroplastene, men

ikke så meget at de brytes opp av kraften). 10 ml sterilt CaS ble benyttet som en endelig cellevask, og cellene ble sentrifugert igjen ved 700 g i 5-10 min og resuspendert i 0,6 ml CaS.

D. Transformasjon

GS115-celler ble transformert med 1 ug av de lineære sGH-vektorer ved anvendelse av sfæroplast-transformasjonsteknikken i henhold til Sreekrishna et al. i Gene 59, 115-125 (1987). DNA-prøver ble tilsatt (inntil et volum på 20 ul) til 12 x 75 mm sterile polypropylenrør. (DNA bør foreligge i en egnet buffer såsom TE-buffer). 100 ul sfæroplaster ble satt til hver DNA-prøve og inkubert ved værelsetemperatur i ca. 20 min.

1 ml PEG-oppløsning ble satt til hver prøve og inkubert ved

værelsetemperatur i ca. 15 min og sentrifugert ved 700 g i 5-10 min. SOS (150 ul ble satt til pelleten og inkubert i 30 min ved værelsetemperatur. Til slutt ble 850 ul 1 M sorbitol tilsatt.

E. Regenerering av sfæroplaster

Et bunn-agarlag på 20 ml regenereringsagar SDR ble helt på hver plate minst 30 min før transformasjonsprøvene var ferdige. Dessuten ble 8 ml's porsjoner av regenereringsagar fordelt

på 15 ml's rør med konusformet bunn i et 45°C bad i løpet av den periode transformasjonsprøvene forelå i SOS. Porsjoner på 50, 250 eller 800 ul av den transformerte prøve ble satt til 8 ml's porsjonene av smeltet regenereringsagar, holdt på 45°C og helt på plater inneholdende faste 20 ml's bunn-agarlag. Platene ble inkubert ved 30°C i 3-5 dager.

F. Seleksjon av transformanter

Der ble selektert for transformanter ved dyrking på SDR, et .medium som mangler histidin. Kulturer som vokste i fravær av histidin ble dessuten undersøkt for "metanol langsom"-fenotype (hvilket indikerer seteselektiv integrasjon). De transformerte GS115-celler som viste tegn på begge fenotyper, ble deretter dyrket og analysert for produksjonen av sGH. Pichia pastoris GS115/pHIL51-62 ble selektert ved denne fremgangsmåte og ble deponert den 29. mars 1988 i henhold til Budapest-konvensjonen hos the Northern Regional Research Center i Peoria, Illinois, med aksesjonsnr. NRRL(Y-18353).

Eksempel V

Ekspresjon av sGH

A. Cellekultur

Pichia pastoris GS115/pHIL51-62 ble podet inn i 2 1 IM-3-medium inneholdende 2% glycerol ved 3 0°C. Etter at denne sats med glycerol var oppbrukt, ble kontinuerlig vekst opp-rettet på FM-21-medium inneholdende 10% glycerol. Den kontinuerlige kultur ble opprettholdt ved en fortynningshastighet på 0,065 (oppholdstid = 15,4 h) inntil en celletetthet på

ca. 50 g/l regnet på tørr cellevekt ble oppnådd. Etter at fire reaktorvolumer av matningsmedium var blitt tilført gjæringsapparatet, ble gjæringens kontinuerlige trinn avsluttet. Produksjonen av lakseveksthormon ble indusert og opprettholdt ved den vedvarende injisering av metanol på 0,25-0,5% av dyrkingsvolumet slik at konsentrasjonen av metanol ble opprettholdt på mellom 0,1 og 0,8%. Prøver ble samlet opp for analyse av lakseveksthormon etter at kulturen var blitt utsatt for metanol i 0, 24, 50 og 73 h. Etter at kulturen var blitt utsatt for metanol i 73 h, ble den høstet ved sentrifugering. Ca. 300 g våt cellepasta ble oppnådd fra det gjenværende kulturvolum på 1,5 1. Dette svarte til 199 g/l våt cellepasta eller tilnærmet 50 g/l tørr cellevekt, hvilket antydet at

cellemassen ikke i vesentlig grad ble redusert under gjæringens metanolinduksj onstrinn.

B. Deteksjon av sGH

10 ml celler med en ODggg på 5-10 pr. ml ble oppnådd fra

gjæringsapparatet. Cellene ble sentrifugert ved 5000 omdr./min ved bruk av en "Sorvall RT6000B" avkjølt sentrifuge. Pelleten ble vasket medl ml brytningsbuffer, sentrifugert som angitt ovenfor og resuspendert i 0,5 ml brytningsbuffer. Blandingen ble svirret i 8 min alt i alt, fra 2 til 4 min hver gang, under anvendelse av et halvt volum syrevaskede glassperler ("Sigma", 450 pi). Blandingen ble sentrifugert på nytt ved 12 000 omdr./min i 5 min ved bruk av en mikrosentrifuge for

å pelletere celleavfallet. Den resulterende pellet ble resuspendert i 200 pl av den følgende oppløsning: 10 mM Tris-HCl pH 8, 1,0 mM EDTA, 2,5% SDS, 5% |3-merkaptoetanol og 0,01% BPB (bromfenol blått). For deteksjon av sGH ble denne oppløsning kjørt på en 15% SDS-polyakrylamidgel i ca. 25 min. De stan-darder som ble anvendt, var renset 25 kD sGH og Biorad-standard med lav molekylvekt. Protein ble gjort synlig på gelene ved farging med Coomassie Blue. Tilnærmet 1-3% av det samlede celleprotein var sGH med 5-20% av dette i den aktive 22 kD-form. Deteksjon av nærværet av det aktive 22 kD-materiale og 25 kD-materialet av sGH ble utført ved en modifisert Western

ved anvendelse av en trippel antistoffdeteksjons-metode:

sGH mus-MoAb/antimus geit-Ab/antigeit kanin Ab-alkalisk-fosfatase. Begge bånd ble synliggjort på gelene.

De eksempler som er angitt, er bare ment å belyse utførelsen av oppfinnelsen og skal ikke anses som begrensende for omfanget av oppfinnelsen eller de tilhørende krav.

Claims (20)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av 22 kD sGH-protein, . karakterisert ved at den omfatter: a) transformasjon av en metylotrof gjærstamme av slekten Pichia med minst én vektor som har en Pichia-kompatibel ekspresjonskassett inneholdende et sGH strukturelt gen som er operabelt forbundet med et regulatorisk område og en 3'-endesekvens, og deretter b) dyrking av den resulterende transformerte gjærstamme av slekten Pichia under egnede betingelser for oppnåelse av produksjon av 22 kD sGH.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at den nevnte vektor velges fra gruppen bestående av plasmider eller lineære integrative setespesifikke vektorer.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, karakterisert ved at vektoren er en linær integrativ setespesifikk vektor.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert ved at den nevnte lineære integrative sete-spesif ikke vektor inneholder det følgende arrangement i serie: a) et første innsettbart DNA-fragment, b) et markørgen og minst én Pichia-kompatibel ekspresjonskassett inneholdende et sGH strukturelt gen som er operabelt forbundet med et regulatorisk område og en 3'-endesekvens, og c) et annet innsettbart DNA-fragment, hvor rekkefølgen av mørkørgenet og kassetten i komponent (b) kan byttes om.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at det første innsettbare DNA-fragment og det annet innsettbare DNA-fragment fås fra DNA-sekvensen av et gen som er isolert fra Pichia pastoris og valgt fra gruppen bestående av A0X1, p4 0, DHAS og HIS4. .

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at ekspresjonskassetten omfatter a) et regulatorisk område valgt fra gruppen bestående av A0X1, p40, DHAS og HIS4 isolert fra Pichia pastoris, sur fosfatase, galaktosidase, alkoholdehydrogenase, cytokrom c, alfa-paringsfaktor og glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase isolert fra Saccharomyces cerevisiae operabelt forbundet med b) et sGH strukturelt gen som koder for et sGH som er operabelt forbundet med c) en 3'-endesekvens fra Pichia pastoris valgt fra gruppen bestående av de 3'-merkede endesekvenser som er isolert fra AOXl-genet, p40-genet, DHAS-genet og HIS4-genet.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at det nevnte markørgen velges fra gruppen bestående av HIS4 og ARG4 isolert fra Pichia pastoris, SUC2 isolert fra Saccharomyces cerevisiae og G418 <R-> gen av bakterielt Tn903 og Tn601.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at den nevnte vektor omfatter a) et første innsettbart DNA-fragment som er tilnærmet én kilobase av det 5'A0X1 regulatoriske område som er isolert fra Pichia pastoris og er operabelt forbundet med b) et sGH strukturelt gen operabelt forbundet med c) 3'-endesekvensen av A0X1 isolert fra Pichia pastoris ligatisert til d) et markørgen som er HIS4 isolert fra Pichia pastoris ligatisert til e) et annet innsettbart DNA-fragment som er tilnærmet 0.65 kilobaser av 3' AOXl-endesekvensen.

9. Lineær integrativ setespesifikk vektor, karakte risert ved at den omfatter det følgende arrangement i serie: a) et første innsettbart DNA-fragment, b) et markørgen og minst én Pichia-kompatibel ekspresjonskassett inneholdende et sGH strukturelt gen som er operabelt forbundet med et regulatorisk område og en 3'-endesekvens, og c) et annet innsettbart DNA-fragment, hvor rekkefølgen av markørgenet og kassetten i komponent (b) kan byttes om.

10. Vektor som angitt i krav 9, karakterisert ved at det første innsettbare DNA-fragment og det samme annet innsettbare DNA-fragment fås fra DNA-sekvensene av et gen som er isolert fra Pichia pastoris og valgt fra gruppen bestående av AOX1, p40, DHAS og HIS4.

11. Vektor som angitt i krav 9, karakterisert ved at ekspresjonskassetten omfatter a) et regulatorisk område valgt fra gruppen bestående av AOX1, p40, DHAS og HIS4 isolert fra Pichia pastoris, sur fosfatase, gelaktosidase, alkoholdehydrogenase, cytokrom c, alfa-paringsfaktor og glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase isolert fra Saccharomyces cerevisiae operabelt forbundet med b) et sGH strukturelt gen som koder for sGH som er operabelt forbundet med c) en 3'-endesekvens valgt fra gruppen bestående av de 3'-merkede endesekvenser som er isolert fra AOXl-genet, p40-genet, DHAS-genet og HIS4-genet isolert fra Pichia pastoris.

12. Vektor som angitt i krav 9, karakterisert ved at det nevnte markørgen er valgt fra gruppen bestående av HIS4 og ARG4 isolert fra Pichia pastoris, SUC2 isolert fra Saccharomyces cerevisiae og G418 <R-> gen av bakterielt Tn903 og Tn601.

13. Vektor som angitt i krav 9, karakterisert ved at den nevnte vektor omfatter a) et første innsettbart DNA-fragment som er et operabelt regulatorisk område av 5'AOXl-genet som er tilnærmet én kilobase langt, isolert fra Pichia pastoris og operabelt forbundet med b) et sGH strukturelt gen operabelt forbundet med c) 3'-endesekvensen av A0X1 isolert fra Pichia pastoris ligatisert til d) et markørgen som er HIS4 isolert fra Pichia pastoris ligatisert til e) et annet innsettbart DNA-fragment som er tilnærmet 0.65 kilobaser av 3' AOXl-endesekvensen.

14. Vektoren pHIL51.

15. Metylotrof gjær av Pichia-slekten transformert med en vektor inneholdende en Pichia-kompatibel ekspresjonskassett omfattende et regulatorisk område som er operabelt forbundet med et sGH-gen operabelt forbundet med en 3 <1-> endesekvens.

16. Metylotrof gjær av slekten Pichia som angitt i krav 15, karakterisert ved at gjæren er Pichia pastoris.

17. Metylotrof gjær av slekten Pichia som angitt i krav 16, karakterisert ved at gjæren er Pichia pastoris GS115.

18. Pichia pastoris GS115 som angitt i krav 16, transformert med den lineære Bglll/Bglll setespesifikke integrative vektor kløyvet fra vektor pHIL51.

19. Pichia pastoris transformert med vektoren som angitt i krav 9.

20. Pichia pastoris GS 115/PHIL51-62 NRRL(Y-18353).