NO882051L

NO882051L - MRI STABILIZATION IN ANIMAL CELLS.

Info

Publication number: NO882051L
Application number: NO882051A
Authority: NO
Inventors: Stephen D Gillies
Original assignee: Damon Biotech Inc
Priority date: 1986-09-12
Filing date: 1988-05-11
Publication date: 1988-05-11
Also published as: NO882051D0

Abstract

Fremgangsmåte for økning av produksjon av proteiner, f.eks. humant tPA 1 pattedyrceller soa normalt utskiller lmmunoglobullner. Nedbrytning av mSNA transkribert fra rekombinant DNA reduseres ved å redusere lengden av det lkke-translaterte området av mBNA'et. Oet lkke-translaterte området av ONA som koder for et protein av Interesse, forandres til å produsere et kortere rekombinant DBA med et lkke-translatert område, omfattende et poly A-adaisjonsslgnal (AATAAA) og mindre enn ca. 300 nukleotldbaser plassert mellom poly A-signalet og stoppkodonet 3' av kodonomr&det til genet av Interesse. Pattedyrcellellnjen transfekteres og dyrkes til å produsere større mengder av det Interessante protein enn den såmne cellelinjen transfektert med det Ikke-endrede DNA.Method for increasing the production of proteins, e.g. human tPA 1 mammalian cells soa normally secrete immunoglobulins. Degradation of mSNA transcribed from recombinant DNA is reduced by reducing the length of the untranslated region of the mBNA. The untranslated region of ONA encoding a protein of interest is altered to produce a shorter recombinant DBA with a non-translated region, comprising a poly A adhesion signal (AATAAA) and less than about 300 nucleotide bases located between the poly A signal and the stop codon 3 'of the codon region of the gene of interest. The mammalian cell line is transfected and grown to produce larger amounts of the protein of interest than the same cell line transfected with the unaltered DNA.

Description

Bakgrunn for oppfinnelsenBackground for the invention

Denne oppfinnelsen vedrører produkter og fremgangsmåterThis invention relates to products and methods

for å øke fremstillingen av proteiner i pattedyrceller av lymfoid opprinnelse. Nærmere bestemt vedrører den produkter og fremgangsmåter for å øke proteinproduksjonen ved å øke konstantnivået for translaterbart kompetent mRNA ved å redusere den intracellulære nedbrytningshastigheten av mRNA'et. to increase the production of proteins in mammalian cells of lymphoid origin. More specifically, it relates to products and methods for increasing protein production by increasing the constant level of translationally competent mRNA by reducing the intracellular degradation rate of the mRNA.

Proteinproduksjon i de fleste dyreceller innbefatterProtein production in most animal cells includes

syntese av enzymer, strukturproteiner, overflateproteiner og tallrike proteiner med spesialiserte funksjoner så som lymfokiner og hormoner. Typisk produseres relativt moderate mengder av disse proteiner. Det finnes imidlertid typer av dyreceller som er i stand til å produsere og utskille store mengder av proteiner for systemisk bruk i det animalske legemet. Eksem- synthesis of enzymes, structural proteins, surface proteins and numerous proteins with specialized functions such as lymphokines and hormones. Typically, relatively moderate amounts of these proteins are produced. However, there are types of animal cells that are able to produce and secrete large amounts of proteins for systemic use in the animal body. Eczema-

pler på den siste typen av celler innbefatter celler i kretsløps-systemet som produserer globuliner og fibrinogen, leverceller som produserer serumalbumin og betacellene til Islets of Langerhans som produserer insulin. Hvis de genetiske mekanismer Examples of the latter type of cells include cells of the circulatory system that produce globulins and fibrinogen, liver cells that produce serum albumin, and the beta cells of the islets of Langerhans that produce insulin. If the genetic mechanisms

som er ansvarlig for et slikt høyt ekspresjonsnivå kunne utnyttes til å produsere lymfokiner, antistoffer eller andre proteinaktige interessante materialer, kunne store mengder av verdifulle proteiner bli tilgjengelige. which is responsible for such a high level of expression could be exploited to produce lymphokines, antibodies or other proteinaceous materials of interest, large quantities of valuable proteins could become available.

Ekspresjon av endogent DNA i eukaryotiske celler innbefatter transkripsjon av DNA'et i mRNA, etterfølgende vandring av mRNA'et til ribosomer etterfulgt av tRNA-bevirket translasjon av mRNA'et til proteiner omfattende sekvensen av aminosyrer som kodes for av mRNA mellom dets start- og stopp-signalkodoner. Expression of endogenous DNA in eukaryotic cells involves transcription of the DNA into mRNA, subsequent migration of the mRNA to ribosomes followed by tRNA-mediated translation of the mRNA into proteins comprising the sequence of amino acids encoded by the mRNA between its start and stop signal codons.

Som beskrevet av Gillies et al i Cell, Vol 33, pp 717-728,As described by Gillies et al in Cell, Vol 33, pp 717-728,

Juli 1983, og i den samtidige svevende U.S. patentsøknad nr. 592.231, innsendt 22. mars 1984, spiller celleforøkningselementet en viktig rolle i ekspresjon av store proteinmengder i spesialiserte som fremstiller store mengder av immunoglobulin. July 1983, and in the simultaneously hovering U.S. Patent Application No. 592,231, filed March 22, 1984, the cell proliferation element plays an important role in the expression of large amounts of protein in specialized that produce large amounts of immunoglobulin.

Forsterkerne synes å virke ved å øke hastigheten av DNA-transkripsjon til mRNA ved endogen mRNA polymerase. Økede konsentrasjoner av mRNA fører til signifikante økninger i ekspresjonsnivået i slike celler. Aktiviteten til slike forsterkerelementer er avhengig av orientering og kan observeres selv når sekvensen som omfatter forsterkeren befinner seg 10.000 basepar eller mer vekk fra promotoren for genet som koder for proteinet. Disse cellulære forsterkere synes å være vevs-spesifikke, dvs. aktiviteten til en cellulær forsterker som virker i det endogene genomet til en lymfoid celle og øker produksjonen av et spesielt mRNA reduseres sterkt eller mangler hvis forsterkeren sitter i en vektor som brukes til å transformere ikke-lymfoide celler. Imidlertid kan en vektor som The enhancers seem to work by increasing the rate of DNA transcription into mRNA by endogenous mRNA polymerase. Increased concentrations of mRNA lead to significant increases in the expression level in such cells. The activity of such enhancer elements is dependent on orientation and can be observed even when the sequence comprising the enhancer is located 10,000 base pairs or more away from the promoter of the gene that codes for the protein. These cellular enhancers appear to be tissue-specific, i.e. the activity of a cellular enhancer that acts in the endogenous genome of a lymphoid cell and increases the production of a particular mRNA is greatly reduced or absent if the enhancer sits in a vector used to transform not -lymphoid cells. However, a vector such as

inneholder forsterkerelementet, promotor og et rekombinert gen som koder for et ønsket protein, hvis det transkripteres i en celle av den samme type som den hvori forsterkeren naturlig øker transkripsjonshastigheten, med hell transformere cellen til å uttrykke det rekombinerte gen i høye nivåer. containing the enhancer element, promoter and a recombinant gene encoding a desired protein, if transcribed in a cell of the same type as that in which the enhancer naturally increases the rate of transcription, successfully transform the cell to express the recombined gene at high levels.

Eukaryotiske DNA'er omfatter en sekvens av baser forbi stopp-signalet, hvorav en del tjener som et signal til å Eukaryotic DNAs comprise a sequence of bases past the stop signal, part of which serves as a signal to

igangsette tilføyelse av adeninrester (heretter poly A) 3' av stopp-signalet i det translaterte mRNA. Polyadenyleringen forekommer hovedsakelig i kjernen og bevirkes med poly A initiate the addition of adenine residues (hereafter poly A) 3' of the stop signal in the translated mRNA. The polyadenylation occurs mainly in the nucleus and is effected with poly A

polymerase som tilsetter en adenylsyrerest av gangen. Poly Apolymerase that adds one adenylic acid residue at a time. Poly A

koder ikke for en aminosyresekvens etter at stoppkodonet har avsluttet translasjon, men antas å bidra til stabiliseringen av mRNA'er og til effektiviteten av translasjon av det mRNA- does not encode an amino acid sequence after the stop codon has terminated translation, but is thought to contribute to the stabilization of mRNAs and to the efficiency of translation of the mRNA

kodende området til aminosyrer.the coding region of amino acids.

Poly A i mRNA'et av pattedyrceller ligger i en sekvensPoly A in the mRNA of mammalian cells is located in a sequence

kjent som den 3'-ikketranslaterbare (heretter 3'UT) endedel.known as the 3'-untranslatable (hereafter 3'UT) terminus.

3'UT strekker seg typisk fra avslutningskodonet for translasjons-produktet og enden av poly A. 3'UT-området av pattedyr-mRNA'er har typisk et homologiområde kjent som AAUAAA heksanukleotid-sekvensen. Denne sekvensen antas å være poly A-addisjons- The 3'UT typically extends from the termination codon of the translation product and the end of poly A. The 3'UT region of mammalian mRNAs typically has a region of homology known as the AAUAAA hexanucleotide sequence. This sequence is believed to be the poly A addition

signalet. Det ligger ofte 11 til 30 baser foran poly A-addisjonssetet. the signal. It is often 11 to 30 bases before the poly A addition site.

Funksjonen, om den foreligger, av 3'UT og poly A-området,The function, if present, of the 3'UT and the poly A region,

er nylig blitt undersøkt av Soreq et al., (Proe. Nati. Acad.has recently been investigated by Soreq et al., (Proe. Nati. Acad.

Sei. U.S.A. Vol. 78, No. 3, pp 1741 - 1745, Mars 1981); ZaretPollock. U.S.A. Vol. 78, No. 3, pp 1741 - 1745, March 1981); Zaret

et al., (J. Mol. Biol., 1984 Vol. 176, pp 107-135); Baralle (International Review of Cytology, Vol. 81, pp 71-106); og Ross et al., (J. Mol. Biol., 1984 Vol. 176, pp 107-135); Baralle (International Review of Cytology, Vol. 81, pp 71-106); and Ross

et al., (J. Mol. Biol., 1983, vol. 167, pp 607-617).et al., (J. Mol. Biol., 1983, vol. 167, pp 607-617).

Soreq et al. rapporterte at fjerning av poly A og ca. 100 tilstøtende rester fra første human-fibroblast-beta-interferon-mRNA ikke forandret translasjonsaktiviteten eller funksjonsstabiliteten til dette mRNA I oocytter, mens delesjonen av poly A og ca. 200 tilstøtende rester ikke reduserte dets transla-sjonsvirkning. Fjerningen av ca. 200 poly A rester og 200 tilstøtende rester fra et andre beta-interferon mRNA forandret ikke hverken translasjonsaktiviteten eller funksjonsstabiliteten til mRNA'et i oocytter. Disse forfatter konkluderte at hverken poly A restene eller store segmenter av det 3'-ikke-kodende område kreves for å opprettholde funksjonell stabilitet av human beta-interferon mRNA'er i slike oocytter. Soreq et al. reported that removal of poly A and approx. 100 adjacent residues from the first human fibroblast-beta-interferon mRNA did not change the translational activity or functional stability of this mRNA in oocytes, while the deletion of poly A and approx. 200 adjacent residues did not reduce its translational effect. The removal of approx. 200 poly A residues and 200 adjacent residues from a second beta-interferon mRNA did not change either the translational activity or the functional stability of the mRNA in oocytes. These authors concluded that neither the poly A residues nor large segments of the 3'-non-coding region are required to maintain functional stability of human beta-interferon mRNAs in such oocytes.

Zaret et al. studerte cyc 1 - 152 mutanten fra gjæren S. cerevisiae som inneholder en 38 basepars delesjon i det 3'-ikke-kodende området av CYC-1 genet som koder for iso - 1 - cytokrom c. Det rapporterte at forskjellige 3'-ikkekodende sekvenser som oppsto v ed kromosomal omleiring øket stabiliteten av CYC-1 mRNA og hadde varierende virkninger på mRNA-trans-lasj ons-vi rkning. Zaret et al. studied the cyc 1 - 152 mutant from the yeast S. cerevisiae containing a 38 base pair deletion in the 3' non-coding region of the CYC-1 gene encoding iso - 1 - cytochrome c. It reported that various 3' non-coding sequences arising from chromosomal rearrangement increased the stability of CYC-1 mRNA and had varying effects on mRNA translation efficiency.

I Baralles publikasjon, The Functional Significance of Leader and Trailer Sequence in Eucaryotic mRNAs, rapporterte forfatteren at der er "ingen åpenbar funksjon for det 3'-ikkekodende området" og at "forekomsten av regulerbare delesjoner eller innskudd under utviklingen av disse gener tyder på at de spesielle sekvenser som omfatter det 3'-ikkekodende området ikke er vesentlige for mRNA-funksjonen." Baralle rapporterte imidlertid at poly A ikke har noen rolle ved å gi mRNA stabilitet. For eksempel er det blitt funnet at fjerning av poly A-segmentet fr globin mRNA sterkt reduserer halveringstiden til mRNA i oocytter. Imidlertid antyder Baralle at poly A åpenbart ikke er nødvendig for vellykket translasjon, hvilket er blitt demonstrert ved undersøkelser hvor poly A er blitt fjernet fra mRNA'et. In Baralle's publication, The Functional Significance of Leader and Trailer Sequence in Eukaryotic mRNAs, the author reported that there is "no obvious function for the 3' non-coding region" and that "the occurrence of regulatable deletions or insertions during the evolution of these genes suggests that the particular sequences comprising the 3' non-coding region are not essential for mRNA function." However, Baralle reported that poly A has no role in conferring mRNA stability. For example, it has been found that removal of the poly A segment from globin mRNA greatly reduces the half-life of the mRNA in oocytes. However, Baralle suggests that poly A is obviously not necessary for successful translation, which has been demonstrated by studies where poly A has been removed from the mRNA.

Ross og Pizarro studerte hypotesen at konstantnivåer av humant beta- og delta-globin proteiner delvis bestemmes ved den intracellulære stabiliteten til deres respektive budbringer-RNA'er. De fant at det raske skifte av delta-globin i mRNA i det minste delvis forklarer det lave nivå av delta-globin mRNA i ikke-nukleære perifere blodreticulocytter, og antok at mRNA-forfallsgraden kan bestemmes med nukleotidsekvens-signaler som befinner seg i det 3'-ikketranslaterte området. De observerte at de 5'-ikketranslaterte områder av beta- og delta-globin-mRNA'er er lignende, men at deres 3'-ikketranslaterte områder adskiller seg signifikant, og foreslo at det skulle være mulig å prøve rollen til det 3'-ikketranslaterte området ved bestemmelse av mRNA-stabilitet ved å sammenligne halveringstidene i transfekterte celler av kimere mRNA'er som inneholder beta-eller delta-3'-ender. Ross and Pizarro studied the hypothesis that constant levels of human beta- and delta-globin proteins are determined in part by the intracellular stability of their respective messenger RNAs. They found that the rapid turnover of delta-globin mRNA at least partially explains the low level of delta-globin mRNA in non-nuclear peripheral blood reticulocytes, and hypothesized that the rate of mRNA decay can be determined by nucleotide sequence signals located in the 3 '-untranslated area. They observed that the 5'-untranslated regions of beta- and delta-globin mRNAs are similar, but that their 3'-untranslated regions differ significantly, and suggested that it should be possible to test the role of the 3'- untranslated region in determining mRNA stability by comparing the half-lives in transfected cells of chimeric mRNAs containing beta- or delta-3' ends.

Europeisk patent 0077689 beskriver en fremgangsmåte for genmanipulasjon hvor en gjær transformeres med et gen hvori 3'UT av et strukturelt gen tilføyes nedstrøms fra et eksogent gen. Transformanten viser et høyere ekspresjonsnivå når det eksogene gen inneholder 3'UT'er. Faktisk viste undersøkelsen at ekspresjonen i gjæren som inneholder plasmidet med området tilsvarende 3'UT tilsatt, er ca. 10 ganger sammenlignet med gjæren som inneholder plasmidet uten noe slikt tilføyet område. European patent 0077689 describes a method for gene manipulation where a yeast is transformed with a gene in which the 3'UT of a structural gene is added downstream from an exogenous gene. The transformant shows a higher expression level when the exogenous gene contains 3'UTs. In fact, the investigation showed that the expression in the yeast containing the plasmid with the region corresponding to the 3'UT added, is approx. 10-fold compared to the yeast containing the plasmid without any such added region.

Det er et mål for denne oppfinnelsen å tilveiebringe et produkt og en fremgangsmåte for effektiv produksjon av et ønsket protein som inneholder humant tPA i visse typer dyreceller. Et annet mål er å frembringe vektorer for transfeksjon av dyreceller for å indusere sterk ekspresjon av et gen som koder for et ønsket protein. Et annet mål er å frembringe transformanter, som ved dyrking gir store mengder protein for terapeu-tiske, diagnostiske og beslektede anvendelser. Enda et annet mål for oppfinnelsen er å tilveiebringe fremgangsmåter og rekombinante DNA'er som bevirker mRNA-stabilitet i transfekterte cellelinjer ved å redusere graden av det intracellulære mRNA-forfall, og derved øke ekspresjonsnivåene. It is an aim of this invention to provide a product and a method for the efficient production of a desired protein containing human tPA in certain types of animal cells. Another goal is to produce vectors for transfection of animal cells to induce strong expression of a gene encoding a desired protein. Another aim is to produce transformants, which, when cultivated, yield large amounts of protein for therapeutic, diagnostic and related applications. Yet another aim of the invention is to provide methods and recombinant DNAs which effect mRNA stability in transfected cell lines by reducing the degree of intracellular mRNA decay, thereby increasing expression levels.

Disse og andre mål for oppfinnelsen vil fremgå klart forThese and other objectives of the invention will be clear

en fagmann fra den følgende beskrivelse og krav.a professional from the following description and requirements.

Sammenfatning av oppfinnelsenSummary of the Invention

En fremgangsmåte er nå oppdaget for å øke produksjonen av selekterte proteiner i pattedyrcellelinjer som normalt utskiller immunoglobuliner. Det er blitt funnet at et kort segment av et 3'UT-område og polyadenylerings-området, ved rekombinasjon 3' A method has now been discovered to increase the production of selected proteins in mammalian cell lines that normally secrete immunoglobulins. It has been found that a short segment of a 3'UT region and the polyadenylation region, upon recombination 3'

av stopp-kodonet i et DNA som koder for et protein av interesse, effektivt påskynder en økning i produksjonen av det interessante protein. Sekvensene som omfatter det lille segment av 3'UT og polyadenylerings-setet viser seg å stabilisere mRNA tilsvarende det translaterte området og øke translasjonsnivåer. Konstantnivået for mRNA'et som koder for proteinet av interesse økes i forhold til mRNA'er med lengre ikke-translaterte områder. of the stop codon in a DNA encoding a protein of interest effectively prompts an increase in the production of the protein of interest. The sequences comprising the small segment of the 3'UT and the polyadenylation site are shown to stabilize the mRNA corresponding to the translated region and increase translation levels. The constant level of the mRNA encoding the protein of interest is increased relative to mRNAs with longer untranslated regions.

Ifølge oppfinnelsen utnyttes denne oppdagelsen til å frembringe vektorer og fremgangsmåter for å produsere et protein av interesse og å produsere transformanter som kan dyrkes og gi slike materialer på forbedrede ekspresjonsnivåer. Enten eksogene eller endogene proteiner kan fremstilles ifølge oppfinnelsen, dvs. man kan fremstille proteiner som ikke kodes fra det naturlige genom i vertscellene, proteiner som kodes According to the invention, this discovery is exploited to produce vectors and methods for producing a protein of interest and to produce transformants that can be cultured and yield such materials at improved expression levels. Either exogenous or endogenous proteins can be produced according to the invention, i.e. one can produce proteins that are not coded from the natural genome in the host cells, proteins that are coded

for, men normalt ikke uttrykkes i vertscellene, eller proteiner som normalt bare uttrykkes i små mengder. for, but not normally expressed in the host cells, or proteins that are normally only expressed in small amounts.

Ifølge oppfinnelsen utledes et DNA som inneholder et kodeområdet, et stoppsignalkodon og et opprinnelig 3'UT innbefattende et polyadenyleringssignal for proteinet av interesse fra en celle som naturlig produserer proteinet av interesse. Nukleotidsekvensen av 3'UT-området til dette DNA forandres til å produsere en intakt, transkriberbar kompetent, kortere rekombinant DNA med en forandret 3'UT med mindre enn ca. 300 nukleotidbaser mellom stoppsignalet og AATAAA polyadenyleringssignalet. Det rekombinante DNA transfekteres i en valgt pattedyr-cellei inje som normalt utskiller immunoglobuliner. Den resulterende transfekterte cellelinje dyrkes og fremstiller proteinet av interesse. Mengden produsert protein er større enn for den samme cellelinjen som inneholder uendret DNA for proteiner av interesse, som inneholder det lengre opprinnelige 3'UT. According to the invention, a DNA containing a coding region, a stop signal codon and an initial 3'UT including a polyadenylation signal for the protein of interest is derived from a cell that naturally produces the protein of interest. The nucleotide sequence of the 3'UT region of this DNA is altered to produce an intact, transcriptionally competent, shorter recombinant DNA with an altered 3'UT of less than approx. 300 nucleotide bases between the stop signal and the AATAAA polyadenylation signal. The recombinant DNA is transfected into a selected mammalian cell line that normally secretes immunoglobulins. The resulting transfected cell line is cultured and produces the protein of interest. The amount of protein produced is greater than that of the same cell line containing unaltered DNA for proteins of interest, which contain the longer original 3'UT.

I en utførelsesform inneholder det kortere rekombinanteIn one embodiment, it contains shorter recombinants

DNA en del av 3'UT av DNA'et for proteinet av interesse, skjønt 3'UT fra andre DNA'er kan anvendes. I andre utførelsesformer oppnås minst en del av det endrede 3'UT fra et ikke-cellulært DNA, f.eks. viralt DNA, mens i andre oppnås det fra et pattedyrs DNA. Proteinet av interesse kan være et immunoglobulin eller DNA part of the 3'UT of the DNA for the protein of interest, although 3'UT from other DNAs can be used. In other embodiments, at least a portion of the altered 3'UT is obtained from a non-cellular DNA, e.g. viral DNA, while in others it is obtained from a mammalian DNA. The protein of interest can be an immunoglobulin or

en fraksjon derav, et hormon, vaksine, lymfokin, cytokin, enzym eller pro-enzym. For eksempel kan de ønskede proteiner omfatte en plasminogenaktivator så som human vevsplasminogenaktivator, hvis fremstilling brukes som en modell her, og beskrives i detalj. Pattedyrcellelinjen er en dyrkbar cellelinje så som en myelomacellelinje, skjønt andre pattedyrceller som normalt utskiller immunoglobuliner kan anvendes. a fraction thereof, a hormone, vaccine, lymphokine, cytokine, enzyme or pro-enzyme. For example, the desired proteins may comprise a plasminogen activator such as human tissue plasminogen activator, the production of which is used as a model herein, and described in detail. The mammalian cell line is a culturable cell line such as a myeloma cell line, although other mammalian cells that normally secrete immunoglobulins may be used.

Ifølge oppfinnelsen kan fremgangsmåten omfatte det ytterligere trinn å kombinere proksimalt til DNA som koder for proteinet av interesse et DNA omfattende et cellulært forsterkerelement for å øke transkripsjon av det rekombinante DNA. Oppfinnelsen kan videre tilveiebringe et blokkeringselement som beskrevet i den samtidig svevende U.S. søknad nr. 837.595 innsendt 7. mars 1986. Slike blokkeringselementer muliggjør produksjon av transformanter som produserer store mengder av et ønsket protein mens markørproteinet bare produseres i nødvendige mengder for seleksjon. According to the invention, the method may comprise the further step of combining proximal to the DNA encoding the protein of interest a DNA comprising a cellular enhancer element to increase transcription of the recombinant DNA. The invention may further provide a blocking element as described in co-pending U.S. Pat. application No. 837,595 filed Mar. 7, 1986. Such blocking elements enable the production of transformants that produce large amounts of a desired protein while the marker protein is produced only in amounts necessary for selection.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre en vektor for produksjon av et protein ved transvektering i en pattedyrcellei inje som normalt utskiller immunoglobuliner. Vektoren er sammensatt av transkripsjonelt kompetent DNA fremstilt ifølge den ovenfor sammenfattede fremgangsmåten. Denne vektoren opererer ved å produsere økede mengder av det ønskede protein i forhold til forøvrig identiske vektorer med et 3'UT område naturlig for genet som koder for proteinet av interesse. The invention further provides a vector for the production of a protein by transfection in a mammalian cell that normally secretes immunoglobulins. The vector is composed of transcriptionally competent DNA prepared according to the method summarized above. This vector operates by producing increased amounts of the desired protein compared to otherwise identical vectors with a 3'UT region natural to the gene that codes for the protein of interest.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre en transformant for fremstilling av et protein av interesse. Transformanten omfatter fortrinnsvis en pattedyrcelleiinje som normalt produserer immunoglobuliner så som en myelomacelle. Transformanten Inneholder vektoren som rommer det uttrykkbare DNA sammenfattet ovenfor. Transformanten er i stand til å produsere økede mengder av proteinet av interesse i forhold til forøvrig identiske transformanter som inneholder rekombinant DNA innbefattet det 3' ikke-translaterte området naturlig for genet som koder for proteinet av interesse. The invention further provides a transformant for the production of a protein of interest. The transformant preferably comprises a mammalian cell line that normally produces immunoglobulins such as a myeloma cell. The transformant contains the vector containing the expressible DNA summarized above. The transformant is capable of producing increased amounts of the protein of interest relative to otherwise identical transformants containing recombinant DNA including the 3' untranslated region native to the gene encoding the protein of interest.

De økede ekspresjonsnivåer frembragt ifølge oppfinnelsen forårsakes tydelig av en økning i konstantnivået for tilsvarende mRNA i transfekterte celler. Det antas at knappheten på 3'UT-område av det fusjonerte mRNA tjener til å redusere nedbrytning av mRNA i cellen, og derved øke den intra-cellulære halveringstiden til mRNA'et og øke ekspresjonsnivåene. The increased expression levels produced according to the invention are clearly caused by an increase in the constant level of the corresponding mRNA in transfected cells. It is believed that the scarcity of the 3'UT region of the fused mRNA serves to reduce degradation of the mRNA in the cell, thereby increasing the intracellular half-life of the mRNA and increasing expression levels.

Det er kjent at fosfodiester-broer av DNA og RNA angripes av eksonukleaser som virker på enten 3'- eller 5'-enden til molekylet. Enzymer som virker på 3'-enden hydrolyserer esterbindingen mellom 3'-karbonet og fosforgruppen, mens 5'-enzymene hydrolyserer esterbindingen mellom fosforgruppen og 5'-karbonet til fosfodiester-broen. Endonukleaser krever ikke en fri endestående 3'- eller 5'-hydroksylgruppe; de angriper 3'- eller 5'-bindinger uansett hvor de forekommer i polynukleo-tid-kj eden. It is known that phosphodiester bridges of DNA and RNA are attacked by exonucleases that act on either the 3' or 5' end of the molecule. Enzymes that act on the 3'-end hydrolyze the ester bond between the 3'-carbon and the phosphorus group, while the 5'-enzymes hydrolyze the ester bond between the phosphorus group and the 5'-carbon of the phosphodiester bridge. Endonucleases do not require a free terminal 3' or 5' hydroxyl group; they attack 3' or 5' linkages wherever they occur in the polynucleotide chain.

Det formodes at rekombinante DNA'er omfattende en langIt is believed that recombinant DNAs comprising a long

3'UT nedbrytes når en endonuklease spalter en del av mRNA'et til 3'-UT ikke bundet av et ribosom, etterfulgt av eksonuklease-spaltning. På grunn av kortheten til mRNA'ets 3'UT-område, forblir mindre mRNA ikke bundet til ribosomer når det forbinder seg til ribosomer, og antallet seter for endonuklease-angrep reduseres. Tilstedeværelsen av poly A setet beskytter 3'-enden mot eksonukleaser. Nedbrytningsgraden av mRNA reduseres derfor p.g.a. 3'UT-områdets korthet. Ved mekanismen ifølge oppfinnelsen stabiliseres derfor mRNA, og dets biologiske funksjon økes til å resultere i den økede ekspresjon av ønskede proteiner. 3'UT is degraded when an endonuclease cleaves a portion of the mRNA into 3'-UT not bound by a ribosome, followed by exonuclease cleavage. Because of the shortness of the mRNA's 3'UT region, smaller mRNA does not remain bound to ribosomes when it associates with ribosomes, and the number of sites for endonuclease attack is reduced. The presence of the poly A site protects the 3' end from exonucleases. The degradation rate of mRNA is therefore reduced due to The shortness of the 3'UT region. By the mechanism according to the invention, mRNA is therefore stabilized, and its biological function is increased to result in the increased expression of desired proteins.

For en mer fullstendig forståelse av oppfinnelsensFor a more complete understanding of the invention

karakter og hensikt skal det vises til den følgende detaljerte beskrivelse og medfølgende tegninger. character and purpose, reference must be made to the following detailed description and accompanying drawings.

Kort beskrivelse av tegningenBrief description of the drawing

Fig. 1 er et skjematisk diagram som illustrerer den totale fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen; Fig. 2 er et diagram som illustrerer forskjellige segmenter av DNA sammensmeltet med gen som koder for et ønsket protein-produkt (tPA); og Fig. 3 er et diagram for plasmid pEMp-tPA, den foretrukne ekspresjonsvektor for bruk i fremstillingen av tPA i myeloma celler. Denne vektoren representerer den for tiden foretrukne utførelsesform av oppfinnelsen. Fig. 1 is a schematic diagram illustrating the overall method according to the invention; Fig. 2 is a diagram illustrating different segments of DNA fused to gene encoding a desired protein product (tPA); and Fig. 3 is a diagram for plasmid pEMp-tPA, the preferred expression vector for use in the production of tPA in myeloma cells. This vector represents the currently preferred embodiment of the invention.

Beskrivelse av oppfinnelsenDescription of the invention

Oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte, en vektor og transformant for å øke produksjonen av utvalgte proteiner i pattedyrceller. 3'UT-området av et DNA som koder for et protein av interesse forandres til å produsere et kortere rekombinant DNA med et 3'UT-område, generelt omfattende mindre enn ca. 300 nukleotidbaser, og kan omfatte mindre enn 200 baser mellom stoppkodonet til genet og AATAAA poly A-signalet. En pattedyrcellelinje som normalt produserer og utskiller immunoglobuliner transfekteres med det resulterende rekombinante DNA-Transformanten dyrkes og produserer økende mengder av proteinet The invention provides a method, a vector and transformant for increasing the production of selected proteins in mammalian cells. The 3'UT region of a DNA encoding a protein of interest is altered to produce a shorter recombinant DNA with a 3'UT region, generally comprising less than about 300 nucleotide bases, and may include less than 200 bases between the stop codon of the gene and the AATAAA poly A signal. A mammalian cell line that normally produces and secretes immunoglobulins is transfected with the resulting recombinant DNA The transformant is cultured and produces increasing amounts of the protein

av interesse sammenlignet med den samme cellelinje transfektertof interest compared to the same cell line transfected

med et ikke-endret 3'UT-område.with an unaltered 3'UT region.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er vi-st-på fig.^--r. "- DNA The method according to the invention is shown in fig. "- DNA

2 omfatter et kodende område 6 som koder for et protein av 2 comprises a coding region 6 which codes for a protein of

interesse. Det stammer fra en celle som naturlig produserer proteinet, f.eks. syntetisert ved vanlige teknikker med kjenskap til DNA-sekvensen. For eksempel kan DNA'et være et naturlig forekommende DNA elelr et kjemisk syntetisert DNA. Alternativt kan DNA'et være et reverst transkribert cDNA som stammer fra cDNA-teknikker. Den typisk lange nukleotidsekvensen til det ikke-translaterte området 4 av dette DNA 2, forandres til å gi et intakt, transkripsjonelt kompetent, kortere rekombinant DNA 5 inneholdende område 6 som koder for proteinet av interesse, og forbid stoffsignaler; et 3'UT (7) mindre enn ca. 300 nukleotidbaser langt bundet til et polyadenylerings-addisjonssignal 8. Det rekombinante DNA 5 omfatter derfor et kodeområde for proteinet av interesse 6, et stoppsignal 12 og et kortere 3'UT kallt 7, plassert mellom stoppsignalet 12 og et poly A-addisjonssignal 8. 3'UT'et inneholdende poly A setet til det rekombinante DNA kan oppnås fra DNA 2 som koder for proteinet av interesse ved å spleise ut et segment av 3'UT interest. It originates from a cell that naturally produces the protein, e.g. synthesized by common techniques with knowledge of the DNA sequence. For example, the DNA can be a naturally occurring DNA or a chemically synthesized DNA. Alternatively, the DNA may be a reverse transcribed cDNA derived from cDNA techniques. The typically long nucleotide sequence of the untranslated region 4 of this DNA 2 is altered to yield an intact, transcriptionally competent, shorter recombinant DNA 5 containing region 6 encoding the protein of interest, and forbidden substance signals; a 3'UT (7) less than approx. 300 nucleotide bases long linked to a polyadenylation addition signal 8. The recombinant DNA 5 therefore comprises a coding region for the protein of interest 6, a stop signal 12 and a shorter 3'UT called 7, located between the stop signal 12 and a poly A addition signal 8. 3 The 'UT' containing the poly A site of the recombinant DNA can be obtained from DNA 2 encoding the protein of interest by splicing out a segment of the 3'UT

eller fra annet DNA. Det rekombinante DNA 5 innsettes i et plasmid 10 for å produsere en ekspresjonsvektor 14. Plasmidet inneholder en promotorsekvens 16 og et uttrykkbart markørgen or from other DNA. The recombinant DNA 5 is inserted into a plasmid 10 to produce an expression vector 14. The plasmid contains a promoter sequence 16 and an expressible marker gene

18. En pattedyrcellelinje transfekteres med det rekombinante DNA, klones og undersøkes etter en subpopulasjon av celler som 18. A mammalian cell line is transfected with the recombinant DNA, cloned and examined for a subpopulation of cells that

har suksessivt innbygget og kan uttrykket genet 6. Den transfekterte cellelinjen dyrkes og fremstiller det ønskede protein som deretter isoleres og renses. has successively incorporated and can express the gene 6. The transfected cell line is cultivated and produces the desired protein which is then isolated and purified.

Det er blitt funnet at 3'UT'ene av de sterkt utbredte immunoglobulin-mRNA'er i lymfoidceller som utskiller immunoglobuliner er relativt korte (mindre enn ca. 300 nukleotider), It has been found that the 3'UTs of the highly prevalent immunoglobulin mRNAs in immunoglobulin-secreting lymphoid cells are relatively short (less than about 300 nucleotides),

mens 3'UT'ene til flere gener av interesse som ikke uttrykkes i lymfoidceller er relativt lange. For eksempel er UT-området for tPA ca. 800 nukleotider langt (Pennica et al., Nature, V, while the 3'UTs of several genes of interest that are not expressed in lymphoid cells are relatively long. For example, the UT range for tPA is approx. 800 nucleotides long (Pennica et al., Nature, V,

301, 214-231, Jan 10. 1983), faktor VIII's ca. 1.800 nukleotider (Wood et al., Nature, V. 312, 330-337, nov. 1984), og erytro-poietins ca. 560 nukleotider langt (Jacobs et al., Nature, V. 301, 214-231, Jan 10. 1983), factor VIII's approx. 1,800 nucleotides (Wood et al., Nature, V. 312, 330-337, Nov. 1984), and erythropoietin's approx. 560 nucleotides long (Jacobs et al., Nature, V.

313, 806-810, feb. 1985). 313, 806-810, Feb. 1985).

De rekombinante DNA teknikker for fremstilling av ekspresjonsvektorer og transformanter som er anvendelige i denne oppfinnelsen er velkjente og utviklede. De medfører bruk av forskjellige restriksjonsenzymer som gjør sekvens-spesifikke innsnitt i DNA og gir stumpe ender eller heftende ender, DNA-ligaser, teknikker som muliggjør enzymatisk addisjon av klebende ender til stumpendede DNA-molekyler, cDNA-syntese teknikker, syntetiske prober for isolering av gener med en spesiell funksjon, sammensetning av oligonukleotider under fremstilling av syntetiske DNA'er, vanlige transfeksjons- The recombinant DNA techniques for the production of expression vectors and transformants which are applicable in this invention are well known and developed. They involve the use of various restriction enzymes that make sequence-specific incisions in DNA and produce blunt ends or sticky ends, DNA ligases, techniques that enable the enzymatic addition of sticky ends to blunt-ended DNA molecules, cDNA synthesis techniques, synthetic probes for the isolation of genes with a special function, composition of oligonucleotides during the production of synthetic DNAs, common transfection

teknikker og likeledes vanlige teknikker for kloning og subkloning av DNA. techniques and likewise common techniques for cloning and subcloning of DNA.

Forskjellige typer vektorer kan brukes så som plasmider og virus innbefattende dyrevirus og fager. Vektoren vil normalt benytte et markørgen 18 som gir til en med hell transfektert celle en påviselig fenotypisk egenskap som kan brukes til å identifisere hvilke individer en populasjon av celler som med hell har fått innbygget det rekombinante DNA av vektoren 14. Foretrukne markører for bruk i myelomacellelinjene omfatter Different types of vectors can be used such as plasmids and viruses including animal viruses and phages. The vector will normally use a marker gene 18 which gives a successfully transfected cell a detectable phenotypic characteristic that can be used to identify which individuals in a population of cells have successfully incorporated the recombinant DNA of the vector 14. Preferred markers for use in the myeloma cell lines includes

DNA'er som koder for ett normalt ikke uttrykt enzym (eller bare uttrykt i små menger) av cellene som gjør cellene i stand til å overleve i et medium som inneholder et toksin. Eksempler på DNAs that code for an enzyme not normally expressed (or only expressed in small amounts) by the cells that enable the cells to survive in a medium containing a toxin. Examples of

slike enzymer er thymidin-kinase (TK), adenosin-fosforisboysyl- such enzymes are thymidine kinase (TK), adenosine-phosphorisboysyl-

transferase (APRT), og hypoksanthinfosforibosyltranserase (HPRT), som muliggjør TK, APRT, eller HPRT-manglende celler, henholdsvis, å vokse i hypoksanthin/aminopterin/thymidin medium; dihydrofolatreduktase (DHFR), som muliggjør DHRF-manglende celler å vokse i nærvær av methotreksat; E.coli enzymet xantin-guanosin-fosforibosyltransferase (XGPRT), produktet av gpt genet), som gjør normale celler i stand til å vokse i nærvær av mykofenolsyre; og det prokaryotiske enzym Tn5 fosfotransferase, som gjør normale celler i stand til å vokse i nærvær av neomycin. Andre egnede markørgener vil være anvendelige i vektorene som brukes til å transformere myelomaceller ifølge oppfinnelsen. transferase (APRT), and hypoxanthine phosphoribosyltransferase (HPRT), which enable TK, APRT, or HPRT-deficient cells, respectively, to grow in hypoxanthine/aminopterin/thymidine medium; dihydrofolate reductase (DHFR), which enables DHRF-deficient cells to grow in the presence of methotrexate; The E.coli enzyme xanthine-guanosine-phosphoribosyltransferase (XGPRT, the product of the gpt gene), which enables normal cells to grow in the presence of mycophenolic acid; and the prokaryotic enzyme Tn5 phosphotransferase, which enables normal cells to grow in the presence of neomycin. Other suitable marker genes will be applicable in the vectors used to transform myeloma cells according to the invention.

Vektorer ifølge oppfinnelsen kan inneholde et forsterkerelement av den type som virker på promotorer plassert på både 5'- og 3'-enden av forsterkerelementet, eller adskilt fra hver ende, for å øke transkripsjonen av gener som befinner seg på 3'-enden av promotorene. Forsterkerelementet kan inneholde DNA av virusopprinnelse, så som de som er beskrevet av Banerji et al., (Cell, V. 27, 299-308, 1981), deVilliers and Shaffner (Nucl. Acids Res., V. 9, 6351-6264, 1981), eller Levinson et al., (Nature, V. 295, 568-572, 1982), men er fortrinnsvis et cellulært forsterkerelement av den type som nylig er oppdaget av Gillies og Tonegawa og beskrevet i Cell, (V. 33, 717-728, 1983), og i nærmere detalj i den svevende U.S. patent søknad nr. 592.231, innsendt 22. mars 1984. Vektoren kan videre inneholde et blokkeringselement som beskrevet i den samtidig svevende U.S. patentsøknad nr. 837.595 innsendt 7. mars 1986, hvilket muliggjør produksjon av transformanter som produserer store mengder av et ønsket protein under innvirkning av forsterkeren, mens markørproteinet bare produseres 1 lavere nivåer som er nødvendig for seleksjonen. Vectors according to the invention may contain an enhancer element of the type that acts on promoters located at both the 5' and 3' end of the enhancer element, or separated from each end, to increase the transcription of genes located at the 3' end of the promoters . The enhancer element may contain DNA of viral origin, such as those described by Banerji et al., (Cell, V. 27, 299-308, 1981), deVilliers and Shaffner (Nucl. Acids Res., V. 9, 6351-6264 , 1981), or Levinson et al., (Nature, V. 295, 568-572, 1982), but is preferably a cellular enhancer element of the type recently discovered by Gillies and Tonegawa and described in Cell, (V. 33 , 717-728, 1983), and in more detail in the floating U.S. patent application no. 592,231, filed March 22, 1984. The vector may further contain a blocking element as described in co-pending U.S. Pat. patent application No. 837,595 filed March 7, 1986, which enables the production of transformants that produce large amounts of a desired protein under the influence of the enhancer, while the marker protein is only produced at lower levels than are necessary for selection.

Figur 3 representerer restriksjonskartet for den foretrukne plasmidvektor som brukes for produksjonen av tPA ifølge oppfinnelsen. Denne vektoren kalles pEMp-tPA og omfatter 7498 basepar. Den inneholder et forsterkerelement av en myelomacelle som øker transkripsjon av mRNA fra innskutt DNA som koder for protein, her human tPA (se Gillies et al. Cell, 1983, supra), Figure 3 represents the restriction map for the preferred plasmid vector used for the production of tPA according to the invention. This vector is called pEMp-tPA and comprises 7498 base pairs. It contains an enhancer element of a myeloma cell that increases transcription of mRNA from inserted DNA that codes for protein, here human tPA (see Gillies et al. Cell, 1983, supra),

og utnytter vektorkonstruksjonsprinsipper som regulerer and utilizes vector construction principles that regulate

selektivt forsterkerfunksjonen ifølge det som er beskrevet i den samtidig svevende U.S. patentsøknad nr. 837.595. Detaljer ved vektorens konstruksjoner er beskrevet nedenunder. the selective amplifier function as described in the co-floating U.S. patent application no. 837,595. Details of the vector's construction are described below.

I foretrukne utførelsesformer er vertscellesystemet som skal transfekteres med det rekombinante DNA en sammenhengende eller etablert cellelinje som har gjennomgått en forandring som gjør cellene i stand til å vokse uendelig. Disse celler er derfor forskjellige fra normale celler som deler seg i kultur i et begrenset antall generasjoner før de opphører. Evnen til å vokse uendelig hjelper videre scale-up produksjon av proteiner av interesse. In preferred embodiments, the host cell system to be transfected with the recombinant DNA is a contiguous or established cell line that has undergone a change that enables the cells to grow indefinitely. These cells are therefore different from normal cells that divide in culture for a limited number of generations before ceasing. The ability to grow indefinitely helps further scale-up production of proteins of interest.

Vertscellene som brukes for utførelsen av oppfinnelsen er pattedyrceller som normalt produserer og utskiller immunoglobuliner. Disse celler holder normalt til i kretsløpsystemet. The host cells used for carrying out the invention are mammalian cells which normally produce and secrete immunoglobulins. These cells normally reside in the circulatory system.

Den anvendte cellen kan faktisk ha tapt evnen til å utskille immunoglobuliner gjennom forutgående seleksjon. The cell used may actually have lost the ability to secrete immunoglobulins through prior selection.

Det foretrekkes videre at vertssystemet omfatter celler fra mus eller rotte (i motsetning til menneskeceller) for å redusere muligheten for kontaminasjon av produktprotein med humanvirus. I foretrukne utførelsesformer utgjør myelomaceller vertskultursystemet. Myelomaceller er gjerne lette å dyrke og utskiller ekspresjonsprodukter i det ekstracellulære medium. It is further preferred that the host system comprises cells from mice or rats (as opposed to human cells) to reduce the possibility of contamination of product protein with human virus. In preferred embodiments, myeloma cells comprise the host culture system. Myeloma cells are often easy to grow and secrete expression products into the extracellular medium.

Vektoren som er beskrevet på figur 3, og andre egnede ekspresjonsvektorer brukes ifølge oppfinnelsen til å transfektere myelomaceller, fortrinnsvis av museopprinnelse, så som cellelinjen J558 (ATCOTIB 6), Sp2/0-Agl4 (ATCC CRL 1581), og P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Den foretrukne myelomacelleiinje er J558L (ATCC CRL 9132, se 01 et al. Proe. Nati. Acad. Sei., USA, V. 80, p 825 1983). Disse celler omfatter kreftaktige transformanter av B celler fra kretsløpssystemet til Balb/C mus, og stammer fra myeloidvevet. The vector described in Figure 3 and other suitable expression vectors are used according to the invention to transfect myeloma cells, preferably of mouse origin, such as the cell line J558 (ATCOTIB 6), Sp2/0-Agl4 (ATCC CRL 1581), and P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL 1580). The preferred myeloma cell line is J558L (ATCC CRL 9132, See 01 et al. Proe. Nat. Acad. Sci., USA, V. 80, p 825 1983). These cells comprise cancerous transformants of B cells from the circulatory system of Balb/C mice, and originate from the myeloid tissue.

Transformanten av cellene av den type som er beskrevet ovenfor kan dyrkes i suspensjon, eller fortrinnsvis med mikrokapsler ifølge fremgangsmåten som er beskrevet i U.S. patent nr. 4.409.331 (F. Lim). For å lette rensing og for å øke post-utskillelses-stabilitet av proteinproduktet, foretrekkes det at cellene dyrkes i serumfritt medium. Det ekstracellulære protein høstes daglig, mens medium erstattes. Denne metoden har den fordel at det produseres protein som er fritt for forurensende proteolytiske enzymer og andre inaktiverende faktorer som ofte er tilstede i storfe- eller hestesera. Den foretrukne J558L-celle utskiller lambda lett kjede av immunoglobulin A i betydelige mengder. Dette og andre forurensende proteiner kan lett skilles fra proteinproduktet. The transformant of the cells of the type described above can be cultured in suspension, or preferably with microcapsules according to the method described in U.S. Pat. patent no. 4,409,331 (F. Lim). To facilitate purification and to increase post-secretion stability of the protein product, it is preferred that the cells are cultured in serum-free medium. The extracellular protein is harvested daily, while the medium is replaced. This method has the advantage that protein is produced that is free of contaminating proteolytic enzymes and other inactivating factors that are often present in bovine or horse sera. The preferred J558L cell secretes the lambda light chain of immunoglobulin A in significant amounts. This and other contaminating proteins can be easily separated from the protein product.

Oppfinnelsen kan brukes til å fremstille store mengder av verdifulle proteiner i tillegg til tPA i celler som er konstruert genetisk som er beskrevet. Ikke-begrensende eksempler innbefatter andre plasminogenaktivatorer og proaktivatorer, blodkoagulerings-faktorer, hormoner, interferoner, antistoffer, enzymer og pro-enzymer, vaksiner og forskjellige lymfokiner og cytokiner. The invention can be used to produce large amounts of valuable proteins in addition to tPA in genetically engineered cells as described. Non-limiting examples include other plasminogen activators and proactivators, blood coagulation factors, hormones, interferons, antibodies, enzymes and pro-enzymes, vaccines, and various lymphokines and cytokines.

Eksempelet som følger bør bare oppfattes som et eksempel i alle henseender, og som gir en detaljert beskrivelse av en tPA-produksjonsforskrifts-utførelsesform av oppfinnelsen, og en beskrivelse av den for tiden beste kjente form for utøvelse av"denne. The example that follows should only be understood as an example in all respects, and which provides a detailed description of a tPA production regulation embodiment of the invention, and a description of the currently best known form of practice thereof.

Eksempel -Example -

Produksjons av tPA- produserende myeloma transformanterProduction of tPA-producing myeloma transformants

Den grunnleggende ekspresjonsvektor, kalt pEMpl, ble konstruert fra de følgende fragmenter: (a) et 2,25 PvuII-BamHI fragment fra pSV2-gp_t (Mulligan and Berg, Science; V. 209, 1422-1427, 1980) inneholdende SV40-forsterkeren og tidlig område promotor, E.coli gpt genet, den lille SV40 tumor- The basic expression vector, called pEMpl, was constructed from the following fragments: (a) a 2.25 PvuII-BamHI fragment from pSV2-gp_t (Mulligan and Berg, Science; V. 209, 1422-1427, 1980) containing the SV40 enhancer and early region promoter, the E.coli gpt gene, the small SV40 tumor-

antigen intervenerende sekvens, og SV40 transkripsjons-avslut-ningen og polyadenyleringssignaler; (b) et 2,3 kb pVuII-EcoRI fragment fra pBR322 inneholdende ampicillinasegenet og den bakterielle replikasjonsopprinnelse (Sutcliffe, Proe. Nati. antigenic intervening sequence, and the SV40 transcription termination and polyadenylation signals; (b) a 2.3 kb pVuII-EcoRI fragment from pBR322 containing the ampicillinase gene and the bacterial origin of replication (Sutcliffe, Proe. Nat.

Acad. Sei., U.S.A., V. 75, 3737, 1978); (c) et 0,3 kb PvuII-Acad. Sei., U.S.A., V. 75, 3737, 1978); (c) a 0.3 kb PvuII-

EcoRI fragment inneholdende en immunoglobulin tungkjedeEcoRI fragment containing an immunoglobulin heavy chain

forsterker (Gillies et al., Cell, V. 33, pp 717-728, 1983); (d)enhancer (Gillies et al., Cell, V. 33, pp 717-728, 1983); (d)

et 2,25 kg Sacl-Bglll fragment inneholdende metallothionein I promotoren (Brinster et al., Nature, V. 296, 39-42, 1982); og (e) et 0,4 kb Avall-Haelll fragment fra 3'UT-området av det lettkjedede immunoglobulin kappa genet, som inneholder poly-adenyler ingssignalet (Max et al., J. Biol. Chem., V. 256, 5116- a 2.25 kg SacI-BglII fragment containing metallothionein I in the promoter (Brinster et al., Nature, V. 296, 39-42, 1982); and (e) a 0.4 kb Avall-Haelll fragment from the 3'UT region of the light chain immunoglobulin kappa gene, containing the poly-adenylation signal (Max et al., J. Biol. Chem., V. 256, 5116 -

5120, 1981). Disse fragmenter ble ligert sammen i en rekke reaksjoner ifølge velkjente metodikker, (se f.eks. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982). 5120, 1981). These fragments were ligated together in a series of reactions according to well-known methodologies (see, e.g., Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982).

Den grunnleggende ekspresjonsvektor ble brukt til å konstruere en rekke vektorer som uttrykkte tPA. Kalt pEMl-tPA-A, -B, og -C, inneholdt disse tre vektorene alle det fullstendige kodeområdet for tPA cDNA, men adskilte seg i sine 3<*->ikke translaterte områder som beskrevet nedenunder. The basic expression vector was used to construct a series of vectors expressing tPA. Named pEM1-tPA-A, -B, and -C, these three vectors all contained the complete coding region of the tPA cDNA, but differed in their 3<*->untranslated regions as described below.

cDNA'et for tPA ble fremstilt ved standard teknikker (Maniatis, ovenfor). tPA klonene som inneholdt hele kodeområdet og ca. 800 basepar av 3'UT område ble Identifisert og bekreftet ved nukleotidsekvensbestemmelse. tPA cDNA ble avstumpet ved Bgl II setet ca. 400 basepar nedstrøms for translasjons stopp-kodonet, og innsatt gjennom Xhol linkere i det eneste Xhol-setet i den grunnleggende vektor. tPA 3"UT-området i denne ekspresjonsvektoren, pEMl-tPA-A, var derfor sammensatt av ca. 400 basepar av det naturlige tPA 3'UT og 200 basepar av 3"UT-området hav det lettkjedede immunoglobulIngkappa genet. The cDNA for tPA was prepared by standard techniques (Maniatis, supra). The tPA clones that contained the entire coding region and approx. 800 base pairs of the 3'UT region were identified and confirmed by nucleotide sequence determination. tPA cDNA was blunted at the Bgl II site approx. 400 base pairs downstream of the translational stop codon, and inserted through Xhol linkers into the only Xhol site in the basic vector. The tPA 3'UT region in this expression vector, pEM1-tPA-A, was therefore composed of approximately 400 base pairs of the natural tPA 3'UT and 200 base pairs of the 3'UT region of the light chain immunoglobulin kappa gene.

I vektoren pEMl-tPA-B ble hovedmengden av det opprinnelige tPA 3'UT fjernet ved kloning ved Sau 3A setet som befant set 34 basepar nedstrøms for translasjonsstopp-signalet og skjøtt til de 200 basepar 3'UT av det lettkjedede Immunoglobulinkappa genet. In the vector pEM1-tPA-B, the bulk of the original tPA 3'UT was removed by cloning at the Sau 3A site, which was located 34 base pairs downstream of the translation stop signal and adjacent to the 200 base pairs 3'UT of the light-chain Immunoglobulin kappa gene.

Vektor pEMl-tPA-C adskilte seg fra pEMl-B ved at 3'UT-området av det lettkjedede kappagen ble erstattet med et ca. 200 basepar fragment fra 3'UT område av de sene SV40 gener. Vector pEM1-tPA-C differed from pEM1-B in that the 3'UT region of the light chain kappagen was replaced with an approx. 200 base pair fragment from the 3'UT region of the late SV40 genes.

De rekombinante tPA gener med de forskjellige 3'UT områder beskrevet ovenfor er vist på fig. 2. Det er ca. 0,59 kb mellom stoppkodonet og AATAAA polyaddisjonssignalet i vektoren pEMl-tPA-A, 0,23 kb i pEMl-tPA-B, og 0,16 kb i pEMl-tPA-C. The recombinant tPA genes with the different 3'UT regions described above are shown in fig. 2. It is approx. 0.59 kb between the stop codon and the AATAAA polyaddition signal in the vector pEM1-tPA-A, 0.23 kb in pEM1-tPA-B, and 0.16 kb in pEM1-tPA-C.

De tPA-holdige plasmider ble transfektert i J558L myelomaceller ved protoplastfusjonsmetoden (Gillies et al., ovenfor). Celler som inneholdt plasmidet og derfor gpt genet, ble selektert ved dyrking i medier som inneholdt mykofenolsyre. Resistente kolonier som inneholdt plasmidene ble subklonet og undersøkt etter tPA-ekspresjon. Syntesen og sekresjon av tPA i mediet ble bestemt ved hjelp av en måling hvori tPA overfører plasminogen i plasmin, som deretter spalter det kromogene tripeptid S2251 (Pennica et al., ovenfor). Fordi det er kjent at serum inneholder inhibitorer for både tPA og plasmin (Coilen and Lijnen, CRC Critical Reviews in Oncology/Hematology, V. 4, 249-301, 1986), var transformanter kulturer i 48 timer i serumfritt medium før måling. Aktivitet ble målt i internasjo-nale enheter (IU), basert på en standard levert av World Health Organization og bekreftet med en tPA standard fra American Diagnostics, Inc. The tPA-containing plasmids were transfected into J558L myeloma cells by the protoplast fusion method (Gillies et al., supra). Cells containing the plasmid and therefore the gpt gene were selected by cultivation in media containing mycophenolic acid. Resistant colonies containing the plasmids were subcloned and examined for tPA expression. The synthesis and secretion of tPA into the medium was determined by a measurement in which tPA converts plasminogen into plasmin, which then cleaves the chromogenic tripeptide S2251 (Pennica et al., supra). Because serum is known to contain inhibitors of both tPA and plasmin (Coilen and Lijnen, CRC Critical Reviews in Oncology/Hematology, V. 4, 249-301, 1986), transformants were cultured for 48 hours in serum-free medium before measurement. Activity was measured in international units (IU), based on a standard provided by the World Health Organization and confirmed with a tPA standard from American Diagnostics, Inc.

Ingen kloning som uttrykte signifikante mengder av tPA kunne finnes i cellene som var transfektert med vektor pEMl-tPA-A, skjønt analyse viste tilstedeværelsen av lave nivåer av mRNA som kodet for tPA. Av 26 kloner transfektert med pEMl-tPA-B, uttrykte 5 tPA. Hvis det høyeste ekspresjonsnivået gis en relativ verdi på 1,00, varierte ekspresjonen av tPA med pEMl-tPA-B transfektanter mellom 0,28 og 1,00. Av 14 kloner transfektert med pEMl-tPA-C, uttrykte 6 tPA på et relativt nivå på 0,12 til 0,44. No clone expressing significant amounts of tPA could be found in the cells transfected with vector pEM1-tPA-A, although analysis showed the presence of low levels of mRNA encoding tPA. Of 26 clones transfected with pEM1-tPA-B, 5 expressed tPA. If the highest expression level is given a relative value of 1.00, the expression of tPA by pEM1-tPA-B transfectants varied between 0.28 and 1.00. Of 14 clones transfected with pEM1-tPA-C, 6 expressed tPA at a relative level of 0.12 to 0.44.

Oppfinnelsen kan utføres i andre spesifikke former uten at man går ut over dens idé og omfang. The invention can be carried out in other specific forms without going beyond its idea and scope.

Claims

1. Method for producing a protein in a mammalian cell line that normally secretes immunoglobulins, which procedure includes the steps: a) providing a DNA derived from a cell which naturally produces the protein, which DNA comprises in order a coding region, a stop signal codon and an untranslated region containing a polyadenylation signal; b) altering the nucleotide sequence of the untranslated region of said DNA to form an intact, transcriptionally competent, shorter recombinant DNA with an altered untranslated region comprising less than about 300 nucleotide bases between the stop signal codon and a polyadenylation signal; c) transfecting the mammalian cell line with the recombinant DNA; and * • d) culturing the transfected cell line during production of said protein, the amount of protein produced with the transfected cell line being greater than the amount of protein produced with an otherwise identical cell line containing the DNA described in step a.

2. Method according to claim 1, wherein the altered untranslated region contains the sequence AATAAA, where A is adenine and T is thymine.

3. Method according to claim 1, wherein the shorter DNA comprises a portion of the untranslated region of said DNA.

4. Method according to claim 1, wherein at least a portion of the altered untranslated region is obtained from a non-mammalian DNA.

5. Method according to claim 1, wherein at least a portion of the altered untranslated region is obtained from a mammalian gene.

6. Method according to claim 1, wherein the coding region encodes a protein selected from the group consisting of immunoglobulins, hormones, vaccines, lymphokines, cytokines, enzymes and pro-enzymes.

7. Method according to claim 1, wherein the coding region encodes a plasminogen activator.

8. Method according to claim 7, wherein the activator is human tissue plasminogen activator.

9. Method according to claim 1, wherein the mammalian cell line is a myeloma cell line.

10. Method according to claim 1, comprising the further step of combining DNA comprising a cellular enhancer element proximal to said DNA encoding the protein to increase transcription of the recombinant DNA.

11. Vector for the production of a protein by transfection in a mammalian cell line that normally secretes immunoglobulins, which vector comprises replicable transcriptionally competent DNA with in order a first DNA segment comprising a promoter sequence, a second DNA segment encoding the protein linked to the first segment, and a stop signal codon, wherein said DNA further comprises a third DNA segment 3' to the stop signal codon comprising a non-naturally untranslated region containing a polyadenylation signal and less than approx. 300 base pairs between the stop codon and the polyadenylation signal, the vector being operable to produce increased amounts of protein compared to otherwise identical vectors, including the 3' untranslated region native to the gene encoding the protein.

12. Vector According to claim 11, wherein the third DNA segment contains the sequence AATAAA, where A is adenine and T is thymine.

13. Vector according to claim 11, wherein the second DNA segment encodes a material selected from the group consisting of immunoglobulins, vaccines, lymphokines, cytokines, enzymes and pro-enzymes.

14. Vector according to claim 11, wherein the second DNA segment encodes a plasminogen activator.

15. Vector according to claim 14, wherein the activator is human tissue plasminogen activator.

16. A transformant for the production of a protein comprising a mammalian cell which normally produces immunoglobulin, said transformant comprising expressible DNA comprising in the order: a) a first DNA segment comprising a promoter sequence; b) a second DNA segment linked to the first segment and coding for the protein; c) a stop signal codon; and d) a third DNA segment 3' to the stop signal codon comprising a non-native untranslated region containing a polyadenylation signal and with less than about 300 base pairs between the stop codon and the polyadenylation signal, which transformant is capable of producing increased amounts of the protein relative to otherwise identical transformants containing recombinant DNA, including the 3' untranslated region native to the gene encoding the protein.

17. Transformant according to claim 16, wherein the third DNA segment contains the sequence AATAAA, where A is adenine and T is thymine.

18. Transformant according to claim 16, wherein the second DNA segment encodes and the transformant expresses a material selected from the group consisting of immunoglobulins, vaccines, lymphocytes, cytokines, hormones, enzymes and pro-enzymes.

19. Transformant according to claim 16, wherein the second DNA segment encodes a plasminogen activator.

20. Transformant according to claim 19, wherein the activator is human tissue plasminogen activator.

21. Transformant according to claim 19, wherein the mammalian cell is a myeloma cell.

1. Vector for the production of a protein by transfection in a mammalian cell line that normally secretes immunoglobulins, which vector comprises replicable transcriptionally competent DNA with in sequence a first DNA segment comprising a promoter sequence, a second DNA segment encoding the protein linked to the first segment, and a stop signal codon, wherein said DNA further comprises a third DNA segment 3' to the stop signal codon comprising a non-native untranslated region containing a polyadenylation signal and less than about 300 base pairs between the stop codon and the polyadenylation signal, the vector being operable to produce increased amounts of protein compared to otherwise identical vectors, including the 3' untranslated region native to the gene encoding the protein.

2. Vector according to claim 1, wherein the third DNA segment contains the sequence AATAAA, where A is adenine and T is thymine.

3. Vector according to claim 1, wherein the second DNA segment encodes a material selected from the group consisting of immunoglobulins, vaccines, lymphokines, cytokines, enzymes and pro-enzymes.

4. Vector according to claim 1, wherein the second DNA segment encodes a plasminogen activator.

5. Vector according to claim 4, wherein the activator is human tissue plasminogen activator.

6. Transformant for production of a protein comprising a mammalian cell which normally produces immunoglobulin, said transformant comprising expressible DNA comprising in sequence: a) a first DNA segment comprising a promoter sequence; b) a second DNA segment linked to the first segment and encoding the protein; c) a stop signal codon; and d) a third DNA segment 3' to the stop signal codon comprising a non-native untranslated region containing a polyadenylation signal and with less than about 300 base pairs between the stop codon and the polyadenylation signal, which transformant is capable of producing increased amounts of the protein relative to otherwise identical transformants containing recombinant DNA, including the 3' untranslated region native to the gene encoding the protein.

7. Transformant according to claim 6, wherein the third DNA segment contains the sequence AATAAA, where A is adenine and T is thymine.

8. Transformant according to claim 6, wherein the second DNA segment encodes and the transformant expresses a material selected from the group consisting of immunoglobulins, vaccines, lymphocytes, cytokines, hormones, enzymes and pro-enzymes.

9. Transformant according to claim 6, wherein the second DNA segment encodes a plasminogen activator.

10. Transformant according to claim 9, wherein the activator is human tissue plasminogen activator.

11. Transformant according to claim 9, wherein the mammalian cell is a myeloma cell.