NO884304L - Ekspresjon av plasmodium falciparum circumsporozoitt-protein hos gjaer. - Google Patents

Description

Ekspresjon av falciparum circumsporozoitt-protein hos gjær

Bakgrunn for oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår ekspresjonen av P\ falci<p>arum circumspozositt-protein av gjær, samt en vaksine omfattende en immunobeskyttende mengde av slikt protein.

Mange nylige studier antyder at beskyttende immunitet i en følsom vertsorganisme for infeksjon av sporozoitt-stadiet hos en spesiell type plasmodium kan overføres via antistoff dannet av en slik vertsorganisme mot circumsporozoitt-protein (CS protein) av den spesielle sporozoitt. Foreliggende oppfinnelse muliggjør dannelsen av CS proteinet til den menneskelige malariaparasitt P^.falciparum eller et immunogent derivat derav fra gjær ved rekombinante DNA-teknikker.

Det er ønskelig å bruke gjær for dannelsen av slikt P. falciparum CS-protein av flere grunner, innbefattende de velkjente og pålitelige fermenteringskarakteristika av endotoksin når slikt CS-protein blir fremstilt i gjær i stedet for gram-negative bakterieceller, såsom L coli.

Nussenzweig et al., US patent 4.466.917, foreslår et sporozoitt polypeptid fra Plasmodium falciparum. identi-fisiert som Pf-44 proteinet, og dets kloning og ekspresjon i E. coli.

Sharma et al., Science. 228, 279-281 (1985) beskriver ekspresjonen av en del av circumsporozoitt-proteinet (CS) i Plasmodium knovlesi av gjær ved å bruke en ekspre-sjonsvektor inneholdende den 5' regulatoriske region til gjæralkohol-dehydrogenase I-genet i stedet for den 5' oppstrømsregion til P. knovlesi SC gensekvensen.

New York University, PCT ansøkning, publikasjonsnummer WO 84-02922-A, publisert 2. august 1984, beskriver kloning av en del av den kodende region for P. knovlesi CS-protein gjentagelsesenheten samt ekspresjon av beta-lactamase og beta-galactosidase-fusjoner derav i E. coli.

Kemp et al., W084-02917-A, beskriver kloning og ekspresjon i E. coli av en kodende sekvens for CS-proteinet avledet fra blodstadiet til P. falciparum.

Dame et al., Science 225, 593 (1984) angir kloning og ekspresjon av CS-protenet til P. falci<p>arum i E. coli. Proteinet er beskrevet som bestående av ca. 412 aminosyrer med en omtrentlig molekylvekt på 44.000. Den omfatter 41 tandem-repetisjoner av et tetrapeptid. Syntetiske 7-, 11-og 15-residiums-peptider avledet fra gjentagelsesregionen bandt seg til monoklonale antistoffer fremskaffet mot CS proteinet.

Ellis et al., Nature, 302, 536 (1983), angir ekspresjon av beta-lactamase - P. knowlesi CS-proteinfusjon i E. coli.

Weber et al., Molecular and Bacterial Parasitology. 15, 305-316 (1985), beskriver bruken av et CS-protein-gen fra en brasiliansk stamme av P. falciparum.klonet i E. coli, som en sonde for å analysere strukturen til 17 andre P. falciparum- st ammer ved nukleinsyrehybridisering og oppsummerer at CS-proteingenet er sterkt konservert i P. falciparum og at utvikling av malariavaksine med CS-proteinet er lite sann-synlig og blir komplisert ved stammevariasjoner.

Arnot et al., Science. 230, 815-818 (1985) beskriver

kloningen av CS-proteinet fra P. vivax ved å bruke en sonde avledet fra P. cynomolgi CS-genet for å isolere det homologe gen fra et bakteriofag bibliotek av klonet P. vlvax genomisk DNA samt bestemmelse av dets totale kodende sekvens, og konkluderer med at den kodende sekvens til CS-proteinet fra

P. vivax er homolog med den til CS-genet fra

P. knowlesl.men ikke P. falciparum.

Young et al, Science, 228, 958-962 (1985), beskriver ekspresjonen av P. falciparum CS-proteiner i E. coli for mulig bruk i en menneskelig malariavaksine.

The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, PCT patentsøknad W084/02917 publisert 2. august 1984, beskriver kunstig konstruerte polynukleotidsekvenser som i hovedsak tilsvarer alt eller en del av P. falciparum mRNA eller genomisk DNA, peptidet som tilsvarer en slik sekvens samt en metode for fremstilling derav og en binding for å stimulere immunforsvaret mot P. falciparum antigener omfattende slike peptider i pattedyr.

Mazier et al., Science, 231, 156-159 (1986), beskriver at antistoff fremskaffet i mus immuniset med flere rekombinante og syntetiske peptider av circumsporozoitt-proteinet fra P. falciparum ble vurdert for beskyttende aktivitet i et humant hepatosytt kultursystem.

Barr et al. "Modern Approaches to New Vaccines and Aids", side 22, Cold Spring Harbor, New York, 3.-14. september 1986, beskriver ekspresjonen hos S. cerevlsiae av en del av den P. vivax CS-proteinkodende sekvens fusert med en gjæralkohol-dehydrogenase-2/glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase hybrid promoter. Barr et al. beskriver bruken av en regulert hybridpromoter for ekspresjon av P. vivax CS-proteinet. Denne promoters nøyaktige struktur er ikke beskrevet. CS-sekvensen brukt for fusjon til promoteren mangler C-terminalregionen, som er en "anker"-region for innsetning i cellemembranen. Den nøyaktige grense er ikke angitt. Hvorvidt gensekvensen som brukes ved dannelsen også innholder signalsekvensen, er ikke beskrevet.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse omhandler en rekombinant DNA-vektor omfattende en DNA-sekvens operativt forblindet med en ekspresjonskontrollsekvens, og eventuelt i tillegg omfattende et replikon som er funksjonelt i gjær, hvor DNA-sekvensen innholder den kodende sekvens for circumsporozoittproteinet fra Plasmodium falciparum.

Foreliggende oppfinnelse omhandler også en gjær-vertscelle transformert med en rekombinant DNA-vektor hvor nevnte vektor omfatter en DNA-sekvens operativt forbundet til en ekspresjonskontrollsekvens, og eventuelt i tillegg omfatter et replikon som er funksjonelt i nevnte vertscelle hvor DNA-sekvensen inneholder den kodende sekvens for circumsporozoittproteinet fra Plasamodium falciparum. Foreliggende oppfinnelse omhandler også en fremgangsmåte for å fremstille en slik transformert vertscelle som omfatter og trans-formerer en gjærvertscelle med en slik rekombinant vektor.

Foreliggrend oppfinnelse omhandler også en fremgangsmåte for fremstiling av circumsporozoittproteinet fra Plasmodium f alcifarum. som omfatter å dyrke en gjærvertscelle transformert med en rekombinant DNA-vektor i et passende kul-turmedium og isolere et slikt protein fra et kulturlysat av en slik vertsorganisme, hvori nevnte vektor består av en DNA-sekvens operativt forbundet med ekspresjonskntrollse-kvens, og eventuelt i tillegg omfatter en replikon som er funksjonelt i nevnte vertscelle, hvor DNA-sekvensen inneholder den kodende sekvens for circumsporozoitt-proteinet fra Plasmodium falciparum. Foreliggende oppfinnelse omhandler også proteinet som er således fremstilt, samt en vaksine bestående av en immunobeskyttende mengde av et slikt protein.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 er et strømningskart som illustrerer fremstilingen av pRIT10162. Fig. 2 er et restriksjonsendonukleasekart av plasmidene pRIT10172, pRIT12570 og pRIT12569. Fig. 3 er et restriksjonsendonukleasekart av pRIT12290. Fig. 4 er et strømningskart som illustrerer fremstillingen av pRIT12570.

Fig. 5 er et restriksjonsendonukleasekart av pMC200.

Fig. IA er et skjematisk restriksjonskart som illustrerer sekvenseringsstrategien av klon XmPf1. Fig 2A illustrerer nukleotidsekvensen av CS-proteingenet fra P. falciparum.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Med uttrykket "circimsporozoittproteinet fra Plasmodium falciparum" menes det immunodominante overflateantigen på sporozoitten fra Plasmodium falclparum ("CS-protein").

Den DS-proteinkodende sekvens fra Plasmodium falciparum er beskrevet av Dame et al., Science, 225. 593-599 (1984).

Som brukt heri vil uttrykkene "cicumsporozoittprotein", "CS" eller "CS-protein" innbefatte både circusporozoitt-proteinet av full lengde fra Plasmodim falciparum såvel som ethvert immunogent derivat derav. Med uttrykket "immunogent derivat" av circumsporozoittproteinet fra Plasmodium falciparum menes (a) ethvert derivat av circumspotosoitt-proteinet fra Plasmodium falciparum, såsom derivatet kodet for av et subfragment av den kodende sekvens for CS-protein av full lengde, eller en serie av tandem subfragmenter som opprettholder beskyttende immunogen aktivitet, eller (b) ethvert protein avledet fra en modifisert kodende sekvens av circumsporozoittproteinet fra Plasmodium falciparum som har beskyttende immunogen aktivitet. Slike immunogene derivater kan fremstilles ved konvensjonelle teknikker såsom ved metoden til Botstein et al, Science, 229. 1193 (1985). Enkelte immunogene syntetiske derivater av den CS-proteinkodende sekvens fra £_;_ falciparum er beskrevet i Ballou et al., Science. 228. 996-999 (1985).

Den rekombinante vektor ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter et DNA-molekyl operativt forbundet til en ekspresjonskontrollsekvens og eventuelt består den ytterligere av et replikon som er funksjonelt i gjær, hvor DNA-molekylet inneholder den kodende sekvens for circumsporozoittproteinet fra Plasmodium falciparum. Med uttrykket "replikon" menes den minste region av DNA sm virker for å opprettholde en rekombinant vektor i en gjær-vertsmikroorganisme transformert med denne. Slike replikon er velkjent i faget. Med uttrykket "ekspresjonskontrollsekvens" menes enhver region som regulerer transkripsjonen av et strukturelt gens kodende sekvens. Slike ekspresjonskontrollsekvenser er velkjente i faget. Foretrukne ekspresjonskontrollsekvenser innbefatter gjær-glyceraldehyd-3P-dehydrogenasegen (TDH3) promoteren og gjær-ornitin-karbamoyl-transferasegen (ARG3) transkripsjonsavslutningsregionen. Eksempler på andre anvendelige eksepresjonskntrollsekvensregioner innbefatter dem som er avledet fra gjærgener fra glykolysen, såsom de kodende for enolase, aldolase og fosfoglyceratkinase, gjæralkohol-dehydrogenasegenet og generelt gener involvert i katabolis-men, såsom arginasegenet. Slike vektorer kan fremstilles ved konvensjonelle teknikker, såsom ved å sette inn den SC-kodende sekvens fra Plasmodium falciparum i fase i en vektor som på forhånd inneholder et replikon og en ekspresjonskontrollsekvens på en slik måte at DNA-molekylet blir operativt forbundet til slike ekspresjonskontrollsekvenser. Eksempler på anvendelige vektorer i hvilke den SC-kodende sekvens kan settes inn, innbefatter plasmidet YEpl3, som er istand til replisering og opprettholdelse både i E. coli og S. cerevislae og derfor er kjent som en skyttelvektor. Flere andre gjærvektorer er kjent og tilgjengelige. Trans formering med plasmidvektorer inneholdende autonome repli-seringssekvenser (replikons) og som virker i gjær, vil normalt gi ekstra-kromosomal opprettholdelse av DNA-molekylet ifølge oppfinnelsen som et plasmid. Slike replikon er velkjent i faget. Transformering med plasmidvektorer som ikke inneholder replikons som er virksomme i gjær kan resultere i inkorporering av DNA-molekylet i det kromosomale DNA. Foretrukket ligeres DNA-molekylet til en vektor som er istand til ekspresjon i gjærfamilien Saccaromyces. spesielt S. cerevisiae.

Restriksjon av DNA for å fremstille DNA-fragmenter brukt i oppfinnelsen, ligering av slike fragmenter for å fremstille rekombinante DNA-molekyler brukt i oppfinnelsen og innsetning i mikroorganismer utføres ved kjente teknikker, såsom teknikker beskrevet i de foregående og senere angitte referanser. Betingelsene blir valgt med henblikk på å unngå denaturering av DNA og enzymer. For eksempel bufres pH for å forbli ved ca. 7,0 til 11,0 og temperaturen holdes under ca. 60°C. Fortrinnsvis utføres restriksjon ved en temperatur på ca. 30-40°C og ligering utføres ved ca. 0-10"C. Restriksjonsenzymer og ligaser brukt ved utføring av oppfinnelsen er kommersielt tilgjengelige og bør brukes i samsvar med instruksjonen som er innbefattet med disse. T4 DNA ligase er den foretrukne ligase.

De forskjellige fragmenter og endelige konstruksjoner kan skjøtes sammen på vanlig måte. I mange tilfeller har gener blitt isolert og kartlagt ved restriksjon såvel som sekvensert. I denne utstrekning kan man velge ut sekvensen av interesse såsom den CS-proteinkodende sekvens ved restriksjon av genet ved å bruke ytterligere manipulering etter som det er nødvendig, såsom restriksjon med Bal31, in vitro mutagenese, primer reparasjon eller lignende, for å fremskaffe et fragment av ønsket størrelse innbefattende den ønskede sekvensen og som har de passende terminaler. Linkere og adaptere kan bli brukt som skjøtende sekvenser såvel som for å erstatte tapte sekvenser hvor restriksjons- setet er innvendig i forhold til området av interesse. De forskjellige fragmenter som isoleres kan bremses ved elektroforese, elektroelueres, ligeres til andre sekvenser, klones, reisoleres og manipuleres ytterligere.

Bruken av ekspresjonskontrollsekvenser for å kontrollere transkripsjonen av den CS-proteinkodende sekvens tillater vekst av vertscellene til høy tetthet uten eller med lavt ekspresjonsnivå av den CS-proteinkodende sekvens, for derpå å innbefatte ekspresjon ved å forandre de ytre betingelser, f.eks. næringsmiddel, temperatur osv.

For eksepel kan gjærcellen med den GAL4 regulatoriske region bli dyrket i rike medier med en kombinasjon av glycerol-melkesyre til en høy tetthet, f.eks. midlere eller senere logaritmisk fase, fulgt av overgang til galaktose som karbonkilde. For PH05 regulering kunne man dyrke cellene ved høy fosfatkonsentrasjon til ca. 0,1-0,5 mM. For temperaturfølsomhet kunne man dyrke cellene ved 25 °C - 37°C og derpå forandre temperaturen på passende måte ved ca. 5°C - 20°C. Vertcellene ville ha det regulatoriske system assosiert med den anvendte regulatoriske region.

Fusering av den CS-proteinkodende sekvens til ekspre-sj onskontrol len kan utføres ved å bruke mellomliggende vektorer eller alternativt kan den kodende sekvens settes inn direkte i en vektor som inneholder ekspresjonskontrollsekvensen. Foretrukket blir den CS-proteinkodende sekvens plassert relativt til ekspresjonskontrollsekvensen, slik at det syntetiserte protein ved ekspresjon av den CS-proteinkodende sekvens er fri for overflødige aminosyreresidier.

Foreliggende oppfinnelse omhandler også en gjærvertcelle transformert med en slik rekombinant vektor, samt en fremgangsmåte for å fremstille en slik vertsorganisme. En slik transformering utføres med vanlige teknikker, såsom metoden til Ito et al., J.Bacter: 153, 163-168 (1983). Foretrukne gjærvertsceller omfatter dem som tilhører slekten Saccaromyces cerevlsiae.

Foreliggende oppfinnelse omhandler også en fremgangsmåte for fremstilling av Plasmodium falciparum cicumsporozoittprotein som omfatter å dyrke de transformerte gjærceller ifølge oppfinnelsen i passende kulturmedier og isolere slike proteiner fra et kulturlysat av disse vertsceller. Med "passende kulturmedier" menes at slike medier vil tillate den transformerte vertsorganisme å overleve, og som også vil tillate slike vertsorganismer å uttrykke CS-proteinet i gjenvinnbare mengder. Det vil forstås av fagmannen at passende kulturmedier som skal brukes vil avhenge av den anvendte vertscelle. Isoleringen av CS-proteinet fra et kulturlysat av slike vertsorganismer utføres ved vanlige proteinisoleringsteknikker.

Foreliggende oppfinnelse omhandler også en vaksine inneholdende en immunbeskyttende mengde av P. falcifarum CS-protein, fremstilt ved metoden ifølge oppfinnelsen. Med uttrykket "immunbeskyttende" menes at nok av CS-proteinet ifølge oppfinnelsen tilføres et smittet menneske for å fremskaffe tilstrekkelig beskyttende antistoffrespons mot påfølgende P. falciparum parasittinfeksjon. I vaksinen ifølge oppfinnelsen kan en vandig oppløsnng av polypeptid ifølge oppfinnelsen, dvs. P. falci<p>arum CS-protein uttrykt av de transformerte gjærvertsceller ifølge oppfinnelsen, fortrinnsvis bufret ved fysiologisk pH, bli brukt direkte. Alternativt kan polypeptidet med eller uten forutgående frysetørking, blandes eller absorberes med ethvert kjent hjelpestoff. Slike hjelpestoffer innbefatter bl.a. alumi-niumhydroksyd, muramyldipeptid og saponiner, såsom Quil A. Som et ytterligere eksempelvis alt ernativ kan polypeptidet innkapsles i mikropartikler såsom liposomer. I enda et annet eksempelvis alternativ kan polypeptidet konjugeres til et immunstimulerende makromolekyl, såsom avlivet Bordetella eller et tetanustoksid.

Fremstilling av vaksine er generelt beskrevet i New Trends and Developments in Vaccines, redigert av Voller et al.,

University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978. Inn-kapsling i liposomer er beskrevet f.eks. av Fullerton, US

Patent 4.235.877. Konjugering av proteinet til makromole-kyler er beskrevet f.eks. av Likhite, US patent 4.372.945 og av Armor et al., US patent 4.474.757. Anvendelse av Quil A er beskrevet, f.eks. av Dalsgaard et al., Acta Vet. Scand, bind 18, side 349 (1977).

Mengden av gjæravledet P. falci<p>arum CS-polypeptid som er tilstede i hver vaksinedose velges som en mengde som induserer en immunbeskyttende respons uten å indusere vesentlige uheldige bivirkninger. Slike mengder vil variere, avhengig av de spesielle polypeptider som anvendes, og hvorvidt vaksinen har et hjelpemiddel. Generelt er det ventet at hver dose vil innbefatte 1-1000 ug polypeptid, fortrinnsvis 10-200 pg. En optimal mengde for en spesiell vaksine kan finnes ved standard studier som innbefatter observasjon av antistofftiteret og andre responser i pasienter. Etter en opprinneig vaksinering vil pasientene fortrinnsvis motta en forsterkning etter ca. 4 uker, etterfulgt av gjentatte forsterkninger hver 6. måned så lenge risiko for infeksjon eksisterer.

Eksempler

De følgende eksempler er lllustratorlske og ikke begrensende for oppfinnelen. Alle temperaturer er i Celsiusgrader. Enzymene brukt i DNA-behandling var fra Bethesda Research Laboratories, New England Biolabs og/eller Boehringer, og ble brukt i henhold til forhandlers anvisninger.

I de følgende eksempler kan de følgende forkortelser bli brukt: YNB Gjærnitrogenbase uten aminosyrer (Difco Lab)

0,675$, inneholdende 2$ glukose

PBS Fosfatbufret saltvann (pr. liter):

8,0 g NaCl

0,2 g KC1

1,15 g NA2HP04pH 7,4

0,2 g KH2P04

0,1 g CaCl2

0,1 g MgCl2.6H20

BSA bovint serum albumin (A4378, Sigma)

L buljong (pr. liter) 10 g trypton; 5 g NaCl; 5 g gjærekstrakt; 1 ml 0,1 M MgS04. Tilsett 5 ml aseptisk oppløsning av tiamid (1 mg/ml) etter autoklavering. For faste medier tilsett

15 g agar pr. liter.

X-gal 5-brom-4-klorindoyl-3-D-galactopyranosid.

Eksempel A Dannelse av plasmid pRIT10167

Utgangsmaterialet var plasmid p6y inneholdende et 2,1 kb HindiII-fragment av gjær DNA som koder for TDH3-genet klonet på pBR322. pBR322 er beskrevet av Bolivar et al., Gene. 2, 95-113 (1977). p6y plasmidet ble konstruert ogkarakterisertav Musti et al., Gene, 25, 133 (1983) og mottatt fra Dr. M. Rosenberg fra The National Institute of Health. HindiII-fra<g>mentet var reklonet på et pBR322 derivat hvori EcoRI-setet hadde blitt ødelagt for å gi plasmid pRIT10164 (en ikke nødvendig utføring). De følgende behandlinger ble utført for å danne et BamHI-sete beliggende ved G-residiet Utgangsmaterialet var plasmid p6y inneholdende et 2,1 kb HindiII-fragment av gjær DNA som koder for TDH3-genet klonet på pBR322. pBR322 er beskrevet av BolIvar et al., Gene, 2, 95-113 (1977). p6y plasmidet ble konstruert ogkarakterisertav Musti et al., Gene, 25, 133 (1983) og mottatt fra Dr. M. Rosenberg fra The National Institute of Health. HindiII-fragmentet var reklonet på et pBR322 derivat hvori EcoRI-setet hadde blitt ødelagt for å gi plasmid pRIT10164 (en ikke nødvendig utføring). De følgende behandlinger ble utført for å danne et BamHI-sete beliggende ved G-residiet av ATG-kodonet til den TDH3 kodende sekvens og for å erholde et Hindlll- BamHI DNA-fragment med TFH3 promoteraktivitet, hvori TDH3-sekvensene er intakte og uforandrede ved be-handlingen. DNA til pRIT10164, fremstilt som beskrevet ovenfor, ble renset ved to omganger av CsCl - etidiumbromid-tetthetsgradient-sentrifugering i hovedsak som beskrevet av Kahn et al., Methods in Enzymology, 68, 268 (1979). 150 pg pRIT10164 DNA ble fordøyet forskjellig med 75 enheter Xbal endonuklease, ekstrahert med fenol og eter, utfelt med etanol og DNA ble resuspendert I 0,01 M trometamin-HCL-buffer ved en konsentrasjon på 1 pg pr. pl. Prøver på 20 pg av dette Xbal-behandlede DNA ble fordøyet med Bal31 nuklease for å spalte de 61 basepar av DNA mellom ATG-kodonet og Xbal-setet. Fordøyinger med Bal31 ble utført ved 30°C i 1 til 3 minutter i buffer inneholdende 600 mM NaCl, 12 mM CaC12, 12 mM MgC12, 1 mM EDTA, 20 mM trometamin-HCL, pH 3,1 ved å bruke en enhet Bal31 nuklease pr. 20 pg DNA i et endelig reaksjonsvolum på 200 pl.

Enzymreaksjonene ble stoppet ved tilsetning av etylenbis-(oksyetylenitrilo)tetraeddiksyre (EGTA) for å gi 20 mM endelig konsentrasjon og prøvene ble ekstrahert med like volumer fenol, eter og utfelt med etanol. Hver DNA prøve ble resuspendert i 20 pl 10 mM trometamin-HCl-buffer pH 7,5. Graden av Bal31 fordøying ble målt ved å fordøye ca. 2,5 pg av hver DNA-prøve med Hpal endonuklease og sammenligne størrelsen av Hpal- Xbal-fragmentene med 335 bp Hpal- Xbal-fragmentet fra pRIT10164. En 2 minutters fordøyelse med Bal31 ble funnet å fjerne ca. 41 - 88 nukleotider fra Xbal- Hpal-fragmentet av pRIT10164.

Dette resultatet Indikerer at et lignende antall basepar hadde blitt fjernet fra de andre Xbal ender mot ATG-kodonet. 5pg av DNA gjenvunnet fra 2-minutters Bal31-fordøying, ble fordøyet med BamHI endonuklease, ekstrahert med fenol og gjenvunnet ved etanolutfelling. Dette DNA ble behandlet med 5 enheter T4 polymerase i nærvær av deoksynukleotid-trifos-fater for å fylle ut og gjøre enkeltkjedede BamHI og enhver Bal31 ekstrahert med fenol og gjenvunnet med etanolutfelling buttendede. 2,3 pg av dette DNA ble behandlet med 5 enheter T4 DNA ligase og halvparten av ligeringsblandingen ble brukt for å transformere kompetente celler av coli K12 stamme MM294 fremstilt i henhold til metoden til Cohen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 69. 2110 (1972). 1 ml av den transformerte E_j_ coli populasjon ble fortynnet i 350 ml L-buljong med 200 pg/ml ampicillin og det fullstendige plasmid DNA ble renset fra den resulterende kultur. 80 pg av dette plasmid DNA inneholdende en populasjon av plasmidmolekyler med Bal31 induserte uttak på ca. 40 - 80 basepar ble fordøyet sekvensielt med 75 enheter Hindlll endonuklease og 96 enheter av BamHI endonuklease for å frigjøre DNA-fragmenter fra disse plasmider hvori et BamHI sete hadde blitt gjendannet etter behandlingene beskrevet ovenfor, dvs. hvor Bal31 fordøyingen hadde stoppet ved et G-residium. Denne DNA-fordøying ble foretatt på en preparativ 1$ agarosegel og de ønskede Hindlll- BamHI fragmenter tilsvarende størrelser fra 1100 til 1000 bp ble skåret ut fra gelen i to skiver, hvorav én tilsvarte DNA på ca. 1070 bp og den andre på ca. 1030 bp. DNA ble gjenvunnet fra de to agarosegelskiver ved cykler med frysing og tining fulgt av høyhastighetsentrifugering for å pelletere agarosen. Supernatantvæsken ble filtrert gjennom et Millipore GV Millex filter og DNA ble gjenvunnet ved to omganger av etanolutfelling og resuspendert i 20 pl av 0,01 M trometamin-HCl buffer pH 7,5.

Analyse ved agarosegelelektroforese og sammenligning med en Hindlll plus Xbal-fordøying av pRIT10164 DNA samt fragmentene fra en Hindlll plus EcoRI fordøying av fag X DNA viste at to distinkte populasjoner av HindiII- BamHI fragmenter ble erholdt, den ene med en beregnet størrelse på ca. 1070 bp og den andre med en beregnet størrelse på ca. 1030 bp sammenlignet med det parentale 1120 bp Hindlll- Xbal fragment fra pRIT10164. Ca 100 ng av 1030 bp Hindlll- Xbal fragment-populasjonen ble ligert med 200 ng plasmid pUC9 som hadde blitt fordøyet med Hindlll og BamHI endonukleaser og behandlet med alkalisk fosfatase (se Shine, US patent 4.264.731) og ligeringsblandingen ble brukt for å transformere kompetente celler ac E_;_ coli stamme JM103 hvor utvel-gelse ble foretatt for ampicillin-resistens. Transformasjon av Ej_ coli stamme JM103 ble utført i henhold til metoden til Cohen et al. referert ovenfor.

Både pUC9 vektorplasmidet og den mottagende E^. coli stamme JM103 har blitt beskrevet av Vieira og Messing i Gene, 19, 259 (1982) og ble erholdt fra J. Messing (University of Minnesota). pUC9 vektoren er kommersielt tilgjengelig fra Amersham (Buckinghamshire, England) og Pharmacia (Uppsala, Sverige). E^. coli stamme JM103 er tilgjengelig fra J. Messing (Univ. of Minnesota). En annen E_;_ coli stamme med særtrekkene til E^coli stamme JM103, dvs. JM101, kan er-holdes fra The American Type Culture Collection, Bockville, Maryland, under tilgangsnummer ATCC 33876 og kan også bli anvendt som vertsorganisme. Ca. 400 ampicillinresistente kolonier pr. ml ble erholdt, og av 98 kolonier undersøkt på medium inneholdende X-gal var 95 hvite, noe som indikerer suksessrik innsetning av et fremmed DNA-fragment mellom Hindlll og BamHI-setene på vektoren.

Plasmider fra individuelle transformantkolonier ble fremstilt ved fremgangsmåte i liten målestokk [Birnboim og Doly, Nucl. Acid 7, 1513 (1979)] etter forsterking av plasmidene ved tilsetning av spectinomycin (150 pg/ml) til de voksende

kulturer.

De rekombinante plasmider ble analysert på 7,5 % acrylamid-geler etter dobbel fordøying med AvalI og BamHI endonukleaser og sammenlignet med 450 bp AvaII- XbaI-fragmentet omfattende den promoter-N-terminale region av pRIT10164 samt med fragmentene av en HpalI fordøying av pBR322 DNA. Et AvalI- BamHI fragment tilsvarende delesjoner på fra 20 til 90 basepar var tilstede i 36 av 36 undersøkte plasmider når de ble sammenlignet med pRIT10164. Tre plasmider som represen-terer delesjoner av ca. 80 basepar (pRIT10166), 50 basepar (pRIT10167, figur I) og 45 basepar (pRIT10165) ble utvalgt for videre studium. Plasmid DNA ble fremstilt ved CsCl-etidiumbromid-tetthetssentrifugering og 25 pg av hvert ble fordøyet med EcoRI. EcoRI endene ble merket med S-<32>P-ATP ved utbyttekinering og nukleotidsekvensen til Hindlll-EcoRI fragmentene fra hvert plasmid ble bestemt ved den kjemiske modifiseringmetode til Maxam og Gilbert, Methods in Enzymology, 65, 499 (1980). Merking og sekvensering fra EcoRI setet I pUC9 vektordelen av hvert rekombinant plasmid er en passende måte for å bestemme sekvensen omkring det tilstørende BamHI sete som markerer slutten på delesjonen i TDH3 DNA-fragmentet. Denne sekvenseringsanalyse viste at

i plasmid pRIT10166 er BamHI setet gjendannet ved et

gelresidium beliggende i den 5' ikke-translaterte region 25 basepar oppstrøms i ATG kodonet. I pRIT10165 er BamHI setet beliggende ved andre base av tredje kodon, og i pRIT10167 er BamHI setet beliggende ved G-residiet av ATG kodonet.

Hindlll- BamHI fragmentet av TDH3 DNA således konstruert i pRIT10167 inneholder alle sekvensene som er nødvendige for TDH3 promoteraktivitet i uforandret form.

Eksempel B Konstruksjon av vektor pRIT10172

1050 bp Hindlll- BamHI TDH3 DNA-innskuddet fra pRIT10167, fremstilt som beskrevet i eksempel A, ble reklonet på

YEpl3 skyttelvektoren beskrevet av Broach et al. Gene. 8, 121 (1979) mellom Hindlll setet i 2 micron DNA-delen av vektoren og BamHI setet for å gi det rekombinante plasmid pRIT12159. DNA fra pRIT12159 ble så fordøyet med Xbal og BamHI endonukleaser og det resulterende 1650 bp fragment ble ligert på plass i et lignende Xbal- BamHI fragment inneholdende ARG3-promoteren på plasmid pRIT10774. Plasmid pRIT10774 er beskrevet av Cabezon et al., Proe. Nati. Acad. Schi. U. S.. 81, 6594-6598 (1986) såvel som Cabezon et al., U.S. pat. søkn. 575.122 innlevert 30. januar 1984, og omfatter YEpl3-replikonet, hvorfra den naturlige vektors BamHI og XHoI seter har blitt fjernet ved in vitro manipulering sammen med et 1470 bp Hindlll- BamHI innskudd omfattende ARG3 promoterregionen og et 1150 bp BamHI- HindiII fragment omfattende ARG3 transkripsjonsavslutningsregionen. Erstat-ning av ARG3 promoterinskuddet på pRIT10774 med TDH3 promoterinskuddet gir plasmid pRIT10172, som følgelig inneholder et enkelt BamHI sete beliggende ved ARG kodonet av TDH3 promoterinnskuddet og før et funksonelt signal for transkripsjonsavslutning på 1150 bp BamHI- Hlndlll ARG3 DNA-fragmentet. Fremmed DNA kan følgelig klones ved dette sete. Videre er de to DNA innskudd flankert av Hindlll seter som tillater fjerning av ekspresjonsenhetmodulen (kassett) som et 2200 bp Hindlll fragment for innsetning i andre vektorer. Figur 2 er et restriksjonsendonuklease-spaltningskart av pRIT10172.

Eksempel 1

Ekspresjon av den P. falciparum circumsporozoitt protein-kodende sekvens minus dets antatte signalsekvens i gjær

A. Konstruksjon av plasmidene pRIT12570 og pRIT12569 Plasmid WR201 ble erholdt fra the Walter Reed Army Institute of Research og stammer fra innsetning av et 2,3 kilobaser (kb) EcoRI fragment fra XmPfl [se Dame et al., Science, 225. 593-599, (1984)], og som koder for det fullstendige circumsporozoitt-proteingen Plasmodium falciparum i vektor pUC8. Figur IA viser et skjematisk restriksjonskart og sekvenseringsstrategi av XmPf1. Beliggenhetene av restrik-sjonsenzym-spaltningssetene vist i figuren ble bestemt fra sekvensen og bekreftet ved fordøying: A, AvalI; Ac, AccI;

B, BstnI; D, Dral; Dd, Ddel; F, Foki; N, Ndel; R, Rsal; S, Stul; T, Tthlll; Tq, Taql; X, XhoII. Piler angir start-punktet, retningen og utstekningen av den bestemte sekvens. Den CS proteinkodende region er vist som en uthevet linje.

Fig. 2A viser nukleotidsekvensen til CS proteingenet til P. falciparum. Nukleotidsekvensen av CS proteingenet i XmPfl er vist. Vektor pUC8 er beskrevet av Vieira et al., Gene, 19, 259 (1982). Vektor pUC8 er kommersielt tilgjengelig fra Amersham, Buckinghamshire, England, og Pharmacia, Pis-cataway, New Jersey, USA, og Uppsala, Sverige. Et 1215 basepar (bp) Stul- Rsal fragment av plasmid WR201 inneholdende den P. falciparum CS-proteinkodende sekvens minus de første 52 bp av den CS-proteinkodende sekvens ble renset ved elektroeluering fra en 7,5$ polyakrylamidelektroforese-gel. Restriksjonsendonuklease Stul spalter CS-proteingenet i attende kodon av sekvensen. Siden sekvensen av de første aminosyrer til CS-proteinet er karakteristisk for et spaltet signalpeptid (Dame et al. Science. 225. 593-599 (1984)) er disse aminosyrer antatt å være fraværende fra det ferdigutviklede CS-protein på sporozoitter.

Således bør 1215 bp Stul- Rsal fragmentet eller plasmid WR201 kode for alle, bortsett fra de første to aminosyrer av det ferdigutviklede protein forutsagt fra sekvensen. Dette buttendende Stul- Rsal fragment fuseres i fase til transla-sjonsstartkodonet tilstøtende det DNA polymerasereparerte BamHI-sete av gjærekspresjonsvektor pRIT10172, fremstilt som beskrevet i eksempel B (ligeringen av det innfylte BamHI-sete til Stul-setet gjendanner BamHI-setet). DNA av plasmid pRIT10172 ble fordøyet med BamHI endonuklease, behandlet med E. coli DNA polymerase I (Klenow-fragment), ekstrahert med fenol og gjenvunnet ved etanolutfelling. 0,4 pg av dette DNA ble blandet med 0,2 pg av 1215 BP Stul- Rsal fragmentet fra WR201 beskrevet ovenfor, behandlet med T4DNA ligase og legeringsblandingen ble brukt for å transformere kompetente celler av E. coil K12 stamme MM294 fremstilt i henhold til fremgangsmåten til Cohen et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA. 69, 2110 (1972). 1200 kolonier ble undersøkt ved kolonihybridiseringsmetoden (Grundstein and Hogness, Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 72, 3961 (1975)) på Whatman 541-filtere ved å bruke Stil- Rsal fragmentet, radiomerket med<32>P ved spaltningsforflytning, som sonde. 20$ av klonene ga et positivt signal med sonden. 28 plasmider fra positive kolonier ble fremstilt ved en fremgangsmåte i liten skala [Birnboim et al. Nuclelc Acids Research. 7, 1513 (1979)]. Stul-Rsal-fragmentets orientering ble undersøkt ved dobbel fordøying med BamHI og Sali endonukleaser. Blandt plasmidene hadde syv plasmider fragmenter i riktig orientering (hvorav ett ble betegnet pRIT12570, fig. 2) og 12 plasmider haddde fragmentet i gal orientering (hvorav ett ble betegnet pRIT12569, fig. 2). Fig. 4 er et strømningskart som viser fremstillingen av pRIT12570.

Plasmidene pRIT12570, pRIT12569 og pRIT10172 ble satt inn i gjær ( Saccharomycea cerevislae) stammer DC5 ( leu2-3. Ieu2-112, his3, canl-11) og 10S44C (leu2-3, leu2-112. p_ep_4-3) erholdt fra M. Crabeel, Ceria Institute, Anderlecht, Belgia, ved trnsformering av litiumacetat-behandlede celler (Ito et al., J. Bacteriol. 153. 163-168 (1983)] og utvalgt for leucinuavhengighet. Proteinet forutsagt ved denne konstruksjon inneholder 394 aminosyrer av det ferdigutviklede P. falciparum CS protein fusert til tre aminosyrer (Met-Asp-Pro-) ved dets NHg-ende og som er avledet fra vektorsekven-sen (pRIT10172). S^. cerevislae stamme 10S44C ble deponert ved The American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, U.S.A. i samsvar med bestemmelsene i Budapestav-talen 18. august 1988 under tilgangsnummer ATCC 20819. S. cerevisla stamme DC5 ble deponert ved The American Type Culture Collection 2. juni 1982 i samsvar med bestemmelsene i Buda- pestavtalen under tilgangsnummer ATCC 20630.

B. Syntese av P. falciparum circumsporozoittprotein i gjær. Gjær ( Saccharomyses cerevislae) stammer DC5 eller 10S44C inneholdende enten pRIT2570, pRIT12569 eller pRIT10172, fremstilt som beskrevet ovenfor, ble separat dyrket i flytende medium som manglet leucin (YNB + 80 pg/ml histidin eller YNB). CS proteinsekvenser ble identifisert ved proteinlmmunoblotting-teknikk [se Burnette, Anal. Biochem.. 112. 195-203 (1981); Gershoni and Palade, Anal. Biochem.. 131, 1-15 (1983); Towbin and Gordon, J. Immunol. Methods. 72, 313-340 (1984)] ved å bruke en blanding av 5 monoklonale antistoffer mot CS protein (Dame et al., Science, 225, 593-599 (1984)]. Etter elektroblotting av proteinene på et nitrocellulosefilter (Schleicher og Schull, 045 u) [Towbin et al., Proe. Nati. Acad. Si.. U. S. A.. 76, 4350-4354, 1979)] ble filteret preinkubert i 1 time ved 39°C med 3$ gelatin i PBS. Deretter ble filteret vasket 5 ganger i 5 minutter hver gang med PBS inneholdende 0,1$ Tween 20 (polyoksy-etylensorbitanmonolaurat), og arket ble behandlet i 1 time ved romtemperatur med en blanding av 5 monoklonale antistoffer mot CS protein [Dame et al., Science 225, 593-599,

(1984)] i PBS, 1$ gelatin. Filterarkene ble vasket 5 ganger i 5 minutter hver gang med RBS, 0,1$ Tween 20, og et andre biotynilert saue anti-muse antistoff (Amersham) i PBS, 1$ gelatin ble tilsatt i 1 time ved romtemperatur. Arkene ble igjen vasket med PBS, 0,1$ Tween 20, 5 ganger i 5 minutter hver gang, og ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur med atreptavidin-biotinylert pepperrot-peroksydase (HRP)-kompleks (Amersham). Arkene ble igjen vasket 3 ganger i 5 minutter hver gang med PBS 0,1$ Tween 20, og ble endelig inkubert med 30 jjI H2O2og HRP fargeutviklingsreagens inneholdende 4-klor-l-naftol (BioRad), 30 mg i 10 ml metanol, i 50 ml PBS. Molekylvekten til antigenene ble beregnet fra på forhånd fargede proteinmarkører, ovalbumin, alfa-chymo-trypsinogen, beta-lactoglobin, lysozym, cytokrom C (BRL).

Immunreaksjonen som er spesifik for proteiner avledet fra pRIT12570-inneholdende celler, viste en type som hadde molekylvekt fra 30.000 til 50.000 dalton. Dette viser at det P. falciparum CS-relaterte produkt uttrykt av gjær er heterogent. Mer av dette heterogene materiale ble funnet blandt proteinene fra 10S44C transformerte celler enn blandt DC5 transformerte celler.

Eksempel II

Antistoffrespons - ELISA. CS reaktivitet av antisrum mot p. falciparum CS- protein fremstilt i gjær, hepatocyttblok-kering

P. falciparum CS polypeptidet fremstilt i gjær i henhold til fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan vurderes for sin immunogenisitet i henhold til metodene skissert i Ballou et al., US patentsøknad serienummer 699.116, inngitt 7. februar 1985, hvorav hele beskrivelsen herved er innbefattet pr. referanse.

Eksempel III

Vaksine inneholdende P. falciparum CS protein uttrykt av g- 1ær

En illustratorisk vaksine ifølge oppfinnelsen fremstilles som følger: Til en bufret, vandig oppløsning av 3$ alumi-niumhydroksyd (10 mM natriumfosfat, 150 mM.NaCl, pH 6,8, sterilisert ved filtrering) hvor gjær-avledet P. falciparum CS polypeptid ifølge oppfinnelen i lignende buffer tilsettes under omrøring til en endelig konsentrasjon på 100 Mg/ml polypeptid og 0,5 mg/ml aluminium (Al<3+>). pH opprettholdes ved 6,8. Blandingen oppbevares over natten ved ca. 0°C. Timerosal tilsettes til en endelig konsentrasjon på 0,0005$. pH undersøkes og justeres om nødvendig til 6,8.

Eksempel IV

Konstruksjon av vektorer for ekspresjon av Immunogene deler av den tetrapeptidgjentagende region av P. falciparum PC-proteinet i gjær

A. Dannelse av pRIT12290

Et 1050 bp Hindlll- EcoRI fragment fra pRIT10167 (figur 1) fremstilt som beskrevet i eksempel A og inneholdende Hindlll- BamHI TDH3 promoterfragmentet sammen med BamHI-Smal- EcoRI delen av pUC9 polylinkeren ble reklonet mellom Hindlll og EcoRI-setene av et pBR322 derivatplasmid på forhånd utskilt fra BamHI-setet ved innfylling med T4 DNA polymerase og religering. Det resulterende rekombinante plasmid ble identifisert som pRIT12176.

Plasmid DNA av pRIT 10158 (figur 1), fremstilt som beskrevet i eksempel V, ble fordøyet med EcoRI endonuklease og behandlet med T4 DNA polymerase for å fylle i EcoRI enkeltkjedede forlengelser. Dette preparat ble ytterligere fordøyet med Clal endonuklease. En ytterligere prøve på pRIT10158 DNA ble fordøyet med Clal og Haelll endonuklease og et 1150 bp Clal- Haelll fragment som bærer transkripsjonsavslutningsregionen av ERG3-genet ble gjenvunnet ved preparativ agarosegelelektroforese og elektroeluering. Dette fragment ble ligert med EcoRI. T4 DNA polymerase, Clal-behandlet pRIT10158 DNA, og ligeringsblandingen ble brukt for å transformere kompetente celler av E. coli stamme MM294 fremstilt som beskrevet av Cohen et al. ovenfor, til ampicillinresistens. Fra de transformerte kolonier ble et plasmid identifisert som pRIT10162 Isolert, hvori Clal-Haelll ARG 3 transkripsjonsavslutningsfragmentet var satt inn på pRIT10158 mellom Clal og de innfylte ECORI-seter. og hvori EcoRI-setet har blitt gjendannet. Figur 1 er et strømningskart som illustrerer fremstillingen av pRIT10162. Plasmid DNA av pRIT10162 ble fordøyet med EcoRI og Pstl endonukleaser blandet med plasmid DNA av pRIT12176, fremstilt som beskrevet ovenfor (også fordøyet med EcoRI og Pstl endonukleaser) og blandingen ble ligert og brukt for å transformere celler av E. coli K12 stamme MM294 til ampicillinresistens ved metoden til Cohen et al.som er angitt ovenfor. Et plasmid, pRIT12208, ble gjenvunnet fra en koloni fra denne transformasjon, hvori det store 4630 bp EcoRI- PstI fragment fra pRIT12176 hadde blitt ligert til det lille 1930 bp EcoRI- PstI fragment fra pRIT10162 og hvori ARG3 transkripsjonsavslutningsregionen nå ligger overfor TDH3-promoteren. ARG3 og TDH3 DNA regionene kan fjernes fra pRIT12208 som et enkelt 2200 bp fragment ved fordøying med Hindlll endonuklease. For å erholde den andre orientering av dette fragment med hensyn til vektorsekvensene, ble det 2200 bp Hindlll fragment fra pRIT12208 reklonet i HindiII-setet av et pBR322 derivatplasmid hvori de naturlige EcoTI og BamHI-seter separat hadde blitt fjernet ved innfylling med T4 DNA polymerase og religering. Det resulterende plasmid med det 2200 bp HindiII-fragment satt inn i motsatt orienterng med hensyn til vektorsekvensene sammenlignet ned pRIT12208 er identifisert som pRIT12290.

Figur 3 er et restriksjonsendonuklease-spaltningskart av pRIIT12290. Både I pRIT2208 og pR IT2290 vektorene er TDH3 promoteren og ARG3 transkripsjonsavslutningsfragmentene ad-skilt av enestående BamHI, Smal og EcoRI restriksjonsseter som er anvendelige for kloningen av DNA-fragmenter som bærer kodende sekvenser, og promoter og transkripsjons-avslutningsregioner kan skilles ut sammen på et 2200

bp HindiII fragment som en modul eller kassett for over-føring til andre vektorer.

BamHI setet er spesielt anvendelig, idet det er lokalisert ved ATG kodonet av TDH3 genet og kan anvendes for fusjon av andre gener til TDH3 promoteren med en mulighet for å uttrykke disse i gjær, som eksemplifisert nedenfor. Slike fusjoner kan gjenvinnes fra pRIT12208 eller pRIT12290 derivatene i form av kassetter eller moduler for innsetning på gjærskyttelvektorer ved fordøying med Hindlll endonuklease eller ved bruk av andre restriksjonsendonukleaser som spalter ved flankerende restriksjonsseter.

B. Konstruksjon av et plasmid som inneholder en syntetisk linker for innsetning av en del av P. falciparum CS protein tetrapeptid g. 1 entagelsesreglonen

Plasmid pR IT12290, fremstilt som beskrevet i del A ovenfor, fordøyes med BamHI og EcoRI endonukleaser og blandes med et syntetisk DNA fragment med følgende sammensetning

Blandingen av fragmentene føres sammen og ligeres med T4 DNA ligase og brukes for å transformere kompetente celler av E. coli stamme MM294 for ampicillinresistens i henhold til vanlige teknikker. Plasmider fremstilt fra enkle kolonier undersøkes for tilstedeværelse av enkle EcoRI og BamHI endonukleaserestriksjonsseter og for fravær av et Smal sete som er tilstede på den opprinnelige pRIT12290 vektor, men ikke på den ønskede rekombinant. Riktigheten av plasmidet som velges ut kan bekreftes ved DNA sekvensering. Innsetning av det syntetiske DNA fragment gjendanner et BamHI sete etter TDH3 ATG kodonet og gir et stoppkodon (TAA) i fase med ATG-kodonet. Formålet med å danne et slikt plasmid er å danne en passende vektor for fusjon av 192 basepar-delen av P. falciparum CS protein tetrapeptid gjentagelsesregionen til TDH3promoterregionen og fremskaffe et stoppkodon umiddelbart 3' til en slik kodende region.

C. Dannelse av et plasmid Inneholdende en 192 basepar- del av P. falciparum CS protein tetrapeptid gjentagelsesregionen

1215bp StuII- Rsal fragmentet av plasmid WR201, renset som beskrevet i eksempel 1 og inneholdende den SC proteinkodende sekvens minus de første 52 bp, fordøyes med Sau3A for å danne mindre fragmenter som blandt annet innbefatter 192 bp Sau3A fragment som koder for 16 tetrapeptidgjentagelser av CS proteinet. BamHI-setet av den modifiserte pRIT12290

vektor i del B ovenfor, beliggende ved ATG startkodonet,

er i fase med Sau3A setene av den gjentagende epitop av CS proteinet til P. falciparum.

DNA av dette plasmid fordøyes med BAMHI endonuklease, ekstraheres med fenol og gjenvinnes ved etanolutfelling.

0,2 pg av dette DNA blandes med ca. 0,1-0,2 pg av Sau3A fordøyingen av Stul- Rsal fragmentet fremstilt som beskrevet ovenfor, og behandles med T4 DNA ligase, og ligeringsblandingen brukes for å transformere kompetente celler av E. coli stamme MM294 til ampicillinresistens i henhold til konvensjonelle teknikker. Plasmider fra individuelle transformanter blir fremstilt og analysert på 7,5$ akryl-amidgeler etter dobbel fordøying med BamHI og EcoRI endonukleaser og sammenlignes med den opprinnelige vektor, med Sau3A-fordøyingen av Stul-Rsal CS genfragmentet og med passende molekylvektmarkører, f.eks. en HaelII-fordøying av 0x174 DNA.

Plasmider som inneholder et BamHI- EcoRI innskutt fragment på 200 bp tilsvarer innskuddet på 192 bp Sau3A fragmentet i den ønskede orientering for fusjon av den SC-kodende sekvens til ATG startkodonet. Innsetning av 192 Sau3A-fragmentet i den ønskede orientering gjendanner BamHI-setet ved ATG-kodonet.

I tillegg vil fordøying av et slikt plasmid med Sau3A fri-gjøre et 192 bp fragment av samme størrelse som det erholdt fra fordøying av Stul- Rsal fragment inneholdende den CS protein gjentagende epitop. Denne konstruksjon vil inneholde en åpen leseramme på 67 aminosyrer som strekker seg fra ATG-kodonet ved TDH3 promotergrensen gjennom det CS gjentagende epitopinnskudd og slutter ved TAA kodonet i det innsatte syntetiske DNA-fragment umiddelbart 3' til Sau3A-setet og 5' til EcoRI-setet. Riktighet av konstruksjonen kan bekreftes ved DNA-sekvensering og fordøying av plasmidet med Hindlll endonuklease vil frigjøre et Hindlll-fragment på 2390 bp omfattende TDH3-promoteren, den CS- gjentagende epitop og den ARG3-avsluttende region. Dette Hindlll fragment kan reklones på enhver passende gjærvektor, f.eks. YEpl3 og innsettes i gjær i henhold til konvensjonelle teknikker.

Plasmidet kan også fordøyes med BamHI endonuklease og blandes og ligeres igjen med Sau3A-fordøyingen av det Stul-Rsal-gjentagende epitopfragment for å innsette en tandem-kopi av epitopen som vil være i fase med den første kopi, og som lik tidligere vil gjendanne et BamHI-sete ved ATG-kodonet, forutsatt at orienteringen av innskuddet er korrekt. Fremgangsmåten kan gjentas for å bygge opp en serie gjentagelser av 192 bp epitopfragmentet omfattende to, tre, fire osv. tandemkopier. Denne prosess vil øke lengden av den åpne leseramme og resultere i stadig større proteiner, omfattende 131, 195 og 259 aminosyrer.

Fordøying av disse konstruksjoner med Hindlll endonuklease vil progressivt frigjøre større fragmenter inneholdende ekspresjonskassettene, som kan reklones på passende gjærvektorer for transformering og innføring i gjær vedkjente metoder, såsom de beskrevet i eksempel 1.

Eksempel V

Konstruksjon av plasmid pRIT. 10158

3300 bp Hindlll fragmenter fra plasmid pMC200 (tilgjengelig fra The American Type XCultyure Collection, Rockville, Maryland, U.S.A. uten resstriksjoner under tilgangsnummer ATCC 39131), beskrevet av Crabeel M. et al; EMBO J.. 2, 205-212 (1983), ble reklonet på et pBR322 derivatplasmid på hvilket det naturlige EcoRI-sete hadde blitt fjernet ved innfylling av T4 DNA polymerase og religering. Et resulterende rekombinant plasmid, pRIT10158 (figur I), ble valgt ut, hvori Hindlll ARG3-geninnskuddet har 3' regionen av ARG3-genet nærliggende Clal-setet på den modifiserte pBR322 vektor. Figur 5 er et restriksjonsendonukleasespaltnings-kart av pMC200.

Selv om beskrivelsen ovenfor fullstendig beskriver oppfinnelsen og alle foretrukne utførelsesformer derav, vil det forstås at oppfinnelsen ikke er begrenset til utførelses-formene som er spesielt beskrevet, men innbefatter alle modifikasjoner derav som faller innenfor rammen av de følgende krav.

Claims (41)

1. Rekombinant vektor omfattende en DNA-sekvens operativt forbundet med en ekspresjonskontrollsekvens, karakterisert ved at DNA-sekvensen inneholder den kodende sekvens for circumsporozoitt-proteinet av Plasmodium falciparum.

2. Vektor ifølge krav 1, karakterisert ved at den ytterligere omfatter et replikon som er funksjonelt i gjær.

3. Vektor ifølge krav 1, karakterisert ved at ekspresjonskontrollsekvensen omfatter gjær glyceraldehyd-3P-dehydrogenase (TDH3)-promoteren.

4. Vektor ifølge krav 3, karakterisert ved at ekspresjonskontrollsekvensen i tillegg omfatter ARG3 transkripsjonsavlutnings-regionen.

5. Vektor ifølge krav 4, karakterisert ved at den omfatter et 1215 bp Stul-Rsal-fragment av WR201 inneholdende den P. falciparum CS proteinkodende sekvens minus ca. de første 50 bp.

6. Vektor ifølge krav 5, karakterisert ved at den er pRIT12570.

7. Vektor ifølge krav 4, karakterisert ved at den omfatter et 192 bp Sau3A fragment som koder for 16 tetrapeptidgjentagelser av P. falciparum CS proteinet avledet fra Sau3A fordøyingen av et 1215 bp Stul- Rsal-fragment av WR201 inneholdende den P. falciparum CS-proteinkodende sekvens minus ca. de første 50 bp eller to, tre, fire eller flere tandemkopier av et slikt 192 bp Sau3A-fragment.

8. Gjærvertsceller transformert med en rekombinant DNA vektor, karakterisert ved at vektoren omfatter en DNA sekvens operativt forbundet med en ekspre-sj onskontrollsekvens hvori DNA-sekvensen inneholder den kodende sekvens for circumsporozoitt-proteinet fra Plasmodium falciparum.

9. Vertsorganisme ifølge krav 8, karakterisert ved at vektoren i tillegg omfatter et replikon som er funksjonelt i gjær.

10. Vertsorganisme ifølge krav 8, karakterisert ved at ekspresjonskontrollsekvensen omfatter gjær glyceraldehyd-3P-dehydrogenase (TDH3) promoteren.

11. Vertsorganisme ifølge krav 10, karakterisert ved at ekspresjonskontrollsekvensen i tillegg omfatter den ARG3 transkripsjonsavslut-tende region.

12. Vertsorganisme ifølge krav 11, karakterisert ved at vektoren omfatter et

1215 bp Stul- Rsal-fragment av WR201 inneholdende den P. falciparum CS-proteinkodende sekvens minus ca. dets første 50 bp.

13. Vertsorganisme ifølge krav 12, karakterisert ved at vektoren er pRIT12570.

14. Vertsorganisme ifølge krav 11, karakterisert ved at vektoren omfatter et

192 bp Sau3A fragment som koder for 16 tetrapeptidgjentagelser av P. falciparum CS proteinet avledet fra Sau3A- fordøyingen av et 1215 bp StuI-Rsal-fragment av WR 201, inneholdende den P. falciparum CS-proteinkodende sekvens minus ca. de første 50 bp eller to, tre, fire eller flere tandemkopier av et slikt 192 bp Sau3A-fragment.

15. Vertsorganisme ifølge krav 8, karakterisert ved at den tilhører slekten Saccharomyces.

16. Vertsorganisme ifølge krav 15, karakterisert ved at den tilhører familien S. cerevislae.

17. Vertsorganisme ifølge krav 16, karakterisert ved at den er S. cerevislae stamme DC5 eller 10S44C.

18. Fremgangsmåte ved fremstilling av en gjær-vertscelle transformert med en rekombinant DNA-vektor, karakterisert ved at vektoren omfatter en DNA-sekvens operativt forbundet med en ekspresjonskontrollsekvens , hvor DNA-sekvensen inneholder den kodende sekvens for circumsporozoittproteinet av Plasmodium falciparum.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved at vektoren i tillegg omfatter et replikon som er funksjonelt i gjær.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved at ekspresjonskontrollsekvensen omfatter gjær glyceraldehyd-3P-dehydrogenase (TDH3)-promoteren.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 20, karakterisert ved at ekspresjonskontrollsekvensen i tillegg omfatter den ARG3 transkripsjonsav-sluttende region.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 21, karakterisert ved at vektoren omfatter et

1215 bp Stul- Rsal-fragment av WR201 inneholdende den P. falciparum CS protein-kodende sekvens minus ca. dets første 50 bp.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 22, karakterisert ved at vektoren er pRIT12570.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 21, karakterisert ved at vektoren omfatter et 192 bp Sau3A-fragment som koder for 16 tetrapeptidgjentagelser av P. falciparum CS-proteinet avledet fra Sau3A fordøyingen av et 1215 bp Stul- Rsal-fragment av WR2001 inneholdende en P. falciparum CS-proteinkodende sekvens minus ca. dets første 50 bp eller to, tre, fire eller flere tandemkopier av et slikt 192 bp Sau3A-fragment.

25. Fremgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved at vertsorganismen til-hører slekten Saccharomyces.

26. Fremgangsmåte ifølge krav 25. karakterisert ved at vertsorganismen til-hører familien S. cerevislae.

27. Fremgangsmåte ifølge krav 26, karakterisert ved at vertsorganismen er S. cerevislae stamme DC5 eller 10S44C.

28. Fremgangsmåte ved fremstilling av circumsporozoitt-protein av Plasmodium falciparum. karakterisert ved at den omfatter å dyrke en gjærvertscelle transformert med en rekombinant DNA-vektor i passende kulturmedier og isolere et slikt protein fra et kulturlysat av en slik vertsorganisme, hvor vektoren omfatter en DNA-sekvens som er operativt forbundet med en ekspresjonskontrollsekvens hvori DNA-sekvensen inneholder den kodende sekvens for circumsporozoitt-proteinet fra Plasmodium falciparum.

29. Fremgangsmåte ifølge krav 28, karakterisert ved at vektoren i tillegg omfatter et replikon som er funksjonelt i gjær.

30. Fremgangsmåte ifølge krav 28, karakterisert ved at ekspresjonskontrollsekvensen omfatter gjærglyceraldehyd -3P-dehydrogenase (TDH3) promoteren.

31. Fremgangsmåte ifølge krav 30, karakterisert ved at ekspresjonskontrollsekvensen i tillegg omfatter den ARG3 transkripsjons-avsluttende region.

32. Fremgangsmåte ifølge krav 31, karakterisert ved at vektoren omfatter et

1215 bp Stul- Rsal -fragment av WR201 innholdende den P. falciparum CS-proteinkodende sekvens minus ca. dets første 50 bp.

33. Fremgangsmåte ifølge krav 32, karakterisert ved at vektoren erP RIT12570.

34. Fremgangsmåte ifølge krav 31, karakterisert ved at vektoren omfatter et 192 bp Sau3A fragment som koder for 16 tetrapeptidgjentagelser av P. falciparum CS-proteinet avledet fra Sau3A-fordøyingen av et 1215 bp Stul- Rsal-fragment av WR201 inneholdende den P. falciparum CS-proteinkodende sekvens minus ca. dets første 50 bp.

35. Fremgangsmåte ifølge krav 28, karakterisert ved at vertsorganismen tilhører slekten Saccharomyces.

36. Fremgangsmåte ifølge krav 35, karakterisert ved at vertsorganismen tilhører familien S. cerevislae.

37. Fremgangamåte ifølge krav 36, karakterisert ved at vertsorganismen er S. cerevislae stamme DC5 eller 10S44C.

38. Protein, karakterisert ved at det er fremstilt i henhold til fremgangsmåten ifølge krav 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 eller 33.

39. Vaksine, karakterisert ved at den omfatter en immunobeskyttende mengde av proteinet ifølge krav 38.

40. Vaksine ifølge krav 39, karakterisert ved at den omfatter l-100pg av proteinet.

41. Vaksine ifølge krav 40, karakterisert ved at den omfatter 10-200pg av proteinet.