NO871687L - Fremgangsmaate for fremstilling av l-aminosyrer ved transaminering. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av L-aminosyrer ved transaminering.

Aminosyrer har en mangfoldig anvendelsesprofil. De finner anvendelse av supplement innenfor dyreernæring, som nærings-middeladdi ti v for mennesker eller som bestanddel av infu-sjonsoppløsninger. L-fenylalanin finner en ytterligere anvendelse som syntesebyggesten for søtningsstoffet Aspartam, som består av fenylalaninmetylester og asparaginsyre.

Fremstillingen av L-aminosyrer ved biotransformasjon med transaminaser er i og for seg kjent. I den europeiske patentsøknaden 152 275 beskriver spesielt en fremgangsmåte for fremstilling av fenylalanin ved transaminering ved hjelp av en genetisk modifisert mikroorganisme som utmerker seg ved overproduksjon av aminotransferase. Transamineringsreaksjonen gjennomføres ved minst 40°C, idet mikroorganismecellene lettere gjennomtrenges ved disse høyere temperaturene.

Ifølge den euorpeiske patentsøknaden 135 846 (US 4.518.692; US 45 25 454) foregår fremstillingen av L-aminosyrene på en slik måte at cx-ketosyrer omsettes med L-asparaginsyre i nærvær av en transaminase som er isolert fra E. Coli. Fra asparaginsyren oppstår cx-aminosyren svarende til ketosyren, samt oksalacetat. Ved fjernelse av oksalacetat fra reaksjonsmediet etter dekarboksylering, forskyves reaksjonslikevekten i retning mot sluttproduktet. Oksalacetat dekarboksyleres i vandig oppløsning på grunn av sin instabilitet. Denne reaksjonen kan akselereres termisk, kjemisk eller enzymatisk.

Seleksjonen og mutasjonen av mikroorganismer fra gruppen E. coli, Paracoccus denitrificans, Torula, Rhodotorula og Streptomyces for fremstilling av L-fenylalanin fra fenyl-pyrodruesyre med et forbedret utbytte beskrives i den tyske patentsøknad nr. DE 3 423 936.

Overraskende er det nå funnet at det ved enkel gassbehandling av reaksjonsoppløsningen hvori transamineringen gjennomføres etter kort reaksjonstid kan oppnås et utbytte av den ønskede aminosyren på inntil 100%.

Oppfinnelsen vedrører følgelig en fremgangsmåte for mikrobiell fremstilling av L-aminosyrer ved transaminering av en cx-ketosyre ved hjelp av en aminogruppedonater som er kjennetegnet ved at det som aminogruppedonator anvendes asparagin, asparaginsyre, glutamin og glutaminsyre og at reaksjonsopp-løsningen gassbehandles.

I det følgende såkal oppfinnelsen beskrives nærmere og defineres også i patentkravene.

Tallrike mikroorganismer er i stand til å omvandle a-ketosyrer til L-aminosyre ved biotransformasjon. Disse mikroorganismene kan anvendes ifølge oppfinnelsen. Fortrinnsvis arbeides imidlertid med Paracoccus denitrificans DSM 65, samt med Streptomyceter isolert fra jordprøver. De beste resultatene oppnås med E. coli ATTC 11303. Det er fordelaktig, men ikke ubetinget nødvendig, at det ved seleksjon og mutasjon på i og for seg kjent måte, spesielt ved fremgangsmåten ifølge den tyske patentsøknad DE 3 423 936, for de videre arbeidene utvelges mikroorganismer mot økende mengder av den tilsvarende cx-ketosyren i dyrkningsmediene, som på grunn av sin tilpasning til ot-ketosyren gjennomfører bio-transf ormas j onen med bedre utbytter.

Ved seleksjon kan det eksempelvis legges til grunn trans-aminaseaktiviteter på 100-200 jjmol/min'1 kulturvæske. På denne måten kan det ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen transamineres en inntil 60 g/l cx-ketosyre med ca. 100$ utbytte til den tilsvarende aminosyren.

Mikroorganismene dyrkes fordelaktig i et næringsmedium som er optimalt for deres vekst under tilsvarende gunstige tempera- tur- og utluftningsbetingelser inntil en våtvekt på ca. 4 til 10 g/l næringsoppløsning. De for enhver mikroorganisme gunstige betingelsene er enten kjente for fagmannen eller kan bestemmes i enkle forforsøk. Cellene anvendes deretter for aminer ing av ketosyrene i næringsoppløsningen eller adskilt fra næringsoppløsningen. Tranamineringen kan gjennomføres med hele eller også med åpnede celler, hvorved vanlige åpnings-fremgangsmåter anvendes. For å lette arbeidet arbeides det fortrinnsvis med intakte celler. Det er videre mulig å anvende mikroorganismene i fiksert form. For fiksering kommer de vanlige fremgangsmåtene i betraktning, fordelaktig fremgangsmåtene ifølge de tyske utlegningsskriftene 32 37 341 (US 4 603 111) og 32 43 591 (US 4 542 069).

Mikroorganismene suspenderes i en for cellene fysiologisk buffer under tilsats av cx-ketosyren og aminogruppedonatoren. Avhengig av mengden av mikroorganismene kan den enzymatiske aktiviteten tilført til blandingen variere Innenfor vide områder. Hensiktsmessig ligger den mellom 10 og 20 000 pmol/min'1. Fortrinnsvis Inneholder blandingen cellemengder med en enzymaktivitet på 1500-2000 jjmol/min*l. ;Som aminogruppedonator anvendes aminosyrer, som f.eks. glycin, alanin, valin, leucin, spesielt asparagin, asparaginsyre, glutamin og glutaminsyre. Disse aminosyrene anvendes i form av deres frie syre eller egnede salter (i overens-stemmelse med det anvendte mediet). Aminogruppedonatoren anvendes i ekvimolare mengder, henholdsvis i overskudd, i forhold til cx-ketosyren. Forhold fra 1:1 til 5:1, fordelaktig 1:1 til 2:1, er funnet velegnede. ;Til sat sen av reaksj onskomponentene til reaksj onsblandingen kan foregå som oppløsning i vann eller ved tilsats av de faste stoffene samtidig. Foretrukket er imidlertid en trinnvis tilsats i mengder på 1-2$, spesielt 1,5-4,5$, beregnet på basis av vekten av reaksjonsblandingen, i løpet av et tidsrom på 1-90 timer, fortrinnsvis 2-40 timer. ;Det arbeides fordelaktig ved en pH-verdi mellom 5 og 9, spesielt mellom 7 og 8,5. Det er meget hensiktsmessig å gjennomføre transamineringen i et temperaturområde på 20-65°C. Ved lavere temperaturer forløper enzymreaksjonen stadig langsommere, mens enzymet ved høyere temperaturer i stadig større grad deaktiveres. ;Den mest gunstige fremgangsmåten avhenger av den aktuelle mikroorganismen og kan lett fastslås ved enkle forsøk. ;Det har vist seg spesielt hensiktsmessig å permeabilisere mikroorganismene før, henholdsvis under transamineringsreaksjonen. Dette kan foregå ved tilsats av egnede agenser, som toluen, cetyltrimetylammoniumbromid, dimetylsulfoksyd osv. til inkubasjonsmediet. ;Høye omsatshastigheter i løpet av kort tid oppnås overraskende når den omtalte reaksjonsblandingen, hvori biotrans-formasjonen finner sted, gassbehandles. Gassbehandlingen foregår i området fra 0,1-15 VVm, fordelaktig i området 0,2-3 VVm. Prinsipielt kan alle gasser anvendes som ikke i vesentlig grad reduserer enzymaktiviteten for mikroorganismen. Egnet er eksempelvis trykkluft, rent oksygen, nitrogen, men også forskjellige edelgasser, som helium, neon, argon eller krypton. ;På grunn av den gunstige prisen og tilgjengeligheten er trykkluft og rent nitrogen foretrukket. ;Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan prinsipielt alle a-ketosyrer amineres. Fortrinnsvis anvendes aminosyrer som bygges inn i naturlige proteiner, spesielt de som er oppført i den følgende tabellen. ; De etterfølgende eksemplene skal illustrere oppfinnelsen nærmere. Prosentangivelser angir, så fremt ikke annet er angitt, vekt-$. ;Eksempel 1;Escherichia coli ATTC 11303 ble dyrket ved konvensjonelle fremgangsmåter og mutagenisert med N-metyl-N-nitro-N-nitro-guanidin (MNG). De med MNG-behandlede cellene ble påført på en autoklavbehandlet agar med følgende sammensetning: ; pH ble innstilt på 7,2 med natronlut.;En sterilfUtrert oppløsning av fenylpyruvat ble helt i den fremdeles varme agaren, slik at det ble oppnådd en sluttkon-sentrasjon på 24 g/l fenylpyruvat. Platene ble inkubert ved 37° C i 4 dager. Kolonier med en diameter >1 mm ble isolert. 20% av de dyrkede stammene hadde en forhøyet transaminaseaktivitet sammenlignet med utgangsstammen. Transaminaseaktlvitetsbestemmelsen ble gjennomført med "Sigma Test-kit G 0390". I steden for oc-ketoglutarat ble 12 mmol/1 fenylpyruvat-natriumsalt anvendt. ;Eksempel 2;De ifølge eksempel 1 seleksjonerte mutantene av Escherichia coli ATCC 11303 ble dyrket i næringsoppløsningen fra eksempel 1 uten agar. De hadde en t ransaminaseakt ivitet på 170 jjmol/min'1 etter 20 timers dyrkning ved 37°C. Cellene ble frasentrifugert, vasket med 50 mmol/1 fosfatbuffer pH 7,4 og suspendert i 30 mmolar fosfatbuffer (pH 7,4), slik at suspensjonen inneholdt en transaminaseaktivitet på 1500 jjmol/min*l. 24 g/l Na-fenylpyruvat og 20 g/l asparaginsyre ble tilsatt til cellesuspensjonen.

Etter en inkubasjonstid på 6 timer ved 37°C inneholdt reaksj onesblandingen 21 g/l L-fenylalanin. Oppløsningen ble filtrert og ved fordampning av vannet konsentrert til 1:10. Fenylalanin ble krystallisert ved pH 5,5 og 5°C. Den kvali-tative og kvantitative bestemmelsen av aminosyren foregikk ved HPLC på en "RP 18"-søyle.

Eksempel 3

Cellematerialet oppnådd i eksempel 1 ble suspendert i 100 ml av en oppløsning av 42 g/l fenylpyruvat, 34 g/l asparaginsyre og 10 mmol/1 fosfatbuffer pH 7,4, slik at enzymaktiviteten i oppløsningen tilsvarte 1500 pmol/1'min. En halvdel av reaksj onsblandingen ble omrørt ved 37° C, mens den andre halvdelen i tillegg ble behandlet med 1 1 trykkluft pr. liter reaksjonsbuffer og minutt. Etter 4 timer inneholdt den ikke-luftbehandlede reaksjonsbeholderen 16,5 g/l fenylalanin, mens den luftbehandlede beholderen Inneholdt 26,9 g/l.

Eksempel 4

Celler av Paracoccus denitrificans DSM 65, hvis mengde tilsvarte en enzymaktivitet på 100 pmol/1'min, ble suspendert i 100 ml av en vandig oppløsning av følgende sammensetning: 90 mmol/1 asparaginsyre, 27 pmol/1 N-cetyl-N,N,N-trimetyl-ammoniumbromid, 20 mmol/1 4-hydroksyfenylpyruvat og 30 mmol/1 fosfatbuffer (pH 7,4).

Etter 20 timers inkubering ved 30°C og en gassbehandling med 0,5 VVm med nitrogen, ble det målt 18 mmol/1 L-tyrosin.

Eksempel 5

Cellematerialet som i eksempel 3 ble inkubert i 100 ml av en vandig oppløsning av 90 mmol/1 asparaginsyre, 27 jjmol/1 N-cetyl-N,N,N-trimetylammoniumbromid, 35 mmol/1 dimetylpyruvat og 30 mmol/1 fosfatbuffer (pH 7,4). Etter 20 timer ved 40° C og en gassbehandling på 1 VVm med trykkluft ble det målt 30 mmol/1 valin.

Eksempel 6

Cellematerialet som i eksempel 3 ble inkubert i 100 ml av en vandig oppløsning av 320 mmol/1 fenylpyruvat natriumsalt, 340 mmol/1 asparaginsyre, 10 jjmol/l toluen og 10 mmol/1 tris/HCl-buffer (pH 7,4). Etter 5 timer ved en gassbehandling på 0,5 VVm med oksygen, kunne det ved 37°C måles et fenylalanininnhold på 150 mmol/1 og ved 50° C et fenylalanininnhold på 270 mmol/1.

Eksempel 7

Cellematerialet som i eksempel 3 ble suspendert i 100 ml av en vandig oppløsning av 30 g/l fenylpyruvatnatriumsalt, 28 g/l asparaginsyre og 10 mmol/1 tris/HCl-buffer (pH 7,4). Suspensjonen ble inkubert ved 50° C under gassbehandling med 0,5 VVm trykkluft. Etter 2 timer kunne det måles en fenylalaninkonsentrasjon på 25 g/l. Det ble så tilsatt 30 g fast fenylpyruvatnatriumsalt og 26 g fast asparaginsyrenatrlumsalt pr. liter reaksjonsvolum. Etter ytterligere 2 timer kunne det måles en fenylalaninkonsentrasjon på 45 g/l.

Claims (7)

1. Fremgangsmåte for mikrobiell fremstilling av L-aminosyrer ved transaminering av en cx-ketosyre ved hjelp av en aminogruppedonator i vandig oppløsning, karakterisert ved at det som aminogruppedonator anvendes asparagin, asparaginsyre, glutamin og glutaminsyre og at reaksjonsopp-løsningen gassbehandles.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at reaksjonsoppløsningen gassbehandles med 0,1-15 VVm.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at reaksjonsoppløsningen gassbehandles med 0,2-3 VVm.

4. Fremgangsmåte ifølge ett eller flere av kravene 1 til 3, karakterisert ved at cx-ketosyren og aminogruppedonatoren tilsettes samtidig til reaksjonsmediet i porsjoner i løpet av et tidsrom på 1-90 timer.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at tilsatsen foregår på 2-40 timer.

6. Fremgangsmåte ifølge ett eller flere av kravene 1 til 5, karakterisert ved at aminogruppedonatoren og cx-ketosyren anvendes i forhold på 1:1 til 5:1 (mol:mol).

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at aminogruppedonatoren og cx-ketosyren anvendes i forhold på 1:1 til 2:1 (mol:mol).