NO874908L - Antimikrobielle proteiner, preparater som inneholder samme og bruk derav. - Google Patents

Description

Denne oppfinnelsen ble utført med regjeringsstøtte med legatnumrene CA 22090 og CA 43610 fra det Nasjonale Kreft-instituttet og legatnumrene AI 07012 og AI 21516 fra U.S. Public Health Service. U.S. regjerning har visse rettigheter i oppfinnelsen.

Bakgrunn for oppfinnelsen.

Innenfor denne søknaden blir flere publikasjoner referert til ved bruk av arabiske tall innenfor parenteser. Hele sitater for disse referansene kan finnes på slutten av saken rett etter kravene. Publikasjonene er i deres helhet inkorporert ved referanse inn i denne søknaden for å bedre beskrive hvordan tilstanden er innenfor dette fagområdet som denne oppfinnelsen vedrører.

Granulosytter er nøkkelkomponenter til minst to verts-forsvarssystemer mot opportunistisk mikrobiell infeksjon. I et av disse systemene, produserer polymorfonukleære leukocytter (PMN'er) reaktive oksygenintermediater som direkte eller indirekte ødelegger invaderende mikroorganismer. Det andre systemet avhenger av mekanismer som er uavhengig av respiratorisk utbrudd (1-3). Nøytrofil-avledede proteiner har lenge vært implisert som komponenter av denne respiratorisk utbrudd-uavhengige mikrodrepende vei (4-6). En gruppe med lav molekylvekt (mindre enn 4kD) humane nøytrofile antibio-tikapeptider som kalles defensiner, er blitt sekvenserte og det er blitt vist at de er lokalisert immunohistokjemisk til azurofile granuler (7). Disse peptidene demonstrerer in vitro antibakterielle, antisopp, og antivirale effekter som er veldig avhengig av mange faktorer, inkludert pH, ione-styrke, og kalsium eller magnesiumkonsentrasjon. I tillegg diskuteres hvordan disse peptidene reagerer og deres virke-lige bidrag til in vivo antimikrobiell aktivitet.

Sammendrag av oppfinnelsen.

Oppfinnelsen fremlegger en sammensetning som er nyttig som et antimikrobielt middel. Denne sammensetningen består av minst to polypeptlder selektert fra gruppen bestående av human polymorfonukleær leukocyttpolypeptider med molekylvekter på omtrent 3.500 daltons, omtrent 13,000 daltons, omtrent 18,000 daltons, omtrent 29,000 daltons, og omtrent 54,000 daltons. Sammensetningen har respiratorisk utbrudd-uavhengig, antimikrobiell aktivitet mot bakterier og sopp ved en pH fra omtrent 5.0 til omtrent 8.0 og ved kalsium-ion-konsentrasjoner opp til omtrent 10 mM, bakterielle aktivitet ved natriumklorid-konsentrasjoner opp til omtrent 0.3M, og soppdrepende aktivitet ved en natriumkloridkonsentrasjon opp til omtrent 0.15M.

Denne oppfinnelsen tilveiebringer en metode for fremstilling av en sammensetning som er nyttig som et antimikrobielt middelt. Denne metoden innbefatter i vesentlig grad separering av polymorfonukleaere leukocytter fra blod slik at man oppnår en polymorfonuklaer leukocytt-anriket preparat. Det polymorfonukleaere leukocytt-anrikede preparatet blir suspendert i en egnet buffer, hvorpå den resulterende suspensjonen blir behandlet med en egnet proteaseinhibitor, og de suspenderte blir behandlet under lyse-betingelser for å oppnå en suspensjon bestående av lyserte ■ leukocytter. Den lyserte leukocyttsuspensjonen blir behandlet med et egnet gelaterende middel og den behandlede suspensjonen blir deretter sentrifugert for å oppnå en nuklein/ubrukket cellefase og en postnukleær supernatant. Den postnukleaere supernatanten blir gjenvunnet og fraksjonert på en tetthetsgradient og fraksjonen som inneholder azurofile granuler blir samlet og suspendert i en buffer som har en pH på omtrent 7.0. Den resulterende azurofile granula-suspensjonen blir behandlet med et reagens som har en pH som er mindre enn omtrent 8.0 og som kan oppløse azurofile membranproteiner. Den behandlede suspensjonen blir separert i en fast fase og en supernatant og supernatanten blir gjenvunnet og dermed oppnås sammensetningen som kan brukes som et antimikrobielt middel.

Denne oppfinnelsen tilveiebringer også et renset polypeptid som innbefatter et polymorfonukleært leukocyttpolypeptid med en antatt molekylvekt på 24,823 daltons og med aminosyresekvens som vist i figur 20, eller et fragment avledet derfra.

Denne oppfinnelsen tilveiebringer også et annet renset polypeptid som kan benyttes som et antimikrobielt middel. Dette polypeptidet innbefatter et human polymorfonukleær-leukocyttpolypeptid med en angivelig molekylvekt på omtrent 18,000 daltons.

Det tilveiebringes også et renset polypeptid som er nyttig som et antimikrobielt middel som innbefatter et humant polymorfonukleær-leukocyttpolypeptid med en molekylvekt på omtrent 54,000 daltons. Polypeptidet har også respiratorisk utbrudds-uavhengig, antibakteriell aktivitet ved en pH fra omtrent 5,0 til omtrent 8,0, ved kalsium-ione-konsentrasjoner opp til omtrent lOmM, og ved natriumkloridkonsentrasjoner opp til omtrent 0.3M.

Det tilveiebringes også et renset polypeptid som er nyttig som et antimikrobielt middel som innbefatter et humant polymorfonukleær-leukocyttpolypeptid med en angivelig molekylvekt på omtrent 29,000 daltons, respiratorisk utbrudd-uavhengig, antimikrobiell aktivitet mot bakterier og sopp ved en pH fra omtrent 5.0 til omtrent 8.0 og ved kalsium-ion-konsentrasjoner opp til omtrent 10 mM, bakteriedrepende aktivitet ved natriumkloridkonsentrasjoner på opp til omtrent 0.3M, og soppdrepende aktivitet ved natriumkloridkonsentrasjoner opp til omtrent 0.15M.

Oppfinnelsen tilveiebringer også et renset polypeptid som er nyttig som et antimikrobielt middel. Dette polypeptidet Innbefatter et humant polymorfonukleær-leukocyttpolypeptid med en angivelig molekylvekt på omtrent 25,000 daltons. Polypeptidet har respiratorisk utbrudd-uavhengig, antimikrobiell aktivitet mot bakterier og sopp, ved en pH fra omtrent 5.0 til omtrent 8.0 og ved kalsium-ion-konsentrasjoner opp til omtrent 10 mM, bakteriedrepende aktivitet ved natriumkloridkonsentrasjoner opp til 0.3M, og soppdrepende aktivitet ved natriumkloridkonsentrasjoner opp til omtrent 0.15 M.

Kort beskrivelse av figurene.

Figur 1. Subcellulær distribusjon av bakteriedrepende aktivitet i human nøytrofIler.

(A) Distribusjon av markører for azurofile granula (myelo-peroksidase), spesifikk granula (vitamin B12-bindende

protein), og plasmamembran (alkalisk fosfat).

(B) Profil av bakteriedrepende aktivitet. Hver fraksjon ble ekstrahert med 0.05 M glysin-HCl pH 2.0, sentrifugert ved

10,000 x g i 20 minutter og supernatanten inkubert med E. coli K12, ved en proteinkonsentrasjon på 5 mikrogram/ml. Prosent av drepte bakterier etter 30 minutters inkubasjon ved 37° C er presentert her. Innskudd (C) viser mengde protein fra rensede azurofiler (©) og rensede spesifikke granula (a) som er nødvendig for å danne 5 056 reduksjon i bakteriell koloni-dannende enheter (LD50).

Figur 2. HL60 postnukleær supernatant Percoll gradient bakteriedrepende og soppdrepende aktivitetsprofiler.

( ) = turbiditet (OD450 );

Sammenhengende strek = bakteriedrepende aktivitetsprofil; Skrå-strek linjer = soppdrepende aktivitetsprofil;

Figur 3. Membran-assosiasjon av en azurofil avledet bakteriedrepende faktor (ADBF).

Isolerte azurofile granula i hvilebuffer (pH 7.3, se Materialer og Metoder), ble ødelagt ved fryse-tining/sonikering og sentrifugering. Supernatanten (GS), det pelleterte materialet

(©) og de totale granula (a) ble ekstrahert ved pH 2.0 og testet for bakteriedrepende aktivitet.

Figur 4. Effekt av pH ved ekstraksjon av en bakteriedrepende faktor fra azurofil granularaembraner.

Aliquoter av azurofile membraner ble satt til forskjellige buffersystemer (0.05 M): glysin, pH 2.0-3.0; citrat, pH 4.0-6.0; fosfat, pH 7.0. Etter inkubering ved 25 °C i 40 minutter, ble suspensjonen sentrifugert ved 10,000 x g i 20 minutter og supernatantene ble analysert for bestemmelse av proteininnhold og bakteriedrepende aktivitet. Drap-enheter (K.U.) korresponderer til de resiproke av antall mlkrogram/ml protein som er nødvendig for å drepe 105 bakterier i 30 minutter ved 37°C. I hvert tilfelle, ble den bakteriedrepende analyse utført i 0.05 M citratbuffer, pH 5.5

Figur 5. Bakteriedrepende aktivitet til azurofile granula ekstrahert ved økende bakteriekonsentrasjoner.

Granulaekstrakt ble fremstilt som beskrevet i Materialer og Metoder. 30 mikrogram/ml (®)j 3 mikrogram/ml (a), 0.3 mlkrogram/ml (El), eller 0.03 mikrogram/ml (A.) av det azurofile ekstraktet ble tilsatt til hver bakteriekonsentrasjon som ble testet.

Figur 6. Kinetikk til bakteriedrepende aktivitet til en azurofil-avledet bakteriedrepende faktor.

E. coli K12 celler (2 x IO<5>CFU/ml) ble inkubert med 1.4 mikrogram/ml (0) eller 0.7 mikrogram/ml (A) azurofile granula ekstrahert i 0.05 M citratbuffer pH 5.5 og med bare citratbuffer (H).

Figur 7. Effekt av pH på bakteriedrepende aktivitet til en azurofil-avledet bakteridrepende faktor.

E. coli K12 celler (2.5 x IO<5>CFU/ml) ble Inkubert i 30 minutter ved 37°C med 2.8 mlkrogram/ml (©) eller 0.7 mikrogram/ml (a) azurofile granula ekstrahert 1 citratbuffer pH 5 og 5.5 og natriumfosfat eller natriumfosfat-citratbuffer pH 6.0 til 8.0.

Figur 8. Effekt av pH på bakteriedrepende aktivitet til en HL60 avledet BF.

E. coli K12 celler (2 x IO<5>CFU/ml) ble inkubert i 30 minutter ved 37°C med 1.25 mikrogram/ml (©) eller 0.625 mikrogram/ml (H) HL60 rå granulaekstrakt i 50 mM citratbuffer pH 5, 5.5, og 6, og 50mM tris-HCl, pH 7 og 8.

Figur 9. Effekt av Ca<2+>ioner på bakteriedrepende aktivitet til en azurofil-avledet bakteriedrepende faktor.

E. coli K12 celler (2.5 x IO<5>CFU/ml) ble inkubert i 30 minutter ved 37°C med 2.8 mikrogram/ml azurofile granula ekstrahert i 0.05 M citratbuffer 5.5, supplementert med CaCl2som vist.

Figur 10. Effekt av Ca<2+>ioner på bakteriedrepende aktivitet til HL60 avledet BF.

E. coli K12 celler (2 x IO<5>CFU/ml) ble inkubert i 30 minutter ved 37° C med 1.25 mikrogram/ml HL60 rå granulaekstrakt i 0.5M citratbuffer pH 5.5, supplementert med CaCl2«

Figur 11. Effekt av natriumkloridkonsentrasjon på bakteriedrepende aktivitet til azurofil-avledet bakteridrepende faktor.

E. coli K12 celler (2.5 x 10<5>CFU/ml) ble inkubert i 30 minutter ved 37°C med 2.8 mikrogram/ml (©) eller 1.4 mikrogram/ml (a) azurofile granula ekstrahert i 0.05 M citratbuf fer pH 5.5, supplementert med NaCl som vist. Pilen indikerer NaCl-konsentrasjonen i plasma.

Figur 12. Soppdrepende aktivitet til ABDF ved forskjellige tidspunkter og konsentrasjoner ble målt;

(ti) = 1.6 mikrogram ADBF/ml

(a) = 3.2 mikrogram ADBF/ml

= 8 mikrogram ADBF/ml

(o) = 16 mikrogram ADBF/ml

(<q>O = kontroll

Figur 13. Revers fase høy ytelse væskekromatografi (HPLC) av

ADBF.

Revers fase HPLC ble utført som beskrevet i materialer og metoder. Kolonnen ble avlest ved 214 nm (0.5 AUFS) og 1 ml fraksjoner ble samlet. For analysen ble 100 mikroliter av hver fraksjon tørket i en "Savant Speed-Vac", resuspendert i 100 mikroliter 0.1$ eddiksyre, tørket igjen og til slutt resuspendert i 160 mikroliter 0.05 M citrat pH 5.5. Førti mikroliter E. coli K12 ble tilsått som fører til en final konsentrasjon på 2 x IO<5>CFU/ml og inkubert ved 37° C i 30 minutter. Kryss-linjede områder indikerer regioner med 100$ dreping. Panel A representerer rå ADBF: Panel B, TSK renset ADBF (50-60 kD topp); og panel C TSK renset ADBF (10-20 kD topp).

Figur 14. N-terminal sekvensanalyse av azurofil-avledete proteiner renset ved revers fase high performance liqiiid chromatography (enkel-bokstav betegnelse).

De kumulative sekvensdata er vist (fra flere analyser) som korresponderer til hver av hoved revers fase toppene vist i figur 13.

Topp 1 = defensin; Topp 4 = katepsin G;

Topp 5a = lysozym; og topp 8 = elastase.

Figur 15. ADBF størrelse eksklusjonns-kromatogram.

1 mg ADBF ble kjørt på en TSK størrelse eksklusjons-kolonne beskrevet heri.

(©) = bakteriedrepende aktivitetsprofil.

(A) = soppdrepende aktivitetsprofil

(-) = UV-profil.

Figur 16. SDS-PAGE av ADBF og fraksjoner fra TSK størrelse eksklusjons-kromatografi.

ADBF og forskjellige ADBF-fraksjoner fra kromatografen vist i figur 15 ble samlet opp og kjørt ved reduserende betingelser på en 15$ SDS polyakrylamidgel. Filene 1 og 10 = lav molekylvekts-markøer; fil 2 = fraksjon 58; fil 3 = fraksjon 41; fil 4 = fraksjon 34; fil 5 = fraksjon 33; fil 6 = fraksjon 32; fil 7 = fraksjon 31; fil 8 = fraksjon 30; og fil 9 = ADBF før størrelses-eksklusjonskromatografi.

Figur 17. SDS-PAGE av TSK - RPHPLC topp 9.

Topp 9 fra RPHPLC (fig. 13) ble applisert på en reduserende 105é SDS polyakrylamidgel.

Filene 1 og 3 = molekylvektmarkører; fil 2 = topp 9.

Figur 18. SDS-PAGE av TSK-RPHPLC topp 5b.

Fraksjoner som følger etter hverandre fra RPHPLC som korresponderer til elueringstider fra 45-65 minutter ble kjørt på en 12% SDS polyakrylamidgel.

Fil 8 inneholder topp 5b (fra fig. 13C) og fil 11 inneholder startmaterialet, som består av TSK topp fraksjon 42.

Figur 19. RPHPLC av TSK renset HL60-avledet bakteriedrepende faktor (BF). Figur 20. cDNA-protein-sekvens av 25,000 dalton/13,000 dalton ADBF polypeptlder. Figur 21. ADBF størrelses-eksklusjonskromatografi i høyt salt.

ADBF ble kjørt på TSK størrelses-eksklusjonskromatografi i 50 mM glysin pH 2, 500mM NaCl.

= bakteriedrepende aktivitetsprofil

(å) = soppdrepende aktivitetsprofil

(-) = UV280profil

Figur 22. SDS-PAGE av fraksjoner fra TSK størrelses-eksklu-sjonskromatografi i høyt salt.

Forskjellige ADBF-fraksjoner fra kromatogrammet vist i figur 21.

Filene 1 og 3 = ADBF-ekstrakt; filene 2 og 12 = molekylvekt-markøer; filene 4 og 5 = fraksjonene 34 og 35, respektivt (p54); fil 6 = fraksjon 36; filene 7,8 og 9 = fraksjonene 37,38 og 39, respektivt (p29); fil 10 = fraksjon 43 (pl4 hovedsakelig); fil 11 = fraksjon 45 (pl8 + pl4).

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen.

Denne oppfinnelsen tilveiebringer en sammensetning som kan benyttes som et antimikrobielt middel. Denne sammensetningen består av minst to polypeptlder selektert fra gruppen bestående av human polymorfonukleær-leukocyttpolypeptider med molekylvekter på omtrent 3,500 daltons, omtrent 13,000 daltons, omtrent 18,000 daltons, omtrent 29,000 daltons, og omtrent 54,000 daltons., I denne søknaden betyr "polymorfonukleær-leukocytt" polymorfonukleær leukocytt, nøytrofil, nøytrofil forløpercelle og promyelocytisk leukemicelle. Sammensetningen har respiratorisk utbrudd-uavhengig, antimikrobiell aktivitet mot bakterier og sopp ved en pH fra omtrent 5.0 til omtrent 8.0 og ved kalsium-ion-konsentrasjoner opp til omtrent 10 mM, bakteriedrepende aktivitet ved natriumkloridkonsentrasjoner opp til omtrent 0.3M, og soppdrepende aktivitet ved natriumkloridkonsentrasjoner opp til omtrent 0.15M.

I en fremstilling av oppfinnelsen, kommer humane polymorfonukleaere leukocyttpolypeptider fra HL-60 celler. I en annen fremstilling av oppfinnelsen, kommer humane polymorfonukleære leukocyttpolypeptider fra KG-1 celler. I enda en annen fremstilling av oppfinnelsen kommer humane polymorfonukleaere leukocyttpolypeptider fra azurofile granula.

I enda en annen fremstilling av oppfinnelsen er polypeptidet som har en molekylvekt på omtrent 3,500 daltons defensin.

I en annen fremstilling av oppfinnelsen består polypeptidet som har en molekylvekt på omtrent 13,000 av det 12,867 dalton polypeptidet vist i figur 20 fra amonisyre 105 til aminosyre 220. I enda en annen fremstilling av oppfinnelsen kan hvilken som helst av polypeptidene som har molekylvekter på omtrent 18,000, omtrent 29,000 og omtrent 45,000 daltons være tilstede i et azurofilt granulaekstrakt.

I enda en annen fremstilling er polypeptidet som har en molekylvekt på omtrent 29,000 elastase, katepsin G, eller et polypeptid som er det azurofile granula-ekstrak-fraksjonen som korresponderer til toppene 6 eller 7 i figur 13A. I enda en annen fremstilling av oppfinnelsen har polypeptidet med molekylvekt på omtrent 54,000 daltons følgende N-terminale aminosyresekvens Val-Asn-Pro-Gly-Val-Val-Val-Arg-Ile-Ser-Gln-Lys-Gly-Leu-Asp-Tyr-Ala-Ser-Gln-Gln-Gly-Thr-Ala-Ala-Leu-Gln-X-X-Leu-Lys-His-Ile-Lys-Ile-Pro-Asp-Tyr-Leu.

Sammensetningen av denne oppfinnelsen kan bli brukt som et konserveringsmiddel, et desinfeksjonsmiddel eller som et terapeutisk middel. Bakterier som sammensetningen har bakteriedrepende aktivitet mot inkluderer Gram-positive og Gram-negative bakterier. Eksempel på slike Gram-positive bakterier er Staphylococcus aureus, p<->hemolytisk Streptococci, f.eks., Streptococcus pneumoniae, og Listeria. Eksempler på slike Gram-negative bakterier er Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, og Salmonella typhimurium. I tillegg, sopp mot hvilket sammensetningen virker som et antimikrobielt middel inkluderer gjær. I en fremstilling av oppfinnelsen, er gjær Candida albicans.

Sammensetningen som tilveiebringes i denne oppfinnelsen opprettholder mere enn 80$ av dets oksygen-uavhengige, antimikrobielle aktivitet etter syv dager lagring ved omtrent pH 2.0 og omtrent ved 4'C.

En metode for dreping av bakterier eller sopp tilveibrInges også. Denne metoden innbefatter denne bakterien eller soppen i kontakt med en effektiv bakteriell eller soppdrepende mengde av sammensetningen som tilveiebringes i denne oppfinnelsen, vanligvis oppløst i en hensiktsmessig buffer. Eksempler på hensiktsmessige buffere er kjent innenfor fagområdet og inkluderer fosfatbuffer eller fosfatbufret saltvann ved fysiologisk pH.

Et farmasøytisk preparat som kan benyttes i behandling av bakterielle eller sopp-infeksjoner tilveiebringes i denne oppfinnelsen. Det farmasøytiske preparater innbefatter en effektiv bakteriell eller soppdrepende mengde av sammensetningen i denne oppfinnelsen og en farmasøytisk akseptabel bærer. Farmasøytisk akseptable bærere er kjent innenfor fagområdet og er fremlagt i The Pharmacopeia of the United States og the National Formulary.

Avhengig av den spesifikke bruken som betraktes, kan det farmasøytiske preparatet som tilveiebringes i oppfinnelsen bli formulert som en løsning, suspensjon, parentalt preparat, salve, krem, badevann, spray, pulver, tablett eller kapsel. Parentale preparater kan innbefatte en oppløsning slik som spesielt destillert, pyrogenfritt vann, fosfatbuffer, eller normal saltvann. Salver, kremer, badevann og sprayer kan inneholde en bærer slik som grønnsaks- eller mineralolje, hvit vaselin, eller en alkohol med høy molekylvekt, dvs., større en C12. Tabletter eller kapsler kan inneholde tilsetningsstoffer, f.eks. laktose, bindere, smøremidler, f.eks. stearinsyre, og en disintegrator, f.eks. kornstivelse.

Det tilveiebringes også en metode for behandling av et emne som har en bakteriell eller soppinfeksjon som innbefatter administrering til emnet en effektiv bakteriell eller soppdrepende mengde av det farmasøytiske preparatet i denne oppfinnelsen.

Oppfinnelsen tilveiebringer en metode for fremstilling av sammensetningen som kan benyttes som et antimikrobielt middel. Denne metoden innbefatter separering av polymorfonukleaere leukocytter fra blod for å oppnå et polymorfonukleært leukocytt-anriket preparat. Dette preparatet blir suspendert i en egnet buffer, f.eks. fosfatbuffer, hvorpå den resulterende suspensjonen blir behandlet med en egnet protease-inhibitor, f.eks. diisopropylfluorfosfat, og de suspenderte cellene blir behandlet ved lyserende betingelser for å oppnå en suspensjon av lyserte leukocytter. Den lyserte leukocyttsuspensjonen blir behandlet med et egnet gelaterende middel, f.eks. EDTA eller kalsium-gelator EGTA, og den behandlede suspensjonen blir deretter sentrifugert for å oppnå en nuklein/ødelagt cellefase og en postnukleær supernatant. Den postnukleære supernatanten blir samlet og fraksjonert på en tetthetsgradient og fraksjonen som inneholder azurofile granula blir samlet og suspendert i en buffer som har en pH på omtrent 7.0, f.eks. hvilebufferen som er beskrevet heri. Den resulterende azurofile granula-suspensjonen blir behandlet med et reagens som har en pH mindre enn omtrent 8.0 og som kan oppløse azurofile membranproteiner. Den behandlede suspensjonen blir separert i en fast fase og en supernatant og supernatanten blir gjenvunnet, og dermed oppnås sammensetningen som kan brukes som et antimikrobielt middel.

I en fremstilling av oppfinnelsen, er en egnet protease-inhibitor diisopropylfluorofosfat. I en annen fremstilling av oppfinnelsen, er blodprøven fra et menneske. I enda en annen fremstilling av oppfinnelsen, innbefatter det poly-morf onukleære leukocytt-anrikede preparatet mere enn omtrent 95% polymorfonukleære leukocytter og mindre enn omtrent 3% eosinofiler. I enda en annen fremstilling av oppfinnelsen, blir den polymorfonukleære leukocyttsuspensjonen behandlet med nitrogen-kavitasjon for å oppnå en lysert leukocytt-suspens j on.

I enda en annen fremstilling av oppfinnelsen, består tetthetsgradienten som blir brukt til å fraksjonere den postnukleære supernatanten en diskontinuerlig Percoll-tetthetsgradient. I en annen fremstilling av oppfinnelsen, blir det fraksjonerte materialet variert fra de azurofile granula før suspensjon av de samlede azurofile granula i en nøytral buffer.

I en annen fremstilling av oppfinnelsen, kan den azurofile granula-suspensjonen bli behandlet slik at de azurofile granula lyserer, hvorpå de resulterende membranfragmentene blir gjenvunnet. Disse membranfragmentene blir deretter behandlet med et ekstraherende reagens for å oppnå en ekstraherende reagens/azurof11 membransuspensjon. I en fremstilling av oppfinnelsen, har det ekstraherende reagenset en pH på mindre enn omtrent 4.0. I en annen fremstilling av denne oppfinnelsen, har det ekstraherende reagenset en pH på omtrent 2.0. I en enda en annen fremstilling av oppfinnel sen, er det ekstraherende reagenset en ikke-ionisk detergent med en pH på omtrent 7.0.

Denne oppfinnelsen tilveiebringer også et renset polypeptid som kan benyttes som et antimikrobielt middel. Dette polypeptidet består av et humant polymorfonukleaert leukocytt-polypeptid som har en antatt molekylvekt på 24,823 daltons og med aminosyresekvens som vist i figur 20, eller et fragment avledet derav. Et DNA-molekyl som koder for dette polypeptidet er også tilstede som innbefatter nukleotidsekvensen vist i figur 20.

Innenfor sammenhengen i denne oppfinnelsen, er det klart det eksisterer variasjoner i proteiner og nukleinsyrer blant forskjellige individer, f.eks. aminosyrer eller nukleotid-substitusjoner, delsjoner, insersjoner, og grad eller lokalisasjon av glykosylering, og at funksjonelle derivater som resulterer derav er inkludert innenfor rammen av denne oppf innelsen.

I en fremstilling av denne oppfinnelsen har det rensede polypeptidet en molekylvekt på omtrent 13,000 daltons. I en foretrukket fremstilling av oppfinnelsen har polypeptidet en antatt molekylvekt på 12,867 daltons. Dette polypeptidet kan bestå av aminosyresekvensen vist i figur 20 fra aminosyre 105 til aminosyre 220. Et DNA-molekyl som koder for polypeptidet finnes. I en fremstilling, har DNA-molekylet DNA-sekvensen som er vist i figur 20 fra nukleotid 369 til nukleotid 716. I en annen fremstilling av oppfinnelsen, har polypeptidet en molekylvekt på omtrent 18,000 daltons. Et DNA-molekyl som koder for dette polypeptidet er tilvelebragt.

En metode for dreping av en mikroorganisme, f.eks. en bakterie, sopp eller virus, tilveiebringes også. Denne metoden innbefatter å sette mikroorganismen i kontakt med en effektiv mikroorganismedrepende mengde av polypeptidet som har den antatte molekylvekt på 24,823 daltons, eller et fragment derav, som tilveiebringes i denne oppfinnelsen.

En vektor som inneholder DNA-molekylet som koder for polypeptidet i denne oppfinnelsen med en antatt molekylvekt på 24,823 daltons, eller et fragment derav, tilveiebringes også. I en fremstilling av oppfinnelsen innbefatter vektoren et plasmid. Et verts-vektorsystem for fremstillingav 24,823 dalton polypeptidet, eller et fragment derav, tilveiebringes som innbefatter et plasmid i denne oppfinnelsen i en egnet vert. Dette verts-vektorsystemet ble satt til å vokse ved egnede betingelser som tillater produksjonen av 24,823 dalton polypeptid i denne oppfinnelsen, eller et fragment derav, og det resulterende polypeptidet kan gjenvinnes.

En metode tilveibringes også for fremstilling av det rensede 24,823 dalton polypeptidet, eller fragment derav, som innbefatter kultivering av nøytrofile forløperceller , høsting av cellene og suspendere dem i en egnet buffer. Den resulterende nøytrofile forløper-cellesuspensjonen blir behandlet slik at man oppnår en suspensjon bestående av lyserte nøytrofleie forløperceller, og suspensjonen blir separert for å oppnå en nuklein og en ikke-ødelagt cellefase og en fast nukleær supernatant. Den postnukleære supernatanten blir gjenvunnet og behandlet med et ekstraherende reagens som har en pH mindre enn omtrent 8.0 og som har mulighet for å oppløse membranproteiner for å oppnå en ekstraherende reagensfase og en uløselig membranfase. Den ekstraherende reagensfasen blir separert fra den uløselige membranfasen slik at man oppnår en oppløselig proteinfase og en uoppløse-lig membranfase. Den oppløselige membranfasen blir gjenvunnet og renset slik at man oppnår 24,823 dalton polypeptidet i denne oppfinnelsen, eller fragment derav.

I en fremstilling av oppfinnelsen, er de nøytrofile forløper-cellene HL60 celler. I en annen fremstilling av denne oppfinnelsen, før behandling av den nøytrofile forløper- cellesuspensjonen for å oppnå en suspensjon av lyserte nøytrofiler, blir suspensjonen behandlet med en egnet proteaseinhibitor. I en annen fremstilling av oppfinnelsen, før separering av suspensjonen bestående av lyserte nøytrofi-ler, blir suspensjonen behandlet med et egnet gelaterende middel.

I en annen fremstilling av oppfinnelsen, blir den løselige proteinfasen renset ved ione-byttekromatografi. Den løselige proteinfasen kan bli renset ved størrelses-eksklusjonskroma-tografi, affinitetskromatografi eller immuno-affinitetskromatograf i.

Denne oppfinnelsen tilveiebringer et farmasøytisk preparat som innbefatter det 24,283 dalton polypeptidet, eller fragment derav, som tilveiebringes heri og en farmasøytisk akseptabel bærer. Dette farmasøytiske preparatet kan bli brukt til å behandle et emne som har en bakteriell eller sopp-infeksjon ved administrering til emnet en effektiv bakteriell eller sopp-drepende mengde av det farmasøytiske preparatet.

Denne oppfinnelsen tilveiebringer enda et annet renset polypeptid som kan brukes som et antimikrobielt middel. Dette polypeptidet innbefatter et humant polymorfonukleært leukocyttpolypeptid med en molekylvekt på omtrent 18,000 daltons. I en fremstilling av oppfinnelsen har polypeptidet respiratorisk utbrudd-uavhengig, antimikrobiell aktivitet mot bakterier og sopp ved en pH fra omtrent 5.0 til omtrent 8.0 og ved kalsium-ion-konsentrasjoner opp til omtrent 10 mM, bakteriedrepende aktivitet ved natriumkloridkonsentrasjoner opp til omtrent 0.3M, og soppdrepende aktivitet ved natriumkloridkonsentrasjoner opp til omtrent 0.15M. I en annen fremstilling av oppfinnelsen innbefatter polypeptidet følgende N-terminale aminosyresekvens X-Pro-Pro-Gln-Phe-Thr-X-Ala-Gln-X-Phe-Ala-Ile-Gln-X-Ile-X-Leu-Asn-Pro.

En metode for dreping av mikroorganismer tilveiebringes også. Denne metoden innbefatter å sette mikroorganismen i kontakt med en effektiv mikroorganismedrepende mengde av det 18,000 dalton polypeptidet i denne oppfinnelsen.

Det DNA-molekyl som koder for det 18,000 dalton polypeptidet i denne oppfinnelsen er også fremlagt. En vektor som inneholder DNA-molekylet i denne oppfinnelsen tilveiebringes også. I en fremstilling av oppfinnelsen innbefatter vektoren et plasmid. Et verts-vektorsystem for dannelse av 18,000 dalton polypeptid i denne oppfinnelsen tilveiebringes som innbefatter et plasmid i denne oppfinnelsen i en egnet vert. Dette verts-vektorsystemet kan bli satt til å vokse ved egnede betingelser som tillater fremstilling av det 18,000 dalton polypeptidet i denne oppfinnelsen, og det resulterende polypeptidet kan bli gjenvunnet.

Metode tilveiebringes også for fremstilling av det rensede 18,000 dalton polypeptidet i denne oppfinnelsen som innbefatter kultivering av de nøytrofile forløpercellene, høsting av cellene og suspendere dem i en egnet buffer. Den resulterende nøytrofile forløpercellesuspensjonen blir behandlet slik at man oppnår en suspensjon bestående av lyserte nøytrofile forløperceller, og suspensjonen blir separert slik at man oppnår en nuklein og ikke-ødelagt cellefase og en postnukleær supernatant. Den postnukleære supernatanten blir gjenvunnet og behandlet med et ekstraherende reagens som har en pH mindre enn omtrent 8.0 og har mulighet for å løse opp membranproteinene for å oppnå en ekstraherende reagensfase og en uløselig membranfase. Den ekstraherende reagensfasen blir separert fra den uløselige membranfasen slik at man oppnår en løselig proteinfase og en uløselig membranfase. Den uløse-lige proteinfasen blir gjenvunnet og renset slik at man oppnår et 18,000 dalton polypeptid.

I en fremstilling av oppfinnelsen, er de nøytrofile forløper-cellene HL60 celler. I en annen fremstilling av oppfinnelsen, før behandling av den nøytrofile forløpercellesuspensjo-nen slik at man oppnår en suspensjon bestående av lyserte nøytrofiler, blir suspensjonen behandlet med en egnet proteaseinhibitor. I en annen fremstilling av oppfinnelsen, før separering av suspensjonen bestående av lyserte nøytrofi-ler, blir suspensjonen behandlet med et egnet gelaterende middel.

I enda en annen fremstilling av oppfinnelsen, blir den løselige proteinfasen renset med ionebytte-kromatografi. Ellers, så kan den løselige proteinfasen blir renset ved størrelses-eksklusjonskromatografi, affinitetskromatografi, eller immuno-affinitetskromatografi.

Denne oppfinnelsen tilveiebringer også et farmasøytisk preparat som innbefatter det 18,000 dalton polypeptidet som tilveiebringes heri og en farmasøytisk akseptabel bærer. Dette farmasøytiske preparatet kan bli brukt til å behandle et emne som har en mikroorganisme-soppinfeksjon ved administrering til emnet en effektiv mikroorganisme-drepende mengde av det farmasøytiske preparatet.

Denne oppfinnelsen tilveiebringer et annet renset polypeptid som kan benyttes som et antimikrobielt middel som innbefatter et humant polymorfonukleært leukocyttpolypeptid med en molekylvekt på omtrent 54,000 daltons Dette polypeptidet har respiratorisk utbrudd-uavhengig, antibakteriell aktivitet ved en pH fra omtrent 5.0 til omtrent 8.0, ved kalsium-ion-konsentrasjoner opp til omtrent lOmM, og ved natriumklorid-konsentrasjoner opp til omtrent 0.3M. I en fremstilling av oppfinnelsen har polypeptidet i tillegg antisopp aktivitet ved en pH fra omtrent 5.0 til omtrent 8.0, ved kalsium-ion-konsentrasjoner opp til omtrent 10 mM, og ved natriumklorid-konsentrasjoner opp til omtrent 0.15M.

I en annen fremstilling av oppfinnelsen, har polypeptidet følgende N-terminale aminosyresekvens Val-Asn-Pro-Gly-Val-Val-Val-Arg-Ile-Ser-Gln-Lys-Gly-Leu-Asp-Tyr-Ala-Ser-Gln-Gln-Gly-Thr-Ala-Ala-Leu-Gln-X-X-Leu-Lys-His-Ile-Lys-Ile-Pro-Asp-Tyr-Leu.

En metode for dreping av bakterierer eller sopp tilveiebringes også. Denne metoden innbefatter å sette bakterien eller soppen i kontakt med en effektiv bakteriell eller sopp-drepende mengde av det 54,000 daltons polypeptidet i denne oppf innelsen.

Et DNA-molekyl som koder for det 54,000 dalton polypeptidet i denne oppfinnelsen og en vektor som inneholder DNA-molekylet tilveiebringes også. Oppfinnelsen innbefatter ogsåe n vektor som inneholder plasmidet i denne oppfinnelsen. Et verts-vektorsystem for fremstilling av det 54,000 dalton polypeptidet i denne oppfinnelsen fremlegges som innbefatter et plasmid i denne oppfinnelsen i en egnet vert. Dette verts-vektorsystem kan bli satt til å vokse ved egnede betingelser som tillater fremstilling av det 54,000 polypeptidet i denne oppfinnelsen og det resulterende polypeptidet kan bli gj envunnet.

En metode er også fremlagt for fremstilling av det rensede 54,000 polypeptidet i denne oppfinnelsen som innbefatter dyrking av nøytrofile forløperceller, høsting av cellene og suspendering i en egnet buffer. Den resulterende nøytrofile forløpercelle-suspensjonen blir behandlet slik at man oppnår en suspensjon bestående av lyserte nøytrofile forløperceller og suspensjonen blir separert slik at man oppnår en nuklein og ikke-ødelagt cellefase og en postnukleær supernatant. Den postnukleære supernatanten blir gjenvunnet og behandlet med et ekstraherende reagens som har en pH mindre enn omtrent 8.0 og har mulighet for å løse opp membranproteiner slik at man oppnår en ekstraherende reagensfase og en uløselig membranfase. Den ekstraherende reagensfasen blir separert fra den uløselige membranfasen slik at man oppnår en løselig proteinfase og en uløselig membranfase. Den løselige proteinfasen blir deretter gjenvunnet og renset slik at man oppnår en 54,000 dalton polypeptid.

I en fremstilling av oppfinnelsen, er de nøytrofile forløper-cellene HL60 celler. I en annen fremstilling av oppfinnelsen, før behandling av den nøytrofile forløpercelle-suspensjonen for å oppnå en suspensjon bestående av lyserte nøytrofiler, blir suspensjonen behandlet med en egnet proteaseinhibitor. I en annen fremstilling av oppfinnelsen, før separering av suspensjonen bestående av lyserte nøytro-filer, blir suspensjonen behandlet med et egnet gelaterende middel.

I en annen fremstilling av oppfinnelsen, blir den løselige proteinfasen renset med ione-bytte-kromatografi. Ellers så kan den løselige proteinfasen bli renset ved størrelses-eksklusjonskromatografi, affinitetskromatografi eller immuno-affinitetskromatografi.

Denne oppfinnelsen tilveiebringer også et farmasøytisk preparat som Innbefatter det 54,000 dalton polypeptidet som tilveiebringes heri og en farmasøytisk akseptabel bærer. Dette farmasøytiske preparatet kan bli brukt til å behandle et emne som har en bakteriell infeksjon ved administrering til emnet en effektiv bakteriedrepende mengde av det farma-søytiske preparatet. I en annen fremstilling av oppfinnelsen, kan det farmasøytiske preparatet bli brukt til å behandle et emne som har en bakteriell eller sopp-infeksjon ved administrering til emnet en effektiv bakterielle eller sopp-drepende mengde av det farmasøytiske preparatet.

En metode fremlegges for dreping av sopp som innbefatter å sette soppen i kontakt med en effektiv soppdrepende mengde av et humant polymorfonukleær leukocyttpolypeptid med en molekylvekt på omtrent 29,000 daltons. I en fremstilling er polypeptidet tilstede i et azurofilt granulaekstrakt. I en annen fremstilling er polypeptidet eleastase. I enda en annen fremstilling er polypeptidet katepsin G.

Det tilveiebringes videre et farmasøytisk preparat som består av et humant polymorfonukleært leukocyttpolypeptid som har en molekylvekt på omtrent 29,000 daltons og en farmasøytisk akseptabel bærer. En metode for behandling av et emne som har en bakteriell infeksjon tilveiebringes også som innbefatter administrering til emnet en effektiv bakteriell drepende mengde av det farmasøytiske preparatet. Det fremlegges videre en metode for behandling av et emne som har en sopp-infeksjon som innbefatter administrering til emnet en effektiv soppdrepende mengde av det farmasøytiske preparatet.

Et renset polypeptid som er nyttig som et antimikrobielt middel som innbefatter et humant polymorfonukleært leukocytt-polypeptid som har en molekylvekt på omtrent 25,000 daltons, respiratorisk utbrudd-uavhengig, antimikrobiell aktivitet mot bakterie og sopp ved en pH på omtrent 5.0 til omtrent 8.0 og ved kalsium-ion-konsentrasjon opp til omtrent 10 mM, bakteriedrepende aktivitet ved natriumkloridkonsentrasjoner opp til omtrent 0.3M, og soppdrepende aktivitet ved natriumkloridkonsentrasjoner opp til omtrent 0.15M.

Sammensetningene, polypeptidene og metodene i denne oppfinnelsen vil bli forstått bedre ved referanse til følgende eksperimenter og eksempler, som tilveiebringes i illustra-sjonsøyemed og kan ikke bli konstruert på noen som helst slags måte som begrenser rammen av oppfinnelsen, som er definert ved fremlagte krav.

Materialer og metoder.

Isolering av nøytrofiler.

Blod fra friske givere ble antikoagulert med 25 mM natrium-citrat og blandet med et likt volum 6% dekstran i 0.9% NaCl for å forsterke sedimentasjon av erytrocyttene. Etter 60 minutter ved romtemperatur, ble den leukocytt-rike supernatanten samlet og sentrifugert ved 200 x g i 10 minutter. Celle-bunnfallene ble resuspendert i 0.9% NaCl og PMN'ene ble separert fra mononukleære celler ved sentrifugering gjennom FIcoll-Hypaque. Kontaminerende erytrocytter ble fjernet ved to påfølgende cykler av hypotonisk lyse som beskrevet (8, 9). Mere enn 98% av cellene var PMN'er, hvorpå mere enn 95% var nøytrofiler og mindre enn 3% var eosinofiler. Dette preparatet ble referert til som nøytrofiler. En blodenhet ga 109 nøytrofiler.

Subcellulær fraksjonering av nøytrofiler.

Isolerte nøytrofiler i fosfat-buffret saltvann (2 x IO<7>celler/ml) ble behandlet med 5 mM diisopropylfluorofosfat (DFP) i 15 minutter ved 4°C. De DFP-behandlede cellene ble sentrifugert ved 130 x g i 10 minutter ved 4<0>C, og det resulterende bunnfallet ble resuspendert i iskald buffer inneholdende 100 mM KC1 , 3 mM NaCl, 1 mM ATP(Na)2, 3.5 mM MgCl2, og 10 mM Piper, pH 7.3 (hvilebuffer). Cellesuspen-sjonen ble ødelagt ved nitrogenkavitasjon i 20 minutter ved 350 psi i en bombe (Parr Instrument Company, Moline, IL) ved 4°C og kavitatet ble samlet inn i Ca<2+>ion-gelator EGTA, pH 7.4, ved en final konsentrasjon på 1.5 mM. Nuklein og ikke-ødelagte celler ble pelletert (P^) ved sentrifugering ved 500 x g i 10 minutter ved 4°C. Den postnukleære supernatanten (S-jJ ble sentrifugert i 15 minutter ved 20,000 rpm (Ss 34 rotor) på en diskontinuerlig Percoll tetthetsgradient, som beskrevet (8). Fraksjoner på omtrent 1 ml ble samlet ved 4°C og analysert for spesifikke azurofile granula markører (p-glukuronidase og myeloperoksidase), spesifikke granula (vitamin B12-binding protein) og plasma-membran (alkalisk fosfatase) som beskrevet nedenfor. Percoll ble fjernet fra de sammenslåtte fraksjonene ved sentrifugering ved 35,000 rpm (180,000 x g) i 2 timer i en SW41 rotor. Laget som ble sedimentert ovenfor det pakkede Percoll ble resuspendert i hvilebuffer og lagret i aliquoter ved -70"C.

Analyser for spesifikke markører i subcellulære fraksjoner. For å forsikre seg om fullstendig oppløsning, ble aliquoter bestående av azurofile granula i hvilebuffer fortynnet 1:5 i Triton X-100 (0.05% w/v final konsentrasjon) før enzym eller proteinanalyser. Alkalisk fosfatase ble analysert med 1 mg/ml p-nitrofenylfosfat som substrat i en 0.3 mM MgClg, 50 mM natriumbarbitalbuffer, pH 10.5. 50 mikroliter prøver fortynnet i Triton X-100 ble analysert. Prøver ble inkubert i 80 minutter ved 37° C i en analyseblanding (1 ml volum) og reaksjonen ble avsluttet ved tilsetting av 100 mikroliter IN NaOH. Absorbansen ved 410 nm ble med en gang avlest. Enzymaktivitet ble beregnet som beskrevet (10).

p<->glukuronidase ble analysert ved frigjøring av fenolftalein fra 1 mM fenolftalein p-monoglukuronsyre i 100 mM natriumace-tat-buffer, pH 4.4, ved 37°C i 3 timer. 25 mikroliter prøver fortynnet i Triton-X-100 ble analysert i 550 mikroliter av analyseblandingen. Reaksjonen ble avsluttet ved tilsetting av 200 mikroliter 1 M glysin, 1 M NaCl, 1 M NaOH og absorbansen avlest ved 500 nm. Enzymaktiviteten ble beregnet som beskrevet (8).

Vitamin B12-bindende protein ble målt på 25-, 50- og 100 mikroliter prøver fortynnet i Triton X-100 slik som det er blitt beskrevet før (11).<57>Co-Vitamin B12 ble fremstilt ved blanding av 5 ng/ml vitamin B12 (Sigma) med 0.025 mikro-curies/ml ^<7>Co-cyanokobalamin (Amersham, sp. act. IO<5>cpm/ng). 750 mikroliter saltløsning ble blandet med 350 mikroliter<57>Co-vitamin B12 og med prøven i et finalt volum på 100 mikroliter. 0.5 ml albumin-dekket trekull ble deretter tilsatt og reagensrørene ble sentrifugert i 2 minutter ved 10,000 x g ved romtemperatur. 1 ml av supernatanten ble samlet og tellet i en Packard auto-gamma scintillasjonsteller (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL) for bestemmelsen av mengden bundet ^<7>Co-B12 i hver prøve. Protein ble bestemt som beskrevet i (12) ved bruk av bovin serumalbumin som standard. For å forhindre Triton X-100 interferens med analysen, ble 0.1 % natriumdodecylsulfat tilsatt til den alkaliske kobberløsningen (13). Percoll i konsentrasjoner som var tilstede i fraksjonene påvirket ikke analysen.

For å analysere myeloperoksidase, ble 200 mikroliter av hver av fraksjonene fortynnet 5-ganer i hvilebuffer inneholdende 0.2% Triton X-100, og applisert inn i prøveavdelingen til et Perkin-Elmer 557 dobbeltrådet spektrofometer (Coleman Instruments Divison, Oak Brook, IL). Absorpsjonsspektra, fra 400 til 600 nm, av oksyderte fraksjoner mot fraksjoner redusert med dithionit ble deretter målt (E472nm = 75 mM-<1>) (14).

Fremstilling av en azurofil-avledet bakteriedrepende faktor

(ADBF).

Fraksjoner fra Percoll-gradientene som korresponderer til de azurofile granula ble slått sammen og Percoll ble fjernet ved sentrifugering som beskrevet (8).! Azurofil granula-preparatet ble resuspendert i hvilebuffer og lagret enten på is ved 4°C eller ved -70°C. Azurofil granula lagret på is ved 4°C så ut til å være intakte, da ikke noen p-glukuronidase eller myeloperoksidase-frigjøring fra granula ble detektert i løpet av 2 uker. Frysing av azurofile granula ved -70°C resulterte i frigjøring (<20%) av p<->glukuronidase men ikke av myelo-peroksidase. De isolerte azurofile granula ble ekstrahert med 0.05 M glysin-HCl buffer pH 2.0 i 40 minutter ved 25°C. Syre-ekstraktert ble sentrifugert ved 10,000 x g i 20 minutter og supernatanten brukt som ADBF-kilde. Supernatanten ble enten fortynnet i eller dialysert mot inkubasjonsmediet før de bakteriedrepende analysene. Til dialyse av ADBF-ekstraktene, ble et membranrør med 1,000 MR av-kutt (Spectra-/Por, Spectrum Medical, Los Angeles, CA) brukt. Fraksjoner fra Percoll tetthetsgradientene ble ekstrahert ved bruk av de samme prosedyrene; og Percoll hadde ingen effekt på ekstra-sjonen eller aktiviteten av den bakteridrepende faktoren.

Bakteriedrepende analyser.

Bakteriedrepende aktivitet ble testet mot E. coli K12 (MC 4100) i rutineanalyser og, ble indikert mot Salmonella typhimurium LT2, Pseudomonas aeruginosa PAC og PAO, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, og Streptococcus pneumoniae type III, type II og en ikke-kapslet variant av S. pneumoniae type II stamme. Tryptikase soyakraft og tryptikase soya-agarplater ble brukt til å dyrke opp de fleste bakteriene. Når det gjelder S. pneumoniae, ble Cy-medium og 5% defibrinert saueblod agarplater brukt (15).

Organismer fra en enkelt koloni på agarplater ble inokulert inn i væskemedium og dyrket over natt ved 37°C. Aliquoter av over-natt kulturen ble inokulert inn i friskt næringsmedium og latt vokse til mid-eksponensiell fase. Bakterielle kulturer ble deretter fortynnet inn i tett-mediet i den hensiktsmessige konsentrasjon. De fleste eksperimentene ble utført 1 0.05 M citratbuffer, pH 5.5. Kontrolleksperimenter viste at denne bufferen ikke haddé noen effekt på levedyktig-heten av noen av bakteriene som ble testet untatt P. aeruginosa og S. pneumoniae type II, hvorpå 0.05 M fosfatbuffer, pH 6.0 ble brukt. Andre buffere, slik som acetat, fosfat eller citrat-fosfat ved en konsentrasjon på 0.01 M eller 0.05M ble brukt i noen bakteriedrepende analyser, som spesifisert nedenfor.

Bakterier (4 x 10^ koloni-dannende enheter i et finalt volum på 200 mikroliter) ble inkubert i 30 minutter ved 37° C med forskjellige mengder azurofile granula ekstrakt (ADBF) eller HL60 avledet ekstrakt (BF) fortynnet i inkubasjonsmedium. Prøver ble deretter fortynnet 1:100 i M63 minimalmedium (16), og sådd på agarplater. Kolonidannende enheter (CFU) ble telt etter inkubasjon ved 37°C i 16 timer. Bakteridrepende aktivitet ble uttrykt i prosent av bakterier som ble drept etter utsetting for ADBF eller BF sammenlignet med kontroll. Alternativt, blir 1 drepings-aktivitet-enhet (K.U.) definert som det resiproke av fortynningen av ADBF eller BF preparatet som dreper IO<5>bakterier/ml i 30 minutter ved 37°C (LD50).

Soppdrepende analyser.

Soppdrepende aktivitet ble testet mot Candida albicans (klinisk isolat fra Columbia Presbyterian Hospital) i rutinemessige analyser. Sabauraud-medium og Sabauraud-agarplater (Difco) ble brukt til å dyrke sopp.

Organismer fra en enkel koloni på agarplater ble inokulert inn i væskemedium og dyrket over natt ved 37°C. Aliquoter av over-natt-kulturen ble inokulert inn i friskt næringsmedium og latt vokse til midt-eksponensiell fase. Soppkulturer ble deretter fortynnet inn i test-mediet til en hensiktsmessig konsentrasjon. Eksperimentene ble utført i lOmM fosfat-buf f er, pH 5.5. C. albicans (10^ koloni-dannende enheter/ml) ble inkubert i 60 minutter ved 37°C med forskjellige mengder av azurofil granulaekstrakt (ADBF) eller HL60 avledet ekstrakt (BF) fortynnet i inkubasjonsmediet. Prøver ble deretter fortynnet 1:100 i M63 minimalmedium (16), og sådd på agarplater. Kolonidannende enheter (CFU) ble telt etter inkubering ved 37°C i 30 timer.

Soppdrepende aktivitet ble uttrykt som prosent sopp som ble drept etter utsetting for ADBF eller BF sammenlignet til kontroll. Alternativt, er 1 drepingsaktivitet-enhet (K.U.) definert som resiproke av fortynningen til ADBF eller BF preparatet nødvendig for å drepe IO<5>sopp i 60 minutter ved 37°C (LD50).

Isolering av azurofile granula-membraner.

Isolerte azurofile granula i hvilebuffer (pH 7.3) fra nøytrofile celler ble ødelagt etter syv cykler av frysing I et aceton-tørr isbad og tining ved 37"C, etterfulgt hver gang av nedsenkning i 10 sekunder i et sonikerende vannbad (Bransen B3, Heat Systems-Ultrasonic Inc. Plainview, NY). Et bunnfall ble deretter oppnådd ved sentrifugering av de lyserte granula ved 10,000 x g i 60 minutter eller ved 135,000 x g i 6 minutter ved 4°C. Dette pelleterte materialet ble referert til som azurofile granula-membraner. Isolerte granula-membraner og løselige granula ble analysert for ADBF-aktivitet etter inkubasjon med 0.05 M glysin pH 2.0 som tidligere beskrevet.

Karakterisering av ADBF ved størrelses-eksklusjonskromato-graf i.

Omtrent 1 mg ADBF membranekstrakt ble applisert på en Bio-Sil TSK-125 størrelses-eksklusjonskolonne ekvilibrert i enten 50 mM glysin /o.lM NaCl, pH 2.0 eller 50mM glysin/o.5 M NaCl pH 2. ADBF bakteriedrepende og soppdrepende profiler og en O.D. 280 profil ble dannet fra de eluerte fraksjoner. Natrium-dodecyl-sulfat-polyakrylamid gel-elektroforese (SDS-PAGE 15%) ble utført på ADBF-membranekstraktet og på selekterte fraksjoner fra størrelses-eksklusjonskolonne.

Karakterisering av ADBF ved revers fase High Performance Liquid Chromatography (HPLC).

Trifluoreddiksyre (TFA) ble satt til ADBF eller TSK renset ADBF til 0.1% og prøvene ble applisert på en Vydac vidporet C4(250 x 4 mm) revers fase kolonne og kjørt på en 92 minutter gradient, etterfulgt av 3 minutter ved 100% og deretter en vask på 2 minutter. Løsning A var 0.1% vandig TFA, løsning B var 0.1% TFA i HPLC sort acetonitril. Gradienten ble laget som følger:

Utstyret som ble benyttet var en Beckman revers-fase HPLC system bestående av en Vydac vldporet C4(250 x 4 mm) reversfase-kolonne, to 110B pumper, en 421A kontrollenhet, en 210A injektor, en 2 ml prøvesløyfe, en 163 variabel bølge-lengde-detektor, en 2112 Redirac-fraksjonssamler, og en Kipp og Zonen BD 41 kart-apparat. Detektorsettingen var 214 nm, 0-0.5 absorbanseenheter full skala (AUFS) og toppfraksjoner ble samlet manuelt.

Sekvensanalyser av polypeptlder avledet fra ADBF.

RPHPLC renset ADBF og TSK/RPHPLC renset ADBF ble konsentrert til 50 mikroliter på et "Speed Vac" og applisert på en Applied Biosystems 477A" puls-væskefase-sekvenator. Fenyl-thiohydantoin (PTH) analyser ble utført fortløpende ved bruk av en "Applied Biosystems Model 120A" PTH-analysator.

Aminosyreanalyser av polypeptlder avledet fra ADBF. PTC-aminosyreanalyser av polypeptlder ble oppnådd ved 1 time hydrolyse med 6.0 N HC1 ved 150° C ved bruk av "Waters Picotag" system utstyrt med et Beckman HPLC system.

Dyrking av HL60 celler.

HL60 celler (39, 40 ) ble satt til å vokse i suspensjonskul-turer som inneholdt basalmedium (serumfritt) supplementert med insulin og transferring. Cellene med en tetthet på 2 x 10^ celler/ml ble høstet ved sentrifugering. Celle-bunnfallet ble resuspendert til lxlO<8>celler/ml for videre fraksjonering.

Subcellulær fraksjonering av HL60 celler.

HL60-celler i fosfatbufret saltvann (2xl07celler/ml) ble behandlet med 5 mM DFP i 15 minutter ved 4°C. DFP-behandlede celler ble sentrifugert ved 130 x g i 10 minutter ved 4°C, og det resulterende bunnfallet ble resuspendert i is-kaldt hvilebuffer inneholdende 100 mM KC1, 3 mM NaCl, 1 mM ATP (Na)2, 3.5 mM MgCl2, og 10 mM pipe, pH 7.3. Cellesuspensjo-nen ble ødelagt ved nitrogenkavitasjon i 20 minutter ved 350 psi i en bombe ved 4°C og kavitatet ble samlet i Ca<2+->ion-gelator EGTA, pH 7.4, ved en final konsentrasjon på 1.5 mM. Nuklein og ikke-ødelagte celler ble pelletert (P^) ved sentrifugering ved 500 x g i 10 minutter ved 4°C. Den postnukleære supernatanten (S^) ble sentrifugert i 30 minutter ved 10,000xg for å felle granula. Dette rå-granula-preparatet ble resuspendert i hvilebuffer og lagret i aliquoter ved -70°C. Alternativt, ble den postnukleære supernatanten (S^) sentrifugert i 15 minutter ved 20,000 rpm (SS 34 rotor) på en diskontinuerlig Percoll tetthetsgradient, som beskrevet (8). Fraksjoner på omtrent 1 ml ble samlet ved 4°C og analysert for spesifikke markører av azurofile granula (P-glukuronidase og myelo-peroksidase), spesifikke granula (vitamin B12-bindingsprotein) og plasmamembran (alkalisk fosfatase) som beskrevet ovenfor. Percoll ble fjernet fra samlede fraksjoner ved sentrifugering ved 35,000 rpm (180,000 x g) i 2 timer i en SW41 roter. Laget som sedimenterte over det pakkede Percoll ble resuspendert i hvilebuffer og lagret i aliquoter ved -70°C.

Fremstilling av en HL60 avledet bakteriedrepende faktor (BF). Fraksjoner fra enten Percoll-gradientene som korresponderer til myeloperoksidase-aktivitet eller det rå granula-preparatet fra HL60-celler ble resuspendert i buffer og lagret enten på is ved 4°C eller ved -70° C. Det rå granula-preparatet eller de isolerte granula ble ekstrahert med 0.05 M glysin-HC1 buffer pH 2.0 i 40 minutter ved 25° C. Syre-ekstraktet ble sentrifugert ved 10,000 x g i 20 minutter og supernatanten ble enten fortynnet eller dialysert mot inkubasjonsmediet før de bakteriedrepende analysene. For dialyse av BF-ekstraktene, ble et membranrør med 1000 Mr av-kutt (Spectra/- For, Spectrum Medical, Los Angeles, CA) brukt.

Fremstilling og screening for HL60 cDNA bibliotek.

Humane HL60-celler (ATCC CCL 240) ble latt vokse som spesifisert til 1 x IO<6>celler/ml i DMEM inneholdende 5% føtalt kalveserum. For det induserte biblioteket, ble cellene behandlet med 1% DMSO i 40 timer før høsting. Cellene ble høstet ved 4°C og vasket to ganger med fosfat-bufret saltvann (PBS). Cellepelleten ble gjenvunnet, homogenisert i buffer inneholdende 20 mM vanadyl-kompleks (Bethesda Research Laboratories) og 0. 2% Nonidet P-40, og sentrifugert i 10 minutter ved 14,000 rpm i en Beckman JS-13 rotor. RNA ble fremstilt fra supernatanten ved bruk av fenol-kloroform ekstraksjon og totalt RNA som ble oppnådd ble utsatt for oligo-dT affinitetskromatograf for å få mRNA.

Det totale mRNA-preparatet fra de induserte og ikke-induserte cellene ble brukt som et templat for å fremstille cDNA bibliotek i XgtlO, som beskrevet i (41), men en annen-tråd syntesen ble utført ifølge metoden beskrevet i (42). Det resulterende cDNA ble ligert med et syntetisk oligonukleotid (CCGGAATTCCGG, Bethesda Research Laboratories) og deretter kuttet med EcoRl. cDNA'et ble størrelse-fraksjonert og renset ved bruk av polyakrylamidgeler og satt inn i EcoRl setet til XgtlO. Flere millioner fag ble oppnådd både fra indusert og ikke-indusert RNA. Triplikate filterdeler ble fremstilt og fagene ble screenet ved moderat stringens (6 x SSC, 35°C) med en 5'-ende merket blanding av en samling 14mer bestående av 16 oligonukleotider fremstilt ved bruk av det reverse komplementet til sekvensen som koder for aminosyrene 31-35 i topp 5b. (Se figur 14).

Resultater

Subcellulær distribusjon av bakteridrepende faktor.

For å bestemme den subcellulære beliggenheten av ADBF i nøytrofiler, ble nøytrofilene fraksjonert ved bruk av metoden beskrevet (8). Nøytrofilene ble behandlet med 5 mM diisopropylfluorofosfat (DFP) før fraksjoneringen da DFP, en potent serinprotease-inhibitor, Inhiberer effekt proteolyse i PMN-ekstrakter (17, 18). IO<9>DFP-behandlede celler ble ødelagt ved nitrogenkavitasjon, og den postnukleære supernatanten ble sentrifugert på en diskontinuerlig Percoll tetthetsgradient. Hver fraksjon i gradienten ble analysert for spesifikke markører av azurofile granula (myeloperoksidase), spesifikke granula (vitamin B12-bindende protein) og plasmamembran (alkalisk fosfatase). Som det er vist i figur 1, resulterer metoden i effektiv separasjon av disse tre komponentene. Azurofile granula viste ingen forurensning av markører av spesifikke granula eller plasmamembraner. Spesifikke granula var ikke forurenset av plasmamembraner, men var svakt forurenset av azurofile granula, som indikert ved tilstedeværelse av 10% myeloperoksidase i denne toppen.

Bakteriedrepende aktivitet, oppnås ved ekstraksjon av cellulære fraksjoner ved pH 2.0, og blir distribuert som vist i Tabell I.

Hoveddelen av aktiviteten i kavitatet var tilstede i den postnukleære supernatanten (S^). 6% av aktiviteten var assosiert med den nukleære fraksjonen, som kanskje skyldes adhereringen av noen granula til kjerne. Beliggenheten av den bakteridrepende faktoren i granula-fraksjonen ble videre indikert ved en spesifikk aktivitet som var to ganger høyere enn til ufraksjonert kavitat. Som vist i figur 1, var mer enn 90% av den bakteriedrepende faktor tilstede i den azurofile granulafraksjonen. Det lave aktivitetsnivået i den spesifikke granulafraksjonen kan skyldes at den var forurenset med 10% av azurofile granula, som bestemt ved myeloperoksidase-analysen (se figur 1). Omtrent 10 ganger mere protein fra den spesifikke fraksjonen var nødvendig for å drepe 50% av bakteriene enn fra den azurofile granulafraksjonen (innskudd, figur 1).

For bestemmelse av den subcellulære beliggenheten av BF i HL60-celler, ble DFP-behandlede HL60-celler fraksjonert som beskrevet for DFP behandlede nøytrofiler. Hver fraksjon til Percoll-gradienten ble analysert for bakteriedrepende og soppdrepende aktivitet. Som det er vist i figur 2, er granulaprofilen fra HL60-celler forskjellige fra granulaprofilen til nøytrofiler, som muligens skyldes at HL60-celler er udifferensierte nøytrofile forløperceller. Bakteriedrepende og soppdrepende aktiviteter var størst i fraksjonene 20-22. Disse fraksjonene korresponderer også til de høyeste konsen-trasjonene av myeloperoksidase-aktivitet.

Membran-assosiasjon av bakteriedrepende faktorer.

For bestemmelse av beliggenheten av ADBF i nøytrofile azurofile granula, ble intakte rensede granula lysert ved nøytral pH ved gjentatt frysing-tining og sonikering. Sprengte granula ble sentrifugert og det løselige granulainn-holdet ble separert fra pelleterte granulamembraner. Ved disse betingelser, ble mer enn 90% av p-glukuronidase og myeloperoksidase funnet i supernatantfraksjonen (data ikke vist). I kontrast til dette var 98% ADBF assosiert med azurofile membraner, som vist i figur 3. Undersøkelser av rå granulaekstrakter fra HL60-celler har også indikert membran-assosiasjon av BF (data ikke vist).

Det ble også undersøkt hvilke muligheter en mengde midler har til å frigjøre ADBF fra azurofile membraner. ADBF-aktivitet ble analysert i supernatanten og pelleten etter sentrifugering av azurofile membraner ble behandlet med buffere som hadde forskjellige pH'er. Figur 4 viser at mindre enn 10% ADBF-aktivitet ble frigjort fra membranet ved pH 5.0-7.0, 50% ved pH 4.0 og 100% ved pH 2.0-3.0. Ekstraksjon av den bakteriedrepende faktor fra hele azurofile granula fulgte den samme pH-kurven (data ikke vist). Deretter ble andre midler som vanligvis blir brukt til å løse opp perifere og integrerte membranproteiner analysert (se tabell II nedenfor). 50 mikroliter azurofile membraner (0.5 mikrogram protein/- mikrollter) ble Inkubert ved 25°C i 40 minutter i 200 mikroliter av de ovenfor nevnte forskjellige midlene. Etter sentrifugering ved 10,000 x g i 20 minutter (4°C), ble supernatantene samlet, dialysert mot 0.05 M citrat pH 5.5 og testet for protein og bakteridrepende aktivitet. Pelletene ble vasket 3 ganger med is-kald 0.05 M fosfat pH 7.0, inkubert ved 25° C i 40 minutter med 0.05 M glysin pH 2.0, sentrifugert og supernatanten analysert for protein og drepings-aktivitet. Når det gjelder Triton X-114 behandling av azurofile membraner, ble fremgangsmåten i (19) fulgt.

Som vist i Tabell II, etter behandling av de azurofile membraner med 1% Triton X-100 til en like effektiv frigjøring av ADBF-aktivitet som syre. I kontrast, hverken 6 M urea eller 0.1 M natrlumbikarbonat pH 11 frigjorde den bakteriedrepende faktoren fra granulamembranen.

Triton X-114 er blitt brukt på isolerte membraner elelr hele celler for å separere integrerte membranproteiner fra hydrofile proteiner; hydrofile proteiner blir gjenvunnet i den vandige fasen, mens ampifile integrerte membranproteiner finnes i detergentfasen etter faseseparasjon av denne detergenten ved 20°C og høyrere (19,20). Når azurofile membraner ble ekstrahert med Triton X-114, ble 87% av ADBF-aktiviteten funnet innenfor detergentfasen.

ADBF-aktivitet in vitro avhenger av frigjøring fra den azurofile membranen.

Azurofile membraner ble behandlet ved pH 2.0, som løser ADBF, eller ved pH 5.5, som representerer introlysosomal pH (21-23), men frigjør ikke ADBF fra membranen (se figur 4). Bakteriedrepende aktivitet ble deretter analysert ved pH 5.5 i hele membraner, og i supernatant og pelletfraksjonene som var oppnådd etter sentrifugering av membranene som var behandlet ved begge pH'er. ADBF fra membranene behandlet ved pH 5.5 (membran-bundet ADBF: 1 K.U.) var 10 ganger mindre aktiv enn ADBF fra membraner behandlet ved pH 2.0 (løselig ADBF: 11.6 K.U.). Bakteriedrepende aktivitet kunnen nesten helt bli gjenvunnet fra membranene behandlet ved pH 5.5 ved reekstraksjon ved pH 2.0 (se tabell II ovenfor).

Effekt av dose, tid, bakterie-vekststatus, og buffer.

ADBF-aktivitet var lineær med hensyn til proteinkonsentrasjon over området fra 0.3 til 30 mikrogram/ml (figur 1 og andre data ikke vist). Effekt av bakteriekonsentrasjon er vist i figur 5: opp til IO<7>bakterier/ml kunne bli drept av 30 mikrogram/ml ADBF-inneholdende ekstrakt i 30 minutter ved 37" C. Drepingen skjedde raskt: 50% av cellene var drept i løpet av 5 minutter ved 37° C av det azurofile granula-ekstraktet inneholdende 1.4 mikrogram protein/ml (figur 6). Den fysiologiske tilstanden til bakteriene som ble inkubert i testmediet påvirket ikke deres mottagelighet for ADBF. Men bakterier i eksponensiell vekst eller i stasjonær fase var like sensitive. Tilsetting av glukose (20 mM) til inkubasjonsmediet affekterte ikke ADBF-aktivitet. Drepings-aktiviteten til ADBF var omtrent den samme når citrat, acetat eller fosfatsalter ble brukt som buffer (data ikke vist).

Effekt av pH og divalente kationer.

Siden det er blitt vist at fagosomer raskt når å opprettholde en pH-verdi på 5.5 i løpet av intracellulær dreping av bakterier in vivo (21-23), ble pH-effekten på bakteriedrepende aktivitet til ADBF og BF in vitro undersøkt. ADBF og BF var effektiv for et bredt pH-området (5.0 til 8.0) (figurer 7 og 8, respektivt). Media med høyere surhet enn pH 5.0, som er bakteriedrepende per se, kunne ikke bli brukt for teste ADBF-dreping.

Da ioner slik som Mg<2+>og Ca2+ spiller en kritisk rolle i fagocyttiske prosesser (24) og! også påvirker overflate-egenskapene til Gram-negative bakterier (25), ble også effekten av disse ionene på ADBF og BF bakteriedrepende effekt undersøkt. MG<2+>ioner motvirket men blokkerte ikke ADBF-aktiviteten fullstendig. Effekten av MG<2+>ionene var maksimal ved 1 mM, med en 25% reduksjon i bakteriedrepende aktivitet (data ikke vist). Ca<2+>derimot, inhiberte all ADBF og BF aktivitet ved en konsentrasjon på 25 mM og 20 mM (figurer 9 og 10 respektivt). Nedgang i bakteriedrepende aktivitet var omtrent lineær med hensyn på kalsium-konsentrasjonen innenfor konsentrasjonsområdet 1 til 25 mM. Siden mediet som ble brukt i disse testene inneholder citrat, som gelaterer divalente kationer, er konsentrasjonen av frie kationer i løsningen lavere enn den nominerte konsentrasjonen. Men citrat binder ikke signifikante mengder av magnesium og kalsium ved lav pH (26). Tilsetting av EDTA (1- 25 mM) til inkubasjonsmediet (for å gelatere kationer) påvirket ikke ADBF eller BF-aktivitet (data ikke vist). Natriumklorid inhiberte ved en konsentrasjon på 0.3 M eller høyere (figur 11). Fysiologiske konsentrasjoner av natriumklorid eller kalsiumklorid inhiberte ikke ADBF-aktiviteten når den siste ble festet til en konsentrasjon på 2.8 mikrogram/ml eller høyere.

Bakterielt spektrum av ADBF-dreping.

ADBF dreper både Gram-positive og Gram-negative bakterier (se tabell III nedenfor).

<a>ADBF-aktivitet er beregnet ifølge mikrogram/ml protein i azurofil ekstrakt som er nødvendig for drepe 10^ bakterier 1 30 minutter ved 37°C; + , 0.1 til 0.3 mikrogram/ml; (+), 1 til 2.5 mikrogram/ml; -, 20 mikrogram/ml.

^Kliniske isolater fra to pasienter med toksisk sjokksyndrom.

De Gram-positive bakteriene mottagelige for ADBF-dreping innbefattet forskjellige stammer av Staphylococcus aureus (to isolater fra pasienter med toksisk sjokksyndrom, p<->hemolyt-tisk streptococci (untatt den kapseldekkede streptokokk-type III) og i noen grad Llsteria monocytogenes. Alle Gram-negative bakterier som ble testet ble drept like effektivt som E. coli.

Soppdrepende aktivitet til ADBF.

Figur 12 viser at ADBF har soppdrepende aktivitet innenfor området på 3.0 mikrogram/ml til omtrent 16.0 77mikrogram/ml.

Rensing av ADBF.

Reversfase high performance liquid chromatography (RPHPLC) av ADBF-ekstraktet resulterte i en reproduserbar profil som inneholder minst 9 karakteristiske topper, hvor noen fremkom som dubletter (se figur 13A). Når en del av hver fraksjon ble tørket for å fjerne revers-fase løsningsmidlene og deretter resuspendert og analysert, ble to aktivitetstopper identifisert som vist ved de kryss-1injete områdene på figur 13A. Den første aktivitetstoppen overlapper to hoved UV-topper, betegnet topp 5 og topp 6) den andre aktivitetstoppen er assosiert med en enkelt UV-topp, betegnet topp 9. Aminosyresekvensen til topp 5 viste to proteiner, en med sekvensidentitet til lysozym (5a) og en annen (5b) med N-terminal sekvens vist i figur 14. Topp 6 inneholdt en enkelt ny sekvens med homolog! til trypsin superfamilien (se figur 14). Topp 9 Inneholdt minst 2 proteiner, d.v.s. 9a og 9b, med sekvenser vist i figur 14.

Siden sekvensene betegnet 5b og 9b er identiske og siden begge toppene er assosiert med bakteriedrepende aktivitet, antar søkerene at denne sekvensen sammen med sekvensen til 9a, er ansvarlig for slik bakteriedrepende aktivitet.

ADBF-aktivitet ble delvis renset ved størrelses-eksklusjons-kromatografi på en Bio-Sil TSK-125 kolonne som vist i figur 15. Sopp og bakteriedrepende aktivitet ko-eluerte på kolonnen med to aktivitetstopper, hovedtoppen vandret innenfor 50-60 kD området (fraksjonene 31 og 32) og den mindre toppen innenfor 10-20 kD området (fraksjon 42). Utgangsmaterialet for TSK størrelses-eksklusjonskromatografi (ADBF) og forskjellige TSK størrelses-eksklusjonskromato-graf i-f raks j oner ble analysert ved polyakrylamid gel-elektroforese (15%) som vist i fig. 16.

RPHPLC av den 50-60 kD størrelses-eksklusjonstoppen (fraksjonene 31-32) resulterte i 2 aktivitetstopper, en mindre aktivitetstopp assosiert med regionen som innbefatter topper 4,5 og 6, og en hovedaktivi tetstopp assosiert med topp 9 (figur 13B). Aminosyresekvensanalyse av topp 4 viser identitet til humant katepsin G (se figur 14). Topp 9 korresponderer til en enkel N-terminal sekvens betegnet 9a i figur 14. Aminosyre-sammensetning av renset topp 9a er vist i tabell IV nedenfor.

SDS-PAGE (10%) analyse av topp 9 viser at hovedproteinbåndet har en molekylvekt på omtrent 54,000 daltons (figur 17). RPHPLC av 10-20 kD størrelses-eksklusjonstopp (fraksjon 42) resulterte 1 en enkelt aktlvltetstopp assosiert med topp 5 (figur 13c) som hadde en enkelt n-terminalsekvens identisk til 5b (figur 14). SDS-PAGE analyse av topp 5 viste et enkelt bånd på SDS-PAGE med en molekylvekt på 13,000 daltons (se figur 18).

Forbedret resolusjon ble oppnådd med TSK størrelses-eksklu-sjonskromatografi ved bruk av en bufffer av 50mM glysin pH 2, 500mM NaCl (se figur 21). Under disse betingelsene ble det oppnådd nesten fullstendig separasjon av 54kD båndet fra 29 kD båndene. Aktivitetsprofiler indikerte at 54kD protein (fraksjoner 34-36) demonstrerte bare bakteriedrepende aktivitet og ingen antisopp aktivitet. Et område som inneholdt hovedsakelig to proteiner på 13kD og 18kD (fraksjonene 42-45) inneholdt for det meste antisopp aktivitet i tillegg til bakteriedrepende aktivitet. Figur 22 viser SDS-PAGE resultater som korresponderer til forskjellige fraksjoner .

HL60-avledet BF ble renset fra granula (samlet etter Percoll gradient-sentrifugering) ved TSK størrelses-eksklusjonskroma-tografi og RPHPLC som beskrevet for ADBF. RPHPLC (figur 19) ga en aktivitets-topp som ved sekvensanalyse, korresponderte til sekvens 9a (figur 14) med noe elastaseforurensning (topp 8).

Humane HL60 cDNA-bibliotek ble screenet med en probe avledet fra sekvensen bestående av aminosyrene 31-34 til topp 5b som beskrevet ovenfor. 16 kloner ble plaque-renset fra det induserte biblioteket. Hver klon ble kuttet med enzymet Sau3a og fragmentene satt inn i enkelt-trådet fag M13. Fag ble screenet ved hybridisering til 14mer samlingen og positivt M13 fag ble sekvensert ved bruk av dideoksy-kjede termineringsmetoden som beskrevet i (43). En av disse klonene, P-7, inneholdt en sekvens som passet akkurat til den antatte ved proteinsekvensen til et punkt mellom aminosyre-resten 13 og 14 hvor det syntetiske oligonukleotidet ble satt inn. EcoRl fragmentet til klon P-7 ble brukt til å screene på nytt det ikke-induserte biblioteket, hvorfra 8 cDNA-kloner ble isolert. En av disse klonene, betegnet P-FL2, ble satt inn i M13 vektorer og sekvensert. En annen cDNA klon (P-FL1) ble også sekvensert. Den var identisk til P-FL2 med unntag-else av at dets 5'ende begynte ved et punkt 43 base-par etter 5'enden til klon P-FL2.

Begge klonene (P-FL1 og P-FLZ) inneholder identiske åpne leserammer som koder for 220 aminosyrer med en antatt molekylvekt på 24,823 (figur 20). Et N-bundet glykosyler-ingssete er tilstede (Asn-85) som kunne resultere i et større molekyl. Residiene Thr^QQ-Ilei44korresponderer akkurat til aminoterminale sekvensen fra topp 5b. Den antatte molekylvekten for den C-terminale delen av molekylet (Thr^Q5-Tyr220) er 12,867, lik den antatte molekylvekten til topp 5b fra SDS-PAGE.

Diskusjon.

Siden de tidligere studiene av Hirsch (27-29), er forskjellige bakteriedrepende proteiner blitt beskrevet og i noen tilfeller isolert fra nøytrofiler (7, 18, 30-34). Den subcellulære beliggenheten av disse eller andre humane nøytrofil-avledete bakteriedrepende proteiner er ikke blitt bestemt. Som fremlagt her, ble humane nøytrofiler behandlet med DFP for å forhindre proteolyse. Disse behandlede nøytrofilene ble fraksjonert ved bruk av en metode som resulterte i en klar separasjon av cytosol, plasmamembran, spesifikke granula, og azurofile granula, med minimal proteolyse eller forandring av granula-integriteten eller tettheten. Optimale betingelser for ekstraksjonene og analyse av ADBF ble bestemt; ADBF ble maksimalt ekstrahert ved pH 2.0-3.0 og analsyert ved pH 4.4 (f agolyssomal pH). Ved disse betingelsene, ble alle cellulære deler screenet og det ble funnet ut at mesteparten av den bakteriedrepende aktiviteten (97%) var assosiert med den postnukleære supernatanten (S-l) mens omtrent 90% av aktiviteten ko-vandret med den azurofile granula-populasjonen etter sentrifugering av S^på Percoll tetthetsgradienter. Hverken cytosol eller plasmamembranfraks]onene hadde signifikant aktivitet. Den lave aktivitetsgraden (5-10%) i den spesifikke granula-fraksjonen skyldtes den 5-10% forurensningen av disse fraksjonene av myelo-peroksidase-positive azurofile granula. Resultatene viste en enkelt beliggenhet for humane nøytrofile BF, dvs. azurofile granula.

Til støtte i disse resultatene, ble en beliggenhet for ADBF funnet i humane nøytrofiler, hvor bakteriedrepende aktivitet bare var lokalisert til en større myelo-peroksidase-positiv granula-populasjon (35). I tillegg, er det blitt rapportert at en av de nøytrofilavledete bakteriedrepende faktorer (BPI) kan bli gjenvunnet (90%) i de cellulære fraksjonene som inneholder azurofile granula (36). Rest et al. (37) fant derimot en bakteriedrepende faktor i både azurofile og spesifikke granula til humane nøytrofiler. Siden de brukte en annen fraksjoneringsteknikk (homogenisering i sukrose og isopyknik sentrifugering på sukrose tetthetsgradienter), i tillegg til forskjellige ekstraksjonsmetoder og analyser, er deres resultater ikke direkte sammenhengbare med resultatene beskrevet heri.

ADBF er assosiert med den azurofile membranen. Ved hydrolyse av azurofile granula ved nøytral pH, som løste opp 90% av myelo-peroksidase, forble 90% av ADBF i den membran-inneholdende pelleten. All membran-assosiert ADBF kunne bli ekstrahert ved pH 2.0 og frigjort i løselig form etter sentrifugering av den syre-behandlede membranen. Mulige forklaringer når det gjelder den oppløsende effekten til syrer: (1) syre induserer en proteolytisk hending; (2) syre induserer konformasjons-forandringer som ødelegger assosiasjonen av ADBF med granulamembran; eller (3) syre forskyver en lad-ningsinteraksjon mellom ADBF og membranen. Lav pH var ikke helt nødvendig for oppløsning av ADBF. Triton X-100 ved nøytral pH kunne også frigjøre ADBF. Midler som vanligvis blir brukt til å løse opp perifere membran-proteiner, slik som 2 M NaCl, 6 M urea eller 0.1 M natrium-bikarbonat pH 11, kunne ikke dissosiere ADBF fra den azurofile membranen. Dette indikerer at ADBF er enten fast assosiert med eller inneholder en integrert bestanddel av den azurofile membranen. Ved behandling av azurofile membraner med Triton X-114, oppførte ADBF seg som en integrert membran-bestanddel, ved at den gikk inn i detergentfasen.

Det ble også stilt spørsmål om frigjøring av en bakteriedrepende faktor fra membranen er nødvendig for bakteriedrepende effekt. Membran-bundet ADBF var 10 ganger mindre aktiv enn oppløselig ADBF, som tyder på en in vitro kobling mellom ADBF oppløsning og aktivitet. Den molekylære mekanismen til ADBF aktivering in vivo gjenstår å finne ut.

Når det gjelder beliggenhets-resultatene beskrevet heri, ble hele, rensede azurofile granula brukt som ADBF-kilde og deres egenskaper studert. Dette står i kontrast til tidligere arbeider hvor bakteriedrepende proteiner ble oppnådd fra en heterogen granula-anriket fraksjon, ved ekstraksjon med syre over lange tidsperioder (7, 18, 31) uten proteaseinhibitor (7, 31). ADBF ligner noen av de tidligere beskrevne bakteriedrepende proteinene ved at de er syre-ekstraherbare og granula-assosierte. Spesielt, ADBF deler mange av karakter-trekkene med kanin nøytrofi 1-avledet fagocytin (28, 29, 39 ): (1) Forandringer i testmedium såsom variasjon i buffer, tilsetting av glukose, og tilsetting av et metall-bindende middel har liten effekt på den bakteriedrepende aktiviteten til ADBF; og (2) Divalente kationer (Mg<++>, Ca<++>) var ikke nødvendig for dets letale funksjon (ved høy konsentrasjon, motvirket disse ionene eller, når det gjelder Ca<++>, Inhiberte den bakteriedrepende effekten fullstendig -ID5Qfor Ca<++>= 10 mM). ADBF var, som fagocytin, mere aktiv ved en lav pH (5.0- 5.5), så var den estimerte fagolysosomale pH ved den intra-cellulære dreping av bakterien.

ADBF er forskjellig fra andre rapporterte nøytrofil-avledete antimikrobielle proteiner på en rekke områder. ADBF er aktiv innenfor et stort pH-område, med optimal aktivitet ved pH 5.5, og er relativ ufølsom når det gjelder høy ione-styrke. Dette står i kontrast til den bakterielle permeabilitets-økende faktor (BPI), som er optimalt aktiv ved pH 7.0, og defensiner, som krever pH 7.0-8.0 og lav ione-styrke for å oppnå bakteriedrepende aktivitet (7, 31, 34, 35 ). På grunn av dets antimikrobielle spektrum, er ADBF forskjellig fra rensede faktorer slik som BPI eller katloniske antimikrobielle proteiner, som bare er aktive på Gram-negative bakterier (18, 31, 34).

ADBF er ekstremt aktive: 0.1 til 0.3 mlkrogram/ml kan drepe 10^ bakter pr. ml, ved bruk av en stort spekter av test-organismer -- Gram-positive og Gram-negative bakterier. Rensede bakteriedrepende faktorer som er spesifikke for Gram-negative bakterier, slik som BPI (31, 44) og det 57 kD katloniske antimikrobielle proteinet (18) har sammenlignbare aktiviteter, mens andre, slik som defensiner, ser ut til å være aktive bare ved høyere konsentrasjoner (50 mikrogram/ml) på både Gram-positive og Gram-negative bakterier (7, 34). I tillegg, dreper ADBF bakterier raskt: mer enn 50% drap oppnås i løpet av 5 minutter. ADBF-drap ser ikke ut til å involvere HgOg-avhengige systemer, da katalase (500 U/ml) ikke redu-serer dets aktivitet i nevneverdig grad (data ikke vist) og siden mere enn 90% myelo-peroksidase blir frigjort i den oppløselige fraksjonen ved isolering av membran-ADBF.

Kromatografi av ADBF på revers-fase HPLC gir 9 hovedprotein-topper som innbefatter minst 10 forskjellige polypeptlder. Flere inneholder amino-terminalsekvenser som er identiske til kjente polypeptlder, som innbefatter:

Aktivitetsprofiler langs reversfase-kromatografifraksjoner av azurofile granula-ekstrakt og delvis rensede ADBF assosiert drap av E. coli med toppene 5b og 9a. Dermed kan to rensede polypeptlder med distinkt amino-terminale sekvenser bli identifisert. BPI, som beskrevet i litteraturen (31,44), er bare aktive mot Gram-negative bakterier.

Fra aminosyresekvensen avledet fra topp 5b, ble en ny cDNA med full lengde klonet som koder for et 220 aminosyre-polypeptid, med en antatt molekylvekt på 24,823 dalton. Dette proteinet representerer en forløper til det 13kD polypeptidet beskrevet ved topp 5b som kan bli prosessert i nøytrofil eller i løpet av renseprosessen. Det faktum at sekvensen i topp 5b også fremkommer i topp 9 (betegnet sekvens 9b i figur 14) kan bli forklart på flere måter: 1) C-terminal degradering; 2) konformasjons-forskjeller eller 3) postkolonne-prosessering av en N-terminalt blokkert forløper.

Da modne polymorfonukleaere leukocytter ikke kan vokse i en forlenget tidsperiode i kultur, ble bruken av nøytrofile forløperceller for fremstilling av bakteriedrepende faktorer undersøkt. Undersøkelse av HL60 celle-avledet bakteriedrepende faktor (BF) viste at den besto av en granula-profil som var forskjellig fra den som ble oppnådd fra nøytrofiler etter separasjon på Percoll-gradienter. Derimot var en bakteriedrepende og soppdrepende aktivitetstopp tilstede som overlap-pet toppen til myelo-peroksidase-aktiviteten (en markør for azurofile granula i modne nøytrofiler). Aktiviteten til HL60 avledet BF er essensielt identisk til ADBF i dets styrke (nanogram per milliliter som er nødvendig for å drepe et visst antall bakterier-), pH aktivitets-prof il, sensitivitet til CaCl2, vandring på Superose 12 FPLC størrelses-eksklu- sjonskromatografi og membranassosiasjon. Fremstilling av BF fra HL60-celler tilveiebringer derfor en alternativ måte for fremstilling av store mengder BF for kommersiell bruk.

Claims (68)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en sammensetning som kan benyttes som et antimikrobielt middel, karakterisert ved at det innbefatter: (a) separering av polymorfonukleære leukocytter i vesentlig grad fra blod for å oppnå et polymorfonukleært leukocytt anriket preparat; (b) suspendering av polymorfonukleære leukocytt anriket preparat i en egnet buffer; (c) behandling av den resulterende polymorfonukleaere leukocytt-suspensjonen med en egnet protease-inhibitor; (d) behandling av polymorfonukleær leukocytt-suspensjonen slik at de suspenderte leukocyttene lyserer; (e) behandling av den resulterende suspensjonen som består av lyserte leukocytter med et egnet gelaterende middel; (f) sentrifugering av den behandlede suspensjonen som består av lyserte leukocytter for å oppnå en nuklein/hel cellefase og en postnukleær supernatant; ( s) gjenvinning av den postnukleære supernatanten; (h) fraksjonering av den postnukleære supernatanten på en tetthetsgradient; (i) oppsamling av tetthet-gradientfraksjonen som inneholder azurofile granula; (j) suspendering av de oppsamlede azurofile granula i en buffer med en pH på omtrent 7; (k) forhandling av den resulterende azurofile granula-suspensjonen med en ekstraherende reagens som har en pH på mindre enn omtrent 8.0 og som kan løse opp azurofile membranproteiner for å oppnå en ekstraherende reagens/azurof11 membransuspensjon;

(1) separering av det ekstraherende reagens/azurofile membransuspensjonen for å danne en fast fase og supernatant; og (m) gjenvinning av supernatanten.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at proteaseinhibitoren er di isopropylfluorofosfat.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man tar blodprøve fra et menneske.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det polymorfonukleaere leukocytt-anrikede preparatet inneholder mere enn omtrent 95% polymorfonukleaere leukocytter og mindre enn omtrent 3% eosinofiler.

5 . Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved den polymorfonukleaere leukocytt-suspensjonen blir behandlet med nitrogen-kavitasjon for å oppnå en lysert leukocytt-suspensjon.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at tetthetsgradienten består av en diskontinuerlig Percoll tetthetsgradient.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man før steg (j ) separerer det fraksjonerende materialet i tetthetsgradienten fra de azurofile granula.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man før steg (k) behandler den azurofile granula suspensjonen slik at man lyserer de azurofile granula og membranfragmentene blir gjenvunnet og behandlet med et ekstraherende reagens slik at man oppnår et ekstraherende reagens/azurof ile membransuspensj on.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det ekstraherende reagens har en pH på mindre enn 4.0.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at det ekstraherende reagens har en pH på omtrent 2.0.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det ekstraherende reagens er en ikke-ionisk detergent med en pH på omtrent 7.0.

12. Renset polypeptid som kan benyttes som et antimikrobielt middel, karakterisert ved at det inneholder et humant polymorfonukleært leukocytt-polypeptid med en antatt molekylvekt på 24,823 daltons og med amlnosyresekvens som vist i figur 20, eller et fragment avledet derfra.

13. DNA-molekyl som koder for polypeptidet i krav 12, karak terisert ved at det inneholder i hvert fall en del av nukleotidsekvensen vist i figur 20.

14. Renset polypeptid ifølge krav 12, karakterisert ved at det har en molekylvekt på omtrent 13,000 daltons.

15 . Renset polypeptid ifølge krav 14, karakterisert ved at det har en antatt molekylvekt på 12,867 daltons.

16. Renset polypeptid ifølge krav 15, karakterisert ved at det består av amlnosyresekvens vist i figur 20 fra aminosyre 105 til aminosyre 220.

17. DNA-molekyl som koder for polypeptidet ifølge krav 16, karakterisert ved at den består av DNA-sekvensen vist i figur 20 fra nukleotid 369 til nukleotid 716.

18. Renset polypeptid ifølge krav 12, karakterisert ved at det har en molekylvekt på omtrent 18,000 daltons.

19. DNA-molekyl, karakterisert ved at den koder for polypeptidet i krav 18.

20. Vektor, karakterisert ved at den inneholder DNA-molekylet ifølge krav 19.

21. Vektor ifølge krav 20, karakterisert ved at den inneholder et plasmid.

22. Verts-vektorsystem for fremstilling av et humant polymorfonukleært leukocytt polypeptid med en antatt molekylvekt på 24,823 daltons, eller et fragment derav, karakterisert ved at det innbefatter plasmid ifølge krav 21 i en egnet vert.

23. Fremgangsmåte for fremstilling av et humant polymorfonukleært leukocytt polypeptid med en molekylvekt på 24,823 daltons, eller et fragment derav, karakterisert ved at man lar verts-vektorsystemet i krav 22 vokse ved egnede betingelser som tillater produksjon av det humane polymorfonukleaere leukocytt-polypeptidet og gjenvinning av det resulterende humane polymorfonukleære leukocytt-polypeptidet.

24 . Fremgangsmåte for fremstilling av det rensede polypeptidet ifølge krav 12, karakterisert ved at det innbefatter: (a) oppdyrking av nøytrofile forløperceller; (b) høsting av de oppdyrkede nøytrofile forløpercellene; (c) suspendering av de høstede, oppdyrkede nøytrofile forløpercellene, i en egnet buffer; (d) behandling av den resulterende nøytrofile forløper-celle-suspensjonen slik at man oppnår en suspensjon bestående av lyserte nøytrofile forløperceller; (e) separering av den behandlede suspensjonen av lyserte nøytrofile forløperceller slik at man oppnår en nuklein og hel cellefase og en postnukleær supernatant ; (f) gjenvinning av den postnukleære supernatanten; (g) behandling av den postnukleære supernatanten med et ekstraherende reagens som har en pH mindre enn omtrent 8.0 og som kan løse opp membranproteiner slik at man oppnår en ekstraherende reagens-fase og en uløselig membranfase; (h) separering av den ekstraherende reagensfasen fra den uløselige membranfasen slik at man oppnår en løselig proteinfase og en uløselig membranfase; (i) gjenvinning av den løselige proteinfasen; og rensing av den gjenvunnede løselige proteinfasen slik at man oppnår et renset 24,823 dalton polypeptid eller et fragment derav.

25. Fremgangsmåte ifølge krav 24, karakterisert ved at de nøytrofile forløpercellene er HL60-celler.

26. Fremgangsmåte ifølge krav 24, karakterisert ved at før steg (d), behandles den nøytrofile forløper-celle-suspensjonen med en egnet protease-inhibitor.

27. Fremgangsmåte ifølge krav 24, karakterisert ved at man før steg (e), behandler suspensjonen bestående av lyserte nøytrofiler med et egnet gelaterende middel.

28. Fremgangsmåte ifølge krav 24, karakterisert ved at den løselige proteinfasen blir renset ved ione-bytte-kromatografi .

29. Fremgangsmåte ifølge krav 24, karakterisert ved at den løselige proteinfasen blir renset ved størrelses-eksklusj onskromatograf i.

30. Metode ifølge krav 24, karakterisert ved at den løselige proteinfasen blir renset affinitetskromatograf i.

31. Fremgangsmåte ifølge krav 24, karakterisert ved at den løselige proteinfasen blir renset ved immuno-aff initetskromatograf i.

32. Renset polypeptid som kan benyttes som et antimikrobielt middel, karakterisert ved at det inneholder et humant polymorfonukleær leukocytt-polypeptid med en molekylvekt på omtrent 18,000 daltons.

33. Renset polypeptid ifølge krav 32, karakterisert ved at det har respiratorisk utbrudd-uavhengig, antimikrobiell aktivitet mot bakterier og sopp ved en pH fra omtrent 5.0 til omtrent 8.0 og ved kalsium-ion-konsentrasjoner opp til omtrent 10 mM, bakteriedrepende aktivitet ved natriumkloridkonsentrasjoner opp til omtrent 0.3M, og soppdrepende aktivitet ved natriumkloridkonsentrasjoner opp til omtrent 0.15 M.

34. DNA-molekyl, karakterisert ved at det koder for polypeptidet i krav 32.

35. Fremgangsmåte for dreping av en mikroorganisme, karakterisert ved at det innbefatter at man setter mikroorganismen i kontakt med en effektiv mikroorganisme-drepende mengde av polypeptid i krav 32.

36. Vektor, karakterisert ved at den inneholder DNA-molekylet i krav 34.

37. Vektor ifølge krav 36, karakterisert ved at den inneholder et plasmid.

38. Verts-vektorsystem for fremstilling av et humant polymorfonukleært leukocytt polypeptid med en molekylvekt på omtrent 18,000 daltons, karakterisert ved at det inneholder plasmid ifølge krav 37 i en egnet vert.

39. Metode for fremstilling av et humant polymorfonukleært leukocytt-polypeptld med en molekylvekt på omtrent 18,000 daltons, karakterisert ved at den innbefatter at man lar verts-vektorsystemet Ifølge krav 38 vokse ved egnede betingelser som tillater fremstilling av det humane polymorfonukleaere leukocytt-polypeptidet og gjenvinning av det resulterende human polymorfonukleaer-leukocytt-polypeptldet.

40. Fremgangsmåte for fremstilling av det rensede polypeptidet ifølge krav 32, karakterisert ved at det innbefatter: (a) oppdyrking av nøytrofile forløperceller; (b) høsting av oppdyrkede nøytrofile forløperceller; (c) suspendering av de høstede, oppdyrkede nøytrofile forløpercellene i en egnet buffer; (d) behandling av den resulterende nøytrofile forløper-celle-suspensjonen slik at man oppnår en suspensjon bestående av lyserte nøytrofile forløperceller; (e) separering av den behandlede suspensjonen bestående av lyserte nøytrofile forløperceller slik at man oppnår en nuklein og hel cellefase og en postnukleær supernatant; (f) gjenvinning av den postnukleære supernatanten; (g) behandling av den postnukleære supernatanten med et ekstraherende reagens som har en pH mindre enn omtrent 8.0 og som kan løse opp membranproteiner slik at man oppnår en ekstraherende reagens-fase og en uløselig membranfase; (h) separering av den ekstraherende reagensfasen fra den uløselige membranfasen slik at man oppnår en løselig proteinfase og en uløselig membranfase; (i) gjenvinning av den løselige proteinfasen; og rensing av den gjenvunnede løselige proteinfasen slik at man oppnår et renset 18,000 dalton polypeptid eller et fragment derav.

41. Fremgangsmåte ifølge krav 40, karakterisert ved at de nøytrofile forløpercellene er HL60-celler.

42. Fremgangsmåte ifølge krav 40, karakterisert ved at man før steg (d), behandler det nøytrofile forløpercelle-suspensjonen med en egnet protease-inhlbitor.

43. Fremgangsmåte ifølge krav 40, karakterisert ved at man før steg (e) behandler suspensjonen bestående av lyserte nøytrofiler med et egnet gelaterende middel.

44 . Fremgangsmåte ifølge krav 40, karakterisert ved at den løselige proteinfasen blir renset ved ione-bytter-kromatografi.

45 . Fremgangsmåte ifølge krav 40, karakterisert ved at den løselige proteinfasen blir renset ved størrelses-eksklusjonskromatograf i.

46. Fremgangsmåte ifølge krav 40, karakterisert ved at den løselige proteinfasen blir renset ved affinitetskromatografi .

47. Fremgangsmåte ifølge krav 40, karakterisert ved at den løselige proteinfasen blir renset ved immuno-affinitetskromatografi.

48. Renset polypeptid som kan benyttes som et antimikrobielt middel, karakterisert ved at det innbefatter et human polymorfonukleær-leukocytt-polypeptid med en molekylvekt på omtrent 54,000 daltons, respiratorisk utbrudd-uavhengig, antibakterlell aktivitet ved en pH fra omtrent 5.0 til omtrent 8.0, ved kalsium-ion-konsentrasjoner opp til omtrent 10 mM, og ved natriumkloridkonsentrasjoner opp til omtrent 0.3M.

49. Renset polypeptid ifølge krav 48, karakterisert ved at det har antisopp aktivitet ved en pH fra omtrent 5.0 til omtrent 8.0 ved kalsium-ion-konsentrasjoner opp til omtrent lOmM, og ved natriumklorid-konsentrasjoner opp til omtrent 0.15M.

50. DNA-molekyl, karakterisert ved at det koder for polypeptid ifølge krav 48.

51. Renset polypeptid ifølge krav 48, karakterisert ved at det har følgende N-terminal amlnosyresekvens Val-Asn-Pro-Gly-Val-Val-Arg-Ile-Ser-Gln-Lys-Gly-Leu-Asp-Tyr-Ala-Ser-Gln-Gln-Gly-Thr-Ala-Ala-Leu-Gln-X-X-Leu-Lys-His-Ile-Lys-Ile-Pro-Asp-Tyr-Leu.

52. Fremgangsmåte for dreping av bakterier eller sopp, karakterisert ved at den innbefatter at man setter bakterier eller sopp i kontakt med en effektiv bakteriell eller soppdrepende mengde av polypeptid i krav 49.

53. Vektor, karakterisert ved at den inneholder DNA-molekylet i krav 50.

54 . Vektor ifølge krav 53, karakterisert ved at den inneholder et plasmid.

55 . Verts-vektorsystem for fremstilling av et humant polymorfonukleært leukocytt polypeptid med en molekylvekt på omtrent 54,000 daltons, respiratorisk, utbrudd-uavhengig, antibakteriell aktivitet ved en pH fra omtrent 5.0 til omtrent 8.0, ved kalsium-ion-konsentrasjoner opp til omtrent 10 mM, og ved natriumklorid-konsentrasjoner opp til omtrent 0.3M, karakterisert ved at det inneholder plasmid ifølge krav 54 i en egnet vert.

56. Fremgangsmåte for fremstilling av et humant polymorfonukleært leukocytt-polypeptid med en molekylvekt på omtrent 54,000 daltons, respiratorisk utbrudd-uavhengig, antibakterielle aktivitet ved en pH fra omtrent 5.0 til omtrent 8.0, ved kalsium-ion-konsentrasjoner opp til omtrent 10 mM, og ved natriumklorid-konsentrasjoner opp til omtrent 0.3M, karakterisert ved at den innbefatter at man lar verts-vektorsystemet ifølge krav 55 vokse ved egnede betingelser som tillater fremstilling av det humane polymorfonukleaere leukocytt-polypeptidet og gjenvinning av det resulterende humane polymorfonukleær-leukocyttpolypeptidet.

57. Fremgangsmåte for fremstilling av det rensede polypeptidet ifølge krav 48, karakterisert ved at den innbefatter: (a) oppdyrking av nøytrofile forløperceller; (b) høsting av oppdyrkede nøytrofile forløperceller; (c) suspendering av de høstede, oppdyrkede nøytrofile forløpercellene i en egnet buffer; (d) behandling av den resulterende nøytrofile forløper-celle-suspensjonen slik at man oppnår en suspensjon bestående av lyserte nøytrofile forløperceller; (e) separering av den behandlede suspensjonen bestående av lyserte nøytrofile forløperceller slik at man oppnår en nuklein og hel cellefase og en postnukleær supernatant; (f) gjenvinning av den postnukleære supernatanten; (g) behandling av den postnukleære supernatanten med et ekstraherende reagens som har en pH mindre enn omtrent 8.0 og som kan løse opp membranproteiner slik at man oppnår en ekstraherende reagens-fase og en uløselig membranfase; (h) separering av den ekstraherende reagensfasen fra den uløselige membranfasen slik at man oppnår en løselig proteinfase og en uløselig membranfase; (i) gjenvinning av den løselige proteinfasen; og (j) rensing av den gjenvunnede løselige proteinfasen slik at man oppnår et renset 54,000 dalton polypeptid

58. Fremgangsmåte ifølge krav 57, karakterisert ved at de nøytrofile forløpercellene er HL60-celler.

59. Fremgangsmåte ifølge krav 57, karakterisert ved at man før steg (d), behandler den nøytrofile forløpercelle-suspensjonen med en egnet protease-inhibitor.

60. Fremgangsmåte ifølge krav 57, karakterisert ved at man før steg (e) behandler suspensjonen bestående av lyserte nøytrofiler med et egnet gelaterende middel.

61. Fremgangsmåte ifølge krav 57, karakterisert ved at den løselige proteinfasen blir renset ved ione-bytter-kromatografi.

62. Fremgangsmåte ifølge krav 57, karakterisert ved at den løselige proteinfasen blir renset ved størrelses-eksklusjonskromatograf i.

63. Fremgangsmåte ifølge krav 57, ' karakterisert ved at den løselige proteinfasen blir renset ved affinitetskromatografi .

64. Fremgangsmåte ifølge krav 57, karakterisert ved at den løselige proteinfasen blir renset ved immuno-affinitetskromatografi.

65. Fremgangsmåte ifølge krav 57, karakterisert ved det humane polymorfonukleær-leukocytt-polypeptidet med en molekylvekt på omtrent 29,000 daltons er tilstede i et azurofilt granula-ekstrakt.

66. Fremgangsmåte ifølge krav 57, karakterisert ved at det humane polymorfonukleær-leukocytt-polypetidet med en molekylvekt på omtrent 29,000 daltons er elastase.

67. Fremgangsmåte ifølge krav 57, karakterisert ved at det humane polymorfonukleær-leukocytt-polypeptidet har en molekylvekt på omtrent 29,000 daltons er katepsin G.

68. Renset polypeptid som kan benyttes som et antimikrobielt middel, karakterisert ved at det innbefatter et humant polymorfonukleær-leukocytt-polypeptid med en molekylvekt på omtrent 25,000 daltons, respiratorisk utbrudd-uavhengig, antimikrobiell aktivitet mot bakterier og sopp ved en pH fra omtrent 5.0 til omtrent 8.0 og ved kalsium-ion-konsentrasjoner til omtrent 10 mM, bakteriedrepende aktivitet ved natriumklorid-konsentrasjoner opp til omtrent 0.3M, og soppdrepende aktivitet ved natriumklorid-konsentrasjoner opp til omtrent 0.15M. R EFERANSER 1. Klebanoff, S.J. and R.A. Clark. 1978. The Neutrophil: function and clinical disorders. North-Holland Publishing Company, pp. 1-810. 2. Kaplan, E.L., T. Laxdal, and P.G. Quie. 1968. Studies of polymorphonuclear leukocytes from pa-tients with chronic granulomatous disease of childhood: Bactericidal capacity for streptococci. Pediatrics 41:591-599. ,3. Mandell, G.L. 1974. Bactericidal activity of aerobic and anaerobic polymorphonuclear neutrophils. Infect. Immun. 9:337-341. 4. Elsbach, P. , and J. Weiss. 1983. A reevaluation of the roles of the 02-dependent and 02-independent microbicidal systems of phagocytes. Rev. Infect. Dis. 5:843-853. 5. Spitznagel, J.K., and W.M. Shafer. 1985. Neutrophil killing of bacteria by oxygen-independent mechanisms: A historical summary. Rev. Infect. Dis. 7:398-403. 6. 2Ganz, T., M.E.S elsted, D. Szklarek, S.S.L. Harwig, K. Daher, D.F. Bainton and R.I. Lehrer. 1985. Defensins, natural peptide antibiotics of human neutrophils. J. Clin. Invest. 76:1427-1435. 7. Selsted, M.E., S.S.L. Harwig, T. Ganz, J.W. Schilling and R. I. Lehrer. 1985. Primary Struc-tures of Three Human Neutrophil Defensins. J. Clin. Invest., 76: 1436-1439. 8. Borregaard, N., J.M. Heiple, E.R. Simons, and R.A . Clark. 1983. Subcellular localization of the b-cytochrome component of the human neutrophil microbicidal oxidase: translocation during activa-tion. J. Cell Biol 97:52-61. 9. Boyum, A. 1968. Separation of leukocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21 (Suppl.):77-89. 10. Lindhardt, K. and K. Walter. 1963. Phosphatases (phosphomonoesterases) . In Methods of Enzymic Analysis. H.-U. Bergmeyer, editor. Academic Press, Inc., New York. 779-787. i 111. Gottlieb, C. , K.-S. Lau, L.R. Wasserman, and V. Herbert. 1965. Rapid charcoal assay for intrinsic factor (IF), gastric juice unsaturated B12 binding capacity, antibody to IF, and serum unsaturated B12 binding capacity. Blood 25:875-893. 12. Lowry, O.H., N.J. Rosebrough, A.L. Farr, and R.J. Randall. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193:265-275. 13. Wang, C.S. and R.L. Smith. 1975. Lowry determina-tion of protein in the presence of Triton X-100. Anal. Biochem. 63:414-417. 14. Bos, A., R. Wever, and D. Roos.19 78. Characterization and quantification of the peroxidase in human neutrophils. Biochem. Biophy. Acta. 525:37-44. 15. Tomasz, A. 1968. Biological consequences of the replacement of choline by ethanolamine in the cell wall of pneumococcus: chain formation, loss of transformability, and loss of autolysis. Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 59:86-93. 16. Miller, J.H. 1972. Experiments in Molecular Genet-ics. Cold Spring Harbor Laboratory, New York. pp. 137-140. 17. Amrein, P.C. and T.P Stossel. 1980. Prevention of degradation of human polymorphonuclear leukocyte proteins by diisopropylfuorophosphate. Blood 56:442-447. 18. Shafter, W.M., L.E. Martin, and J.K. Sptiznagel. 1984. Cationic antimicrobial proteins isolated from human neutrophil granulocytes in the presence of diisopropylflourophosphate. Infect. Immun. £9:29-35. 19. Bordier, C. 1981 .P hase separation of integral membrane proteins in Triton X-114 solution. J. Biol. Chem. 256:1604-1607. 20. Lewis, V., S.A. Green, M. Marsh, P. Vihko, A. Helenius, and I. Mellman. 1985. Glycoproteins of the lysosomal membrane. J. Cell Biol. 100:1839-1847. 21. Geisow, M.J., P. D'Arcy Hart, and M.R. Young. 1981. Temporal changes of lysosome and phagosome pH during phagolysosome formation in macrophages: Studies by fluorescence spectroscopy. J. Cell. Biol. 89:645-652. 22. McNeil, P.L., L. Tanasugarn, J.B. Meigs, and D.K . Taylor. 1983. Acidification of phagosomes is initiated before lysosomal enzyme activity is detected. J. Cell Biol. 97:692-702. 23. Horvitz, M.A. and F.R. Maxfield. 1984. Legionel-la pneumophila inhibits acidification of its phagosome in human monocytes. J. Cell Biol. 99:1936-1943. 24. Silverstein, S.C., R.M. Steinman and Z.A. Cohn. 1977. Endocytosis. Ann. Rev. Biochem. 46:669-722 . 25. Nikaido, H. and M. Vaara. 1985. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability. Micro-biol. Rev. 49:1-32. 26. Chaberek, S. and A.E. Martell. 1959.. Organic sequestering agents. Wiley & Sons, editors. Chap-man & Hall, New York. pp. 312-313. 27. Hirsch, J.G. 1956. Phagocytin: A bactericidal substance from polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 103:589-611. 28. Hirsch, J.G. 1956. Studies of the bactericidal action of phagocytin. J. Exp. Med. 103:613-621. 29. Hirsch, J.G. 1960. Further studies on preparation and properties of phagocytin. J. Exp. Med. 111:323-337. 30. Zeya, H.I. and J.K. Spitznagel. 1963. Antibacterial and enzymic basic proteins from leukocyte lysosomes: separation and identification. Sci-ence 142:1085-1087. 31. Weiss, J., P. Elsbach, I. Olsson, and H. Odeberg. 1978. Purification and characterization of a potent bactericidal and membrane active protein from the granules of human polymorphonuclear leukocytes. J. Biol. Chem. 253:2664-2672. 32. Elsbach, P. , J. Weiss, R.C. Franson, S. Becker-dite-Quagliata, A. Schneider and L. Harris. 1979. Separation and purification of a potent bactericidal/permeability increasing protein and a close-ly associated phospholipase A2 from rabbit polymorphonuclear leukocytes. J. Biol. Chem. 254:11000-11009. 33. Lehrer, R.I., K.M. Ladra, and R.B. Hake., 1975. Nonoxidative fungicidal mechanisms of mammalian granulocytes: demonstration of components with candidacidal activity in human, rabbit, and guinea pig leukocytes. Infect. Immun. 11:1226-1234 . 34. Selsted, M.E., D. Szklarek, and R.I. Lehrer. 1984. Purification and antibacterial activity of antimicrobial peptides of rabbit granulocytes. Infect. Immun. 45:150-154♦ 35. Gennaro, R., B. Dewald, U. Horisberger, H.-U. Gubler, and M. Baggiolini. 1983. A novel type of cytoplasmic granule in bovine neutrophils. J. Cell. Biol. 96:1651-1661. 36. Weiss, J., T. Goldberg-Klein, and I. Olsson. 1986 . Cellular and subcellular localization of the neutrophil bactericidal/permeability-increasing protein. Clin. Res. 3_4:537A (Abstr.). 37. Rest, R.F., M.H. Cooney, and J.K. Spitznagel. 1978. Bactericidal activity of specific and azur-ophil granules from human neutrophils: studies with outer-membrane mutants of Salmonella typhimurium LT-2. Infect. Immun. 19:131-137. 38. Cohn, Z.A. and J.G. Hirsch. 1960. The isolation of the specific granules of rabbit polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 112:983-1003. 39. Collins, S.J., Gallo R.C., and Gallagher, R.E., 1977. Continous growth and differentiation of human myeloid leukaemic cells in suspension cul-ture. Nature 270: 347-349. 40. Collins, S.J., Ruscetti, F.W., Gallagher, R.E., and Gallo, R.C., 1978. Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75: 2458-2462. 41. Huynh, T.V., et al., 1984. DNA Cloninq Tech-niques: A Practical Approach, Glover, D. ed., IRL, Oxford. 42. Gubler, V., et al., 198 3. Gene 25: 263-269. 43. Smith, A.J.H., 1980 . Meth. Enzym. 65: 560-580. 44. Ooi, C.E., et al., 1987. A 25-kDa NH2 -terminal Fragment Carriers All The Antibacterial Activities of the Human Neutrophil 60-kDa Bactericidal/Permeability-Increasing Protein, J. Biol. Chem. 252: 14891-14894.