NO863974L - Monoklonale antihuman brystcanser antistoffer. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår immunologi- og cancer diagnose og-terapi. Mere spesielt angår oppfinnelsen murine monoklonale antihuman brystcancer antistoffer, hybridomer som produserer disse antistoffer, immunokjemikalier fremstilt fra disse antistoffer samt diagnostiske og terapeutiske metoder som bruker disse immunokjemikalier.

Siden midten av 1970 årene har det vært tallrike rapporter om murine monoklonale antistoffer som samvirker med human brystcancer assosierte antigener. I disse rapporterte studier ble mus immunisert og "boosted" med human melkefettglobulproteiner, brystcancer cellelinje eller brystcancer membranekstrakter. Immunsplenocyter ble limt sammen med musemyelomceller og hybridomer ble valgt ut basert på en viss spesifisitet i kulturmediet for bryst- eller brystcancer antigener. Taylor-Papadimitriou, J., et al, Int. J. Cancer (1981) 2&17-21; Yuan, D. et al, JNC1 (1982) 68^719-728; Ciocca, D.R., et al, Cancer Res. (1982) 42:4256-4258. Normalvev reaktivitetene til disse tidlige antistoffer er anderledes enn de vanlige vevreaktiviteter for antistoffene ifølge oppfinnelsen.

Et hovedaspekt ved oppfinnelsen angår murine monoklonale antistoffer som: a) ikke binder til blodceller; b) har et brysttumor bindingsområde på minst 0,25 eller et bryst-cancercellelinjebindingeområde på over eller lik 0,25; c) har en selektivitet lik eller mindre enn 0,09;

d) G- eller M isotype-linje

e) konjugert til en "pregende" del, produserer et signal tilstrekkelig

til å gi brystcancertumorer.

Foretrukne utførelsesformer av disse antistoffer er de som kalles 2G3, 32A1, 33F8, 35E10, 41B4, 87H7, 106A10, 113F1, 120H7, 140A7, 200F9, 203E2, 219F3, 245E7, 254H9, 260F9, 266B2, 317G5, 369F10, 387H9, 421E8, 452E12, 452F2, 454A12, 454C11, 457D7, 520C9, 650E2, 697B3, 741F8, 759E3, 788G6 og funksjonelle ekvivalenter derav.

De murin x murinhybridomer som produserer de ovenfor beskrevne antistoffer og avkom av disse hybridomer er andre trekk ved oppfinnelsen.

Ytterligere et trekk ved oppfinnelsen henger sammen med immunoimager-ende midler som er konjugater av

a) de ovenfor beskrevne monoklone antistoffer, og

b) en påvisbar imagerende del.

Et annet trekk ved oppfinnelsen angår metoder for gjenspeiling av

brysttumorer hos en pasient som har behov for slik gjenspeiling ved administrering av en slik gjenspeilende effektiv mengde av et immuno-gjenspeilingsmiddel og detektering av dette middel i pasienten med en egnet detekteringsanordning.

Som brukt heri betyr uttrykket "monoklonalt antistoff" et antistoff prepa-rat med en homogen antistoff populasjon. Uttrykket er ikke ment å være begrenset hva angår kilden for antistoff eller den måte på hvilken dette fremstilles. Som brukt heri med henblikk på de monoklonale antistoff-produserende hybridomer ifølge oppfinnelsen er uttrykket "avkom" ment å inkludere alle derivater, utgaver og avkom av opphavshybridomet som produserer det monoklonale antihuman brystcancer antistoff som produse-res av opphavet, uansett generasjon eller kariotypisk identitet.

Som brukt heri med henblikk på de murine monoklonale antihuman brystcancer antistoffer, betyr uttrykket "funksjonell ekvivalent" et monoklonalt antistoff som: a) binder til det samme antigen eller den samme epitop som et eksemplifisert monoklonalt antistoff; b) har et brysttumor bindingsområde på minst 0,25 eller et bryst cancer cellelinje bindingsområde på større enn eller lik 0,25; c) har en selektivitet lik eller mindre enn 0,09;

d) har en G- eller M isotype; og

e) konjugert til en gjenspeilende del, produserer et signal tilstrekkelig til å gjenspeile brystcancertumorer.

Som beskrevet ovenfor inkluderer uttrykket "funksjonell ekvivalent" fem kriterier. Det første av disse kriterier, binding til det samme antigen eller epitop som et eksemplifisert monoklonalt antistoff kan demonstreres ved forsøk som viser kryssblokking av et eksemplifisert monoklonalt antistoff av det funksjonelt ekvivalente monoklonale antistoff. Kryssblokkering opptrer som et resultat av et antistoff som binder til den samme epitop på et antigen som den som bindes av et av de eksemplifi-serte antistoffer, eller som et resultat av et antistoff som binder til en forskjellig epitop som er så nær beliggende på det samme antigen at bindingen av et antistoff til en epitop blokkerer bindingen av et antistoff til den andre epitop. Kryssblokkering er således et av kriteriene ved hjelp av hvilke man kan bestemme at et funksjonelt ekvivalent monoklonalt anitstoff binder til det samme antigen eller epitop som et eksemplifisert monoklonalt antistoff.

Såkalte "sandwich" analyser er en annen metode for å bestemme hvorvidt et antistoff binder til det samme antigen eller epitop. I disse analyser blir først et monoklonalt antistoff bundet til en bærer, f. eks. overflaten av en titerflatebrønn. Etter behandling for å forhindre ikke-spesifikk binding blir et høyt oppløseliggjort antigenpreparat tilsatt til det bundne antistoff. Deretter blir et andre antistoff, med en detekterbar merkelapp, f. eks. et fluorescerende fargestoff, tilsatt. Hvis det andre antistoff binder til antigenet indikeres en forskjellig epitop spesifisitet eller multiplekopier av den samme epitop på det samme antigen. Hvis det andre stoffet ikke binder indikeres enten den samme epitop spesifisitet eller en forskjellig antigen spesifisitet. Resultatene av både kryssblokkering- og sandwichanalysen defineres ytterligere ved en andre serie prøver slik som immunutfelling eller Westernblotting for å vise at antigenet som bindes av begge antistoffer har den samme molekylvekt.

Fremstilling av monoklonale antistoffer.

De antistoff produser ende fusjonspartnere som benyttes for å fremstille hybridomene ifølge oppfinnelsen dannes ved immunisering av mus ved levende human brystcancerceller eller membranekstrakter fremstilt derfra. Musene inokkuleres intr ape ritonialt ved en immunogen mengde av cellene eller ekstrakt og boostes så med en tilsvarende mengde av immunogenet. Miltene samles fra de immuniserte mus noen dager etter det siste skudd og en cellesuspensjon fremstilles derfra for bruk ved fusjonen.

Hybridomer fremstilles fra splenocytene og en murin tumorpartner ved bruk av den generelle somatiske cellehybridiseringsteknikk ifølge Kohler, B. and Milstein, C, Nature (1975) 256:495-497 som modifisert av Buck, D.W., et al, In Vitro (1982) 18:377-381. Tilgjengelige murin myelomlinjer slik som de fra Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, California, USA, kan benyttes ved hybridiseringen. Prinsippielt involverer teknikken sammensmelting av tumorcellene og splenocytene ved bruk av et fusogen slik som polyetylenglykol. Etter sammensmeltingen separeres cellene fra fusonsmediet og dyrkes i et selektivt vekstmedium slik som HAT medium for å fjerne ikke-hybridiserte opphavsceller. Hybridomene ekspanderes hvis ønskelig og supernatantene analyseres på humanbryst cancer aktivitet i konvensjonelle immunoanalyse prosedyrer (f. eks. radioimmunoanalyse, enzymimmunoanalyse eller fluorescensim-munoanalyse) ved bruk av immuniseringsmidlet (brystcancercellene eller membranekstrakt) som antigen. Positive kloner karakteriseres videre for å bestemme hvorvidt de oppfyller kriteriene til antistoffene ifølge oppfinnelsen.

Hybridomer som produserer slik antistoffer kan dyrkes in vitro eller in vivo ved bruk av kjente prosedyrer. De monoklonale antistoffer kan isoleres fra kulturmedia eller kroppsvæsker alt etter som, ved konvensjonelle immunoglubulin renseprosedyrer slik som ammoniumsulfat presipiter-ing, gelelektroforese, dialyse, kromatografi og ultrafiltrering hvis dette er ønsket.

Karakterisering/ selektering av monoklonalt antistoff.

De viktige karakteristika for de monoklonale antistoffer er (1) deres immunoglobulinklasse, (2) deres selektivitet for human brystcancerceller, (3) område for human brystcancer tumorceller hvortil de binder, (4) område for human brysttumor frosne seksjoner hvortil de binder, og (5) deres brukbarhet ved fremstilling av effektive antihuman brystcancer immunogjenspeilende midler.

Selektiviteten og området for et gitt antistoff bestemmes ved prøving av det mot paneler av (1) human brystcancer tumorvev, (2) human brystcancer cellelinjer, og (3) normal human vev eller celler av bryst eller annen opprinnelse.

Ved selektering av de krevede antistoffer ble ca. 22.000 voksne hybri-domkulturer til å begynne med avsøkt mot immuniserende brysttumor membraner eller cellelinjer, et panel av syv vanlige vevmembraner, en fibroblastcellelinje og et frossent brysttumorsnitt. Kloner som reagerte med de neoplastiske stoffer men ikke de vanlige stoffer, ble identifisert i denne første avsøking og valgt for isotyping og ytterligere avsøking for selektivitet og område. Den ytterligere avsøking involverte: seksten normalvevsnitt, fem normalblodcelletyper, elleve ikke-bryst neoplasma-snitt, enogtyve brystcancersnitt og fjorten brystcancercellelinjer.

For foreliggende søknads formål brukes spesifisitet og selektivitet om hverandre og er definert som summen av antall substrukturer som flekkes i seksten normalvevsnitt og antallet blodcelletyper som bindes, dividert med summen av det totale antall substrukturer som bindes av en hvilken som helst av de monoklone antistoffer i alle vevene på hvilke de monoklone antistoffer ble prøvet og fem blodcelletyper som ble prøvet.

Uttrykket "tumorområde" defineres som antallet frosne brysttumorsnitt som flekkes dividert med antallet frosne brysttumorsnitt som ble prøvet. Uttrykket brystcancer "cellelinjeområde" er definert som antall brystcancercellelinjer som flekkes dividert med antallet brystcancer cellelinjer som ble prøvet. Antistoffene ble ansett å være egnet for brystcancer immunoavspeilings gjenspeilingsforhold hvis de hadde en selektivitet lik eller mindre enn 0,09 og et brysttumor bindingsområde lik eller større enn 0,25 eller et brystcancer cellelinjebindingsområde lik eller større enn 0,25.

Antistoffer som viser aksepterbar selektivitet og område kan konjugeres til forskjellige gjenspeilende deler slik som radioisotoper eller stoffer som er detekterbare ved kjernemagnetisk ressonans. I enkelte tilfeller kan et koblingsmiddel slik som et gelateringsmiddel benyttes for å forbinde gjenspeilingsmidlet med antistoffet.

Antistoffer av fem av de treogtredve deponerte hybridomer ble funnet å erkjenne det samme 200 K dalton antigen. Antistoffer av fire av de treogtredve bandt til 230 K dalton intracellulært antigen. Tre binder til et eller flere høymolekylvekts muciner (HMW) og to band til transferrin reseptorer i form av et 97 K dalton antigen. Alle antigenvekter som her nevnes ble bestemt ved natrium dodecylsulfat (CDC) polyakrylamidgel elektroforese under reduserende betingelser ved bruk av kjente prosedyrer.

Ytterligere detaljer ved karakteriseringen av disse antistoffer gis i eksemplene nedenfor.

Immunokjemikalier.

Immunokjemikaliederivatene av de monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen som er av hovedsakelig viktighet er merket med en gjenspeilende del slik som radioisotoper, radioopaksubstanser eller NMR detekterbare stoffer. Slike immunokjemikaliederivater hvori den gjenspeilende del gir et middel for å identifisere immunkompleksene som inkluderer det merkede antistoff kan benyttes ved gjenspeiling av brystcancertumorer in vivo.

Antistoffer som viser enten et brystcancer tumorbindingsområde på minst 0,25 eller et brystcancer cellelinjebindingsområde på minst 0,25, og som også viser en selektivitet lik eller mindre enn 0,09 og som ikke binder til blodceller, ble ansett selektive for brystcancer immunogjenspeilingsformål og kan konjugeres til en detekterbar gjenspeilingsdel. Slike gjenspeilende deler kan være direkte bundet til det monoklonale antistoff eller kan bindes til det monoklonale antistoff ved hjelp av et bindende eller gelaterende middel. Derivater av det monoklonale antistoff, merket med gjenspeilingsdelene, kan fremstilles ved et antall i og for seg kjente metoder. Slike merkede derivater kalles her også immunogjenspeilings-midler.

Radioisotoper av jod kan benyttes for å jodere monoklonale antistoffer ved bruk av fastfaseoksydasjonsmidlet 13,4,6-tetrakloro-3a,6cx-difenylgly- koril, kommersielt tilgjengelig som "Iodogen", eller N-kloro-p-toluen sulfonamid (kloramin T).

Uttrykket "forbindere" slik det her benyttes er ment å omfatte kjemiske deler som kan bindes til gjenspeilingsdelen og som også binder til det monoklonale antistoff. Egnede forbindere kan inkludere de som binder til det monoklonale antistoff og chelat radionuklider. Andre forbindere slik som de som selektivt kan binde til karbohydratet som bærer områder av det monoklonale antistoff, eller de som er istand til å binde frie aminosidegruppe i proteinområdet i de monoklonale antistoff, slik som amidinerings- eller imidineringsmidler, og som kovalent kan forbindes til den gjenspeilende del, er også inkludert innenfor rammen av uttrykket forbinder slik det her benyttes.

Egnede forbindere vil ha tre karakteristika. Først må de være istand til å binde gjenspeilingsdelen som har det ønskede karakteristikum for avlesning for gjenspeiling. For det andre må forbinderen ikke i vesentlig grad påvirke bindingsselektiviteten for det antiklonale antistoff eller som i vesentlig grad reduserer dets affinitet for antigenet som skal bindes. Til slutt må forbinderen danne en stabil binding med gjenspeilingsdelen og det monoklonale antistoff slik at den gjenspeilende del og antistoffet ikke separeres fra hverandre.

Den spesielle forbinder og gjenspeilingsdel som benyttes for å fremstille immunogjenspeilingsmidlene ifølge oppfinnelsen vil variere fra antistoff til antistoff avhengig av virkningen av en spesiell gjenspeilingsdel, eller gjenspeilingsdel og forbinder kan ved bindingen ha egenskapene til det monoklonale antistoff for målantigen. Mens således et monoklonalt antistoff kan joderes med en radioisotop av jod på tyrosinrester i det monoklonale antistoff uten i vesentlig grad å påvirke affinitet eller selektivitet, kan den samme behandling av et andre monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen i vesentlig grad redusere affiniteten eller bindings spesifisiteten for et annet monoklonalt antistoff. En forskjellig merkelapp eller forbinder, f. eks. en som binder til antistoffet på en annen aminosyrerest, kan benyttes uten å påvirke selektiviteten eller affiniteten til det andre antistoff. Således kan jodradioisotoper forbindes til det andre stoff, f. eks. ved å benytte metoden ifølge Wood, F.T., et al. Analy. Biochem. 69:339 (1975) og forbinderen metyl-p-hydroksybenzimidat eller metoden ifølge Bolton-Hunter, Bolton, A.E. og Hunter, W.M., Biochem. J. 133:529-539 (1973) og forbinderen N-succinimidyl-3-(4-hydroksyfenyl) propionat. Et chelateringsmiddel slik som dietylentriaminpentaeddiksyre anhydrid som binder til lycinrester på antistoffet, eller etylentriamintetraeddiksyre kan benyttes for å merke antistoffet med 111-Indium (111-In) og kan også benyttes som alternativt middel for å forbinde antistoffet til gjenspeilingsdelen. Se f. eks. Goodwin, et al., "Chelat Conjugates og Monoclonal Antibodies for Imaging Lymphoid Structures in the Mouse', J. Nucl. Med. 26(5)493-502 (1985) og Meares et al., "Conjugation of Antibodies With Bifunctional Chelating Agents Bearing Isothiocyanate or Bromoacetamide Groups and Subsequent Addition of Metal Ions", Analy. Biochem. 142:68-78 (1984).

Forskjellige deler egnet for gjenspeiling er kjent. For eksempel er monoklonale antistoffer blitt radiomerket med et antall radionuclider egnet for dette, inkludert 131-iodin (1-131) og 1-123. Levin et al., "Localization of 1-131 Labeled Tumor Bearing Balb/c Mouse", J. Nuclear Medicine, 21:570-572 (1980); Farrands et al., "Radioimmunodetection of Human Colorectal Cancers by an AntiTumor Monoclonal Antibody", Lancet 397-399 (1982); Zimmer et al., "Radioimmunoimaging of Human Small Cell Lung Carcinoma With 1-131 Tumor Specific Monoclonal Antibody", Hybridoma, 4(1):1-11 (1985). Den direkte merking av det monoklonale antistoff med radioisotoper av jod kan gjennomføres i henhold til Contreras et al, Methods in Enzymology (1973) 97:277. Technetium-99 har vært benyttet som gjenspeilingsdel; Khaw et al., "Monoclonal Antibody to Cardiac Myosimlmaging of Experimental Myocardial Infraction", Hybridoma 3:11-23 (1984). 111-In har vært benyttet som merkelapp for antistoffer, Krejack et al., "Covalent Attachment of Chelating Groups to Macromolecules", Biochem. Biophys. Res. Comm, 77:581-585 (1977); Hnatowhich et al., "Radioactive Labeling of Antibody A Simple and Efficient Method", Science, 220:613-615 (1983) og Schienberg, D.A. et al., "Tumor Imaging With Radioactive Metal Chelates Conjugated to Monoclonal Antibodies", Science, 215:1511-1513

(1982).

For til å begynne med å anta egnetheten for antistoffet til anvendelse som gjenspeiling, kan dette merkes med en del som er direkte detekterbar slik som fluorkromer, såvel som deler slik som enzymer som må omsettes eller derivatiseres for påvisning. Eksempler på slike merkelapper er fluorescein og derivater, rhodamin og dervater, dansylgrupper, umbelliferon, luciferin, 2,3-dihydroftalazindioner, pepperrot peroksydase, alkalisk fosfatase, lysozom og glukose-6-fosfat dehydrogenase. Antistoffene kan merkes med slike merkelapper med kjente metoder. For eksempel kan koblingsmidler slik som aldehyder, karbodiimider, dimalei-mid, imidater, succinimider, bis-diazotert benzidin og lignende benyttes for å merke antistoffene med de ovenfor beskrevne fluorescenter, kjemiluminescente og enzymmerkelapper.

Antistoffene og merket antistoff kan benyttes i et antall immunogjenspeilende eller immunoanalyseprosedyrer for å detektere nærværet av brystcancer hos en pasient eller overvåke status for en slik cancer i en pasient som allerede er påvist å ha den. Benyttet for in vivo immuno-gjenspeiling for å detektere nærværet av en tumor, dennes lokalisering og disseminering i pasientens legeme samt fremdriften av terapien for å forbedre tumorbelastningen, blir det monoklone antistoff merket med en gjenspeilende del administreres parenteralt, fortrinnsvis intravenøst eller subkutant, i en mengde tilstrekkelig til å akkumuleres på tumorsetet og detekteres ved et valgt detekteringsmiddel. Typisk vil det monoklonale antistoff merket med en gjenspeilende del administreres med en egnet farmasøytisk akseptabel bærer av velkjent type for fagmannen. Slike bærere påvirker ikke pasienten. Mengden av monoklont antistoff som skal administreres vil avhenge av mengden detekterbar gjenspeilende del bundet til det monoklonale antistoff og gjenværende bindingseffektivitet for det monoklonale antistoff etter merking med den gjenspeilende del.

Gjenværende bindingseffektivitet for det monoklonale antistoff merket med den gjenspeilende del bestemmes in vitro ved bruk av en tumor cellebindingsanalyse. Generelt bestemmes radioimmuno reaktiviteten som måler gjenværende bindingseffektivitet til et radioisotop merket monoklonalt antistoff, ved å sammenligne spesifikk binding for den radioisotop merkede monoklon til en fiksert vevkultur av en immunoreaktiv tumor- cellelinje slik som SKBR-3, MCF-7 og MX-1 med ikke-spesifikk binding til en fiksert cellelinje som ikke spesifikt binder monoklonet.

Den optimale radioimmuno reaktivitet til den merkede monoklon bestemmes i dette system ved å variere konsentrasjonen av gjenspeilingsmidlet tilgjengelig for binding til det monoklonale antistoff mens man holder konsentrasjonen av det monoklonale antistoff konstant. De merkede monokloner prøves så i fiksert celleimmunoanalyse som er beskrevet ovenfor ved å tilsette den merkede monoklon til de fikserte celler under betingelser med antigen overskudd. Den merkede monoklon som gir den høyeste detekterbare binding blir bestemt og kan til å begynne med benyttes for in vivo radioimmuno gjenspeiling.

Når en in vitro immunoanalyse benyttes for å overvåke status hos en cancerpasient, må det benyttes en kvantitativ immunoanalyseprosedyre. Ved slik overvåking gjennomføres analysene periodisk og resultatene sammenlignes for å bestemme hvorvidt pasientens tumorbelastning er øket eller redusert. Vanlige analyseteknikker som kan benyttes inkluderer direkte og indirekte analyser. Direkte analyser involverer inkubering av en vevprøve eller celler fra pasienten med et merket antistoff. Hvis prøven inkluderer brystcancerceller vil det merkede antistoff binde til disse. Etter vasking av vevet eller cellene for å fjerne ikke-bundet merket antistoff, blir vevprøven avlest på nærvær av merkede immunkom-plekser. Ved indirekte analyser blir vev- eller celleprøven inkubert med umerket monoklonalt antistoff. Prøven behandles så med et merket antistoff mot det monoklonale antistoff (f. eks. et merket antimurin antistoff), vasket og avlest for nærvær av merkede ternærkomplekser.

For in vitro diagnostisk bruk vil antistoffene karakteristisk fordeles i kittform. En slik kitt vil karakteristisk omfatte: antistoffet i merket eller ikke-merket form i egnede beholdere, reagenser for inkubering og vasking, et merket antimurin antistoff hvis kitten er for en indirekte analyse og substrater og dervatiseringsmidler avhengig av merkelappens art. For in vivo gjenspeilingsbruk vil antistoffet også være distribuert i kittform og vil karakteristisk omfatte de samme typer komponenter som nevnt ovenfor. Antistoffet kan leveres derivatisert med et middel allerede bundet til eller chelatert med radioisotopen som skal benyttes eller monoklonene kan suppleres derivatisert kun med bindings- eller chelateringsmidlet, og radioisotopen som skal benyttes kan suppleres separat. Radioisotopen som skal benyttes kan tilsettes akkurat før bruk slik at man oppnår et optimalt radioaktivitetsnivå for gjenspeilingen for tidspunktet for administrering av midlet til pasienten. Human brystcancer antigenkontroller og -instruksjoner kan også være inkludert hvis dette er hensiktsmessig for prøven.

De følgende eksempler gir en detaljert beskrivelse av fremstilling, karakterisering og bruk av representative monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen. Disse eksempler er ikke ment å begrense oppfinnelsen på noen måte.

Immunisering.

Friskt postkirurgisk human brystcancervev og et antall normalvev ble benyttet for å fremstille membranekstrakter ved homogenisering og diskontinuerlig succrosegradient sentrifugering. Human brystcancer cellelinjer ble oppnådd fra Breast Cancer Task Force, Amercan Type Culture Collection (ATCC) og fra Dr. Jorgen Fogh ved Memorial Sloan Kettering. Cellene ble opprettholdt og benyttet som anbefalt av Breast Cancer Task Force, ATCC og Dr. Fogh. For immunisering ble enten membranekstrakt inneholdende 100 >jg protein (Lowry analyse) eller ti millioner levende brystcancerceller, inokulert intraperitonealt i 5 uker gamle Balb/c mus. Musene ble injisert identisk to ganger i måndelige intervaller. Tre dager etter det siste skudd ble miltene fjernet for cellefusjon.

Hybridom metoder.

Somatiske cellehybrider ble preparert i henhold til Buck, D.W., et al, supra, ved bruk av murin myelomcellelinjen Sp-2/0/Agl4. All hybridom-cellelinjer ble klonet ved begrensende fortynning. Halvparten av fusjonene benyttet splenocyter fra mus immuniset med brystcancer membranekstrakter og halvparten brukte splenocyter fra mus immunisert med levende brystcancercellelinjer. Treogåttitusen firehundrede og fireogtyve brønner ble generert fra disse fusjoner av hvilke toogtyve-tusen firehundrede og niogfemti viste hybridomvekst.

Avsøkingsmetoder.

Hybridomsupernatanten ble analysert på reaktivt antistoff i enten en fastfase enzymbundet immunosorbentanalyse, ELISA, med den immuniserende brystcancermembranekstrakt, eller den indirekte immunofluorescens-analyse med den immuniserende brystcancercellelinje. For fastfasemem-bran ELISA ble 40 ul 0,1 mg/ml brystcancermembran protein anbragt i polyvinylklorid mikrotiterbrønner i 12 timer ved 4°C. Ekstraktene ble aspirert og brønnene vasket med fosfatbuffret saltoppløsning, PBS, inneholdende 1% bovin serum albumin, BSA. Brønnene ble så inkubert med 45 ul 1:10 fortynnet hybridom supernatant. Fortynningsmiddel var media med 25 mM av en buffer, 10% bovin serum og 0,1% natrim acid. Etter 30 min. ved romtemperatur ble brønnene igjen vasket og inkubert 45 min. ved 37"C med en 1:200 fortynning av peroksydase konjugert gjeteantimuse IgG. Fortynningsmidlet var PBS. Brønnene ble så vasket med PBS og omsatt med 200 ml l,2-azino-di(3-etylbenztiazolin sulfonsyre i 0,1 M natrimsitrat buffer pH 4,2 i 30 min. ved romtemperatur. Optisk densitet ble målt ved 405 nm på en mikroElisa leser. For hvert forsøk ble en positiv kontroll, anti-p 2 mikroglobulin ved 5 ug/ml, omsatt med normalt human nyremembran. Dette ga en optisk densitet på 1,0<+->0,1 (standard avvik). Bakgrunnen var 0<+->0,1 optisk densitetsenheter, O.D., ved bruk av media uten musemonoklonat antistoff. Brønner som ga en reaksjon på brystcancermembranekstrakten på over 0,7 O.D. ble gjemt.

For indirekte immunofluorescens cellelinjeanalyse ble 100.000 brystcancerceller av den immuniserende cellelinje plassert over natt med egnet media i hvert kammer i et sett av åttekamrede slider. På tilsvarende måte ble 100.000 fibroblastceller fra cellelinje CC95 inkubert over natt i kamrede slidebrønner. Cellene ble vasket med PBS inneholdende 1% BSA. Brønnene, både de med brystcancer og med fibroblast, ble inkubert i 30 minutter ved 4°C med 1:10 fortynninger av hybridomsupernatant. Cellene ble vasket igjen og inkubert 30 minutter ved 4°C med en 1:50 fortynning av fluorescein isotiocyanat (FITC)-konjugert gjeite F(ab')2antimuse lg. Cellen ble vasket tre ganger, fiksert i 1,5% formaldehyd i PBS i 5 minutter, kamrene fjernet og skyllet i PBS. Slidsene ble så montert i en blanding inneholdende polyvinylalkohol, glycerol, buffere og et preserver-ingsmiddel og undersøkt med et fluorescens mikroskop. Hybridomceller som viste sterk fluorescent binding til brystcancercellene men ingen fluorescent binding til fibroblastene, ble gjemt. 5.156 viste brystcancer reaktivitet ved denne avsøking.

Supernatanter fra de 5.156 positive celler ble så prøvet i fastfaseELISA med syv normalvevekstrakter (lever, lunge:, mage, nyre, mandel og milt). Hver brønn supernatant som ga en ELISA O.D. på over 0,3 ble kassert. 1.101 av supernatant ene ble funnet å være ikke-reaktive med normalvev ekstrakter.

De 1.101 hybridomsupenatanter ble prøvet på frosne snitt av human brystkarsinomvev. 6 u snitt ble festet til slides, fiksert 10 minutter i aceton ved 4°C, tørket 10 minutter ved romtemperatur, vasket med PBS, blokkert med hesteserum og inkubert 20 minutter ved romtemperatur med 100 pl ren hybridomsupernatant. Slidsene ble vasket med PBS og til slutt inkubert 20 minutter ved 37 "C med en 1:50 fortynning av perksyd-ase konjugert kanin anti-muse lg, vasket igjen med PBS og til slutt inkubert 7,5 minutter ved 37 "C med 0,5 mg/ml diaminobenzidin i 0,05 M Tris buffer pH 7,2 inneholdende 0,01% hydrogenperoksydase. Slidsene ble flekket med hematoxylin, dehydratisert og montert i et medium inneholdende 35,9% metyl/n-butylmetakrylat kopolymer, 7,1% butyl benzyl ftalat og 0,3% 2,6-ditertbutyl-p-kresol. 124 brønner ga brystcancerselektiv binding og ble klonet.

Rensing og klassebestemmelse.

Immunoglobulinklasse og underklasse for de monoklonale brystcancersel-ektive antistoffer ble bestemt ved en immunodott analyse i det vesentlige som beskrevet av McDougal et al. J. Immunol. Meth. 63:281- 290 (1983). Antistoffer ble også internt merket ved dyrking av 2-3 x 10^ hybridomceller i 4 timer i et metionin-fritt medium inneholdende 0,2 pCi<35>§ metionin.<3>25S merkede antistoffer ble immunopresipitert med fikserte staphylococcus A celler, eller med fikserte staphylococcus A celler på forhånd belagt med kanin anti-muse lg, og immunopresipi tåtene ble analysert ved SDS-PAGE for å bestemme antistoff lett- og -tung kjedemobilitet, mangel på ekstrakjeder samt evne for hvert antistoff til å binde staphylococcalt protein A.

Antistoffene ble ekspandert in vivo. Balb/c- eller Fl (C57B/6 x Balb/c) mus ble primet med 0,5 ml pristan intraperitonealt og etter 10 - 14 dager inokulert med 1 million log fase hybridomceller i PBS. Ascit fluid ble lagret ved -70 °C og tint og filtrert gjennom en 0,8 um filterenhet før ytterligere rensing.

Noen IgG antistoffer som bandt staphylococcalt prtein A ble renset ved affinitets kromatografi på protein A-kromatografisk harpiks inneholdende enten agarose, dextran og/eller akrylamid med pH trinngradient eluering. IgG antistoffer som ikke bandt protein A ble presipitert ved tilsetning av ammonium sul fat til 40% metning ved 0°C eller ved binding til DEAE eller "Affigel" (Biorad, Richmond, California). Alternativt renses IgG antistoffer ved kromatografisk å benytte en Sephacryl S-200 kolonne fulgt av DEAE cellulose som beskrevet. Presipitatene ble oppløst igjen i PBS, dialysert til 20 mM Tris pH 7,2 og kromatografert på en 1,6 x 50 cm kolonne av dietylamino metyl cellulose (DEAE), eluering med en 1,5 1 0-600 mM NaCl gradiant ved 4'C ved en strømningshastighet på 1 ml/min. I hvert tilfelle ble kolonnefraksjonene overvåket ved SDS-PAGE og de reneste antistoffraksjoner ble samlet, konsentrert til 1 - 3 mg/l, dialyset til PBS/0,02% NaN3og lagret ved 4°C.

IgM antistoffer ble renset ved gelfiltrering og en 2,6 x 40 cm kolonne av Sephacryl S-300 eller annen gelfiltrering eller harpiksholdig agarose, dextran og/eller akrylamid, eluering med PBS/0.01% natrium azid ved romtemperatur ved en strømningshastighet på 1 ml/min.

Selektivitetsbestemmelse.

For å evaluere selektiviteten for brystcancer ble de rensede antistoffer prøvet ved immunoperoksydasesnitt flekking på snitt av 16 normale vev og ved immunofluorescent celle utsortering av fem blodcelletyper. Immunoperoksydaseflekking ble gjennomført som ovenfor bortsett fra at kjente fortynninger av rensede antistoffer i PBS innen området 1-40 ug/ml ble benyttet istedet for hybridomsupernatanter. De rene antistoffer ble først titrert for å finne den minimale konsentrasjon som ga sterk immunoperoksydaseflekking på brystcancersnitt og så benyttet ved den konsentrasjon for normal vevp røver. Perifere blodceller (plater, lymfocyter, røde blodlegemer, granulocyter og monocyter) ble preparert ved sentrifugering ved bruk av et medium som separerte monocyter fra polymorfonucleære leucocyter. Cellen ble omsatt med antistoff ved den optimale konsentrasjon bestemt ovenfor i 30 min. ved 4°C, vasket, omsatt med en 1:50 fortynning av fluorescein isotiocyanat-konjugert gjeite anti-muse lg i 30 min. ved 4°C, vasket igjen og undersøkt i en cellesorterer. Vaskebuffer og fortynningsmiddel var PBS med 1% gelatin og 0,02% natrimazid. Cellesortereren var utstyrt med en 76 um dyse og en 1 watt argonionelaser ved 488 nm. En 80 mm konfokal linse ble benyttet på den optiske skinne for fokusering. Andre filtere som ble benyttet var et 515 nm interferensfilter og et 515 nm absorbansfilter (for spredd laserlys) og et nøytraldensitets 1,5 filter for fremadrettet vinkellysspredning. Konturplotter av log fluorescein fluorescens mot fremoverrettet vinkellysspredning ble benyttet for prøveanalysene. Ingen blodcelletyper viste påvisbar binding.

Bindingsoppførslene for de krevede antistoffer er angitt i Tabell I. De følgende forkortelser benyttes for å angi strukturer bundet av antistoffene: Ac, acini; G, kjertler; T, tubuler; D, kanaler; L, lumen; W, svette-kjertler; E, epitel; S, talgkjertler; Gr, granulocyter; Mk, megakariocyter; M, makrofag; Ly, lymfocyter; Bl, basalsjikt; Fe, fokalepitel; A, alveolær foringsceller; B, Bowmans kapsel; Mu, muskel; og I "islets"; H, hårfollik-ler; U, glomerulier og V, kar/endotelial.

Bestemmelse av brystcancertumorbindingsområde.

For å bestemme hvor vidt et område brystcancer kan erkjennes av hvert antistoff, ble brystcancerselektivie antistoffer prøvet ved immunoperoksydaseflekking på frosne snitt av 27 forskjellige brysttumorer. Brystcance-ren som ble benyttet for snittflekking var alle infiltrerende intraduktale karcinomer slik at dét ikke kunne skje noen korrelering av antistoffbinding med histologiske typer av brystcancer. I tillegg ble ingen korrelering mellom antistoffbinding og nodalstatus eller estrogenreceptorstatus funnet for tolv tumorer for hvilke donorinformasjon var tilgjengelig. Antistoffene reagerte like godt med metastatiske og primære brysttumorer. Resulatetene av disse prøver for de krevede antistoffer er angitt i Tabell 2.

Bestemmelse av brystcancer cellebindingsområde.

Antistoffer ble ytterligere evaluert med henblikk på område av brystcancer cellelinje erkjennelse ved immunofluorescensanalyser på 14 brystcancer cellelinjer. Tabell 3 angir resultatene av disse prøver for de krevede antistoffer.

Ikke- brystcancerbinding av gjenspeilende monoklonale antistoffer.

Til slutt ble antistoffene prøvet ved immunoperoksydaseflekking på 11 ikke-bryst malignancier. Resultatene for de krevede antistoffer er gitt i Tabell 4.

Tumor brystcancerområde, brystcancercellebindingsområde, blodcellebinding og selektive karakteristika for de monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen er oppsummert i Tabell 5.

Antistoff affinitet og antigen densitet.

Flere av de krevede antistoffer ble jodert og prøvet for binding til MCF-7, CAMA1-, SKBR3 eller ZR7530 celler. Antistoffene ble merket med<125>j ved bruk av kloramin T til en spesifikk aktivitet på ca. 10 uC/ug. For å bestemme immunoradiokjemisk renhet ble 100.000 cpm av to av de merkede antistoffer i 0,5 ml fetal kalveserum serieabsorbert med 5 aliquoter målceller i 15 minutter ved 0°C (generelt 4 millioner celler/ali-quote) og den gjenværende radioaktivitet i supernatanten etter hver absorbsjon ble bestemt.

For målinger av assosiasjonskonstanter ble kjente konsentrasjoner av merkede og ikke-merkede monoklonale antistoffer inkubert med målceller i fetal kalveserum i 10 minutter i is. Aliquoter av celle/antistoffbland-ingen ble så tellet i en gammateller eller filtrert igjennom Microfold filterplater (V & P Scientific) og filtrene tellet. For å gjøre regning for ikke-bundet antistoff holdt tilbake i væskene på filtrene ble kontroller inneholdende de samme konsentrasjoner av antistoff men ingen celler gjennomført i parallell. Assosiasjonskonstanter og antigenkopitall pr. mål beregnes fra affinitetsprøveresultatene og er angitt i Tabell 6.

For å identifisere antigener erkjent av de monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen ble immunopresipitering av antigenene gjennomført i henhold til følgende metode. Polystyrenkuler (Precision Plastic Ball Co.) med diameter 8 mm ble dekket med 10% rykende salpetersyre i iseddik og inkubert i 3 timer i et 50°vannbad. Etter syrebehandlingen ble kulene skyllet tre ganger med destillert vann, dekket med 1% natriumditionit og 0,1 M NaOH og inkubert tre timer i et 50°vannbad. Kulene ble skyllet igjen tre ganger med destillert vann, dekket med 0,1% l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-karbodimid (EDAC), 0,2% suberinsyre (suberinsyre oppløst i dimetylformamid) og inkubert over natt ved romtemperatur. Kulene ble skyllet tre ganger med destillert vann og merket for identifisering.

Rensede monoklone antistoffer ble fortynnet 0,2 mg/ml i 2-(N-morfo-lino)etan sulfonsyrebuffer og de tidligere behandlede og merkede polystyrenkuler ble anbragt i individuelle rør og dekket med 450 ul fortynnet antistoff og 50 pl frisk 1% EDAC. Rørene ble tettet og inkubert ved 25"C i 24 timer. Etter denne inkubering ble kulene skyllet to ganger med PBC og ble enten benyttet friske eller lagret noen dage ved 4°C før bruk.

Nymerkede målcelleekstrakter ble fremstilt fra human brystcancercellelinjer merket med 125-1 ved laktoperoksydasemetoden til Marchalonis, J., "An Enzymic Method for the Trace Iodination of Immunoglobulins and other Proteins", Biochem. J. 113:299-305 (1969) eller med 35-S ved dyrking i 35-S metionin. De merkede celler ble oppløst i oppløseliggjør-ingsbuffer (1% (v/v) Triton X-100, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 25 mM Tris-HCl, pH 7,5). Fire deler merket ekstrakt ble blandet i en beholder med en del oppløseliggjøringsbuffer inneholdende 5 mg/ml bovin serum albumin for å gi en konsentrasjon på 10 mg/ml BSA. Kulene belagt med monoklont antistoff ble tilsatt til beholderen og inkubert i 4 timer på is under rysting. Merket antigen ble pipettert fra beholderen og kulene skyllet 4 ganger med oppløseliggjøringsbuffer. Kulene ble fjernet, bragt i individuelle rør med 100 ul Laemmli SDS gel prøvebuffer og inkubert 3 minutter i kokende vann. Kulene ble fjernet og prøvene kjørt over en SDS gel med egnede standarder.

Immunopresipiterningsprøve på antistoffene antydet at fem av dem (454C11, 452F2, 520C9, 741F8 og 759E3) alle bandt et monomert protein på ca. 200 K dalton funnet i cancerøst brystvev. To av de fem (520C9 og 741F8) antas å erkjenne den samme epitop på 200 K dalton proteinet. 545C11 og 759E3 binder en andre epitop på det samme antigen og 452F2 binder en tredje epitop på det samme antigen. Fire av antistoffene (41B4, 87H7, 452E12, 457D7) binder til en 230.000 dalton intracellulær antigen. Syv antistoffer (2G3, 200F9, 203E2, 245E7, 369F10, 697B3 og 788G6) binder til høymolekylvekts muciner ,HMW. To antistoffer (51C3 og 454A12) binder til transferrinresptorer i form av en 97.000 dalton antigen. Hverken 451C3 eller 454A12 blokkerte binding av transferrin til reseptoren. Antigenbindingsegenskapene for de monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen er oppsummert i Tabell 7.

Antistoff Isotype.

Antistoff isotypen ble bestemt som følger: Et nettverk av 5 mm ruter, lett opptrukket med blyant på nitrocellulosearket og 1 ml dråper av antiisotype sera (Litton Bionetics, Kensington, Maryland, kaninantisera til mus k, X, ot, -yl, -y2a, -y2b, -y3 og u kjeder) påføres slik at hver rekke av kvadrater fikk en flekk av hvert tung- og lettkjedet reagens. Arket inkuberes 1 time ved romtemperatur i et fuktig kammer, skylles hurtig i PBS-BSA inneholdende 1% vekt/volum og etterlates over natt i PBS-BSA ved 4°C. Strimler skjæres løs med sakser og lagres ved 4°C i PBS-BSA inneholdende 0,02% natriumazid. Alternativt kan strimlene lufttørkes og lagres tørt ved 4°C. En serie små rør fremstilles inneholdende 3 ml hybridom kultur supernatant eller supernatant fortynnet med PBS-BSA. 1:10 fortynninger er vanligvis vellykkede og enkelte supernatanter kan fortynnes helt til 1:200. En nitrocellulosestrimmel inkuberes i hvert rør i 1 time ved romtemperatur. Strimlene skylles tre ganger i PBS-BSA og inkuberes i 1 time ved romtemperatur i fortynnet kanin anti-muse-pepperrot peroksydase. Strimlene skylles to ganger i PBS-BSA og to ganger i trisbuffer. Strimlene anbringes i trisbuffer inneholdende diaminobenzidin og hydrogenperksyd inntil tilstrekkelig farge utvikles på antiisotypeflekkene (vanligvis 3-4 minutter). Antistoffisotypene er antydet i Tabell 8.

Prøver av hybridomene som produserer de krevede antiklonale antistoffer er deponert hos Collection of In Vitro International, 7885 Jackson Road, Suite 4, Ann Arbor, Michigan 48103, U.S.A.

Eksempel I

Dette eksempel viser en metode for merking av antistoffene ifølge oppfinnelsen med radioisotoper av jod, enten 125 jod eller 131 jod, ved bruk av en metode som er kjent for å jodere tyrosinrester.

Monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen kan merkes ved den følgende mikrometode: 0,1 mg av det rensede monoklonale antistoff merkes med 10 millicuriemengder av 125 jod som følger. En 2,5 cm 21 nål skyves delvis gjennom septum av en 3 ml ampulle og en 3,0 ml engangssprøytesylinder pakket med glassull festes til nålen. Det monoklonale antistoffet 0,1 N NaCl, fortrinnsvis ikke mere enn 0,2 ml i volum, tilsettes med en tuberkulinsprøyte utstyrt med en 20 nål som på forhånd er skyllet med boratbuffer. Natrium 125 jod oppløsningen er fortrinnsvis ikke mer enn 0,2 til 0,3 ml og tilsettes med en sprøyte festet til en 18 nål som på forhånd er skyllet med buffer. Blandingen omrøres kort for å blande oppløsningen av protein og 125 jod. Sluttfortynning av jodkloridet skjer ved å blande 0,2 ml 125 jodklorid i en mengde av ca. 125 x 10"^ M med en spesifikk aktivitet på 10 millicurie/mol. Etter ca. 1 min. blir et overskudd på 6,25% oppløsning av humanserum albumin eller animal albumin slik som bovinserum albumin tilsatt til oppløsningen. Det merkede antistoff føres gjennom en egnet kolonne for å fjerne ikke-bundet radioaktivt jod; en ionebytteharpiks eller et gelfiltreringsmedium slik som Sephadex G-25 kan tilsettes. For Sephadex kolonnerensing blir etter føring av merket antistoff gjennom harpiks i en mengde på ca. 1 ml/min., harpiksen skyllet med ytterligere 1 til 1,5 ml av den ovenfor nevnte human albumin oppløsning.

Eksempel II.

De monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen kan også joderes ved forbindingsmidler. Dette eksempel beskriver den radioaktive merking av monoklonalt antistoff med et jodert imidineringsreagens. Imidoester metylparahydroksybenzimidat HCL (MPHBIM) syntetiseres i henhold til den metode som er beskrevet av Wood et al., "The Radioactive Labeling of Protein With an Iodinated Imidination Reagent", Analytical Biochem. 69:339-349 (1975). MPHBIM joderes som følger: 3,7 ml MPHBIM oppløses i 1 ml 50 millimolar natriumboratbuffer pH 8,5 for å oppnå en 20 mM MPHBIM lageroppløsning. 1,0 ml 40 mM natriumjodid fulgt av 10 microliter natriumjodid-125 oppløsning med en spesifikk aktivitiet på ca. 2 millicurie/mol tilsettes til 1 ml av MPHBIM lageroppløsning. 1 ml 40 mM kloramin T tilsettes under hurtig blanding. Blandingen holdes i ca. 15 mn. ved 20 - 22°C hvoretter 0,1 ml 1,05 p-merkaptoetanol tilsettes for å redusere kloramin T og gjenværende jod. pH-verdien i oppløsningen senkes deretter mot nøytralitet ved tilsetning av 20 ul 1 molar eddiksyre og det dannes et flokkulert hvitt presipitat. Ikke-omsatt MPHBIM jod og kloramin T forble oppløselige. Presipitatet av jodert aminoester samles ved sentrifugering ved 10.000 omdreininger/minutt i fem minutter, oppløst i 2 ml 50 mM natriumboratbuffer pH 8,5 ved 37 "C. Jodering av antistoffer gjennomføres som følger: 20 mg renset antistoff suspenderes i 1 ml 4 mM jodert forbinder, 50 mM natriumboratbuffer ved pH 9,5. Reaksjonen gjennomføres ved 37 "C i et tidsrom tilstrekkelig til å oppnå den ønskede mengde binding. Under disse betingelser blir den radioaktive merkelapp innarbeidet på antistoffet i en mengde av ca. 1 - 2/time med en maksimal innarbeiding av ca. 30% av jod 125 merkelappen. Ikke-omsatt bindemiddel kan fjernes ved dialyse mot 0,15 M natriumklorid inneholdende en 5 mM natriumfosfatbuffer ved pH 7,4.

Eksempel III.

Merking av monoklonalt antistoff med chelaterende grupper- DTPA.

De monoklonale antistoffer kan merkes med 111—In ved bruk av chelater-ingmidlet dietylentriaminpentaeddiksyre (DTPA) anhydrid i henhold til metoden ifølge Hnatowich et al., Science 220:613-615 (1983). Antistoff 113F1 fremstilles ved 11 mg/ml dialysert inn i NaHC03ved pH 7. 1 mg DTPA cyklisk anhydrid ble oppløst i 10 ml CHCI3. 40 ul av denne oppløsning ble avgitt til 5 ml glassprøverør og CHCL3fordampet med en strøm av N2. 100 ul 113F1 tilsvarende 1,1 mg protein ble tilsatt til røret inneholdende 4 ug anhydrid og røret ble kort slynget. Etter 1 minutt ble det tilsatt 5 ul 111-In med en spesifikk aktivitet på ca. 3,28 x 10^ cpm/ml i 0,5 M natriumacetat pH 5,8 tilsatt. To PD10 kolonner ble preparert med 20 ml fosfatbufret salin 1% bovinseumalbumin. Prøvene ble kjørt på PD10 kolonnene med 2,2 ml tomvolum. En 2,5 ml proteintopp og 2,5 ml liten molekyltopp ble funnet ved eluering med PBS 1% BSA. Kontrollen var en 100 ul prøve 113G1 sammen med 4 ul av et mikro-gram/mikroliter DTPA, ikke-anhydride, og 5 ul 111-In. DTPA anhydrid merket 113F1 proteintoppen inneholdt 75% av tellingene og den lille molekyltopp pr. fraksjon inneholdt ca. 25% av tellingene. I kontrollen forble ca. 92% av tellingene i den lille molekylfraksjon.

Eksempel IV.

Merking av antistoff med forskjellig aktiviteter av indium.

Monoklonalt antistoff 113F1 fra det forgående forsøk ble fortynnet i 50 mM NaHCC-3 pH 7 til konsentrasjoner på 100, 10 og 1 ug/ul. 100 ul av hver fortynning av 113F1 ble tilsatt til et 4 ug DTPA anhydrid i et glassrør som i Eks. II. 111-In ble fortynnet i 0,5 molar natrim acetat pH 5,8 til 100 microcurie/10 pl. 100 microcurie 111-In i 10 pl oppløsnig ble tilsatt til rørene inneholdende antistoffet. Blandingen ble behandlet som i Eks. III. 27% av tellingene ble funnet i proteinfraksjonen og 1 pg/100 pl fortynning og 60% av tellingene ble funnet i 100 pg/100 pl fortynning.

Eksempel V.

Merking av antistoff 245E7 med 111- Indium.

Dette eksempel viser merking av et annet antistoff ifølge oppfinnelsen med 111-In. 1 mg DTPA cyklisk anhydrid ble oppløst i 10 ml tørr CHCI3. 40 pl av oppløst DTPA anhydrid ble anbragt i et 5 ml glassrør og fordampet med N2for derved å gi ca. 4 pg DTPA cyklisk anhydrid belagt på innsiden av røret.

100 pl antistoff 245E7 i en konsentrasjon av 15 mg/ml i 50 mM NaHCC"3 pH 7 ble tilsatt til DTPA cyklisk anhydrid. Røret ble kort slynget og satt hen i ca. 1 minutt for å danne komplekset.

Fem prøver ble satt opp som følger:

111-In ble fortynnet til en spesifikk aktivitet på 100 cpm/pl i 0,5 natriumacetat pH 5,8. 10 ml av denne 111-In oppløsning ble tilsatt til

hvert rør. 10 ug DTPA i ikke-anhydridform ble tilsatt til rørene 2 og 4. Innholdet av hvert rør ble kjørt på en PD10 kolonne ekvilibrert med NaHCC>3 som i Eks. III. Prøvene ble samlet og protein- og små molekyl-topper ble tellet i en væskescintillasjonsteller ved bruk av konvensjonelle metoder. Resultatene er vist i Tabell 9.

Resultatene antyder at 77% 111-In bandt til DTPA merket 245E7. Etterfølgende tilsetning av overskytende fri DTPA fjernet ikke indium fra DTPA-245E7 antistoff komplekset. Prøve 3 viste at indium ikke binder ikke-spesifikt til antistoffet i noen vesentlig mengde, imidlertid synes indium å holdes tilbake på kolonnen istedet for å bli eluert med småmole-kylf raks jon. DTPA tilsatt før eller etter indium resulterer i at indium eluerer i små-molekyltoppen.

Eksempel VI.

Opptak av 111- Indium merket monoklonale antistoffer mot brysttumorvev. Dette eksempel viser at 111-In merkede monoklonale antistoffer effektivt bindes av human brysttumorvev.

Seks antibrysttumor antiklonale antistoffer 113F1, 245E7, 260F9, 280D11, 2G3, 266B2 og en negativ kontroll MOPC21 ble kovalent bundet til DTPA anhydrid ved den metode som er beskrevet i Eks. III. Antistoff DTPA komplekset ble radiomerket ved chelatering ved 111-In ved en spesifikk aktivitet på ca. 1 u Ci/ ug. 111-In merket antistoff ble renset hvis nødvendig på en 0,4 x 17 cm kolonne av Sephadex G50 til en radiokjem-isk renhet på ca. 90%. To ikke-brystspesifikke antistoffer, anti-carcino-embryonisk antigen monoklonalt antistoff, anti-CEA, oppnådd fra Medi-Physics, Emeryville, California og anti-prostatisk surt fosfatase antistoff, anti-PAP, oppnådd fra New England Nuclear Corporation, Boston, Massachusetts) ble merket på samme måte som antibrystcancer tumor antistoffene og tjente som postitiv bindingskontroll. Humanbryst- og kolorektal tumorvev ble oppnådd umiddelbart etter kirurgi og anbragt i friskt Eagles Minimal Essential Media (MEM) supplementert med 10% fetal kalveserum, ikke-essensielle aminosyrer, glutamin, peniccilin og streptomycin (MEM) for transport. Friskt vev ble benyttet innen 3 timer etter mottagelsen mens kryopreservert vev ble holdt i MEM ved-70°C. Vevet ble seksjonert manuelt med kirurgisk utstyr til 1,0+-0,02 mm kuber og undersøkt på størrelsesnøyaktighet ved bruk av et okkulær mikrometer. Ved bruk av sterilteknikker ble vevkubene overført til en 96 brønners mikrotiterplate inneholdende 200 pl MEM og enten 1,0 eller

10 ug 111-In merket antistoff. Vevene ble inkubert fra 1 til 24 timer ved 37 "C i en 5% CO2vannkappeinkubator. Etter inkubering ble media omhyggelig fjernet ved bruk av en automatisk pippetør med minimal oppbryting av vevet og friskt media tilsatt. Etter inkubering i ytterligere 20 minutter ble media igjen erstattet og vevet inkubert i ytterligere 20 minutter. Etter denne siste vasking ble media fjernet og vevet overført til et tørt tarert vektpapir. Vevet ble tørket ved 70"C i 20 minutter og ble så veiet og anbragt i prøverør for telling i en Nal brønnteller. Resultatene angis som prosent tilført radioaktivitet i vevet/vektenhet tørket vev. Små forskjeller i størrelsen på hver vevkubus ble korrigert.

Bindingspesifisitet.

For å fastslå at akkumuleringen av radiomerket antistoff i tumorvev skyldes spesifikk binding eller en ikke-spesifikk adsorbsjon ble radiomerkede anti-CEA- og anti-PAP antistoffer, benyttet som kontroller, inkubert med frisk og kryopreservert human kolorektal tumorvev som eksprimerer CEA. Fig. 1 viser prosentandel innarbeiding av radioaktivitet mot inkuberingstid ved 37 °C for begge antistoffer, hert ved 1 ug og 10 jjg/brønn for et tumorvev.

Ved 1 ug/brønn konsentrasjonen viste anti-PAP antistoffet liten innarbeiding hele tiden. I motsetning viste anti-CEA antistoffet en ca. 20 ganger øket akkumulering. Ved 10 ug/brønn var forskjellen i radioaktivi-tets akkumulering for de spesifikke og ikke-spesifikke antistoffer meget mindre, noe som antydet metning av antigenesetene.

Spesifikk binding av anti-CEA kontroll antistoffet ble ytterligere demonstrert ved et kompetitivt bindings studium. Tumorvev ble inkubert med metningsnivåer (25 ug) ikke-merket anti-CEA antistoff i 17 timer før normalanalyse ved bruk av 1 ug merket anti-CEA antistoff. Kontroll-brønnene mottok ikke det ikke-merkede antistoff. Som vist i Tabell 10 var det når det gjaldt ikke-spesifikt antistoff i det vesentlige ingen endring i vevakkumulering av radioaktivitet med preinkuberingen mens når det gjaldt det spesifikke antistoff oppsto det en stor reduksjon i akkumuleringen i vevet som på forhånd var inkubert med ikke-merket anti-CEA antistoff.

Bindingsselektivitet.

Et panel bestående av merket anti-CEA og anti-PAP og seks antibrystcancer tumor monoklonale antistoffer ble prøvet ved bruk av to human brysttumorvev. Replikatmålinger for binding av det samme antistoff i det samme vev viste kun små variasjoner mens variasjonen i binding av det samme antistoff i forskjellige vev eller forskjellige antistoffer i det samme vev er meget større som vist i Fig. 1.

Antistoff 113F1 viste kun moderat binding i en av tumorvevene men viste den høyeste grad av binding i det andre. Selv om det er forventet viste anti-CEA antistoffet den samme grad av binding som anti-PAP antistoff i en av brysttumorvevene, det førstnevnte viste øket binding med henblikk på det sistnevnte i det andre prøvede tumorvev. Videre vises det i venstre spalte av Fig. 1 resultatene av en repetisjonsmåling av de samme antistoffer og de samme vev analysert til å begynne med (opptrukne stolper) og tre dager senere (skraverte stolper). Selv om det er lette forskjeller i nivået av opptak av individuelle antistoffer er rekkefølgen i henhold til antistoffakkumulering uforandre.

Eksempel VII.

Nitten 8 uker gamle nakne hunnmus ble implantert med MX-1 tumorer subkutant i den høyre dorsale flanke. Musene ble gitt næring og vann ad libitum. 14 dager etter implantering og etter at de subkutane tumorer hadde nådd en størrelse på ca. 0,5 cm<3>ble vannet erstattet med vann inneholdende 0,1% Kl.

Monoklonalt antistoff 260F9 ble merket med 125-1 l,3,4,6Tetrakloro-3^,6^-difenyl glycoril "Indogen" som følger. 10 ul "Idogen" ble plasseret i et sterilt glassrør og 1 USi 125-1 som Nal salt med en spesifikk aktivitet på 17 Ci/mg (New England Nuclear) ble tilsatt til jodogenet. Monoklont antistoff 260F9 i fosfatbuffret saltoppløsning uten azid ble tilsatt til jodogen 125-1 for å merke antistoffet ved en spesifikk aktivitet på 5 uCi/ug antistoff.

Monoklonalt antistoff MOPC21 ble merket på samme måte og tjente som kontroll. Ca. 2 ug merket antistoff inneholdende ca. 10 uCi 1-125 ble administrert til hver mus. Merkede antistoff ble administrert i et volum av ca. 0,1 ml PBS inneholdende 1% BSA via musehalevenen. 4 dager etter administrering av merket antistoff ble musene exanguinert ved øyepunktur. Blodet ble heparinisert, sentrifugert og blodplasma holdt tilbake. Organene ble dissekert, hakket til ca. 1 mm<3>stykker og vasket i saltoppløsning for å fjerne overskytende telling. Opphakket vev ble veiet og radioaktiviteten målt i en LKB gammateller.

Vevene av seks mus behandlet med jodert MOPC21 tjente som kontroller. Vevet av 13 mus behandlet med 1-125 merket 260F9 tjente som prøvevev. Tellinger/minutt/gram (cpm/gm) vev eller tumor ble bestemt og en opptaksindeks ble bestemt ved forholdet cpm/gm tumor:cpm/gram organ (T/O forhold).

Tabell 11 viser T/O forholdet for 260F9 ved 10 uCi 1-125 for MX-1 tumorer i hvert prøvet dyr. Tabell 12 viser T/O forholdet for MOPC21 ved 10 uCi 1-125 for MX-1 tumorer i hvert prøvet dyr. Tabell 13 viser midlere og standard avvik for alle prøvedyrene.

Eksempel VIII.

Før exsanguinering ble to mus behandlet med merket 260F9 og en mus behandlet med merket M0PC21 i henhold til Eks. 7 undersøkt ved bruk av et Searle Pho-gamma kamera med en hullcollimnator. Rådata ble samlet og computerforbedret. Bildene av behandlet og kontrollmus er vist i Fig. 3.

I den første linje i Fig. 3 vises fra venstre mot høyre bildet av en tumorbærende mus behandlet med 125-I-merket 260F9 før kirurgisk fjerning av tumoren, rådata; et computerforbedret bilde av samme mus; et bilde av musen etter operasjon, rådata; og et computerforbedret bilde av den samme mus etter inngrep. Et prominent lokaliseringsareal av detekterbar stråling er funnet i en possisjon tilsvarende MX-1 tumoren på dorsal høyre flanke av musen behandlet med 125-I-merket 260F9.

I den andre linje i Fig. 3 vises fra venstre mot høyre bilder av en tumorholdig mus behandlet med 125-I-merket MOPC21, et antistoff ikke spesifikt for tumor som ble benyttet som kontroll, rådata og et computerforbedret bilde av den samme mus. Det er intet tilsvarende lokaliser-ings område for detekterbar stråling på den dorsale høyre flanke som i musen behandlet med 125-I-merket 260F9. Videre synes fordelingen av merkelappen i kontrollmusen å tilsvare fordelingen av merkelappen i etterkirurgisk mus behandlet med 125-I-merket 260F9.

i den tredje linjei Fig. 3 vises fra venstre mot høyre bilder av en tumorbærende mus behandlet med 125-I-merket 260F9, rådata før inngrep, og et computerforbedret bilde av den samme mus. Et prominent lokaliseringsareal av detekterbar stråling er funnet på høyre dorsale flanke av musen i en possisjon tilsvarende MX-I tumoren.

I den fjerde linje i Fig. 3 vises fra venstre mot høyre bilder av den tumorholdige mus fra linje 3 etter inngrep og i rådata; et computerforbedret bilde av den samme mus etter inngrepet, et bilde av tumoren skåret ut fra den samme mus som rådata og et computerforbedret bilde av den samme utskårne tumor. En signifikant menge tumorspesifikt antistoff vises å ha lokalisert seg i tumoren. Mengde detekterbart tumorspesifikt antistoff som er tilbake i musen etter inngrep synes å være mindre enn mengden detekterbart antistoff i kontrollmusen i linje 2 i denne begrensede prøve.

De monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen har etter derivatisering med en merkelappdel et antall anvendelser. De immunogjenspeilende monoklonale antistoffer kan benyttes ved diagnose av primære malignøse brysttumorer. Pasienter med indikasjoner på en mulighet for malignøs brysttumor går rutinemessig idag gjennom en serie diagnostiske mammo-grafiske undersøkelser. I tillegg til mammografi kan de immunogjenspeilende antistoffer ifølge oppfinnelsen administreres subkutant eller intravenøst for å bestemme hvorvidt massen er positiv for opptak av merket antistoff ifølge oppfinnelsen. Akkumulering av merket antistoff vil tjene som ytterligere indikasjon som antyder behovet for biopsy eller mere utstrakte kirurgisk intervensjon.

De merkede monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen har også en klar anvendelse ved analysering av de kliniske prognoser for pasienter som har hatt mastectomi eller lumpectomi for fjerning av malinøs brysttumor. Konvensjonelt blir axillaer lymfeknutene hos slike pasienter dissekert for å bestemme graden av disseminering av ondartetheten. Under vanlig praksis vil pasienter med positive knuter få en omgang med adjuvant kjemoterapi. Axillaer knuteprøvetaking er en invasiv prosedyre som krever generell anestesi. Det medfører alle risiki som følger med store kirurg-iske inngrep inkludert infeksjon og reaksjon overfor anestetika, og krever en vesentlig postoperativ periode med smerte, rekonvalesens og helbredelse.

De monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen og derivatene derav kan benyttes som ikke-invasiv metode for å bestemme nodal involvering av brystondartethet og kan tjene som en adjunktiv prosedyre til konvensjo-nell nodal dissekering eller som erstatning for denne.

Brukbarheten av radiomerkede monoklonale antistoffer er vist, i det minste som et forstudium, i et antall kliniske studier. McKenzie et al. "Immunoscintigraphy for Detection of Lymph Node Mestastases from Breast Cancer" Lancet No. 8414:1245 (1984) har vist at subkutan interdi-gital injeksjon av et 1-131 merket monoklonalt antistoff spesifikt for en human malignøs brysttumor kan benyttes for å bekrefte nærværet av metastaser hos pasienter som allerede var mistenkt for å ha tumorer involvert axillære lymfeknuter, og for å detektere tumorer i lymfeknuter der nærværet av tumor ikke var forventet. Ved bruk av et Toshiba GCA402 gammatellerkamera og en høyenergi parallell hull kollimator datastyrt equalisering med en Informatek Simes 4 computer, ved 24 timers postinjeksjon immunoscintigrafi, var mere følsom enn konvensjo-nell klinisk undersøkelse for detektering av metastaser i drenerende knuter.

Brysttumorlokalisering med merkede derivater av monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen ved intravenøs administrering er også et klart alternativ til den subkutane administreringsvei. Ved denne metode blir det radiomerkede monoklonale antistoff innført i pasienten i en oppløsn-ing egnet for intravenøs administrering slik som 0,15 M NaCl med 1% human serum albumin. Det radiomerkede monoklonale antistoffet injiseres fortrinnsvis ved bruk av et venekateter i et volum av saltopp-løsning og ved ca. 30 minutter.

Ved både den subkutane og den intravenøse administrering prøves pasienten på allergi mot normal antistoff fra det dyr hvorfra det monoklonalproduserende hybridom ble fremstilt. Hvis det monoklonale antistoff derivatiseres med en radioisotop av jod blir generelt pasienten forbehandlet med Lugols jodoppløsning for å blokkere thyroidopptak av 131-1, og premediert med prometazin og prednisolon før administrering av immunogjenspeilende monoklonalt antistoff. Pasienten avsøkes over en periode på timer til dager etter administrering av det immunogjenspeilende monoklone antistoff. Avsøkningsmetoder for radioisotopisk gjenspeiling inkludert egnede kontrollprosedyrer slik som subtraksjonsanalyse med ikke-spesifikt antistoff er kjent for fagmannen på dette området og inkluderer computerassisterte fotoavsøking og computerassisterte tomocin-tigrafi.

Andre kliniske anvendelser av de merkede monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen er klare for fagmannen på dette området. Slike anvendelser inkluderer bruken av merkede monoklonale antistoffer for å overvåke responsen på metastatiske metatumorer overfor terapien ved anvendelse av forskjellige terapeutika inkludert kjemoterapeutika, immunotoksiner, immunomedikamenter eller lymfokiner.

De merkede monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen kan også benyttes for å detektere nærværet av livstruende sterkt morbide metastaser på et tidspunkt før deres symptomatiske manifestering tidlig nok til å tillate preventiv eller forbedrende radioterapi. De fleste høyst selektive antistoffer ifølge oppfinnelsen kan også merkes for å bestemme fordelingen eller lokaliseringen eller mangelen derpå av monoklonalt antistoff i det normale vev hos pasienter for derved å gi en basis for identifisering av brystcancer spesifikke monoklonale antistoffer som med fordel kan benyttes som komponenter for antistoffbaserte terapeutika slik som immunotoksiner eller immunomedikamenter for behandling av ondartede brysttumorer.

Disse og andre aspekter ved oppfinnelsen vil være åpenbare for fagmannen.

Hybridomer som fremstiller de monoklonale antistoffer er deponert ved "American Type Culture Collection" (ATCC) eller "Invitro International Inc." (IVI) under Budapestavtalens regelverk. Oppstillingen nedenfor viser cellelinjebetegnelse, IVI- henholdsvis ATTC aksessnummer og deponeringsdato.

Hybridomene er tilgjengelige under den såkalte ekspertløsning.

Claims (15)

1. Murint monoklonalt antistoff egnet for gjenspeiling av brysttumorer, karakterisert ved at det: a) ikke binder til blodceller; b) har et brysttumorbindingsområde på minst 0,25 eller har et brystcancer cellelinjeområde på mere enn eller lik 0,25; c) har en selektivitet lik eller mindre enn 0,09; d) har en G- eller M isotype, og e) konjugert til en gjenspeilende del, gir et signal tilstrekkelig til å gjenspeile brystcancertumorer.

2. Antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at det er valgt blant 2G3, 9C6, 32A1, 33FB, 35E10, 41B4, 87H7, 106A10, 113F1, 120H7, 140A7, 200F9, 203E2, 219F3, 245E7, 254H9, 266B2, 317G5, 369F10, 387H9, 421E8, 451C3, 452E12, 452F2, 454A12, 454C11, 457D7, 520C9, 650E2, 697B3, 741F8, 759E3, 788G6 og monoklonale antistoffer som er funksjonelt ekvivalente slike i denne gruppen.

3. Antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at antistoffer binder til et antigen valgt blant de som finnes i cancerøst brystvev med en molekylvekt på ca. 200 K dalton, med en molekylvekt på ca. 230 K dalton, med en molekylvekt på ca. 55 K dalton og et høymolekylvekts-mucin.

4. Immunogjenspeilende middel, karakterisert ved at de omfatter: a) det monoklonale antistoff ifølge krav 1 og b) en detekterbar merkelapp.

5. Middel ifølge krav 4, karakterisert ved at det omfatter a) det monoklonale antistoff ifølge krav 1 og b) en detekterbar merkelapp konjugert dertil.

6. Middel ifølge krav 5, karakterisert ved at den detekterbare merkelapp er kovalent bundet til det monoklonale antistoff eller bundet til en forbinder som er bundet til det monoklonale antistoff eller er konjugert til slikt monoklonalt antistoff ved hjelp av et chelateringsmiddel.

7. Middel ifølge krav 6, karakterisert ved at den detekterbare merkelapp er bundet til det monoklonale antistoff ved bruk av N-kloro-p-toluensulfonamid eler tetrakloro-3oc, 6c<-difenylglykoril.

8. Middel ifølge krav 6, karakterisert ved at forbinderen er metyl-p-hydroksybenzimidat eller N-succinimidyl-3-(4-hydroksypentyl)-propionat.

9. Middel ifølge krav 6, karakterisert ved at chelateringsmidlet er dietylentriaminpentaeddiksyre anhydrid eller etylentriamin-tetra eddiksyre.

10. Middel ifølge krav 4, karakterisert ved at den detekterbare merkelapp er valgt blant: a) fluorokromer; b) radioaktive isotoper; c) radioopake stoffer; og d) NMR detekterbare stoffer.

11. Middel ifølge krav 10, karakterisert ved at den radioaktive isotop er valgt 123 -lod; 131-Iod, 111-Indium og 99-Technetium.

12. Middel ifølge krav 4 og en bærer egnet for parenteral administrering.

13. Metode for påvisning av brysttumorer hos en pasient som trenger slik påvisning, karakterisert ved at den omfatter administrering av en påvisningseffektiv mengde av et immunopåvisningsmiddel ifølge krav 4 og detektering av dette middel hos pasienten med en egnet detekteringsanordning.

14. Hybridomer som produserer de monoklonale antistoffer ifølge krav 1 eller 2.

15. De monoklonale antistoffer ifølge krav 3, karakterisert ved at de har en molekylvekt på ca. 55 K dalton som kryssblokkerer hverandre.