NO850354L

NO850354L - Paaviselige molekyler samt fremgangsmaate ved fremstilling og bruk derav

Info

Publication number: NO850354L
Application number: NO850354A
Authority: NO
Inventors: Jannis Stavrianopoulos
Original assignee: Enzo Biochem Inc
Priority date: 1984-01-30
Filing date: 1985-01-29
Publication date: 1985-07-31
Also published as: IL74186A; ES8801620A1; EP0810435A2; JPH08800B2; AU581577B2; EP0810435A3; CA1314503C; ES8900237A1; DK39885A; ES8706967A1; IL74186A0; ES539928A0; AU3821285A; DK39885D0; EP0154788A2; ES554044A0; ES554043A0; US4707440A; EP0154788A3; JPS60197645A

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstilling og anvendelse av molekyler som er knyttet til metallkomplekse-ringsreagenser eller biotinholdige påviselige grupper, samt selve produktene.

Bruk av radioaktivt markerte diagnostiske og terapeutiske reagenser fremstilt ved markering av slike reagenser med metallioner har i det senere fått fornyet interesse. I denne teknikk knyttes en gelatiseringsrest kovalent til det aktuelle molekyl, og et radioaktivt ion gelatiseres ved de avsondrede gruppene til gelatoren. De radioaktivt markerte reagenser kan så brukes både in vitro (f. eks. i radioaktive immunologiske målingssystemer) og in vivo (f. eks. både i diagnostiske billedteknikker og i be-strålingsterapiteknikker). Bruk av metallmarkering av ikke-radioaktiv type er også av interesse som f. eks. ved bruk av kjernemagnetisk resonans, elektronspinnresonans, kataiyseteknikker o.l..

Forskjellige metallgelatiseringsgrupper er blitt knyttet til biopolymerer tidligere. Aktiverte analoge av etylen-diamintetraeddiksyre (EDTA) avledet fra 1-(p-benzendiazonium)EDTA (I) er blitt brukt på proteiner:

(Se, f.eks., Meares et al. U.S. patent 4,043,998, Sundberg et al. Journal of Medicinal Chemistry 17:1304-1307

(1974) eller Sundberg et al., Nature 250:587-588 (1974).1 p-benzendiazonium EDTA med formel I kobles gjennom en azor binding til valgte tyrosin, histidin eller aminrester i proteiner, idet sistnevnte danner triaziner som er syrelabile. Dietylentriaminpentaeddiksyre (DTPA) er en metallgelatdanner som også er blitt knyttet ti polypeptider (se, f. eks., Krejcarek et al Biochemical Biophysical Research Communications 77: 582-585 (1977), Hnatovich Science 220: 613-615 (1983), eller Khaw, ibid, 209: 295-297 (1980).) Gelatoren knyttes gjennom en av karboksylgruppene gjennom en amidbinding til en proteinavledet aminogruppe som vist i formel II:

Dette DTPA konjugatet oppnås ved først å fremstille di-anhydridet og omsette dette med et protein. (Se f. eks., Scheinberg, Science 215: 1511-1513 (1982).) Medvirkning av di-anhydcidet kan imidlertid bevirke potensielle kryss-bindingsproblemer som enten er intramolekylære eller intermolekylære. Også tilknytningen av gelatdanneren gjennom en av sine karboksygrupper kan sette denne karbok^sygruppen ut av betraktning som komplekseringsrest, og således redusere gelatiseringsvirkningsgraden ved en modifisering av bindingsaffinitetskonstanten og geometrien .

Wieder et al U.S. patent 4.352.751 har også foreslått å binde metallgelatiseringsgrupper til proteiner ved bruk av trans-diaminocykloheksantetraeddiksyre (DCTA), knyttet gjennom en av sine karboksygrupper til aminogruppen i et protein. Som en modell viser Wieder et al omsetning med etylamin under dannelse av forbindelse (III):

Denne forbindelsen kan lide av de samme problemene som DTPA-komplekset ved at konjugering opptrer gjennom en av karboksygruppene og således potensielt reduserer bindings-affiniteten, og modifiserer geometrien til de resulterende metallkomplekser.

Andre metallgelatiseringsgrupper er også blitt knyttet til biopolymerer, f.eks., metylpikolinimidat til lysozym ( Benisek et al, J. Biol. Chem., 243:4267-4271 (1968)], ferritin til monoklonale antistoffer ( Block et al, Nature 301: 342-344 (1983)), o.l..

En mulighet for å overvinne de forannevnte problemer med tap av affinitet, begrensning av proteinreaktive rester og forandring i geometri eller kryssbinding er beskrevet i U.S. patentsøknad nr. 391.440 innsendt 23. juni 1982 for "Modified Nucleotides, Methods of Preparing and Utilizing, and Compositions Containing the Same" by Engelhardt et al. Denne søknad beskriver kobling av et tiocyanatderivat

av DCTA til en allylaminmodifisert deoksy UTP og mulig innføring i polynukleotider derav. Se IV:

Bruk av deoksyUTP allylamin og knytting ay dette til andre påviselige grupper såsom biotin er også beskrevet

(se, f.eks. Langer et al Proe. Nat. Acad. Sei. 78: 6633-06637 (1981))eller U.S. ansøkning nr. 255.223 innsendt 17. april 1981 med tittelen "Modified Nucleotides and Methods of Preparing and Using Same".

Det ville være en fordel å anvende DCTA-gelatiserings-midlet eller andre gelatiseringsmidler uten å måtte modifisere nukleotidene sterkt a priori, å anvende fysiologiske kjemiske prosessbetingelser og frembringe en rekke alternative metoder anvendelige i polypeptid, polynukleotid, polysakkarid og småmolekylkjemi.

Utviklingen av slik metodikk ville gjøre det mulig å bruke høyaffinitet , fleksible metallgelatiseringsmidler såsom DCTA, og kunne også utvides og anvendes på binding av andre gelatdannere eller påviselige rester såsom biotin.Foreliggende oppfinnelse er delvis basert på oppdagelsen av fremgangsmåter for rask, mild og fleksibelt feste av metallgelatiserende grupper og biotin til polymerene, og spesielt biopolymerer såsom polynukleotider, polypeptider eller polysakkarider. Bindingsmetodene innbefatter både bruk av kjente mellomproduktbindingsmidler (som imidlertid ikke tidligere har vært brukt for dette formål), eller medfører i noen tilfeller utvikling av nye bindings-eller brodan-nelsesgrupper. Oppfinnelsen vedrører også produktene som er fremstilt ved disse metoder og strekker seg til produkter som omfatter både polymerer knyttet til gelatdannere og analoger derav, til biotin og analoger derav, og til forskjellige mellomprodukter.

I tillegg vedrører oppfinnelsen også visse lavmolekylvekts (molekylvekt mindre enn ca. 2,000) molekyler bundet til en rekke påviselige reagenser såsom forskjellige gelatiseringsreagenser, og også biotinrester. De lavmolekylære forbindelser kan knyttes ved direkte bindinger eller alle kjente bindingstyper til ethvert gelatiseringsmolekyl eller potensielt gelatiseringsmolekyl. Lavmolekylvektkonjugatene mellom lavmolekylvektforbindelsene og gelatiseringsmoleky-lene har således formel (V): hvor A"*" er en lavmolekylær forbindelse med molvekt fortrinnsvis under 2,000, og Det er biotin eller en påviselig kjemisk rest omfattende en substituert eller usubstituert metallgelatdanner eller en forbindelse som kan gi en me-tallgelateringsforbindelse, helst en med formel (VI):

hvor M og R 3 er som nedenunder definert, og bindingen angir en direkte kovalent binding eller en passende av-standsarm som ikke interfereres med signaliseringsevnen til Det<a>, med de molekylære gjenkjennelsesegenskapene til A , og som garanterer et stabilt konjugat mellom A"*" og Deta.

I en foretrukken utførelsesform omfatter et annet aspekt av oppfinnelsen et påviselig molekyl med formelen (VII):

hvor

A 3 er A 2 eller en polymer, både A 2 eller polymeren har minst en modifiserbar reaktiv gruppe valgt fra gruppen amino, hydroksy, cis 1,2-di OH, halogenid, aryl, imidazoyl, karbonyl, karboksy, tiol eller en rest omfattende et aktivert karbon;

A 2 er én kjemisk enhet med molekylvekt mindre enn ca. 2,000;

-X- er valgt fra -NH-CO-, -NH-CNH-, -N=N-, -NH-S02~, -0S02-, -NH-N=N-, -NH-CH2-, -CH2"NH-, -0-CO-, -NH-CH2-, -CH2-NH-, -0-CO-, -NH-C0-CH2-S-, -NH-C0-CH2-NH-, -0-C0-CH2-, -S-CH2-, -0-CO-NH-

eller en c^~c10forgrenet eller ikke forgrenet alkyl eller aralkylrest, som kan være substituert med OH; -Y- er en direkte binding til -S-, eller -Y- er

2 2 -S-R -, hvor R er en c^~c^0for9renet eller ikke-forgrenet alkylrest;

Z er klor, brom eller jod;

cL

E er 0, -N- eller et acyklisk toverdig svovelatom;

Det^ er en påviselig kjemisk rest omfattende biotin eller et substituert eller ikke substituert metall-gelatiseringsmiddel, eller en forbindelse som kan gi en metallgelatiseringsforbindelse, fortrinnsvis en forbindelse med formelen:

hvor R 3 er C^-C^-alkyl eller er -CH2-C00M, og hver M er et hensiktsmessig kation;

m er et heltall fra en til totalantallet av modifiserte reaktive grupper på A 3.

Et ytterligere aspekt i foreliggende oppfinnelse er et påviselig molekyl med formelen:

hvor A 3 er som ovenfor definert, j er en elektrontiltrekkende gruppe, K er en signalgivende enhet eller en fast matrisse, r er et heltall fra en til to og n er som ovenfor angitt.

Andre spesifikke aspekter av oppfinnelsen er individuelle nukleotider, sakkarider eller aminosyrer modifisert med gruppen X-R -E-Det som ovenfor angitt. Ytterligere aspekter ved oppfinnelsen vedrører syntetiske fremgangsmåter for fremstilling som generelle metoder for bruk av forannevnte produkter.

De resulterende kovalente konjugater mellom biopolymerene eller små molekyler og metallgelatorene eller biotin-restene kan anvendes for en rekke formål. F. eks. kan produktene brukes som påviselige produkter ved å gelatisere radioaktive metaller til dem. De kan så brukes i en rekke in vivo og in vitro terapeutiske, diagnostiske, billeddan-nende og måle (immunologisk måling eller hybridiserings-måling) teknikker. Biotinmarkerte biopolymerereller små molekyler kan brukes som påviselige molekyler overalt hvor biotin/avidin eller biotin/streptavidin-baserte par eller påvisningssystemer tidligere brukt. De syntetiske polymerer ifølge oppfinnelsen kan anvendes for samme formål som biopolymerene eller små molekyler ved å knytte den syntetiske polymer til biopolymerer eller små molekyler. Således kan f.eks. slike syntetiske polymerer ha mange radioaktive metaller pr. biopolymer eller liten molekyl, hvilket fører til at det dannes et meget sterkt signal.

Hvor lett innføringen er , fysiologiske prosessbetingelser, fleksibilitet og andre slike fordeler ved bruk av de DCTA-baserte gelatiseringsreagenser gir spesielt en gelator med høy affinitet uten tap av geometri og unngår kryssbinding ved innføringen. Fremgangsmåtene gir også mulighet for innføring, i det minste med bestemte bindingsmåter som er beskrevet nedenunder, kvantitativt mer markeringsreagens pr. molekyl enn tidligere kjent.

Enheten A 2 med liten molekylvekt skal omfatte de såkalte ligander som generelt inngår i immunologiske målinger for bestemmelse av dem. Disse omfatter legemidler som brukes i terapeutiske henseende, naturlig forekommende fysiologiske forbindelser, metabolitter, pestisider, forurens-ningen, enzymsubstrater, reaksjonsprodukt av et enzym og dets substrat o.l.. (For en liste over anvendelige rester A 2 se f.eks. spalter 12, 13, 14 og 15 i Rowley et al. U.S. patent 4.220.722). F. eks. er alkaloider, steroider, laktamer, aminoalkylbenzener, benzheterocykler, puriner, vitaminer, prostaglandiner, antibiotika, aminosyrer, pestisider o.l. innbefattet i A 2. Molekylvekten av A 2 er mindre enn ca. 2.000, spesielt mindre enn ca. 1.000.

Forbindelsen A''" med liten molekylvekt omfatter på den annen side alle de forannenvnte forbindelser for A 2 med det forbehold at A"^ ikke er et monosakkarid eller et mononukleotid. Fortrinnsvis er A"<*>" heller ikke en aminosyre. A"*" omfatter således generelt slike forbindelser som pestisider, droger, forurensninger, andre fysiologiske forbindelser o.l.. F.eks. omfatter A alkaloider, steroider, laktamer, aminoalkylbenzener, benzheterocykler, prostaglandiner, antibiotika o.l..

Bestemte andre produkter innenfor foreliggende oppfinnelse er påviselige polymerer som omfatter syntetiske polymerer og biopolymerer såsom polynukleotider, polypeptider eller polysakkarider, eller større fraksjoner som inneholder disse.

"Polynukleotid" skal omfatte både polyribonukleotider, polydeoksyribonukleotider eller alle polypuriner, poly- pyrimidiner eller analoge, eller kombinasjoner derav. Eksempler er DNA, RNA eller fragmenter derav.

"Polypeptid" skal omfatte alle polyaminosyrekjeder både med høy og lav molekylvekt. Disse omfatter proteiner, hormoner, enzymer, immunoglobuliner såsom f.eks. monoklonale antistoffer, proteinkomplekser o.l..

"Polysakkarid" betyr alle naturlige eller ikke naturlige forekommende polysakkarider enten de er lineære, ikke-lineære eller kryssbundne, vannløselige eller uløselige, usubstituerte eller delvis eller helt substituerte. Disse omfatter cellulose, stivelse, amylose, amylopektin o.l..

"Syntetisk" polymer betyr alle syntetiske polymerer med minst en modifisertbar reaktiv gruppe valgt blant amino, hydroksy, 1,2- cis di OH, halogenider, aryl, imidazoyl, karbonyl, karboksy, tiol eller en rest omfattende et aktivert karbon. Ikke-begrensende eksempler på egnede polymerer som kan modifiseres til å ha en slik modifiserbar reaktiv gruppe er polyetylen, polyakrylamid, polyuretan, polystyren, polyetylenglykol, polybutadien, polyvinyl-alkoholer og halogenider og kopolymerer derav. Hvis polymeren ikke inneholder den modifiserbare reaktive gruppe, kan en slik gruppe bindes til polymerene ved enhver for fagmannen innenfor organisk kjemi kjent metode.

3 2

Det er nødvendig at resten A (som enten kan være A ovenfor, eller en polymer) før omsetning har minst en av de flere modifserbare reaktive grupper valgt fra aminogrupper (såsom f.eks. -aminogruppen i lysin, aminogrupper i proteiner, aminogrupper i aminopolysakkarider eller reaktive aminogrupper på nukleotide baser), hydroksygrupper eller cis-OH-grupper (såsom f.eks. i steroider, sakkarider, serin eller i sukkerrester av polynukleotider såsom termi- nal 3' eller 5' hydroksy), karboksylgrupper (såsom f.eks. aspartat, glutamat eller derivater derav), tiolgrupper (såsom f.eks. cystein), karbonylgrupper (såsom sådanne i bestemte steroider, alkaloider, på terminale deler av naturlig forekommende proteiner, eller er holdbare ved modifikasjon som vist i det følgende), eller rester omfattende aktiverte karbongrupper (såsom C-3 eller C-5 karbonpunkter på tyrosinrester, C-4 punktet i histidinrester, det reaktive karbonpunkt i guanin, inosin, cytidin eller analoge derav. F.eks. har guanin et reaktivt karbonatom i stillingen C-8). Også A kan ha modifiserbare reaktive grupper såsom imidazoylgrupper i proteiner som del av en histidin-rest eller arylgrupper som del av tyrosinrest, eller halogenider som del av en syntetisk polymer. De reaktive karbonatomer i disse molekyler eller molekyldeler av A<3>bør kunne reagere kovalent med elektrofile såsom funksjo-nelle diazoarylforbindelser, og gjennomgå kopling (f.eks. diazokoplingsreaksjoner.)

Den modifiserbare reaktive gruppe på o A 3 kan også foreligge som modifikasjon av A 3, og innføringen deri av en slik gruppe. Den kan f.eks. også foreligge i en enzymkofaktor som kan være bundet, kovalent eller ikke-kovalent til et polypeptid.

Antallet modifiserbare reaktive grupper på A 3 vil avhenge av om det foreligger eller ikke foreligger slike grupper i A 2eller bestemte reaktive aminosyrer, baser eller sakkarider i polypeptidet, polynukleotidet eller henholdsvis polysakkaridet. Dette vil i tilfellet biopolymeren avhenge av den faktiske kjemiske sammensetning av biopolymeren,

av dennes molekylvekt, som den tredimensjonale strukturen til biopolymeren, og således den relative tilgjengelighet av reaktive grupper for formålet og kovalent samvirke med reaktive partnere. Det er f.eks. kjent at i proteiner er

det visse rester som er mer reaktive enn andre fordi de kan være nærmere overflaten, foreligge i bestemte aktive områder e.l.. Når biopolymeren modifiseres ifølge foreliggende oppfinnelse med et overskudd av modifiseringsreagens, vil de forannevnte faktorer bestemme mengden og graden av modifisering. Således kan en, flere eller eventuelt alle reaktive rester, baser eller sukkerrester reagere med en tilsvarende reaktiv partner.

Alternativt kan en individuell enhet i en biopolymer, såsom en individuell aminosyre eller et individuelt nukleotid eller sakkarid modifiseres forut, og så innføres i en ferdig oppbygget biopolymer.

I alle fall er det en rutinesak for en fagmann å avgjøre om det foreligger reaktive rester i en gitt enhet A 2 eller biopolymer, og hvor mange rester som har reagert for å bestemme sluttstøkiometrien av konjugatet mellom A 2 eller biopolymeren og den modifiserende gruppe. Slike teknikker som radioaktiv markering kan brukes for å bestemme modi-fiseringsgraden, og faktisk telle antallet modifiserte reaktive grupper. I de fleste tilfeller vil antallet aktuelle modifiserte grupper være mindre enn antallet potensielt tilgjengelige modifiserbare grupper for alle bestemte kjemiske typer.

Blant de foretrukne produkter innenfor oppfinnelsen er sådanne med formel (VII):

hvor A 3 er A 2 eller biopolymeren omfatter et polynukleotid, polypeptid eller polysakkarid.

-X- omfatter generelt en kovalent bindingsfunksjon mellom en av de A 3 -modifiserbare reaktive grupper og gruppen R 1. X kan være en enkel funksjon såsom et amid eller ester, eller -X- kan være en bro eller binding mellom en modifiserbar reaktiv gruppe på A 3 og R 1 gruppen. Når f.eks. X er -NH-CO-, er -NH-delen derav normalt avledet fra en aminfunksjon i A"<*>" eller biopolymeren, og X er en standard amidgruppe. Når X er -N=N- (azobinding), er denne binding normalt knyttet til en aktivert karbonholdig modifiserbar gruppe på A 2 eller på biopolymeren.

R"*" kan være usubstituert fenyl eller fenylsubstituert med et halogenatom såsom klor eller brom. R"<*>" kan også være en fenylsubstituert med en gruppe -Y- hvor Y kan være en direkte kovalent binding til -S- eller være -S-R 2-. R 2 kan være toverdig c^~c^0forgrenet eller ikke-forgrenet alkylen, fortrinnsvis lavere alkylen (C1 ,-CD,), helst metylen, etylen, propylen, isopropylen, n-butylen, isobutylen eller pentylen.

R"*" kan også være en toverdig C]_~C]_q forgrenet eller ikke-forgrenet alkylen som beskrevet for R^ ovenfor, og fortrinnsvis lavere alkylen (C^-Cg) , helst C^-C^ . R"1" kan også være en C-^-C^q aralkylen, såsom fenyl substituert med lavere alkylen, spesielt benzylen.

Det*3 er en påviselig kjemisk rest som enten omfatter biotin, eller et modifisert biotin molekyl, eller omfatter Det , som er en metallgelatiseringsforbindelse eller en forbindelse som kan gi en metallgelatiseringsforbindelse. Foretrukket blant disse forbindelser er slike molekyler som EDTA, DTPA eller DCTA eller analoge eller homologe derav. Sterkest foretrukket er forbindelsen med formel (VIII):

Denne formel viser en cykloheksan-basert metallgelatdanner som kan være knyttet til svovel S gjennom stillingene 4 eller 5, og som har fra 1-4 metall eller ikke-metall-kationer, monovalente kationer eller jordalkalimetaller. Således kan hvert enkelt cykloheksanbasert molekyl med metaller i oksydasjonstilstand +1 ha opptil 4 metallkat-ioner (hvor begge R 3 grupper er Cr^COOM). Mer sann-synlig er det at med høyere oksydasjonstilstander vil antallet metaller avta til 2 eller selv 1 pr. cykloheksanskjelett. Cykloheksanfunksjonen muliggjør varierende stereokjemi, og den forutnevnte: formel skal ikke begrense molekylet til noen spesifikk stereokjemi. Spesielt kan begge aminogruppene være enten cis eller trans til hver-andre .

Cykloheksanet kan være usubstituert (bortsett fra de to nitrogenfunksjoner og svovelsubstituenten) eller kan være substituert, spesielt i 4-stillingen, med en hydroksy eller acylert hydroksygruppe, såsom med en lavere acyl-substitusjon.

For formål ved foreliggende oppfinnelse er andre cykloheksanbaserte analoge såsom alkylderivater (f.eks., lavere alkyl) eller substitusjonsprodukter, hvori derivatiseringen eller substitusjonen ikke interfererer med bindingen av cykloheksankjernen til svovel, med gelatiseringsevnen (affinitet, geometri, o.s.v.) til de enkelte gelatise-ringsrester, eller med den totale biologiske aktiviteten til det modifiserte A 3 ekvivalenter med de som er vist. Substitusjoner som er ekvivalente for formålet ved foreliggende oppfinnelse er slike som hydroksy, acyl, halogen, amino o.l..

A 3 restene er tilknyttet cykloheksanrester som kan foreligge i syreform (M=H) eller et ikke-radioaktivt metall eller ikke-metallform (f.eks., M=Mg+^, Na<1>K<+>, Li<+>, NH^<+>, etc.) eller i en radioaktiv metallform.

Ethvert metall som kan påvises en diagnostisk fremgangsmåte in vivo eller in vitro, eller er i stand til å gi terapeutisk virkning in vivo eller in vitro kan brukes. Både ikke-radioaktive og radioaktive metaller kan anvendes for dette formål. Således kunne metaller som kan katalysere kjemiske reaksjoner, metaller som kan påvirke NMR eller ESR-spektere eller metaller som kan emittere stråling av forskjellige typer eller intensiteter anvendes. Spesielt kan ethvert radioaktivt metallion som er i stand til å produsere et terapeutisk eller diagnostisk resultat hos et menneske eller dyr eller i en in vitro diagnostisk måling anvendes ved utøvelsen av foreliggende oppfinnelse. Egnede ioner omfatter de følgende: Antimon-124, Antimon-125, Arsenikk-74, Barium-103, Barium-140, Beryllium-7, Vismut-206, Vismut-207, Kadmium-109, Kadmium-115m, Kalsium-4 5, Cerium-139, Cerium-141, Cerium-144, Cesium-137, Krom-51, Kobolt-56, Kobolt-57, Kobolt-58, Kobolt-60, Erbium-169, Europium-152, Gadolinium-153, Gull-195, Gull-199, Hafnium-175, Hafnium-175+181, Indium 111, Iridium-192, Jern-55, Jern-59, Krypton-85, Bly-210, Mangan-54, Kvikksølv-197, Kvikksølv-203, Molybdenum-9 9, Neodymium-14 7, Neptunium-237, Nikkel-63, Niobium-95, Osmium-185+191, Palladium-103, Platinum-195m, Praseodynium-143, Prometium-14 7, Protaktinium-233, Radium-226, Rhenium-186, Rubidium-86, Ruthenium-103, Ruthenium-106, Scandium-44, Scandium-4 6, Selenium-7 5, Sølv-llOm, Sølv-111, Natrium-22, Strontium-85, Strontium-89,Strontium-90, Svovel-35, Tantallum-182, Tecnetium-99m, Tellurium-125, Tellurium-132, Turbium-160, Thallium-204, Thorium-228, Thorium-232, Thallium-170, Tinn-113, Titan-44, Wolfram-185, Vanadium-48, Vanadium-49, Ytterbium-169, Yttrium-88, Yttrium-90, Yttrium-91, Sink-65 og Zirkonium-95.

Foretrukne undergrupper innenfor ovennevnte formel (VII)

er:

-nH-CO- kombinert med C^-C-^forgrenet eller ikke-forgrenet alkyl; aktivert karbon på tyrosin, histidin eller guanin inosin eller cytidin kombinert med -N=N-Aryl-, hvor aryl er som definert i formel (VII). -NH-CO-CH2-S- kombinert med C^-C^ forgrenet eller ikke forgrenet alkyl eller med aryl, hvor aryl er som definert i formel (VII),

Spesifiserte eksempler på modifiserte A 3 enheter ifølge foreliggende oppfinnelse er vist i tabell I nedenunder:

Spesifikke eksempler på lavmolekylære enheter av A^" eller A 2 er digoxin, morfin, kodein, heroin, diterpen-alkaloider, estrogener, DES, barbiturater, amfetaminer, katekolaminer, klorpromazin, azepiner, diazepiner, kof-fein, teofyllin, hasjisj, THC, penicilliner, ethambuzol, kloromycetin, nitrofurantoin, metadon, serotonin, anti-histaminer, polyhalogenerte bifenyler, fosfatestere, tio-fosfater, karbamater og metabolitter, derivater og analoger derav.

Andre foretrukne produkter innenfor oppfinnelsen er sådanne med formel (IX):

hvori en A 4 er A 2 eller en polymer, idet både A 2 eller polymeren har minst en modifiserbar reaktiv gruppe valgt blant amino, aryl, imidazoyl eller en rest omfattende et aktivert karbon; A 2 er en kjemisk enhet med en mindre molekylvekt enn ca. 2.000; j er en elektrontiltrekkende gruppe, K er en signalgivende rest eller en fast matrisse, n er et heltall fra 1 til ca. 2, fortrinnsvis 2, og m er som ovenfor definert.

j kan være hovedsakelig hvilken som helst elektrontiltrekkende gruppe. Fortrinnsvis er j valgt fra gruppen klor, fluor, brom, sulfongrupper og jod, idet klor er sterkest foretrukket.

K kan omfatte nesten alle signalgivende enheter som tidligere er brukt, og ethvert system som kan utvikles i frem-tiden. Det omfatter en rest som gir et signal selv,

f.eks. en radioaktiv markør eller en rest som etter ytterligere omsetning ved manipulering vil gi opphav til et signal, f.eks. et enzymbundet system. Ikke-begrensende eksempler på egnede signalgivende enheter er beskrevet i U.S. patentsøknad nr. 391.440 av 23. juni 1982. K kan knyttes til benzenringen ved enhver tidligere kjent metode. K kan også være en fast matrisse såsom cellulose. Dia-zoniumproduktet kan fikseres til cellulose ved den metoden som er beskrevet i Seed, U.S. patent nr. 4.286.964.

De foretrukne produkter med formel (IX) er:

Produktene med formel IX er overraskende stabile og er sterkt elektrofile. En slik stabilitet og sterkt elektrofile egenskaper gjør det mulig å knytte produktene med formel (IX) til A 3 når den modifiserbare reaktive gruppe er meget inert, såsom det reaktive karbonet i C-8-stil-ling i guanin. Det antas at slik stabilitet og sterkt elektrofile egenskaper skyldes den elektrontiltrekkende gruppe eller grupper på benzenringen.

Andre produkter innenfor foreliggende oppfinnelse er individuelle modifiserte mononukleotider (ribo- og deoksyribo-) med formel (X):

hvor P er z

eller metall eller ikke-metallsalter derav;

Q<1>er H eller OH;

BA er en modifiserbar purin eller pyrimidinbase, såsom guanin, inosin eller cytidin.

Blant disse produkter foretrekkes slike hvor BA har formelen (XI) :

Ytterligere produkter innenfor foreliggende oppfinnelse er forskjellige mellomprodukter som er beskrevet senere.

Fremgangsmåter

Reaksjoner hvori det foretrukne cykloheksanbaserte skje-lettet inngår kan utføres på DCTA eller analoge, homologe eller substituerte derivater derav, som fremstilles ifølge ethvert av de følgende reaksjonsskjemaer:

Reaksjonsskjema I: Fremstilling av brom- DCTA

Reaksjonsskjerna I viser reduksjonen av 3,4-dinitrofenol (I-l) til 3,4-diaminocykloheksan (1-2); bromering av 3,4-diaminocykloheksan under dannelse av 3,4-diamino-bromcykloheksan (1-3); og videre omsetning av denne forbindelse med en halogenid-substituert karboksymetylfor-bindelse under dannelse av tetrakarboksymetylderivatet derav som gir tittelforbindelsen (1-4). Detaljer i disse reaksjoner kan finnes i Engelhardt et al, U.S. patentsøknad 391.440 av 23. juni 1982.

Reaksjonsskjerna II: Fremstilling av substituert DCTA

( eksemplifisert ved 4- hydroksy, 5- brom DCTA)

Skjema II viser bruk av 4-cykloheksen-l,2-dikarboksyl-syreanhydrid (II-l) som utgangsmateriale. Omsetning med alkohol etterfulgt av hydrazin gir et dihydrazid (II-3) som ved omsetning med nitrat og oppvarmning gjennomgår omleiring til et diuretan (II-5). Behandling av diure-tanet med base fører til et diamin (II-6) som så kan kar-boksyalkyleres til å gi 1,2-diamino-4-cykloheksentetra-eddiksyre (II-7). Denne forbindelsen kan f.eks. så be- handles med N-bromsuccinimid (NBS) og gi 4-brom-5-hydroksy-DCTA derivat (II-8). Detaljer ved disse reaksjoner kan finnes i de etterfølgende eksempler.

Reaksjonsskjema III: Fremstilling av diaminocykloheksan N, N-( dialkyl, dieddiksyre) derivater

Skjema III viser bruken av 1,4-cykloheksadien (III-l) for å danne dibromderivat III-2, som videre kan omsettes med N-alkylsubstituert glysin og gi tittelforbindelsen (IH-3) .

I de ovenfor nevnte reaksjonskjemaer I, II eller III, må det være klart at forskjellige halogener eller også pseudohalogener kan anvendes, da målet er å substituere cykloheksanet med en avspaltbar gruppe som kan erstattes med en merkaptogruppe, SH. En slik avspaltbar gruppe kunne være klor, brom, cyano, tosylat, mesulat o.l..

Mellomproduktene eller utgangsmaterialene som brukes i disse reaksjonsskjemaer (såsom f.eks. diestercyklohekse-net (II-2)), kan brukes for fremstilling av ytterligere substituerte cykloheksanskjeletter, hvilket vil være åpenbart for en organisk kjemiker. Således kan en rekke forskjellige modifikasjoner og substitusjoner foretas i cykloheksankjernen uten å endre den grunnleggende kjemi av gelatiseringsgruppene eller av den utskiftbare avspaltbare gruppe.

Tilknytningen av det (substituerte eller usubstituerte) cykloheksanskjelett til A 3utføres gjennom en basisk nukleofil substitusjonsreaksjon mellom oksygenet, nitro-genet eller fortrinnsvis svovelatomet i en tiol-holdig forbindelse, og den avspaltbare gruppe eller grupper på cykloheksanet. Tilknytningen kan skje ved tre generelle veier.

Først kan man knytte A 3-X-R-SH-resten til den avspaltbare gruppeholdige cykloheksan ved nukleofil substitu-sjon.

For det andre kan man knytte en A 3-rest som inneholder en reaktiv gruppe til en forut fremstilt X1 -R-S-Det*3, hvor X' er en gruppe som kan reagere med den modifiserbare 3 reaktive gruppe på A og gi X.

For det tredje kan man anvende en kombinasjon av både den første og andre metode ved at A 3 først omsettes med en del av den brodannede gruppe, som igjen omsettes med et forut modifisert cykloheksan, hvilket gir sluttkonju-gatet.

.I den andre reaksjon (skjema IV, nedenunder), kan man fremstille en diazoaryl-rest-holdig cykloheksan (IV-2, bundet til cykloheksanet gjennom svovel) og omsette

dette med et protein eller et polynukleotid som følger:

I den tredje metode kan man f.eks. forut modifisereA<3>ved å omsette modifiserbare reaktive grupper med en halogenacylgruppe, og deretter omsette dette modifiserte A 3 med et modifisert cykloheksan som inneholder en nukleofil gruppe såsom en tiol eller amin (skjema V). Fremstillingen av halogenacyl A 3-er som i reaksjonsskjerna V er f.eks. vist i boken "Chemical Modification of Proteins" av Means og Feeney, Holden-Day, Inc.,1971, og i Rowley et al, U.S. patent 4.220.722.

"A 3-NH"-resten i reaksjonsskjerna V ovenfor kan også modifiseres istedet ved hjelp av en forbindelse som inneholder en diazoarylgruppe (såsom et 3,4,5-triklorbenzendiazoniumsalt) som inneholder en avspaltbar gruppe. En slik forbindelse er kjent i tetrafluorboratformen ( Kor-zeniowsky et al,Journal of Organic Chemistry, 1981, 46:2153-2159). Knytting av denne forbindelsen til en modifiserbar reaktiv gruppe A 3 modifiserer den resulterende A 3 ved å til denne knytte et utskiftbart klor-atom. (Et slikt reaksjonsskjema ville være en modifikasjon av skjema IV, ovenfor, oppnådd ved å snu trinnene). Generelt er knyttingen av (andre) aryldiazoniumfunksjo-ner til biopolymerer kjent (se Seed, U.S. patent nr. 4.286.964 og Meares et al, U.S. patent nr. 4.043.998).

Andre mulige A 3 modifikasjoner, spesielt for biopolymerer, som er anvendelige for å fremstille sluttproduktene i foreliggende oppfinnelse er omsetningen av aminogrupper med diketen som gir acetoacetylholdig A3-er, eventuelt etterfulgt av reduksjon. (Means og Feeney, ovenfor,

side 80-81). Reaktiviteten av ketongruppen i acetoace-tyl er anvendelig ved reduktive amineringsreaksjoner, hvor cykloheksangelatdanneren har et nukleofilt amin.

Amin-holdige biopolymererkan omsettes med imidoestere i alkalisk løsning og danne imidoamider, såkalte amidiner (Means og Feeney, ovenfor, side 90-91). Omsetningen foregår ved middels alkalisk pH i vandig løsningsmiddel og ved romtemperatur. Tilsvarende substituerte amidiner kan fremstilles som så kan omsettes med modifiserte cyklo-heksangelatdannere.

Sulfonylhalogenider og substituerte sulfonylhalogenider såsom klorider og fluorider er kjent for å reagere med amino, merkapto, imidazol og fenoliske hydroksygrupper i proteiner (Means og Feeney, ovenfor, side 97). Omsetning med alifatiske hydroksygrupper er noe langsommere. Tilsvarende substituerte sulfonylhalogenider kan brukes til å innføre utskiftbare grupper såsom utskiftbart klor i en biopolymer.

Individuelle modifiserte mononukleotider kan fremstilles ved å anvende alle de ovenfor beskrevne metoder på mono-nukleotidene.

Knytting av Det til polysakkarider kan utføres, f.eks. ved å omsette ethvert cis-diolholdig polysakkarid med bromcyan og deretter omsette det resulterende vannløselige eller uløselige aktiverte polysakkarid med en tilsvarende modifisert nukleofil gruppe inneholdende en cykloheksangelatdanner, et forstadium for denne eller biotin. Det samme skjema kan anvendes ved fremstilling av cis-diol-holdige molekyler med lav molekylvekt såsom f .eks-, digoxin.

Tilknytningen av en påviselig rest omfattende biotin ville generelt kreve modifikasjon av biotinsidekjeden ved tilknytning av en svovelholdig nukleofil. Et eksempel på en slik modifisering er vist nedenfor i reaksjonsskjema

VI:

Reaksjonsskjerna VI gir eksempler på bruken av 1-amino, 2-merkaptoetan. Reaksjonsskjemaet gir også eksempler på bruken av 3,4,5-triklorbenzendiazoniumsalt, men andre slike koblingsreagenser kan også brukes. F.eks. når A<3>er en biopolymer, kan denne modifiseres med et egnet halogenid, og merkaptoderivatet VI-5 kan omsettes med dette og gi sluttproduktet.

Generelt kan reaksjonene med cykloheksangelatdanneren eller derivater derav utføres med molekylet i nøytrali-sert form (COOH eller COONa eller COOalkyl-form), eller i nærvær av støkiometriske mengder av andre metaller såsom magnesium. Fremstilling av den aktive, påviselige cykloheksanrest inneholdende radioaktivt markert metall eller metall som kan påvises eller gis bilde av ved ikke-radioaktive metoder (NMR, ESR, osv.) kan utføres etter sluttrinnet i den organiske syntese.

Av spesiell interesse er fremstillingen av et radioaktivt markert produkt før bruken av reagenset. En fremgangsmåte ved fremstilling av et radioaktivt markert diagnostisk eller terapeutisk molekyl omfatter generelt å kontakte et terapeutisk eller diagnostisk reagens omfattende en molekylær gjenkjennbar del og en gela-tiseringsdel som kan gelatisere med et radioaktivt metallion, med et ionebyttermateriale med det radioaktive metallion bundet til seg og med en bindingsaktivitet for det radioaktive metallionet som er mindre enn bindingsak-tiviteten til gelatiseringsdelen for det radioaktive metallion, hvor den gelatiserende del før kontakten løsnes eller gelatiseres med et andre metallion med en bindingsaktivitet til gelatiseringsdelen mindre enn bindingsaf-finiteten til det radioaktive metallion, hvorved et radioaktivt markert terapeutisk eller diagnostisk reagens dannes ved kontakten, og deretter separere det radioaktivt markerte terapeutiske eller diagnostiske reagens fra ionebyttermaterialet. Det således standard radioaktivt markerte materialet brukes så umiddelbart i en in vitro eller in vivo diagnostisk metode. En slik fremgangsmåte er beskrevet i U.S. patentansøkning nr. , innsendt samme dag som foreliggende søknad av Y. Stavrianopolous

for "METHOD OF RADIOACTIVELY LABELLING DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC AGENTS CONTAINING A CHELATING GROUP".

Blant andre aspekter av oppfinnelsen er forskjellige mellomprodukter som brukes i de forannevnte syntesemetoder.

Således innbefatter oppfinnelsen også en modifisert forbindelse med formelen (XII):

hvor A 3er som ovenfor angitt, og inneholder minst en modifiserbar reaktiv gruppe valgt fra gruppen aminer og en rest omfattende et aktivert karbon;

er klor, brom eller jod; og

m er et heltall fra 1 opptil totaltallet av modifiserte reaktive grupper på A 3.

Denne modifiserte A 3kan anvendes ved fremstilling av de foretrukne påviselige sluttprodukter ifølge oppfinnelsen .

Oppfinnelsen innbefatter også en forbindelse med formel (XIII):

eller 4-hydroksy eller acyloksyderivatet derav,

hvor M er som forut definert;

-S- er toverdig svovelatom; og

Q 2- er H; forgrenet eller rettkjedet C^-C^-alkyl eller aralkyl med en gruppe valgt fra gruppen -OH, -SH, -NH2, -C0NHNH9, eller -C-Lv,2

hvor Lv er en utskiftbar gruppe; eller Q er

hvor Z er hydrogen, klor, brom eller jod, og J er

-NH2eller -N2CA , hvor CA er et motanion.

Eksempler på Lv er -N^, -Cl, -Br, tosylat, mesylat o.l.. Eksempler på CA er fluorborat, tetrafluorborat, tosylat, perklorat o.l..

Ytterligere andre mellomprodukter er modifiserte mononukleotider med formel XIV:

hvor P z, BA og Q<1>er som ovenfor definert,

De modifiserte mononukleotider (XIV) kan integreres i et polynukleotid og så omsettes med tilsvarende SH-gruppe inneholdende cykloheksangeltdanner eller biotin. Alternativt kan de modifiserte mononukleotider (XIV) omsettes med en cykloheksangelatdanner eller biotin, og de resulterende produkter innebygges i et polynukleotid.

Ytterligere mellomprodukter er forbindelser med formel

XV:

hvor j, n og K er som forut definert, og CA er et egnet motanion.

Fremstillingen av forbindelser (V) som inneholder gelatdannere med liten molekylvekt:

kan utføres ved alle kjente metoder for binding av metallgelatiserende rester eller potensielle metallgelatiserende rester til molekyler. F.eks. kan slike gelatdannere som EDTA, DTPA eller DCTA knyttes til amino- eller hydroksygrupper i A under dannelse av amider eller estere. Diazoaryl inneholdende gelatdannere eller potensielle gelatdannere kan knyttes til aktiverte aromatiske grupper på A"'".

Anvendelser

Bruk og anvendelser av gelatdanneren eller de biotinholdige forbindelser ifølge oppfinnelsen er ubegrensede, og omfatter enhver bruk som tidligere er kjent for denne type påviselige markerte forbindelser. F.eks. kan enhver forbindelse man ønsker å påvise og analysere i en prøve modifiseres ifølge teknikkene i foreliggende oppfinnelse. Av spesiell interesse er modifiseringen av antistoffer for bruk av immunologiske målemetoder, såsom sandwich immunologiske målemetoder. Også av interesse er modifiseringen av droger for radioimmunologiske målemetoder eller av proteiner i forbindelse med eller er kjent for å sitte på mikroorganismevegger eller mem-braner. Påviselige markerte proteiner fremstilt på

slik måte kan også brukes i konkurrerende immunologiske målemetoder. Markerte polynukleotider kan brukes i hy-bridiseringsmålinger.

Annen bruk av påviselige forbindelser, spesielt biopolymerer ifølge oppfinnelsen er ved bildedannelse, spesielt med monoklonale antistoffer. Disse kan modifiseres ifølge teknikkene ved oppfinnelsen og så være et metall til et gitt punkt i et levende materiale-såsom et animalsk legeme. Påvisning kan så utføres ved radio-logiske teknikker. Et metall som er båret til et slikt punkt kan også velges å være et emitterende og således gi lokalisert radioterapi (se, f.eks., Denardo, S. et al, i "Nuclear Medicine and Biology," Vol. IV, Pergamon Press, Paris, Frankrike, 1982, s. 182 - 185).

Av spesiell interesse er påvisning og identifisering

av virus og bakterielle DNA-sekvenser.

Polynukleotidprodukter fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes i diagnose av genetiske for-styrrelser ved å fremstille et polynukleotid komple-mentært til en DNA-gen-sekvens som har tilknytning til en genetisk forstyrrelse, og påvise hybridiserings-forløpene. Påviselige polynukleotider kan også brukes i kromosomal karyotyping, hvilket omfatter bruk av en rekke modifiserte polynukleotider svarende til en rekke definerte genesekvenser som befinner seg på kromosomet, og deretter påvise hybridisering.

En annen anvendelse innbefatter en fremgangsmåte for identifisering eller lokalisering av hormonreseptorpunkter på overflaten av celler, hvilken omfatter binding av en hormonreseptorbindende forbindelse som er en påviselig biopolymer under foreliggende oppfinnelse, og så påviser binding ved hjelp av et deteksjonssystem.

En annen bruk av metallgelatiseringskonjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse er ved fjerning av unødvendige og farlige akkumuleringer av metallioner fra mål spesi-fisert ved en spesiell biopolymer som gelatdannerdelen er knyttet til. Generelt kan de gelatdannende markerte molekyler ifølge oppfinnelsen brukes i andre påvisningssystemer som er kjente eller vil bli oppdaget senere. Slike anvendelser innbefatter gelatisering med ikke-radioaktive tunge metallioner for bruk som radioopake reagenser, gelatisering med et metallion som er påviselig med NMR, gelatisering med et metall med katalytiske egenskaper og som kan katalysere en kromogen kjemisk reaksjon o.l..

Biotinbundne forbindelser kan påvises ved å utføre in-kubering av dem med avidin eller streptavidin, hvori avidinet eller streptavidinet er kovalent koblet til en påviselig markør såsom et enzym (f.eks. alkalisk fosfatase eller peroksydase) som kan katalysere dannelsen av et kromogent produkt. Dette er det standardi-serte, velkjente enzym forbundede immunologiske målesystem (ELISA) og er beskrevet i U.S. patentsøknad nr. 392.440 innsendt 23. juni 1982 vedrørende "Modified Nucleotides, Methods of Preparing and Utilizing, and Compositions Containing the Same" fra Englehardt et al. Foreliggende oppfinnelse muliggjør også lett fremstilling av sett. Et sett kan omfatte en bærer som er aktuelt i seksjoner uten innvendig forbindelse for å romme i tett tilslutning en eller flere beholdere eller serier av beholdere såsom forsøksrør, glass,kolber, flasker, sprøyter e.l.. En første av disse beholdere eller serier av beholdere kan inneholde en påviselig forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse, eller forbindelsen i varierende konsentrasjoner slik at man kan bygge opp en standard interpoleringskurve. Hvis den gelatiseringsdannende bundne forbindelse foreligger i ikke-radiaktivt markert metallform, kan en annen beholder inneholde et ønsket radiaktivt metall og egnede ionebyttermaterialer for å gi utskiftning av "kulde" for radioaktivt metall. Således kan brukeren lett markere den gelatdannende kon-jugerte forbindelse med et radioaktivt metall. Alternativt kan en andre beholder eller serie av beholdere inneholde avidin eller streptavidin, idet slike molekyler er kovalent bundet til et enzym for bruk i et enzym immunologisk målesystem.

Etter denne generelle beskrivelse av oppfinnelsen, vil oppfinnelsen fremgå klarere under henvisning til bestemte spesifikke eksempler som her bare skal være illustrerende og ikke er ment begrensende for oppfinnelsens omfang medmindre annet er eksplisitt angitt.

Eksempel 1

Syntese av 1, 2 trans- diaminocykloheksentetraeddiksyre Trinn 1:

4-cykloheksen-l,2-dikarboksylsyreanhydrid (154 g , 1,01 mol) ble oppløst i 700 ml vannfri 200 grad etanol. Konsentrert svovelsyre (40 ml) ble tilsatt, og reaksjonsblandingen tilbakeløpkokt i 3 timer. Ca. 350 ml etanol ble fjernet ved destillasjon. Destillasjonen fjernet også vann som en del av etanol-vann-azeotropblandingen. Ca. 350 ml absolutt 200 grad vannfri etanol ble tilsatt,

og reaksjonsblandingen fikk så tilbakeløpskoke i ytterligere 90 min.. Så ble ca. 400 ml løsningsmiddel fjernet ved bruk av en rotasjonsfordamper utstyrt med en luftpumpe (ikke en aspirator). En liter eter ble satt til den gjenværende reaksjonsblanding, og reaksjonspro-duktene ble oppløst. Reaksjonsblandingen ble helt i en is-vann-blanding (1 liter vann og 1 liter is) og så plassert i en skilletrakt. Etter risting og separasjon av eter og vannsjikt, ble den vandige fase fjernet og kastet. Eterfasen ble ekstrahert tre ganger med 100 ml alikvoter kald 5% natriumbikarbonat for å fjerne alt H2S04 og monoester. (pH i bikarbonatsluttekstraktet var den samme som en ny 5% bikarbonatløsning.) Etersjiktet ble tørket over vannfritt Na2S0^under røring i 90 min.. Na2S04ble fjernet ved filtrering. Eteren ble fjernet fra produktet 4-cykloheksan-l,2-dikarboksy-latetyldiester på rotasjonsfordamper og luftpumpe.

Når det meste av eteren var fjernet ble vannbadetempera-turen gradvis øket til 90°C for å fjerne resten av eteren kvantitativt. Man fikk et utbytte på 160 g flytende diester.

Trinn 2:

4-cykloheksen-l,2-dikarboksylatetyldiester (160 g,

0,707 mol) og 250 ml teknisk hydrazin (54% hydrazin = 4,22 mol) ble plassert i en tilbakeløpsapparatur uten røring. Oljebadet ble så oppvarmet til 130°C

under argon. (Diesteren og hydrazinet forble i to faser.)

Absolutt (200 grad) etanol (mindre enn 100 ml) ble tilsatt under rask røring gjennom toppen av tilbakeløps-kjøleren inntil man fikk en fase. (Den melkeaktige fase forsvant.) Reaksjonsblandingen ble tilbakeløps-kokt ved 130°C under argon med røring i 24 timer. Produktet 4-cykloheksen 1,2-dihydrazin utfeltes etter-hvert som det ble dannet. Mens reaksjonsblandingen fortsatt var varm, ble den helt i et 2 liters begerglass og fikk avkjøle. Blandingen størknet, og råproduktet ble filtrert på en Buchner-trakt. Under filtrering ble det faste stoff fortsatt på Buchner-trakten vasket med etanol. Det rå hydrazidet ble omkrystallisert som følger: 1 liter 8 5% etanol (i vann) ble oppvarmet under røring. En porsjon (40 - 50 g) av det rå hydrazidet ble tilsatt. Hydrazidet ble oppløst mens blandingen ble kokt i 10 min.. Løsningen ble dekantert for å fjerne alt uløselig materiale, og løsningen fikk avkjøle langsomt ved romtemperatur. Etter som løsningen avkjøltes, utfeltes hydrazidet. Det ble filtrert ved bruk av en Buchner-trakt og så vasket med en liten mengde etanol.

Filtratets volum ble justert til 1 liter med absolutt etanol. Filtratet ble så oppvarmet under røring, og ytterligere 40 - 50 g rått hydrazid ble omkrystallisert som beskrevet ovenfor. Prosessen ble gjentatt inntil alt rått hydrazin var omkrystallisert. Man fikk tilsammen 120 g av hydrazinet.

Trinn 3:

4-cykloheksen-l,2-dihydrazid (20 g, 0,101 mol) ble oppløst i 200 ml 2N svovelsyre. 250 ml eter ble tilsatt, og reaksjonskolben plassert i et is-salt-bad og fikk kjøle til -2 til -3°C. Over et tidsrom på 5 - 10 min. ble fast natriumnitrit (13,9 g, 0,202 mol) tilsatt under kraftig røring. Blandingens temperatur fikk ikke over-skride 5°C. Man fortsatte å røre i 10 min.. Reaksjonsblandingen ble helt i en kald skilletrakt (skilletrakten

og en en-liters Erlenmeyer-kolbe var avkjølt i fryseren), og fasene fikk skilles. Eterfasen ble overført til den kalde, Erlenmeyer. Den vandige fasen ble ekstrahert to ganger med ca. 100 - 150ml porsjoner kald eter som følger. Den vandige fasen ble rørt med eteren i et isbad (ikke salt) i 10 min., og fasene ble så adskilt ved bruk av den kalde skilletrakten. De kalde eter-ekstraktene ble slått sammen og så ekstrahert to ganger med 30 ml porsjoner kald 5% natriumbikarbonatløsning. Eterfasen ble tørket over 60 g vannfritt natriumsulfat ved røring i 30 min. ved 4°C. Natriumsulfatet ble fjernet ved filtrering gjennom glassull. Produktet 4-cykloheksen-1,2-diazid (i eter) ble ikke renset ellerkarakterisert. For å fortsette med neste reaksjon, ble azidet overført fra eter til benzen som følger. En alikvot (ca. 1/3 totalt etervolum) av eterløsningen som inneholdt azid ble satt til ca. 150 ml vannfritt benzen. Eteren ble raskt fordampet ved bruk av rotasjonsfordamperen og luftpumpe. Vannbadets temperatur ble holdt under 45°C mens eteren ble fjernet. Ytterligere alikvoter av azidet i eter (ca. 1/3 hver gang) ble tilsatt inntil alt av azidet var overført til benzenet.

Trinn 4:

100 ml absolutt toluen (100 ml) og benzylalkohol (30 ml, 0,289 mol) ble plassert i en kolbe og oppvarmet til 70°C. Alikvoter (10ml) av 4-cykloheksen-l,2-dikarboksylazidet i benzenløsning (fra foregående trinn) ble langsomt tilsatt (samlet tid for ca. 150 ml benzenløsning var ca. 30 min.), hvilket ga N2utvikling, og for å forhindre at temperaturen oversteg 80°C. All benzenløsningen fra det foregående trinn ble tilsatt.

På dette tidspunkt ble ytterligere 20 g hydrazid fra foregående trinn overført til azidet. Imidlertid, ble ovennevnte fremgangsmåte forandretsom følger. Bare 100 ml (ikke 150 ml) benzen ble brukt pr. 20 g hydrazid-utgangsmateriale. Den gjenværende toluen-benzyl-alkoholblanding fra ovenfor ble tilført 20 ml benzylalkohol, og deretter den 100 ml benzenløsning omsatt i 10 ml alikvoter som beskrevet ovenfor. Denne fremgangsmåten ble gjentatt med en tredje 20 g sats hydrazid. De tre satser ble slått sammen og 10 ml benzylalkohol tilsatt (tilsammen 0,772 mol pr. 60 g hydrazid). Så

mye benzen som mulig ble fjernet ved destillasjon, og så fikk den gjenværende reaksjonsblanding tilbakeløps-koke natten over ved en bad temperatur på 120°C. I løpet av denne tiden ble reaksjonsblandingen rødbrun. Toluenet ble fjernet på rotasjonsfordamper utstyrt med en vakuumpumpe (0,5 mm Hg). Eddiksyre (100 - 200 ml 50% iseddik i vann) ble satt til reaksjonskolben, og blandingen ble rørt med en glasstav. Det ønskede ure-tanprodukt (4-cykloheksen-trans-l,2-dibenzyluretan)

var uløselig, men den rødbrune farge gikk over i væske-fasen. Uretanproduktet ble filtrert på en Buchner-trakt og vasket med kald 50% iseddik i vann. For analyse-formål ble uretanet omkrystallisert fra 50% iseddik i vann. Man fikk et utbytte på 60 g uretan.

Trinn 5:

4-cykloheksen-trans-l,2-dibenzyluretan (60 g) fra foregående trinn ble satt til 300 ml 7N natriumhydroksyd og tilbakeløpskokt 1 time. Ved bruk av en effektiv kjøler ble ca. 70 ml vann fjernet ved destillasjon, hvilket ga en sluttkonsentrasjon av natriumhydroksyd på ca. ION. Ved denne konsentrasjonen av natriumhydroksyd utfelles natriumkarbonat som dannes under reaksjonen. Blandingen fikk avkjøle, og natriumkarbonatet ble så fjernet ved filtrering på en Buchner-trakt. Natriumkarbonatet ble vasket med 100 - 150 ml n-butylalkohol. Det resulterende filtrat hadde to faser. Filtratet ble plassert i en skilletrakt og ristet , og vannsjiktet ble fjernet. Så ble 150 ml vann og konsentrert saltsyre tilsatt inntil pH var 1. Blandingen ble ristet og fasene fikk skille seg. På dette tidspunkt forelå mesteparten av produktet trans-1,2-diamino-4-cykloheksen i dihydrokloridformen i den vandige fasen. Konsentrert saltsyre (50 ml) ble satt til den organiske fase, og mer av produktet amindihydroklorid utfeltes. Det faste stoff ble filtrert på en Buchner-trakt og så tørket i en eksikator over natriumhydroksyd-perler for å fjerne saltsyren. Den vandige fasen som inneholdt det meste av produktet ble inrdampet til tørrhet på rotasjonsfordamper utstyrt med vakuumpumpe (0,5 mm Hg). De to produktsatser ble slått sammen og brukt i det neste trinn uten ytterligere rensing. Man antok at overfø-ringsgraden til amin var 100%.

Trinn 6:

Amin-trans-1,2-diamino-4-cykloheksenet i hydroklorid-form (antatt kvantitativ overføring fra uretan, 0,158 mol) og 75 g kloreddiksyre (0,79 mol) (begge faste stof-fer) ble slått sammen i en Erlenmeyer-kolbe utstyrt med en stor rører og et isbad. Kald 7N natriumhydroksyd (ca. 113 ml) ble langsomt tilsatt for å nøytralisere kloreddiksyren. Man var forsiktig med å holde reaksjonsblandingen kald (under 20°C). Tilsetning av na-triumhydroksydet ga så en suspensjon av aminet. Reaksjonsblandingen ble forsiktig rørt og oppvarmet i et 55°C oljebad. Man brukte et pH meter for å styre pH og tilsatte 7N natriumhydroksyd for å holde pH mellom 9 og 10. Så snart alt aminet var oppløst, ble oljebad,--temperaturen øket til 90 - 9 5°C i en time. I løpet av denne tiden ble pH holdt mellom 9 og 10 med 7N natriumhydroksyd. Reaksjonsblandingen fikk avkjøle, og pH ble så justert til 1,2 med konsentrert saltsyre. En liter aceton ble tilsatt langsomt ved romtemperatur, og hovedmengden av biproduktet, natriumklorid, utfeltes. Natriumkloridet ble fjernet ved filtrering på en Buchner-trakt. Det ønskede produkt, trans-1,2-diamino-4-cyklo-heksentetraeddiksyre, forble i filtratet som var lyst rødbrunt av farge. Acetonet ble fjernet på en rotasjonsfordamper ved bruk av en badtemperatur på 80°C til slutt. Produktet forble i vandig løsning og fikk avkjøle natten over. Man fikk svak utfelling. pH ble rejustert til 1,2 (den var 0,9), og kolbens vegger ble skrapet for å igangsette krystallisering. Ytterligere røring med en magnetrører førte til ytterligere utfelling av produktet. Produktet, trans-1,2-diamino-4-cykloheksen-tetraeddiksyre (11 g) krystalliserte fra den første satsen, og 6 g ytterligere produkt utfeltes langsomt over et tidsrom på en måned. Utfellingen ble oppsamlet ved filtrering, vasket med kaldt vann, tørket under vakuum ved 100°C. Tilsammen 17 g monoumettet DCTA-produkt erholdtes.

Eksempel 2

4- brom- 5- hydroksy- DCTA

N-bromsuccinimid (NBS) ble omkrystallisert ifølge den følgende fremgangsmåte. En liter vann ble plassert i en kolbe utstyrt med en magnetrører og oppvarmet til 7 5°C. Rått NBS (100 g som var malt til et fint pulver ved bruk av en morter og støter) ble tilsatt under rø-ring og så rørt i 2 min.. Løsningen ble filtrert raskt gjennom en varm Buchner-trakt. (Trakten må være varm, ellers vil en felling dannes under filtreringen). Filtratet ble raskt helt i et iskaldt begerglass for å felle ut NBS med minimum spaltning. NBS-et ble frysetørket natten over for å fjerne spor av vann. Tilsammen 80 g ble isolert.

Trans-1,2-diamino-4-cykloheksentetraeddiksyre (1 g, (0,0028 mol) fri syre ble tilsatt i 1,5 ml 7N NaOH, hvilket ga en slutt-pH på ca. 5,2. Løsningen ble avkjølt til 10°C og så satt til 0,5 g NBS (0,0028 mol) på et glassrør utstyrt med en magnetrører og et isbad. Reaksjonsblandingen ble rørt med termometeret, og temperaturen ble holdt på 8 - 10°C i 1 time. Blandingen ble rørt natten over ved 4°C. Reaksjonen ble ansett å være fullstendig når det ikke lenger var syn-lig faststoff. Produktet 4-brom-5-hydroksy-DCTA i form av natriumsaltet ble utfelt ved tilsetning av 10 volumdeler tørr metanol. Produktet ble oppsamlet ved filtrering på en Buchner-trakt, vasket med en liten mengde metanol, og raskt lufttørket. Man utsatte minst mulig for lys for å forhindre spaltning. Produktet ble plassert i en aluminiumsfolie-dekket kolbe og frysetørket under høyvakuum natten over. Man fikk tilsammen 1 g av natriumsaltet. (Stereokjemien ved karbonatomene med Br- og 0H-gruppen er ennå ikke fullstendig avklart. For denne oppfinnelsens formål er imidlertid sterokjemien ikke kritisk.)

Eksempel 3

5- hydroksy- DCTA- 4- p- tiopropionsyrehydrazid

Før denne reaksjonen kan utføres, må reaktanten 3_ merkaptopropionsyrehydrazid syntetiseres ifølge den følgende fremgangsmåte. (3-merkaptopropionsyre (53 g,

0,5 mol, flytende) ble blandet med 0,6 mol NaOH (24 g), 0,2 mol Kl (33,2 g), og 0,5 mol krystallinsk I (126,9 g),

Bistiolen ble dannet og utfeltes med en gang. Den ble filtrert på en Buchner-trakt, omkrystallisertfra vann,

og tørket i 15 min. ved 95°C, hvilket ga 48 g (0,23 mol, 92% utbytte) av bistioldipropionsyren.

Bistioldipropionsyren (48 g, 0,23 mol) ble oppløst i 400 ml absolutt etanol inneholdende 10 ml konsentrert svovelsyre (0,138 mol), og blandingen ble tilbakeløps-kokt 2 timer. Etanol (200 ml) ble fjernet ved destillasjon. Absolutt etanol (ytterligere 200 ml) ble satt til blandingen, blandingen ble tilbakeløpskokt ytterligere 2 timer, og 200 - 250 ml etanol ble fjernet ved destillasjon. Eter (500 ml) ble satt til produktløs-ningen, og blandingen ble så helt på is. Fast natriumbikarbonat (30,7 g,0,366 mol) ble tilsatt under røring for å nøytralisere løsningen. Fasene ble skilt i en skilletrakt. Den vandige fasen ble kastet. Eterfasen ble vasket en gang med 100 ml kaldt 5% natriumbikarbonat etterfulgt av en vask med 200 ml 0,1 M natriumklorid. Etersjiktet ble vasket over 50 g vannfritt Na2S0^ under røring i 90 min.. Na-^SO^ble fjernet ved filtrering. Eteren ble fjernet fra produktet [(CH3CH2-0-CO-CH2-CH2S)2]på rotasjonsfordamperen utstyrt med en luftpumpe. Så snart mesteparten av eteren var fjernet, ble vannbad temperaturen gradvis øket til 90°C for å fjerne eter-resten kvantitativt. Råproduktet ble så blandet med 100 ml teknisk hydrazin (54% hydrazin = 1,7 mol) og 100 ml absolutt etanol for å overføre etylesteren i hydrazidet. Blandingen ble tilbakeløpskokt under rø-ring natten over under argon for å forhindre oksydasjon. Løsningen ble gulbrun. Etanolen ble fjernet på rotasjonsfordamper. Det faste produktet ble revet med 200 ml absolutt etanol og deretter oppsamlet ved filtrering på en Buchner-trakt. Produktet som var et gult pulver, ble omkrystallisert fra 250 ml etanol, hvilket ga 20,3 g bisditiolhydrazid (NH2-NH-CO-CH2-CH2S-)2(0,17 mol, 37%). Produktet ble redusert i et trinn med 30 gangers molart overskudd natriumborhydrid som følger.

Bisditiohydrazid (0,75 mmol) ble oppløst i 1,0 ml vann. Fast natriumborhydrid (2,25 mol, 85 mg) ble tilsatt,

og reaksjonstemperaturen ble holdt på 25°C med leilighets-vis avkjøling. Dannelsen av produkttiolen ble regulert med 5 minutters mellomrom som følger. En 5 ul alikvot ble oppløst i 200 ul kaldt vann, og det gjenværende bor-hydrid ble ødelagt ved tilsetning av 50 ul IN HC1. Tiol ble bestemt med Cleland's reagens.

Da omsetningen var fullstendig, ble blandingen avkjølt og IN HC1 tilsatt dråpevis for å ødelegge borhydrid-overskuddet. HCl (IN) ble tilsatt inntil gassutvikling ikke lenger kunne sees. Reaksjonsblandingen ble nøy-tralisert til pH 7,8 med 5N NaOH. Indikatorpapir ble brukt for å kontrollere pH. På dette tidspunkt fikk man det ønskede sluttprodukt, 3-merkaptopropionsyrehydrazid. Det ble brukt umiddelbart som følger.

4-brom-5-hydroksy-DCTA (441 mg, 1 mmol) og 1 ml 2M natriumkarbonat ble satt til (3-merkaptopropionsyre-hydrazidet, omsatt 2 timer ved 9 5°C under argon, og reaksjonsblandingen ble så avkjølt, fortynnet med vann og satt på en Dowex 1 kolonne. Det uomsatte hydrazidet bindes ikke til kolonnen, og ble kontrollert i kolonne-gjennombruddet med pikrylsulfonsyre (dannelse av en rødfarget løsning). Kolonnen ble vasket med 0,1 N eddiksyre og så ble produktet 5-hydroksy-DCTA-4-tiopropionsyrehydrazidet eluert med 0,2N HCl. De hydrazidpositive fraksjoner (kontrollert ved reaksjonen med pikrylsulfonsyre) ble slått sammen og så nøytrali-sert med 5M NaOH. Man fikk et utbytte på 0,6 mmol.

Eksempel 4

4- aminoetyltio- t- hydroksy- DCTA ( 5- hydroksy- DCTA- 4- B-tioetylamin)

4-brom-5-hydroksy-DCTA (882 mg, 2,0 mmol) og 340 mg 2-aminoetantiolhydroklorid (3,0 mmol) ble slått sammen i en 1,0 ml 2M kaliumkarbonat under argon, og så oppvarmet 2 timer ved 90°C. Reaksjonen ble kontrollert ved å følge at tiolet forsvant ved bruk av Cleland's reagens [5,5<1->ditio-bis-(2-nitrobenzosyre)]. Etter at ca. 90% av tiolen hadde forsvunnet ble reaksjonsblandingen fortynnet ca. 50 ganger med oksygen-fritt vann og så satt på en 6 ml Dowex-1 kolonne (acetatform, 0,8 meg/ml harpiks) . Det uornsatte 2-aminoetantiolhydroklorid ble ikke bundet til kolonnen. Kolonnen ble vasket med 0,1 N eddiksyre. Vasken ble kontrollert med hensyn til nærvær av amin ved bruk av ninhydrin. Noe amin bundet som salt til produktet ble vasket vekk som topp og aminnivåene så utjevnet. På dette tidspunkt ble kolonnen eluert med 0,2M HCl (ca. pH 1). Under elue-ringen utfeltes en del av produktet 4-amino-etyltio-5-hydroksy-DCTA, men når pH nådde ca. 1, gikk produktet i oppløsning, så man må være forsiktig med å eluere alt produktet .

Amin ble undersøkt i eluatet med ninhydrin. Alle amin-positive fraksjoner ble slått sammen og frysetørket. Man fikk et utbytte på 1,07 g av produktet som amin-trihydroklorid.

Eksempel 5

Syntese av modifisert nukleotid — dUTP- allylamin

a)Fremstilling av merkurert dUTP

Deoksyribouridintrifosfat (dUTP, 554 mg) ble oppløst i

100 ml 0,1M natriumacetat-puffer pH 6,0, og kvikksølv-acetat (1,59 g, 5,0 mmol) ble tilsatt. Løsningen ble oppvarmet ved 50°C i 4 timer og så avkjølt på is. Li-tiumklorid (392 mg, 9,0 mmol) ble tilsatt, og løsningen ble ekstrahert 6 ganger med samme volum etylacetat for å fjerne overskudd HgC^. Virkningsgraden av ekstrak-sjonsprosessen ble kontrollert ved å bestemme kvikk-sølvionkonsentrasjonen i det organiske sjiktet ved bruk av 4,4'-bis(dimetylamin)-tiobenzofenon (A.N. Christopher, Analyst, 94, 392 (1969)). Graden av nuk-leotidmerkurering, bestemt spektroskopisk fulgte joderingen av en alikvot av den vandige løsning som beskrevet av Dale et al. (R.M.K. Dale, D.C. Ward, D,C, Livington, og E Martin, Nucleic Acid Res. 2, 915 (1975)), og var jevnt mellom 90 og 100%. Nukleotidproduktene i det vandige sjiktet, som ofte ble grumset under etyl-acetatekstraksjonen, ble utfelt ved tilsetning av 3 volumdeler is-kald etanol og oppsamlet ved sentrifugering. Utfellingen ble vasket to ganger med kald absolutt etanol, en gang med etyleter, så lufttørket. Disse således fremstilte merkurerte nukleotider ble brukt for syntesen av allylamin-nukleotidene uten videre rensing.

b) dUTPallylamin

Det merkurerte nukleotid (fra trinn a) ble oppløst i

0,1 M natriumacetatpuffer ved pH 5,0 og justert til en konsentrasjon på 20 mM (100 OD/ml ved 267 mn). En frisk 2,0 M løsning av allylaminacetat i vandig eddiksyre ble fremstilt ved langsomt å tilsette 1,5 ml allylamin (13,3 mmol) til 8,5 ml i iskald 4M eddiksyre. 3 ml (6,0 mmol) av den nøytraliserte allylaminstamløsning ble satt til 25 ml (0,5 mmol) nukleotid løsning. En nukleotid ekvivalent av f^PdC^ (163 mg, 0,5 mmol) oppløst i 4 ml vann, ble så tilsatt for å sette reaksjonen i gang. Etter tilsetning av palladiumsaltet (Alfa-Venton) ble løsningen gradvis svart av metall-

(Hg og Pd)-avsetninger som kom på veggene i reaksjons-kjelen. Etter henstand ved romtemperatur i 18 - 24 timer ble reaksjonsblandingen ført gjennom et 0,45 mm membranfilter (nalgen) for å fjerne mesteparten av detgjenværende metallpresipitat. Det gule filtratet ble fortynnet 5 ganger og satt på en 100 ml kolonne av DEAE-Sephadex TM A-25 (Pharmacia). Etter vask med et kolonnevolum 0,1 M natriumacetatpuffer med pH 5,0, ble produktene eluert ved bruk av en liter lineær gradient (0,1 - 0,6 M) av enten natriumacetat med pH ca. 8-9 eller trietylammoniumbikarbonat (TEAB) med pH 7,5. Det ønskede produkt var i den UV-absorberende hoveddel som ble eluert mellom 0,30 og 0,35 M salt. Spektralanalyse viste at denne toppen inneholdt flere produkter. Sluttrensing ble oppnådd ved revers fase - HPLC-kromatografi på kolonner av Partisil - 0DS2 ved bruk av enten 0,5 M NH4H2P04~puffer med pH 3,3 (ana-lytiske separasjoner) eller 0,5 M trietylammoniumacetat med pH 4,3 (preparative separasjoner) som eluenter. 5'-trifosfåtene av 5-(3-aminopropen-l-yl) uridin (allyl-aminadduktet til uridin) var de siste deler som ble eluert fra HPLC-kolonnen, og de var tydelig oppløst fra 3 fortsatt ikke-karakteriserte kontaminanter.

Eksempel 6

dUTP- allylamin markert med 5- hydroksy- DCTA- 4-[ 3- tiopropionsyrehydrazid

5-hydroksy-DCTA-4-3-tiopropionsyrehydrazid (12 mmol, 4 gangers overskudd) ble oppløst i 0,3 ml vann. HCl (50 ni, IN) ble tilsatt, og reaksjonsblandingen ble av-kjølt til 0°C. Kald 0,05 M NaN02(0,3 ml) ble satt til reaksjonsblandingen som fikk reagere ved 0°C i 10 min.. På dette tidspunktet hadde DCTA-hydrazidet blitt overført til azidet (-N^). Kaliumkarbonat (25 jil ^2M) blitt tilsatt for å nøytralisere reaksjonsblandingen, og 10 ul 10 M magnesiumsulfat ble tilsatt for å nøytralisere satsen. pH ble justert til ca. 8 med 15 ul 2M kaliumkarbonat, og så ble 500 ul dUTP allylamin (3 mmol i 0,6M NaCl) og 100 ul kald 5% natriumbikarbonat tilsatt ved 0°C. Blandingen fikk reagere natten over (ca. 12 timer) ved 0°C. Produktet ble se-parert fra ikke-omsatte utgangsmaterialer som følger. Reaksjonsblandingen ble nøytralisert til pH 7 med IN HCl og så satt på 1 ml hydroksylapatitt-kolonne som var ekvilibrert med 0,01 M kaliumfosfat (ekvimolar i monobasisk og dibasisk kaliumfosfat, ca. pH 6,8). 0,3 ml fraksjoner ble samlet. Kolonnen ble vasket med den samme puffer (4 ml) inntil man ikke lenger hadde absorpsjon ved A„,^eller A-,-,- i eluatet.r260 255

Produktet DCTA-markerte dUTP og alt uomsatt dUTP allylamin ble eluert med 0,3M kaliumfosfatpuffer (ekvimolar i monobasisk og dibasisk kaliumfosfat). Alle fraksjoner med en absorpsjon på 290 nm ble slått sammen til samlet 0,9 ml. Totalt A29Q=17,8 OD:EdupTAA<2>9Q= 8 nm , utbytte på 2,3 umol = 77%.

Produktet ble overført i en annen puffer ifølge den følgende fremgangsmåte. Produktet (0,9 ml) ble fortynnet 20 ganger med kaldt vann og så satt på en 0,5 ml DE-52 cellulose-kolonne (klorid-form). Alt A2gQble absorbert. Kolonnen ble vasket med 0,5 ml (et fyllingsvolum) 0,05M NaCl. Produktet ble eluert med 0,6 M NaCl i et volum på 1,0 ml. A2909I)envunnet = 17,8 OD for 100% gjenvinning.

En kontrollreaksjon ved bruk av dTTP i stedet for

dUTP allylamin ble kjørt parallelt og behandlet på lignende måte. 10 pl av hver ble fortynnet med 20 ul glycin 0,05 M ammoniumacetat i nærvær av radioaktivt nikkel og fikk binde i 15 min.. Hver sats ble satt på en Dowex 50 (NH^<+>form) kolonne. Bare produktet fra reaksjonen med dUTP-allylamin ble markert med det radioaktive nikkel. Minst 84% av produktet var DCTA-analogen.

Strukturen til det gelatdannende markerte dUTP allyl-aminprodukt var som følger:

Eksempel 7

Protein ( Immunoglobulin G) markert med 5- hydroksy- DCTA

En ekvivalent DCTA-hydrazid (i vann) ble behandlet med et 10 gangers overskudd av IN HCl og avkjølt til 0°C. En ekvivalent kald 0,05M NaN02-løsning i en forutkjølt pipette ble satt til reaksjonsblandingen ved 0°C. Blandingen fikk reagere ved 0°C i 10 - 15 min.. Reaksjonsblandingen ble nøytralisert (til ca. pH 8,5) med kald 5% natriumbikarbonat. Dette resulterte også i høy salt-molaritet. Immunoglobulin G proteinet ble tilsatt og inkubert natten over ved 0°C. Overskuddet aktivert DCTA ble holdt tilbake av en G-50 kolonne, og proteinet kom gjennom ved tomvoluiuet.

Eksempel 8

DCTA- SH

1 mmol DCTA-bromid ble satt til 5 ml 50% DMF inneholdende 0,2 ml 1,2-ditioetylen og 0,5 ml trietylamin. Blandingen ble inkubert under argon i 2 timer ved 60 - 70°C. Etter omsetning ble blandingen fortynnet med oksygen-fritt H20 til 50 ml, pH ble justert til 4,0 - 4,5 med iseddik og overskuddet HS-CH2-CH2-SH ble ekstrahert 3 ganger med 15 ml benzen under røring (ikke risting). Vannfasen ble så satt på en Dowex AG-l-kolonne, 9 ml fyllingsvolum. Kolonnen ble vasket med 50 ml 0,1 M eddiksyreløsning inntil gjennomløpet var tiolfritt. DCTA-SH ble så eluert med 0,25 M HCl. De tiolholdige fraksjoner ble slått sammen, inndampet til tørrhet under redusert trykk ved 40°C, og den frie syre (300 mg) bie lagret ved -20°C under argon.

Eksempel 9

Aktivering av DNA med 3, 4, 5- trikloranilin

100 mg 3,4,5-trikloranilin ble oppløst i 2,5 ml 0,5 M HCl i 50% DMSO og avkjølt på is under kraftig røring,

en ekvimolar mengde NaN02fra en kald IM løsning ble tilsatt så raskt som mulig, og man fortsatte å røre i 10 min.. 1 mg 3H eller fd DNA i 300 ml vann ble blan det med 300 ul 2M kakodylatpuffer pH 6,6 og 600 ul DMSO. (Ved tilsetning av DMSO steg løsningens pH til 8,3). 20 ul av den nyfremstilte diazoniumløsning ble tilsatt og blandingen ble inkubert 2 timer ved romtemperatur. Den svake utfelling som kom til syne under inkuberingen ble fjernet ved sentrifugering. Løsningen ble innstilt på 0,4 M med ammoniumacetat og DNA ble utfelt med etanol.

Eksempel 10

Omsetning av trikloranilin- aktivert DNA med tioler. Eksempel på reaksjon med DCTA- SH

fd DNA aktivert med 3,4,5-trikloranilin (eksempel 9) ble oppløst i 0,1 M natriumhydroksyd med en tilsvarende mengde 0,1 M f^HPO^. Denne løsning ble behandlet med samme volum 0,1M DCTA-SH (eksempel 8) og inkubert under argon ved 65°C i 2 timer. De utfelte disulfider ble fjernet ved sentrifugering, og DNA-et ble renset ved G50 kromatografi og lagret ved -20°C. Ved bruk av radioaktivt Ni for å måle mengden derivatisert DNA, fant man at 60% guaniner var blitt markert.

Eksempel 11

Biotin- SH

3 mmol biotin-NHS-ester ble oppløst i 25 ml vannfritt DMF og blandet med en lM-løsning av cysteaminhydroklo-rid i 12 ml 0,5M natriumbikarbonat og blandingen ble inkubert ved romtemerpatur natten over. Under inkube-ring fremkom en tung utfelling. Væsken ble fjernet under redusert trykk ved 4 5°C og resten ble oppslemmet i 50 ml absolutt etanol, lg NaBH^ble tilsatt og suspensjonen ble rørt 1 time ved 75°C. Etanolen ble fjernet, kald IM HCl ble tilsatt for å bringe pH til 4,5, og vannet ble fjernet under redusert trykk ved 35°C. (Alle disse operasjoner ble utført under en argonatmos-fære for å forhindre oksydasjon av tiolen.) Den faste resten ble pulverisert og revet med 4 ml kald 0,01M eddiksyre befridd for luft. Denne fremgangsmåten ble gjentatt 2 ganger og resten ble frysetørket. Tynn-sjiktskromatografi viste at hovedbiotinflekken inneholdt tiol; to mindre flekker var tiolnegative. I alle reaksjoner var mengden biotin som ble brukt basert på tiolinnholdet. Det er mulig å bruke Biotin-SH i reaksjonen med trikloranilin-aktivert DNA analogt med eksempel 10.

Eksempel 12

Markering av 3, 4, 5- trikloranilin DNA med DCTA- SH

0,5 mg aktivert DNA (eksempel 9) i 0,2 ml vann ble blandet med 2,0 ml 0,5 M trietylammoniumacetat i 90% DMF. 50 mg DCTA-SH (eksempel 8) i trietylammoniumform ble tilsatt. Blandingen ble rørt i mørket 4 timer ved 50°C. DMF ble fjernet under redusert trykk ved 45°C

og DNA ble befridd for salter med G-50-filtrering. Markeringsgraden ble så målt ved bruk av radioaktivt Ni-63. Gjennomsnittlig var hver 5,3 baser markert etter beregning.

Eksempel 13

4- aminotiofenyl DCTA og 3- aminotiofenyl DCTA

4-amino: 13-1

3- amino: 13-2

882 mg 4-brom-5-hydroksy-DCTA (2,0 pol) og 37 6 mg 4- aminotiofenyl, eller 320 ul 3-aminotiofenyl, ble oppløst i 2 ml kaliumkarbonat (IM), og blandingen ble rørt 2 timer ved 90°C under argon. Blandingen ble fortynnet med 50 ul oksygen-fritt t^O og satt på en 10 ml Dowex-kolonne. Kolonnen ble vasket med 0,1 M eddiksyre inntil gjennomløpet var tiolfritt, og produktet ble eluert med 0,2 HCl. Alle tiolholdige fraksjoner ble slått sammen, og HCl-et ble nøytralisert med KOH. Løsningen ble lagret ved -40°C. Utbyttet bestemt ved tiolinnholdet var 92,7% (13-1) og 86,3% (13-2) henholdsvis .

Eksempel 14

Markering av BSA med 4- aminotiofenyl DCTA

Ved markering med 4-aminotiofenyl DCTA (eksempel 13-1) var 4-amino-stamløsningen 0,1 M. 100 ul av 4-aminotiofenyl DCTA-løsningen pluss 25 ul IM HCl pluss 100 ul 0,1M NaN02 ble blandet og inkubert i 30 min. ved 0°C. 50 ul IM K2HP04 ble tilsatt for å bringe pH på 6,7, og en 50 ul alikvot ble blandet med 1 ml BSA (7,0 mg/ml) i 0,1M N a BO-- i,. Blandingen ble inkubert 1 timé ved 4 C. Diazoniumsaltet var meget la-bilt. Etter 1 time ved 4°C, fant man ingen kobling med 3-naftol, og markeringsforholdet var 1,7.

3-aminotiofenyl DCTA-et ble ikke brukt, men p.g.a. sin høye stabilitet ville den være en bedre reagens.

BSA-et som ble brukt her ble forut behandlet i 15 min. ved 95°C i pH 3,5 for å inaktivere nuklease.

Eksempel 15

Markering av BSA med DCTA- hydrazid

200 ul hydrazidløsning (6,7 umol) pluss 50 ul IM HCl ble avkjølt ved 0°C. 7 ul IM NaN02ble tilsatt og inkubert i 15 min. ved 0°C. 30 ul i iskald 2M Na3C03ble satt til løsningen for å bringe pH-et til ca. 8,5 -

9,0. Til 1 ml løsning BSA i 0, IM N a BOj-, (7,0 mg/ml) satte man 125 ul av azidløsningen og blandingen ble inkubert natten over ved 4°C. Azidoverskuddet ble fjernet ved G50 filtrering. BSA-filtratet ble fortynnet til 0,5 mg/ml, og en 100 ul alikvot ble markert med Ni. Totaltellinger var 86,728 (6,9 1 mol). Hvis man antar en mol vekt på 68000 for BSA, er 0,5 mg 7,3 umol (0,72 umol i 100 ml alikvot tilsvarende 9,4 DCTA molekyler/molekyl BSA) .

Eksempel 16

X DNA- hybridisering

Bruk av radioaktivt koboltholdig DNA- sonde

A. Fremstilling av DNA- holdig terminalt poly( allylamin)

dUTP

3,2 OD/260, 200 ug 7\DNA i 200 ul (0,01 puffer Tris-HCl pH 7,4, 0,001M EDTA) ble blandet med 80 ul DNAse (fortynnet 1/5000 med 1 ug/l BSA; 0,005M MgCl2). Blandingen ble inkubert 5 min. ved 37°C, blandet med 50 ul 0,1M EDTA og oppvarmet i 15 min. ved 65°C for å inaktivere enzymet. Inkuberingsblandingen ble satt på en 0,5 ml DEAE-kolonne ekvilibrert i 0,2 M KCl, og løsningen ble vasket med 5 ml 0,2M KCl. DNA-et ble eluert med 0,5 M K0H. De 260 nm absorberende fraksjonene ble slått sammen og nøytralisert med eddiksyre.

Inkuberingsblandingen inneholdt i 3,0 ml: 0,2 M kakodylatpuffer pH 7,3; 0,lM kaliumacetat 1 ituM dUTP - 0,3 mM allyl-amino-dUTP; 1 mM CaCl2; 1 mM B-merkaptoetanol; nedbrutt DNA og 400 enheter terminaltranferase. Inku-bering forløp natten over ved 37°C. 51,8% av nukleotid-trifosfåtene ble innført terminalt på DNA-fragmentene. Blandingen ble satt på en 0,5 ml DEAE-kolonne, vasket med 10 ml 0,2 M KCl og produktet ble eluert med 1,5 M LiCl 9,3 OD/260; 3,2 OD innført =6,1 OD/260 = 244 pg polymer.

B. Radioaktiv markering av allylaminogruppene

1 ml hydrazid-DCTA (eksempel 3) (16,4 mmol) pluss 200 pl 1 M HCl ble avkjølt til 0°C. 50 pl kald 0,35 M NaN02 ble tilsatt under røring og blandingen ble inkubert i 15 min. ved 0°C. 100 pl kald 2 M K2C03 ble tilsatt for å nøytra-lisere syren, etterfulgt av tilsetning av 200 pl 0,5 M boratpuffer pH 9,2. Denne blandingen ble tilsatt "kald" DNA-løsning (1 ml) og inkubert natten over ved0°C. Blandingen ble så satt på en 0,5 ml DEAE-kolonne (ekvilibrert i 0,2 M KCl). Kolonnen ble vasket med 10 ml 0,2 M KCl, og produktet eluert med 1,5 M LiCl. Halvparten av OD/260 ble eluert med dette salt. Resten ble eluert med 1,5 M LiCl i 0,2 M eddiksyre. Radioaktiv CoCl2ble så tilsatt i alikvoter.

Fr I: 8,800, 000 cpm/pg.

Fr II: 9 2,600,000 cpm/pg

Fr I ble så hybridisert med DNA som følger.

C. Hybridisering

C.1 Southern- geler

DNA ble spaltet med Hind III, kromatografert og overført ved Southern blot teknikk til de riktige filtere. Som kontroll brukte man spaltet M13 fag. Kobolt-markert DNA (eksperiment 16.B, 2 pg), og bærer DNA (1 mg) ble oppløst i 5 ml hybridiseringsløsning. Kontrollen og forsøks-prøvene ble inkubert med denne løsning ved 4 2°C natten over, så vasket 3 ganger i puffer med 0,1% SDS ved 55°C, lufttørket, og opptalt i standard toluencocktail.

Resultater:

1) M13 kontroll: 7475 cpm

2a)"Xprøve (a): 25, 724 cpm

2b)X prøve (b)29,412 cpm

Resultatene viser til tross for at bakgrunnstellingene er høye at hybridisering ved bruk av den kobolt-markerte sonde ga ca. 3,5-4 ganger høyere tellinger.

C. 2 Punkthybridisering

Punkthybridiseringer ble utført under betingelser natten over som beskrevet for Cl ovenfor. Bruk av den Co-markerte DNA-sonde gjorde det mulig å påvise 125 pg\DNA.

Eksempel 17

Fremstilling av radioaktivt nikkel- markert anti- HCG- antistoff

0,4 0D/2gQantihumant korionisk gonadotropin-antistoff + 0,22 umol hydrazid DCTA (eksempel 3) i 250 ul volum 0,lM boratpuffer ble inkubert natten over ved 0°C. Overskuddet av DCTA-hydrazid ble fjernet ved G50-filtrering.

Filtrat

OD/28o = 0,376

O<D/>28o = 0,216

En alikvot (100 ul) inneholdende det derivatiserte antistoff ble blandet med 10 umol Ni med spesifikk aktivitet 629 262 cpm/umol. Tellinger bundet til proteinet: 297 350 cpm = 0,472 umol. (Antatt 1,4 OD/28o for 1 mg antistoff og en molekylvekt på 150 000.) 100 ul alikvot inneholdt 0,0376 OD/280som er lik 26'4 W~°fl7^ umol antistoff. 0,175 umol antistoff inneholdt 0,472 umol Ni. Således inneholdt 1 mol antistoff 0,472/0,176 = 2,60 mol Ni.

Eksempel 18

Anbefalt fremgangsmåte for DCTA- markering av substanser med en fri alkoholgruppe som er løselig i inerte løs-ningsmidler

"Dowex" 1-X2 inneholder kvarternære aminogrupper. Disse grupper binder karboksygruppene til DCTA-hydrazid meget sterkt og danner det følgende salt (I):

Salt (I) er stabilt i 0,03M HCl og fortrenges ved høyere (0,1M) HCl konsentrasjoner. Det omsettes med NaN02i 0,03M HCl og danner azidet (II):

Ved å oppvarme salt (II) i benzen går azidet over til iso-cyanat (III):

Isocyanatgruppen i (III) reagerer så med alkoholer ved 80 - 130°C og gir uretanet (IV):

Disse uretanene er stabile substanser ved fysiologisk

pH og hydrolyserer under dannelse av aminer tare med konsentrerte syrer eller konsentrert alkali. Fikserin-gen av DCTA-et til Dowex forhindrer i stor grad at dets -OH-gruppe reagerer med isocyanatgruppen til et annet molekyl, gjør det mulig å arbeide i benzen eller toluen eller andre inerte løsningsmidler, hvorDCTA-azidet er uløselig.

Etter dannelse av uretanet (IV) elueres dette fra Dowex med kald LiCl i 50% etanol. Under kalde betingelser og ved nøytralt pH foregår ingen omestring.

Eksempel 19

Markering av ceramid

Ceramid er et diglycerid med to fri alkoholgrupper.

10 mmol DCTA-hydrazid ((I) fra eksempel 18) ble langsomt satt til en suspensjon av Dowex AG-1-X2 i 50 ml H^O under røring. Røringen ble fortsatt i 15 min. og harpiksen ble vasket på en Buchner-trakt med 500 ml kaldt vann. Harpiksen ble så oppslemmet i 100 ml kald 0,03M HCl, og suspensjonen ble plassert i et isbad. 10 mmol fast NaN02ble tilsatt under røring over et tidsrom på 30 min., og temperaturen ble holdt under 5°C. Etter den siste NaN02-tilsetning ble suspensjonen rørt 15 min. ved samme temperatur. Harpiksen ble så filtrert gjennom en kald Buchner-trakt og vasket med 100 ml kald (-20°C) etanol. Den ble til slutt oppslemmet i 100 ml kald (-20°C) etanol og rørt 30 min. i et is-salt-bad ved -20°C. Etanolen ble fjernet ved avsugning og de gjenværende spor av etanol ble fjernet ved høyvakuum. Den tørre harpiks ble porsjo-nert under vannfrie betingelser og lagret i forseglede ampuller ved -70°C uten noe tap av aktivitet i minst 8 måneder.

For å markere ceramidet ble 0,5 g av azidharpiksen oppslemmet i 15 ml absolutt benzen, 600 umol ceramid ble tilsatt og suspensjonen ble oppvarmet i 30 min. ved 75°C. Så ble benzenen fjernet i vakuum, 15 ml absolutt toluen ble tilsatt, og suspensjonen ble rørt ved 120°C natten over under vannfrie betingelser.

Harpiksen ble filtrert, vasket med etanol for å fjerne spor av toluen, og ikke-omsatt ceramid ble så fjernet med 3 sjikt-volumer 50% etanol i H2O. Produktet ble eluert med 0,6M LiCl i 50% etanol/H20. Fraksjonene med DCTA aktivitet ble slått sammen, og ceramidinnholdet ble bestemt jodometrisk. Det ble funnet å være 63,8% av det påsatte.

Eksempel 20

A. Generell DCTA- markering av substanser med en Cis-Diol- gruppe.

Diolen er aktivert med cyanogen-bromid i K^CO^-løsning, idet overskuddet av cyanogen-bromid er inaktivert med trietanolamin, og den aktiverte diol er omsatt med DCTA-amin. Hvis substansen ikke er løselig i vann, hvilket tilfellet er ved digitoksin, utføres aktiveringen i diglym/vann.

B. Markering av digitoksin

65,4 jomol<3>H-digitoksin (1000 cpm/mg) ble oppløst i 40 ml diglym og avkjølt til 4°C. Det samme volum 0,1M kald r^CO-j ble tilsatt og 300 mg cyanbromid i 2 ml acetonitril ble tilsatt på en gang under røring og kjø-ling. Blandingen ble holdt i 15 min. på 4°C, og overskuddet av cyanbromid ble inaktivert med 5 ml 2M trietanol-aminhydroklorid (pH 1,2), hvilket førte til en pH på 8,5 - 9,0. 200 umol DCTA-amin oppløst i 2 ml H20 ble tilsatt, og blandingen ble inkubert natten over ved 4°C og så satt på en Dowex AG-l-X2-kolonne. Kolonnen ble vasket med 50% etanol inntil gjennomløpsstrømmen ikke inneholdt aktivitetsdelinger, og konjugatet ble eluert med 0,6 M LiCl i 50% etanol. Alle radioaktive fraksjoner ble slått sammen. Gjenvinning av radioaktivite-ten, hvilket medfører konjugert digitoksin var 57,6%.

Eksempel 21

Markering av 4- amino- l- naftol- fosfat med DCTA

Fremgangsmåten som er utviklet for å markere 4-amino-l-naftolfosfat medDCTA kan anvendes på alle substanser med en primær amino^ruppe.

En løsning av 500 umol 5-hydroksy-DCTA-4-B-tiopropionsyrehydrazid oppløst i 20 ml 0,2 M HCl ble avkjølt til 0°C, og 500 umol fast NaN02ble tilsatt over et tidsrom på 10 min. slik at temperaturen forble under 5°C. 15 min. etter den siste NaN02tilsetning ble pH bragt til 8,5 med kald Na2C03 og 450 pmol 4-amino-l-naf tol-f osf at oppløst i 5 ml IM NaHCO^ble tilsatt. Blandingen ble inkubert natten over ved 4°C, fortynnet med 100 ml H20 og satt på en Dowex l-X2-kolonne i acetatform.

Kolonnen ble vasket med 3 sjikt-volumer 0,1 M eddiksyre, og produktet ble eluert med 0,6 M LiCl i H20. De DCTA-holdige fraksjoner ble slått sammen, og produktet ble utfelt med 3 sjikt-volumer etanol ved -20°C natten over. Utbytte: 86,4% produkt:

Produktet er et substrat for alkalisk fosfatase. Ved kobling av fenolen som dannes med et diazoniumsalt får man en felling som kan markeres med et radioaktivt metall. Dette gir en meget følsom måling av alkalisk fosfatase.

Etter denne fullstendige beskrivelse av oppfinnelsen vil det være klart for en fagmann at denne kan utøves innen et bredt ekvivalentområde av strukturer, fremgangsmåter og anvendelser innenfor oppfinnelsesideen.

Claims

1.P åviselig molekyl med formel

karakterisert ved at A 3 er a ? eller en polymer eller et polypeptid eller et polysakkarid; A 2, polymeren, polypeptidet eller polysakkaridet har minst en modifiserbar reaktiv gruppe som er amino, hydroksy, cis-OH, halogenid, aryl, imidazoyl, karbonyl, karboksyl, tiol eller en rest omfattende et aktivert karbon; A 2 er en kjemisk enhet med en molekylvekt mindre enn ca. 2.000; -X- er valgt fra gruppen

en c^~ c^o for9 renet eller rettkjedet alkyl eller aralkyl, som kan være substituert med -OH; -Y- er en direkte binding til -E-, eller -Y- er -E-R 2 - hvor -R 2- er en C1~C]_0 forgrenet eller rettkjedet alkylrest; Z er klor, brom eller jod; a -E- er 0, NH eller et acyklisk divalent svovelatom; Det er en kjemisk rest som kan påvises omfattende biotin eller en substituert eller ikke-substituert metallgelatdanner eller en forbindelse som kan gi en metallgelatdanner; og m er et heltall fra 1 til totalantallet modifiserte 3 reaktive grupper på A .

2. Molekyl ifølge krav 1, karakterisert ved at metallgelatdanneren har formelen

eller 4-hydroksy eller acyloksyderivatet derav, hvor R 3 er C1~ C4 alkyl eller er -CH2 -C00M, og hver M er et metall eller ikke-metall-kation.

3. Molekylet ifølge krav 1, karakterisert ved at Det er valgt fra gruppen forbindelser med fomel:

4. Molekylet ifølge krav 2, karakterisert ved at Det <b> er valgt fra gruppen med formel:

og

5. Påviselig molekyl med formelen A <1> ...Det <a> karakterisert ved at A" <*> " er en forbindelse med mindre molekylvekt enn ca. 2.000 og ikke er et monosakkarid eller et mononukleotid; og Det er en biotin eller påviselig kjemisk rest omfattende en substituert eller ikke-substituert metallgelatdanner eller en forbindelse som kan gi en metallgelatdanner; hvor "..." angir en kovalent binding mellom A"^" cl og Det .

6. Molekyl med formelen:

karakterisert ved at A 3 er A 2 eller en polymer, hvor både A 2og polymeren har minst en modifiserbar gruppe som er en aminogruppe og en rest omfattende et aktivert karbon; ' Z^ er klor eller brom; og m er et heltall fra 1 opptil totalantallet av modifiserte reaktive grupper på A 3.

7. Forbindelse med formelen:

eller 4-hydroksy eller acyloksyderivatet derav, karakterisert ved at R 3 er C-^-C^ alkyl eller er -CH2 COOM, hvert M er et metall eller ikke-metall-kation; -S- er toverdig svovelatom; og Q 2- er H; forgrenet eller rettkjedet C-j^-C^ -alkyl eller aralkyl med minst en gruppe valgt fra -OH, -SH, -NH2 , -CONHNH2, eller

hvor L er en avspaltbar gruppe; eller Q er

hvor Zc er hydrogen, klor eller brom, og J er -NH2 eller - N2<+> CA , hvor CA er et motanion.

8. Forbindelsen ifølge krav 7, karakterisert ved at den er valgt fra gruppen med formel :

9. Forbindelse karakterisert ved formelen:

eller dens metall eller ikke-metall-kationsalter, eller C^ -C^Q -alkylestere eller amider.

10. Forbindelse karakterisert ved formelen:

eller dens metall eller ikke-metalliske kationsalter.

11. Forbindelse med formelen

karakterisert ved atP er

eller metall eller ikke-metall-salter derav; Q <1> er H eller HO; BA er en modifserbar purin eller pyrimidinbase; X er valgt fra gruppen

en ci~ ciq forgrenet eller ikke-forgrenet alkyl eller aralkyl som kan være substituert med OH; -Y- er en direkte binding til -S-, eller -Y- er -S-R 2-hvor -R 2- er en C] _-C] _0 forgrenet eller rett-kjedet alkyl; % a er klor, brom eller jod; -S- er et acyclisk toverdig svovelatom; Det er en kjemisk rest som kan påvises omfattende biotin eller en metallgelatdanner med formelen:

eller 4-hydroksy eller acyloksy-derivatet derav, hvor R 3er C^ -C^j alkyl eller -CF^ COOM, og hver M er et metall eller ikke-metall-kation.

12. Forbindelse med formelen:

karakterisert ved at P er

eller metall eller ikke metallsalter derav; Q <1> er H eller HO; og BA er modifsert purin eller pyrimidinbase.

13. Forbindelse karakterisert ved formelen:

eller metall eller ikke-metallsalter derav, eller C^ -C^Q -alkylestere eller amider.

14. Fremgangsmåte ved modifisering av en biopolymer og innføring av en klor eller bromgruppe deri, hvilken biopolymer inneholder minst en rest omfattende et aktivert karbon som kan kobles med en diazoforbindelse, karakterisert ved at man under kob-lingsbetingelser omsetter biopolymeren med en diazoforbindelse med formelen:

hvor CA er et tilsvarende inert motanion, og Z, er klor eller brom.

15. Måling eller fremgangsmåte ved anvendelse av et radioaktivt markert molekyl omfattende anvendelse av et molekyl ifølge krav 2, karakterisert ved at det som M anvendes et radioaktivt metall.

16. Fremgangsmåte ved stråleterapi karakterisert ved at man bestråler et punkt på et dyr med bestråling fra et radioaktivt metall som befinner seg lokalt på dette punkt, hvilket radioaktivt metall er gelatisert med et monoklonalt antistoff i posisjon A 3 i molekylet ifølge krav 1 og gelatdanneren er gelatisert til et radioaktivt metall.

17. Fremgangsmåte ved fremstilling av en forbindelse med formel (I):

eller et metall eller ikke-metallsalt derav, karakterisert ved at man hydroksybromerer en forbindelse med formel (II):

18. Påviselig molekyl karakterisert ved formelen

hvor A 4 er A 2 eller en polymer, idet både A 2 og polymeren er minst en modifiserbar reaktiv gruppe valgt fra gruppen amino, aryl, imidazoyl og en rest omfattende aktivert karbon; A 2 er en kjemisk enhet med en molekylvekt mindre enn ca. 2.000; j er en elektrontiltrekkende gruppe; K er en signaldannende enhet eller en fast matrisse; r er et heltall fra en til to; og m er et heltall fra en opptil totalantallet av modifiserte reaktive grupper på A 4.

19. Forbindelse karakterisert ved formelen:

hvor j er en elektrontiltrekkende gruppe; K er en signaldannende enhet eller en fast matrisse; CA er et egnet motanion; og n er et heltall fra en til to.