NO854645L - Fremgangsmaate for fremstilling av basiske cykliske peptider. - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling

av basiske cykliske peptider som er -vasopressin- og oksytocin-antagonister. Grunnstrukturen for disse cykliske peptider er en acyklisk 3-merkaptopropionsyre i 1-stillingen og fem aminosyre-enheter cyklisert til en ring, bestående av seks enheter, ved hjelp av et svovelatom fra cystein-enheten og et svovelatom fra propionsyre-enheten. Ringen har en kjennetegnende basisk aminoalkyl- eller guanidinoalkyl-hale som er knyttet via en amidobinding til ringens 6-cystein-enhet, enten direkte eller gjennom en annen aminosyre.

En rekke syntetiske modifikasjoner av vasopressin- og oksytocin-strukturene har ifølge litteraturen gitt anta-gonistiske virkninger. Slike strukturer inneholder enheter som stammer fra 3-merkaptopropionsyrer, for eksempel desamino-penicillamin eller 3-merkaptopropionsyre, i stedet for cystein-enheten i 1-stilling i det naturlige produkts struktur:

J. Lowridge et al., J. Med. Chem. , _22, 565 (1979); M. Manning

et al., J. Med. Chem., 20, 1228 (1977); K. Bankowski et al.,

J. Med. Chem., 2A_, 350 (1978); H. Schulz et al., J. Med. Chem.,

9_, 647 (1966). Av europeisk patent nr. 1 12.809-A (Ferring, A.B) fremgår at visse Mpr oksytocinderivater har oksytocinantagonist-virkning.

Senere undersøkelser av M. Manning et al., J. Med. Chem.,

25, 408 (1982) og M. Manning et al., Peptides: Chemistry, Structure and Biology (Ann Arbor Sciences) 737 (1975), har vist at det på dette området ikke er kommet frem noe klart konsistent mønster for økning eller svekking av antagonistvirkningen. I de fleste av de undersøkte serier har 3,3-dietyl- og 3,3-cyklo-pentametylenpropionsyre-enheter i 1-stilling, vært betydelig mer aktive enn de lavere homologer, se spalte 1 på side 411 i den førstnevnte Manning-referanse.

I denne beskrivelse så vel som i kravene, er den nomenklatur som er vanlig innen peptidkjemien, eller mer presist, innen vasopressin-kjemien, benyttet. Når ingen konfigurasjon er angitt, foreligger aminosyre-enheten i L-, dvs. den naturlig forekommende, form. Tio-leddene i 3-merkaptopropionsyre-enheter (1) og cystein-enheter (6) er tilføyet som forklaring i enkelte strukturformler.

Som eksempel på peptidkjemiske betegnelser benyttet her

kan nevnes: dPen, 3-merkapto-3,3-dimetylpropionsyre; Put, putrescin; Cad, kadaverin; Mpr, 3-merkaptopropionsyre; Trp, tryptofan; Thr, treonin; OXT, oksytocin; Abu, a-aminosmørsyre; Chg, cykloheksylglycin; Cha, cykloheksylalanin; Pba, a-amino-fenylsmørsyre; Gin, glutamin; Gly, glycin; Tyr, tyrosin; Tyr(Alk), _4~alkyleter av tyrosin; Phe, fenylalanin; Phe-(4'-Alk), 41- C^_4~alkylfenylalanin; Val, valin, Ile, isoleucin; Nie, norleucin; Leu, leucin; Ala, alanin; Lys, lysin; Asn, asparagin; Tos, tosylat, Sar, sarkosin; BHA, benzhydrylamin; DIEA, diisopropyletylamin; 4-MeBzl, 4-metylbenzyl; TFA, trifluoreddiksyre; DCC, dicykloheksylkarbodiimid; HBT, 1-hydroksybenzotriazol; ACM, acetamidometyl; Mpa, generiske 3-merkaptopropionsyrer fremstillet i henhold til foreliggende oppfinnelse.

De basiske -antagonistforbindelser som fremstilles etter foreliggende fremgangsmåte fremgår av den følgende struktur-formel:

hvor NH

II

A er -NR-(CH2)n-NR2 eller -NR-(CH2)n~NH-C-NR2;

P er Phe, Ile, Phe(4'-Alk), Tyr eller Tyr(Alk);

X er en D- eller L-isomer av Val, Nva, Leu, Ile, Pba, Phe, Phe(4'-Alk), Trp, Nie, Cha, Abu, Met, Chg, Tyr eller Tyr(Alk);

Y er Val, Ile, Abu, Ala, Chg, Gin, Lys, Cha, Thr, Nie, Phe, Leu eller Gly;

Z er Gly, Sar, en enkeltbinding eller en D- eller L-isomer av Pro, A 3-Pro, Ala eller N-MeAla;

R i er, i hvert tilfelle, hydrogen eller metyl;

n er et heltall fra 2-8; og

R er, i hvert tilfelle, hydrogen eller metyl; eller et farmasøytisk akseptabelt salt, kompleks eller "prodrug" derav.

"Alk" i formel I og i det følgende står for en lavere alkylgruppe med 1-4 karbonatomer, som kan være en substituent som eventuelt er knyttet til fenyl i en aminosyre-enhet, så som Phe i 2- eller 3-stillingene eller til en oksygensubstituent som for eksempel i en tyrosin-enhet når sistnevnte forekommer i 2-eller 3-stillingene. Slike alkylsubstituenter innbefatter metyl, etyl, n-propyl, isopropyl eller butyl. Alk er fortrinnsvis metyl eller etyl.

"Bzl" betyr benzyl.

Når uttrykket "vasopressin" eller "VSP" benyttes, betyr det L-arginin-vasopressin (AVP) om intet annet er angitt. Frem-stillingen av visse antagonister med ringstrukturer beslektet med oksytocin (OXT), omfattes også av oppfinnelsen.

Av forbindelser med formel I foretrekkes strukturer med dPen i posisjon 1, en L-enhet i 2, og Pro i 7, for selektiv V^-antagonist-virkning. Sistnevnte virkning gir gunstige resultater ved behandling av kardiovaskulære lidelser som er ømfintlige overfor spesifikk vasodilatering.

3-merkapto-propionsyre-enheten i posisjon 1, Mpa , innbefatter både de usubstituerte og 3,3-dimetyl- og 3-nionometyl-kongenerne. Den siste kan foreligge i form av adskilte, optiske isomerer eller som en blanding av isomerer.

En underorden av de nye forbindelser omfatter forbindelser med formel I, hvor P er Phe, X er D-Tyr eller D-Tyr(Alk); Y er Ile eller Gin; hver R er hydrogen og Z er Pro, D-Pro eller en enkeltbinding.

Oppfinnelsen innbefatter også fremstilling av salter og komplekser av de nye forbindelsene, spesielt de ugiftige, farmasøytisk akseptable saltene. Syreaddisjonssaltene fremstilles på konvensjonell måte i et egnet oppløsningsmiddel av moderforbindelsen og et overskudd av en syre, så som saltsyre, hydrogenbromidsyre, svovelsyre, fosforsyre, eddiksyre, malein-syre, ravsyre, etandisulfonsyre eller metansulfonsyre. Sluttproduktene med formel I har en ytterligere sterk basisk gruppe og syreaddisjonssalt-derivatene av disse kan derfor lett fremstilles. Sluttproduktene isoleres ofte i form av acetatsaltene som dannes under opprensningen.

Forbindelser med formel I fremstilles ved hjelp av følgende reaksjon: II eller

hvor

X, Z, Y, n, P, Mpa og R er som ovenfor angitt. Mpa står for 3-merkaptopropionsyre-enheten i posisjon 1 av forbindelsene I. Forbindelsene med formel II er viktige nye mellomprodukter og omfattes også av foreliggende oppfinnelse.

Det kan være nødvendig å beskytte det ene eller begge

basiske sentra i den dibasiske forbindelse (III) under omsetningen. En forbindelse med en amino(-NH2) eller sekundær amino(-NHR) kan for eksempel lett omsettes i form av Boc-derivatet. Når strukturen inneholder en guanidino-gruppe, omsettes reaktant III som et tosylat-derivat på kjent måte. Andre kjente amino-beskyttende grupper kan alternativt benyttes.

Reaksjonen mellom karboksylsyren (II) og basen (III), eventuelt i beskyttet form, utføres ved hjelp av en hvilken som helst amid-dannende reaksjon som er vanlig innen peptidkjemien. Således kan for eksempel tilnærmet ekvimolare mengder av de to utgangsmaterialene omsettes ved romtemperatur i nærvær av et karbodiimid, så som dicykloheksylkarbodiimid, pluss 1-hydroksybenzotriazol i et organisk oppløsningsmiddel inntil reaksjonen er fullført. De eventuelle beskyttelsesgruppene fjernes deretter etter kjente fremgangsmåter, så som omsetning i nærvær av trifluormetansulfonsyre og trifluoreddiksyre/anisol ved romtemperatur for tosylatet (guanidin) eller reaksjon ved bruk av trifluoreddiksyre i kald tilstand for Boe (amin)-beskyttende grupper.

Som allerede nevnt omfattes utgangsmaterialene (II) for den ovenfor beskrevne reaksjon av denne oppfinnelse. De er nye mellomprodukter som også har VSP-antagonist-virkning, riktignok ved meget høyere doser enn forbindelsene med formel I. Både disse forbindelsene og sluttproduktene med formel I kan alternativt fremstilles ved oksydasjon av følgende lineære peptid:

hvor

X, Z, Y, Mpa og P er som ovenfor angitt, spesielt for formel I, og A er OH eller som ovenfor angitt for formel I. Merkapto-gruppene er ledd i Mpa- og Cys-enhetene. Hver Q er hydrogen eller en substituerbar gruppe som acetamidometyl (ACM).

Ditiolet med formel IV kan eventuelt også oksyderes i form av et amid-derivat av enheten i posisjonene 6 eller 7. Amidet kan for eksempel være -NHR,~NH2eller et A-holdig amid-derivat. Sistnevnte amid i henhold til definisjonen for struktur I, gir sluttproduktene direkte etter cyklisering og etter fjerning av eventuelle beskyttelsesgrupper.

Oksydasjonen foretas med et overskudd av et alkalimetall-ferricyanid, f.eks. kalium- eller natrium-ferricyanid, på det lineære mellomproduktet IV. Et passende inert oppløsningsmiddel, fortrinnsvis blandbart med vann ved pH 7-7,5, benyttes. Reaksjonen utføres ved romtemperatur eller lavere temperatur inntil reaksjonen i det vesentlige er fullført. Konsentrasjonene av det lineære peptid-dimerkaptan og oksydasjonsmidlet er fortrinnsvis lave, dvs. 0,01-0,1 molar konsentrasjon av oksydasjonsmiddel i flere liter vandig oppløsning for å cyklisere 1-5 g dimerkaptan.

Andre svake oksydasjonsmidler som har omtrent samme oksydasjonspotensial som ferricyanid, kan også benyttes for ring-slutningsreaksjonen. Slike alternativer er for eksempel flere dagers passasje av oksygen gjennom reaksjonsoppløsningen, eller jod i metanol. Cyklisering inntrer dessuten når en forskyvbar,

enheten, forskyves intramolekylært.

En spesielt anvendelig tio-beskyttelsesgruppe er acetamidometyl (ACM). Jod/alkohol benyttes for cyklisering av bis-ACM-S lineære peptid direkte i reaktoren. Selvsagt vil enkelte cykliseringsmetoder være uegnet dersom strukturen av utgangsmaterialet IV inneholder forstyrrende grupper. Det lineære merkaptan som utgjør utgangsmaterialet, kan på kjent måte ha midlertidige beskyttelsesgrupper i de forskjellige lineære enheter.

Mellomproduktene med formel IV kan lett fremstilles ved peptid-syntese i fast eller flytende fase.

Peptidkjeden i de lineære peptidene er vanligvis bygget opp trinnvis fra Z-enheten og mot Mpa-enheten. Hver enhet beskyttes i henhold til kjente metoder innen peptidkjemien slik som beskrevet nedenfor. Det er hensiktsmessig å foretas serien av trinnreaksjoner i en Beckman 99OB peptid-syntetisator uten å isolere hvert mellom-peptid. Detaljene i fremgangsmåten fremgår av eksemplene.

De forskjellige aminosyrer (AA) som etter hvert tilføyes til den resin-understøttede kjede, beskyttes på kjent måte. Eksempelvis benyttes Boc-beskyttelsesgruppen for en aminogruppe, spesielt i a-stillingen til en aminosyre-enhet; eventuelt substituert benzyl eller acetamidometyl for merkaptogrupper i Mpa- og Cys-enheter; og eventuelt substituert karbobenzoksy (Z) for hydroksygruppen i Tyr-enheter. Beskyttelsesgruppene bør helst være grupper som lett kan fjernes, dvs. ved syre-behandling for Boc-gruppen, natrium/flytende ammoniakk eller modifisert katalytisk hydrogenering for benzyl- eller karbobenzoksy-gruppene.

Det resin-understøttede peptid behandles med et overskudd av vannfri hydrogenfluorid med en passende innfanger-forbindelse, så som anisol, hvorved det lineære peptid-mellomprodukt med formel IV, oppnås i godt utbytte.

Forbindelsene fremstillet i henhold til oppfinnelsen har potent V.j-V2~vasopressin- eller oksytocin-antagonistvirkning med en forskyvning i retning av V^-reseptorene i det V-]~V2~biologiske spektrum. Vasopressin er vesentlig kjent for å

bidra til den antidiuretiske mekanisme for samvirkning med nyrene.

Når virkningen av disse forbindelsene antagoniserer virkningen av det naturlige antidiuretiske hormon (ADH), utskiller kroppen vann som følge av en økt permeabilitet av de terminale deler av nyrekanalen. I vasopressin-reseptorene (V^-reseptorene) er denne virkningsmekanisme lokalisert til plasmamembranen av visse nyre-epitelceller.

Pasienter som lider av ufullstendig antidiuretisk hormon-sekresjon (syndromet: SIADH) eller av en uønsket ødematøs tilstand, er en målgruppe for de nye forbindelsene når de virker som ^^-antagonister. Eksempler på kliniske tilstander hvor de nye forbindelsene er indisert er hypertensjon, lever-cirrhose, kongestiv hjertesvikt eller som en komponent av traumatiske tilstander som følge av alvorlig skade eller sykdom. Forbindelsene har svak ^^-antagonistisk virkning sammenlignet

med andre tilsvarende kjente forbindelser.

Den andre gruppen av vasopressin-reseptorer som oppfinnelsen mer spesielt er rettet mot, er slike som påvirker glatt muskulatur i blodkarene eller uterus. Vasopressin eller oksytocin er naturlige stimulantia av disse effektorer som resulterer henholdsvis i pressoreffekter på det kardiovaskulære system og stimulering av uterus. Disse reseptorer er her samlet under begrepet V^-reseptorer siden de nye forbindelsene har begge virkningene.

Mer spesifikt, vil vasopressin V^-antagonister motvirke den pressoraktivitet som induseres av naturlig forekommende vasopressin i vaskulære lag. De er derfor spesifikke vasodilatorer. Virkningen av V^-antagonistene gir.seg utslag ved behandling av diverse unormale kardiovaskulære tilstander, så som hypertensjon, sjokk, karonare eller andre ischemiske tilstander. De benyttes eventuelt sammen med ACE-inhibitorer, (3-blokkere eller a-blokkere.

Forbindelsene fremstillet i henhold til oppfinnelsen er derfor også antagonister i V^-reseptorseter. V^-V2_virknings-forholdet av de nye forbindelsene er faktisk forskjøvet mot større relativ V^-antagonisme. Spesielt aktive V^-antagonister er forbindelser med formel I, hvor X er en L-aminosyrerest og Y er en glutaminrest. Disse forbindelsene har derfor en potent selektiv vasodilaterende virkning som beskrevet ovenfor.

Forbindelsene med formel I som har aminosyre-enheter i

andre posisjoner enn 1-stillingen og ligner oksytocinets amino-

syre-enheter, har spesielt potente antioksytocin-virkninger. Slike forbindelser er derfor spesielt egnet for relaksering av uterusvev. Virkningen er motsatt oksytocinets virkning. Eksempler på slike forbindelser er de basiske forbindelsene med formel I, hvor Z er prolin eller en enkeltbinding; X er D-O-alkyltyrosin; P er fenylalanin eller isoleucin; og Y er glutamin eller treonin. Generelt har de nye forbindelsene en høyere antioksytocin-virkning enn forventet.

Forbindelsene fremstillet i henhold til oppfinnelsen benyttes derfor hovedsakelig for å indusere selektiv vaso-dilatasjon eller antioksytocin-virkning, men kan også benyttes tilødembehandling, hos pasienter som har behov for slik antagonistisk behandling, ved at forbindelsene gis internt, spesielt parenteralt eller ved innblåsning. En ugiftig men effektiv mengde av den valgte forbindelse kombineres fortrinnsvis med et farmasøytisk bæremiddel. Doseringsenhetene for virkestoffet ligger i området fra 10/ug til 10 mg/kg, fortrinnsvis 15^ug til 1 mg/kg for en pasient på 70 kg. Dosene gis en til fem ganger pr. dag eller som kontinuerlige intravenøse drypp.

De farmasøytiske preparatene fremstillet i henhold til oppfinnelsen som inneholder et virkestoff med formel I, omfatter den ovenfor beskrevne doseringsenhet oppløst eller suspendert i et vanlig flytende bæremiddel, så som isotonisk saltoppløsning, i en ampulle eller et hetteglass egnet for parenteral injeksjon som f.eks. intravenøs, subkutan eller intramuskulær administrasjon. For innblåsning kan et lignende preparat benyttes,

men det vil vanligvis bli gitt ved hjelp av en applikator eller inhalasjonsinnretning som avgir en avmålt dose. Pulverpreparater kan også benyttes sammen med oljebaserte preparater, gel, buffere for isotoniske preparater, emulsjoner eller aerosoler. Mengden av virkestoff i produkter for nasal administrasjon er 3-7 ganger høyere enn i de parenterale produktene-

Antagonistisk virkning på V^-vasopressin-reseptorene bestemmes etter en prosedyre som måler reverseringen av vasopressin-indusert kontraksjon av vev fra brystaorta hos rotte. Dette uttrykkes som K_, (nM) i tabellen nedenfor. Slik anti-pressor aktivitet bekreftes i en lignende in vitro undersøkelse hvor binding til plasma-membraner i rotte-lever registreres. V2-vasopressin-antagonisme bestemmes som evnen til reseptor-binding, målt ved inhibering av 3H-LVP-binding (KD ti i nM) ved inhibering av adenylat-cyklase-aktivering av vasopressin i det medullare vev i svinenyrer (Ki i nM) eller in vivo ved den såkalte "hydropenic rat protocol" (ED^qq ^,ug/kg) . Disse under-søkelser er beskrevet i litteraturen: F. Stassen et al.,

J. Pharmacology and Experimental Therapeutics, 223, 50 (1982); F. Stassen et al., 1 st International Conference on Diuretics, Miami, Fla., March (1984). Antagonistisk virkning på oksytocin-reseptorer bestemmes på isolert rotte-uterus: W. Sawyer et al., Endocrinology 106, 81 (1979); P. Melin et al., J. of Endocrinology 88, 173 (1981).

a) Medullart svinenyre-vev, b) rotte-lever-membran, c) rotte-aorta-ring-vev, d) rotte-uterus, e) "hydropenic"

rotte.

Dataene i Tabell 1 viser en forskyvning mot potent V^- og øket OXT-antagonistisk virkning fra antagonismen som oppvises av representative forbindelser med des-Pro eller tri-peptid-hale. Forbindelsene fremstillet i henhold til oppfinnelsen oppviser imidlertid fremdeles en svakV2_antagonisme.

I de følgende eksempler er alle temperaturangivelser i

°C.

Eksempel 1

Generell fremgangsmåte for syntese av de cykliske syre-mellomproduktene (II): Boc-Pro-Merrifield-resin ble fremstillet ved å koble Boc-Pro til Merrifield-resin ved å benytte cesiumsalt-metoden for

å gi Boc-Pro-OCI^CgH^-resin som ble benyttet som utgangsmateriale for syntesen. Syntesen ble utført i en Beckman 99OB peptid-syntetisator på følgende måte. Tre ekvivalenter av aminosyrene ble løst opp i passende oppløsningsmidler for disse (Boc-derivatene av 4-MeBzl-Cys, Val, Phe og 4-MeBzl-Mpa i metylenklorid, Asn i dimetylformamid, D-Tyr(Et) eller BrZ-D-Tyr i 1:1 metylenklorid/dimetylformamid) og ble koblet ved å benytte en ekvimolar mengde dicykloheksylkarbodiimid.(DCC) og 1-hydroksybenzotriazol (HBT), bortsett fra koblingen av 4-MeBzl-Mpa, hvor det som katalysator ble benyttet en 1,0 ekvivalent dimetylaminopyridin. Graden av kobling ble fastslått ved kvalitativ ninhydrin-analyse av hver prøve-alikvot, og om nød-vendig, ble koblingene gjentatt. Boc-gruppene ble fjernet ved bruk av 1:1 trifluoreddiksyre/metylenklorid, hvorpå de frie aminene etter vasking, ble oppnådd ved bruk av 5 % diisopropyletylamin/metylenklorid. Peptidsekvensen ble kontrollert ved bruk av fast-fase sekvensering før koblingen av 4-MeBzl-Mpa og homogeniteten av dette bekreftet. Etter den siste kobling ble peptidet tørket og benyttet som sådant i cykliseringen.

1-Mpa peptid-resinet (0,5 mmol) ble omrørt med 3 ml anisol

i 6 0 minutter ved 0° (isbad) i 25 ml vannfri flytende hydrogenfluorid. Hydrogenfluoridet ble deretter fjernet under redusert trykk ved 0°.Residuet ble vasket med etyleter (4 x 20 ml, kassert) og peptidet eluert med dimetylformamid (3 x 10 ml),

20 % eddiksyre (3 x 10 ml) og 0,3N ammoniumhydroksyd (3 x 10 ml). Filtratet ble tilsatt til 2 liter avgasset vann og pH justert til 7,1 med kons. ammoniumhydroksyd. En 0,01M oppløsning kaliumferricyanid ble deretter tilsatt dråpevis under omrøring inntil oppløsningen beholdt en svakt gul farve (41 ml).

Den resulterende oppløsning ble deretter sendt gjennom en væskekromatografikolonne (5 cm x 15 cm) pakket med oktadekyl-silan (C^g) bundet til silikagel (~40^um). Kolonnen ble deretter vasket med 350 ml vann og peptidet eluert med 500 ml 1:1 acetonitril/vann (0,1 % trifluoreddiksyre) i 20 ml fraksjoner. Residuet fra produktholdige eluater ble oppløst i kons. eddiksyre, fortynnet med vann og lyofilisert for å gi det cykliserte syre-mellomprodukt som deretter ble benyttet uten videre rensing for syntesen av de hale-modifiserte peptidene.

A. Identifikasjon av [1-desaminopenicillamin-2-(0-metyl)-L-tyrosin-8-desarginin-9-desglycinamid]-vasopressin.

Totalt 183 mg renset 7-prolin mellomprodukt av tittelforbindelsen ble oppnådd som beskrevet ovenfor ved å gå ut fra 1 mmol. Opprensningen besto i: 1. g-kolonnekromatografi ("flash"), 2. CCD, og 3. gelfiltrering.

Analyse: C4 1 H^NgCj QS2 (molekylvekt, 898).

1. Fast atom bombardment (FAB) massespektrum: 899 (M+H)+

(positivt ion observert); 897 (M-H) (negativt ion observert).

2. Aminosyreanalyse (AAA): Asp, 1,03; Pro, 0,97; Phe, 0,95; Glu, 1,00; Tyr, 0,79; Cys, -; peptidinnhold 90 %. 3. Høytrykks væskekromatografi (HPLC): 5^u, C18kolonne: Oppløsningsmiddel A: 0,1 % trifluoreddiksyre i vann. Oppløsningsmiddel B: 0,1 % trifluoreddiksyre i acetonitril.

Fra 20 % B til 50 % B i løpet av 30 minutter, eluerte ved 33,01 min.

B. Identifikasjon av [1-merkaptopropionsyre-2-(O-etyl)-D-tyrosin-3-isoleucin-4-treonin-8-desarginin-9-desglycinamid]-vasopressin.

Totalt 29 0 mg renset heptapeptid mellomprodukt av tittelforbindelsen ble oppnådd som beskrevet ovenfor ved å gå ut fra 1 mmol. Rensing som beskrevet ovenfor.

Analyse: C^H^N.^ 1S2 (molekylvekt, 823).

1. FAB-MS: 824 (positivt ion observert) (M+H)<+>;822 (negativt ion observert) (M-H) . 2. AAA: Asp, 1,00; Pro, 1,05; Ile, 0,91; Thr, 0,97; Cys, 0,30; Tyr, 0,91; peptidinnhold, 95 %.

3. HPLC: 5,u, C,0kolonne:

/ i o

Oppløsningsmiddel A: 0,1 % TFA i H20.

Oppløsningsmiddel B: 0,1 % TFA i CH^CN.

Lineær gradient fra 20 % B til 50 % B, i løpet av

30 minutter, eluerte ved 27,6 minutter.

Eksempel 2

1,5-diaminopentan (14,0 ml, 120 mmol), ble løst opp i tert-butanol (70 ml) og deretter i løpet av 10 minutter, dråpevis behandlet med di-tert-butyldikarbonat (9,2 ml, 40 mmol). Etter fullført tilsetning, ble reaksjonsblandingen omrørt ved romtemperatur i 16,5 timer. Reaksjonsblandingen ble deretter behandlet med 1N natriumhydroksydoppløsning (90 ml), omrørt i 1 time og tilslutt ekstrahert med kloroform. Kloroform-ekstraktene ble tørket (MgSO^) og konsentrert under vakuum. Residuet ble løst opp i vann, surgjort (pH=2) ved dråpevis tilsetning av 3N saltsyre ved 0°, og deretter vasket med eter for å fjerne det dobbeltbeskyttede diamin. Den vandige porsjon ble gjort basisk (pH=10) med 5 % natriumkarbonatoppløsning og ekstrahert med etylacetat for å gi 1,6 g (20 %) mono-Boc-1,5-diaminopentan. Strukturen ble bekreftet ved<1>H NMR og CI-MS. Putrescin-og andre mono-Boc-derivater ble fremstillet på lignende måte.

Til en oppløsning av prolin-mellomproduktet fra Eksempel

1A, (40 mg, 0,044 mmol) og mono-Boc-1,4-diaminobutan (40 mg, 0,212 mmol) i dimetylformamid (2 ml), ble det tilsatt dicykloheksylkarbodiimid (14,0 mg, 0,07 mmol) og 1-hydroksybenzotriazol-hydrat (9,0 mg, 0,07 mmol). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 90 timer. Dimetylformamidet ble deretter fjernet under vakuum. Residuet ble behandlet med trifluoreddiksyre (6 ml) ved romtemperatur i 2 timer. Deretter ble trifluoreddiksyren fjernet under vakuum og residuet, i 1 % eddiksyre, sendt gjennom en BioRex-70 (H<+>) ionevekslersøyle. De basiske produktene ble eluert fra ionevekslersøylen med pyridinbuffer (H20/pyridin/HOAc, 66:30:4) og inndampet. Påfølgende opprensning ved preparativ HPLC (5^u Ultrasphere

ODS) og gelfiltrasjonskromatografi (G-15), ga 11,7 mg rent [1-desamino-penicillamin-2-(O-metyl-L-tyrosin-8-(1,4-diamino-butan) -9-desglycinamid]-vasopressin.

Strukturen av produktet ble bekreftet ved FAB-MS [(M+H)<+>= 9 69, (M-H)~ = 967]. Renheten ble bekreftet ved HPLC (5^u Ultrasphere ODS, 4,6 x 250 ram) H2O/CH3CN/0,1 % TFA (70:30:0,1), under gradienteluering i 11,1 min. (80:20 til 50:50) H20/acetonitril med 0,1 % TFA, hvor forbindelsen eluertes etter 16,0 min.

Eksempel 3

Guanidering av mono-Boc-1,4-diaminobutan: Mono-Boc-1,4-diaminobutan (1,25 g, 6,6 mmol) fremstillet fra putrescin som i Eksempel 2, i dioksan (2 ml) og vann (6,5 ml) ble behandlet med O-metylisourea-hydrogensulfat (1,25 g, 7,26 mmol) og 2N natriumhydroksyd (3,75 ml) ved romtemperatur. Den resulterende oppløsning ble omrørt i 6 dager. Oppløsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk og residuet gjort basisk (pH=12) ved tilsetning av 2N natriumhydroksyd. Etter ny inndampning ble residuet tatt opp i etylacetat, filtrert og inndampet. Det rå guanidin ble tørket ved fordampning fra toluen og benyttet uten ytterligere rensing.

Det rå guanidin (410 mg, 1,78 mmol) i 2N natriumhydroksyd (2 ml) og vann (2 ml) ble ved romtemperatur behandlet med p-toluensulfonylklorid (340 mg, 1,78 mmol) i 18 timer. pH ble justert til 8 med 5 % natriumkarbonatoppløsning. Blandingen ble ekstrahert med etylacetat og ga etter inndampning, 437 mg råprodukt. Rensing ved kromatografi (flash, 3 x 15 cm silikalag, 80 % etylacetat/heksan) ga 265 mg (39 %) av det ønskede tosylerte produkt. Identiteten av dette ble bekreftet ved<1>H NMR og CI-massespektroskopi.

Boc-tosyl-guanidinodiamin (108 mg, 0,281.mmol) i metylenklorid (1 ml) ble behandlet med trifluoreddiksyre (1 ml) ved 0° i 40 minutter. Reaksjonsblandingen ble inndampet under vakuum og residuets pH justert til 8 med 5 % natriumkarbonatoppløsning og blandingen inndampet til tøørrhet. Residuet ble tatt opp i etylacetat, filtrert og inndampet. Det rå des-Boc-produktet ble tørket ved fordampning fra toluen og ga 66 mg (82 %). Identiteten ble bekreftet ved<1>H NMR,.hvorpå produktet ble benyttet uten ytterligere opprensing.

[1-desaminopenicillamin-2-L-(O-metyl)-tyrosin-8-desarginin-9-desglycinamid]-vasopressin (35 mg, 0,039 mmol), fremstillet

som i Eksempel 1A, i dimetylformamid (0,5 ml), ble behandlet ved romtemperatur med tosyl-guanidinoaminet (33 mg, 0,114 mmol), DCC (12 mg, 0,057 mmol) og HBT (8 mg, 0,057 mmol). Blandingen ble omrørt i 43 timer. Oppløsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk og residuet løst opp i trifluoreddiksyre (2 ml) og behandlet ved romtemperatur med trifluormetansulfonsyre (150^uliter, 1,7 mmol) og anisol (37^uliter) under omrøring i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble inndampet til tørrhet, løst opp i 10 % eddiksyre, filtrert og sendt gjennom en BioRex-70 søyle. Det rå guanidinopeptidet ble eluert fra søylen med pyridinbuffer (pyridin/vann/eddiksyre, 30:66:4) og inndampet, hvorpå residuet ble renset ved preparativ HPLC (5^u, ODS, H20/CH3CN/TFA 60:40:0,1) for å gi [1-desaminopenicillamin-2-L-(0-etyl)-tyrosin-8-(1-amino-4-guanidinobutan)-9-desglycinamid]-vasopressin.

Eksempel 4

En oppløsning av 40 mg (0,044 mmol) av Pro-syre mellomproduktet, fremstillet som i Eksempel 1A og mono-Boc-1,5-diaminopentan (26 mg, 0,129 mmol) i dimetylf ormamid (900^,uliter) ble behandlet med dicykloheksylkarbodiimid (13 mg, 0,06 5 mmol) og 1-hydroksybenzotriazol-hydrat (9 mg, 0,065 mmol) ved romtemperatur under omrøring i 4 3 timer. Dimetylformamidet ble deretter fjernet under vakuum. Residuet ble behandlet med trifluoreddiksyre ved 0° i 1 time. Deretter ble trifluoreddiksyren fjernet under vakuum og residuet i 1 % eddiksyre, sendt gjennom en BioRex-70 (H<+>) ionevekslersøyle. De basiske produktene ble eluert fra søylen med pyridinbuffer (H20/pyridin/eddiksyre, 66:30:4) og inndampet. En avsluttende rensing ved preparativ HPLC (5^,u Ultrasphere ODS) ga rent [ 1-desaminopenicillamin-2-(O-metyl-L-tyrosin)-8-(1,5-diaminopentan-9-desglycinamid]-vasopressin.

Eksempel 5

En oppløsning av 80 mg (0,097 mmol) av prolinsyren i Eksempel 1B og mono-t-Boc-1,4-diaminobutan (63 mg, 0,335 mmol)

i dimetylformamid (3 ml) ble behandlet med dicykloheksylkarbodiimid (30 mg, 0,146 mmol) og 1-hydroksybenzotriazol-hydrat

(39 mg, 0,291 mmol) og deretter omrørt ved romtemperatur i 48 timer. Dimetylformamidet ble fjernet under vakuum. Residuet ble behandlet med trifluoreddiksyre (5 ml) ved romtemperatur i 2 timer. Trifluoreddiksyren ble fjernet under vakuum og residuet sendt gjennom en BioRex-70 (H<+>) ionevekslersøyle. De basiske produktene ble eluert fra ionevekslersøylen med pyridinbuffer (H20/pyridin/eddiksyre, 66:30:4) og inndampet for å gi [1-3-merkaptopropionsyre)-2-(O-etyl-D-tyrosin)-3-isoleucin-4-treonin-8-(1,4-diaminobutan)-9-desglycinamid]vasopressin. Avsluttende rensing ved preparativ HPLC (5^u Ultrasphere ODS) ga 12 mg rent produkt. Produktets struktur ble bekreftet ved FAB-MS [(M+H)<+>= 894, (M-H)~ = 892].Renheten ble bekreftet ved HPLC (5^u Ultrasphere ODS, 4,6 x 250 mm; vann/acetonitril/TFA (70:30:0,1), under gradienteluering i 15,4 min. (80:20 til 50:50) H2O/CH3CN/0,1 % TFA, hvor forbindelsen eluertes etter 18,2 min.

Anvendelse av a-aminosmørsyre i den ovenfor angitte fremgangsmåte ga [1-(3-merkaptopropionsyre)-2-(a-aminosmørsyre)-3-isoleucin-4-treonin-8-(1,4-diaminobutan)-9-desglycinamid]-vasopressin. Bruk av tilsvarende beskyttet 3-(S-metylbenzyl-merkapto)-3-metylpropionsyre i stedet for Mpr i fremgangsmåten i Eksemplene 1 og 5, ga [1-(3-merkapto-3-metylpropionsyre)-2-(O-etyl-D-tyrosin)-3-isoleucin-4-treonin-8-(1,4-diaminobutan)-9-desglycinamid]-vasopressin. Bruk av N,N-dimetyletylendiamin i stedet for det ovenfor anvendteBoc-putrescin, ga [1-(3-merkaptopropionsyre)-2-(O-etyl-D-tyrosin)-3-isoleucin-4-treonin-8-(2-(N,N-dimetylamino)-1-amino-etan)-9-desglycinamid]vasopressin. Erstatning med monoformylkadaverin og påfølgende maur-syrereduksjon av formylgruppen, ga N-metylkadaverinderivatet.

Eksempel 6

Syntese av [1-desaminopenicillamin-2-(O-metyl)-tyrosin-7-desprolin-8-desarginin-9-desglycinamid]-vasopressin.

Tittelforbindelsen ble fremstillet ved hjelp av fastfase-teknikk, som beskrevet i Eksempel 1, men ved bruk av Boc-Cys-Merrifield-resin som utgangsmateriale, som deretter sekvensielt ble koblet med de passende Boc-aminosyrene, etterfulgt av beskyttelsesgruppe-fjerning med hydrogenfluorid, samtidig avspaltning fra resinet og deretter oksydativ cyklisering og rensing utført som beskrevet i Eksempel 1.

Eksempel 7

En oppløsning av 0,043 mmol av cysteinsyren, fremstillet som i Eksempel 6, og mono-t-Boc-1,5-diaminopentan (26 mg,

0,129 mmol) i dimetylformamid (1 ml), ble behandlet med dicykloheksylkarbodiimid (13 mg, 0,065 mmol) og 1-hydroksybenzotriazol-hydrat (9 mg, 0,065 mmol) og omrørt ved romtemperatur i 48 timer. Dimetylformamidet ble deretter fjernet under vakuum. Residuet ble behandlet med trifluoreddiksyre (5 ml) ved romtemperatur i 3 timer. Deretter ble trifluoreddiksyren fjernet under vakuum og residuet løst opp i 10 % eddiksyre og sendt gjennom en BioRex-70 (H<+>) ionevekslersøyle. De basiske produktene ble eluert fra ionevekslersøylen med pyridinbuffer (vann/pyridin/ eddiksyre, 66:30:4) og inndampet til tørrhet for å gi [1-3-des-aminopenicillamin-2-(O-metyl)-tyrosin-7-(1,5-diaminopentan)-8-desarginin-9-desglycinamid]-vasopressin.

Eksempel 8

Diaminoheptan (13,0 g, 100 mmol) ble løst opp i 100 ml metylenklorid. I løpet av 1 time ble det tilsatt 8,72 g di-t-butylkarbonat (40 mmol) i 10 ml metylenklorid. Etter omrøring ved romtemperatur over natten, ble bunnfallet som opp-sto, frafiltrert. Det ble løst opp i 1N ammoniumhydroksyd og ekstrahert med etylacetat. Etylacetatekstraktet ble vasket med vann og inndampet til tørrhet. Residuet ble løst opp i 1N natriumbisulfat, ekstrahert med etylacetat og deretter gjort basisk (pH 8-9) med ammoniumhydroksyd. Oppløsningen ble ekstrahert med etylacetat. Etylacetatet ble tørket over magnesiumsulfat og inndampet til tørrhet og førte til en blekgul olje som gikk over i fast form ved henstand. Faststoffet ble utgnidd med heksan, frafiltrert og lufttørket. Det ble oppnådd 350 mg (2 %), smp. 55-58°, som ifølge FAB-MS og proton-NMR stemte overens med strukturen av Boc-diaminoheptan.

Pro-OH-peptidet fra Eksempel 1A (25 mg, 0,028 mmol) ble løst opp i dimetylformamid (5 ml). Oppløsningen ble tilsatt

18 mg Boc-diaminoheptan (31 mg, 0,135 mmol), HBT (0,135 mmol) og diisopropylkarbodiimid (21^uliter, 0,135 mmol). Etter omrøring ved romtemperatur over natten ble oppløsningsmidlet fjernet under vakuum. Residuet ble løst opp i kloroform og opp-løsningen vasket med 1N natriumbisulfat og deretter med salt-oppløsning, hvorpå den flere ganger ble inndampet til tørrhet fra kloroform. Residuet ble løst opp i 4N HCl/dioksan og omrørt ved romtemperatur i 30 minutter. Etter fordampning av opp-løsningsmidlet, ble residuet inndampet flere ganger fra kloroform, løst opp i vann, justert til pH 3,5 med iseddik og over-ført til en BioRex-70 søyle (H<+>). Søylen ble vasket med vann og deretter eluert med pyridin-acetatbuffer (30 % pyridin, 6 % eddiksyre). Bufferoppløsningen ble inndampet til tørrhet og residuet lyofilisert fra vann. Peptidet, [1-(3-desamino-penicillamin)-2-(O-metyl-tyrosin)-8-(1,7-diaminoheptan)-9-desglycinamid]-vasopressin, ble renset ved gelfiltrasjonskromatografi i 1 % eddiksyre og deretter ved preparativ HPLC.

Eksempel 9

Fremgangsmåte for fast-fase syntese av de basiske sluttproduktene med formel I: Boc-S-(p-metylbenzyl)-L-cystein ble kondensert med karbo-benzoksykadaverin i metylenklorid ved bruk av DCC/HOBT. Boe ble fjernet med 4N HCl/dioksan og HCl-saltet nøytralisert med trietylamin. S-(p-metylbenzyl)-L-cysteinyl-karbobenzoksy-kadaverinet ble deretter kondensert med fluorenylmetyloksy-karbonyl-3-t-butyl-L-asparaginsyre i DMF ved bruk av DCC/HBT. t-butylesteren ble fjernet med 50 % TFA/metylenklorid og det resulterende Fmoc-Asp-Cys(MeBzl)-Cad-Z ble koblet til benzhydrylamin-resinet ved bruk av DCC/DMAP. Etter fjerning av Fmoc-gruppen med piperidin, ble peptidet forlenget etter den standardiserte fast-fase metoden som i Eksempel 1. Behandling av peptidyl-resinet med vannfri flytende HF ved 0° ga 7-(1,5-diaminopentan)heksapeptid (IV) fullstendig befridd for beskyttelsesgrupper, som deretter ble oksydert til det cykliske disulfid-sluttprodukt med kalium-ferricyanid i fortynnet vandig oppløsning som i tidligere eksempler.

Eksempel 10

Erstatning med den passende beskyttede aminosyre i den ovenfor angitte syntese, ga de respektive cystein- eller prolin-syrer, de basiske peptid-sluttprodukter eller et salt av følgende: a. [1-desaminopenicillamin-2-(O-etyl-D-tyrosin)-3-(4'-metylfenylalanin)-7-D-prolin-8-(1,5-diaminopentan)-9-desglycinamid]-vasopressin-sulfat; b. [1-merkaptopropionsyre-2-(O-etyl-D-tyrosin)-4-(a-amino-smørsyre) -7-(N-metyl-alanin)-8-(1,6-diaminoheptan)-9-desglycinamid]-vasopressin; c. [ 1 -(|3-merkaptopropionsyre) -2-valin-4-cykloheksyl-glycin-7-sarkosin-8-(1,5-diaminoheptan-9-desglycinamid]-vasopressin-hydroklorid; d. [1-(3-merkaptopropionsyre)-4-glutamin-8-(1,5-diaminopentan) -9-desglycinamid]-vasopressin;

e. [1-desaminopenicillamin-2-fenylalanin-7-(1-amino-5-guanidinopentan)-8-desarginin-9-desglycinamid]-vasopressin;

f. [1-desaminopenicillamin-2-D-a-aminofenylsmørsyre-4-isoleucin-7-D-prolin-8-(1-amino-4-N-metylaminobutan)-9-desglycinamid]vasopressin;

g. [1-desaminopenicillamin-2-tryptofan-4-glutamin-7-(1-metylamino-5-N-propylaminopentan)-8-desarginin-9-desglycinamid]-vasopressin.

Eksempel 11

Sammensetning av parenterale enhetsdose- preparater;

Et preparat som inneholdt 0,10 mg av heptapeptidet fra Eksempel 2 eller 5 i form av et sterilt tørt pulver for parenteral injeksjon, ble fremstillet på følgende måte: 0,1 mg peptid ble løst opp i 1 ml av en vandig oppløsning av 20 mg mannitol. Oppløsningen ble under sterile betingelser filtrert over i en 2 ml ampulle og lyofilisert. Pulveret løses opp før intramuskulær eller intravenøs injeksjon til en pasient som.lider av pressor-virkninger som er ømfintlige overfor anti-ADH virkningsmekanisme. Injeksjonen gjentas etter behov 1-5 ganger daglig eller gis kontinuerlig som i.v. drypp.

Sammensetning av nasale enhetsdose- preparater:

2,5 mg finmalt heptapeptid, fremstillet i henhold til oppfinnelsen som angitt i Eksempel 4, ble suspendert i en blanding av 75 mg benzylalkohol og 1,395 g av et suspenderingsmiddel, for eksempel en kommersiell blanding av halv-syntetiske glycerider av høyere fettsyrer. Suspensjonen ble anbrakt i en 10 ml aerosol-beholder som stenges med en måleventil og fylles med aerosol-drivmiddel. Innholdet utgjør 100 enhetsdoser beregnet for nasal administrasjon 1-6 ganger.daglig til pasienter med kardiovaskulære lidelser.

Claims (12)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse med formelen (I)

hvor: NH A er -NH-(CH2)n-NH2 eller -NR-(CH2 )n~ NH-C-NR2 ; P er Phe, Ile, Phe(4'-Alk), Tyr eller Tyr(Alk); X er en D- eller L-isomer av Val, Nva, Leu, Ile, Pba, Phe, Phe(4'-Alk), Trp, Nie, Cha, Abu, Met, Chg, Tyr eller Tyr(Alk); Y er Val, Ile, Abu, Ala, Chg, Gin, Lys, Cha, Thr, Nie, Phe, Leu eller Gly; Z er Gly, Sar, en enkeltbinding eller en D- eller L-isomer av Pro, A 3-Pro, Ala eller N-Me-Ala; R i er, i hvert tilfelle, hydrogen eller metyl; n er et heltall fra 2-8; og R er, i hvert tilfelle; hydrogen eller metyl; eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, karakterisert ved cyklisering av en eventuelt beskyttet forbindelse med formel (II)

hvor: P, X, Y og Z er som ovenfor angitt; Q 1 og Q 2hver er hydrogen eller en gruppe som kan for-trenges; og A er OH eller som ovenfor angitt; eventuelt etterfulgt i en hvilken som helst rekkefølge av (a) fjerning av eventuelle beskyttelsesgrupper, (b) omsetning av Cys(OH) 6 eller Z(OH) 7 forbindelsene, når de forekommer, med et diamin, H-A, eventuelt i beskyttet form, og (c) fremstilling av et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det benyttes en forbindelse hvor Q 1 og Q 2 begge er hydrogen.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det benyttes en forbindelse hvor Q 1 og Q 2 begge er azetamidometyl.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1-3, karakterisert ved at det foretas en oksydativ cyklisering.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at jod benyttes som oksydasjonsmiddel.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at ferri-cyanid benyttes som oksydasjonsmiddel.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at en Cys(OH) -forbindelse med formel I, omsettes med H-A i nærvær av et karbodiimid, hvorpå eventuelt forekommende beskyttelsesgrupper eventuelt fjernes.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at en Pro(OH) <7-> forbindelse med formel I, omsettes med H-A i nærvær av et karbodiimid, hvorpå eventuelt forekommende beskyttelsesgrupper eventuelt fjernes.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1 , karakterisert ved at det fremstilles en forbindelse hvor A er -NH-(CH2 )4 ; P er Phe; X er L-Tyr(Me); Y er Gin; Z er L-Pro og R1 er CH3 -

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det fremstilles en forbindelse hvor A er -NH-(CH2 )4 -NH2 ; P er Ile; X er D-Tyr(Et); Y er Thr; Z er L-Pro og R er hydrogen.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det fremstilles en forbindelse hvor A er -NH-(CH2)5-NH2; P er Phe(4'-Me); X er D-Tyr(Et); Y er Gin; Z er D-Pro; og R1 er CH3 .

12. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det fremstilles en forbindelse hvor A er NH ■i -NH-(CH2 )4 -NH-C-NH2 ; P er Phe; X er L-Tyr(Et); Y er Gin; Z er L-Pro og R1 er CH3 .