NO831406L - Mikrobielle polysakkarider, fremgangsmaate til deres fremstilling, dertil egnede mikroorganismer, og polysakkaridenes anvendelse - Google Patents

Description

Mikrobielle polysakkarider som Xanthan Gum finner mangesidig anvendelse som viskositetsregulator., som eksempelvis ved jordoljebefordring, som tilsetning til kunststoffdisper-sjoner og for farvemiddeltilberedninger.

Oppfinnelsen vedrører ekstrazellulære polysakkarider som er oppnåelige ved fermentering ved hjelp av en blandingskultur av flere mikroorganismer hvorav minst en også i renkultur produserer et polysakkarid, videre.en fremgangsmåte til fremstilling av polysakkarider ved fermentering ved hjelp av mikroorganismer, idet fremgangsmåten erkarakterisert vedat en blandingskultur av flere mikroorganismer hvorav minst en også i renkultur produserer et polysakkarid anvendes, hertil spesielt egnede mikroorganismer, samt anvendelsen av de således oppnåelige polysakkarider som viskositetsregulatorer for flytende,

spesielt vandige systemer. Foretrukkede utforminger av oppfinnelsen forklares nærmere i det følgende.,

Blandingskulturene kan avhengig av den anvendte mikro-organisme podes like etter blandingen i produksjonsmediet, eller holdes over noen generasjoner først som blandingskultur, før det innføres i produksjonsmediet. Den måte man går frem i enkelt-tilfelle er lett å fastslå ved hjelp av forforsøk.

Det optimale mediet for blandingskulturen kan ad-skille seg fra de optimale medier for renkulturene. Funn av det mest hensiktsmessige mediet, er også her mulig for fagfolk ved hjelp av enkle forforsøk uten oppfinnrisk ytelse.

Sammenlignet til de polysakkarider. som produseres

av de hver gang anvendte renkulturer utmerker biopolymerene ifølge oppfinnelsen seg ved forbedrede egenskaper. Således viser de i vandig og/eller vandig saltholdig oppløsning en viskositet som ligger tydelig over den som fåes med samme

mengder av polysakkaridene som ble fremstillet med de tilsvarende renkulturene. Tilsvarende viskositetsmålinger på opp-løsninger av produktene kan også anvendes som kriterium for ut-valg av kulturmediet.

For de ifølge oppfinnelsen avnendbare blandingskulturer kan det anvendes typer av følgende slekter av bakterier eller sopp;

Agrobacterium, Alcaligenesm Arthrobacter, Aureo-basisium, Azotobacter, Bacillus, Corynebacterium, Erwinia, Hansenula, Klebsiella, Leuconostoc, Methylococcus, Methylo-cystis, Methylomonas, Nocardia, Pseudomonas, Sclerotium, Streptomyces og Xanthomonas.

(Volum-)-forholdet av de for blandingskulturen anvendte renkulturer kan utgjøre fra 1:1 til 1:10 000, og ligger fortrinnsvis i området fra 1:1 til 1:100, spesielt fra'1:1

til 1:10.

Fortrinnsvis inneholder blandingskulturen en renkultur av slekten Pseudomonas, spesielt av stammen Pseudomonas maltophilia, som er deponert ved den tyske samling av mikroorganismer under nummer DSM 213 0. Denne stamme samt dens mutanter og varianter som likeledes i blandingskulturer danner ekstrazellulære polymere med fordelaktige egenskaper, er ytterligere gjenstand for oppfinnelsen.

Da mange Pseudomonasrkulturer alene ikke danner brukbar polymere og delvis bare mindre mengder lav-viskose sjikt, er det overraskende at blandingskulturer som inneholder slike stammer produserer polymere med fremragende egenskaper. Ved anvendelse av Pseudomonas-kulturer fåes ofte blandingskulturer som er stabile over tallrike generasjoner. Utskillelsen av polymeren ifølge oppfinnelsen med forbedrede reologiske egenskaper foregår ofte først etter en viss adapsjonstid av blandingskulturen.

Som komponenter for blandingskulturen med Pseudomonas-typer, spesielt Pseudomonas maltophilia, kommer det spesielt følgende bakterietyper i betraktning: Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobac-ter, Agrobacterium rhizogens, Agrobacterium rubi, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella planticola, Enterobacter sp., Xanthomonas sp. og Bacillus polymyxa. "Enterobacter sp." og "Xanto-monas sp." står her for alle typer av disse slekter som er kjent som polysakkariddannende bakterier.

Med følgende bakteriestammer ble det i blanding med Pseudomonas maltophilia DSM 213 0 dannet biopolymere som viser en spesielt tydelig økning av viskositeten sammenlignet til pro duktet fra renkulturen:

Spesielt foretrukket for en blandingskultur med Pseudomonas maltophilia DSM 213 0 er Agrobacterium tumefaciens, som er deponert ved den tyske samling for mikroorganismer under nummer DSM 2138. Denne stamme samt dens mutanter og varianter som likeledes i blandingskulturen danner ekstrazellulære polymere med fordelaktige egenskaper, er videre gjenstand for oppfinnelsen. De tilsvarende blandingskulturer kan holdes stabile over minst 3 måneder i kontinuerlig kultur.

Fermenteringen foregår på i og for seg kjent måte. Som karbonkilde inneholder fermenteringsmediet monomere, dimere eller oligomere sukker, som eksempelvis glukose, sakkarose eller laktose, eller en ønskelig blanding av disse sukker, idet sukkerkonsentrasjonen i mediet utgjør 10 til 100 g/liter, fortrinnsvis 40 til 60 g/liter. I steden for det rene sukker, anvendes teknisk spesielt fordelaktig kullhydratholdige råmaterialer,

f. eks. flytende sukker, melasse, myse eller mysepulver, idet sukkerkonsentrasjonen tilsvarer de overnevnte verdier.

Som nitrogenkilde i fermentasjonsmediet, kommer

det på tale organiske produkter som sojamel, mais-svellevann, gjærekstrakt, hvetekli, samt urinstoff eller uorganiske salter, som nitrater eller ønskelige ammoniumsalter, eller ønskelige blandinger av to eller flere av de nevnte substrater, idet nitrogenkonsentrasjonen i mediet velges således at den tilsvarer 0,5 til 250 mM, fortrinnsvis 10 til 50 mM NH^.

pH-verdien holdes ved fermenteringen i området fra

5 til 9, fortrinnsvis 6 til 7,5.

Temperaturene holdes under vekstfasen i ca. 8 til

12 timer ved ca. 35 til 45°C, og deretter til avslutning av polymerdannelsen mellom ca. 15 og 45°C, fortrinnsvis 20 til 4 0°C, spesielt 25 til 35°C. Sukkersubstratet og nitrogenkilden tilsettes enten i full mengde med en gang ved begynnelsen av fermenteringen, eller tildoseres etter hvert til fermentereren. I dette tilfellet holdes fordelaktig sukkerkonsentrasjonen under det samlede forløp av fermenteringen konstant mellom 0,001 og 1 vekt%, og nitrogenkilden tildoseres så-

ledes at under fermenteringen hersker i mediet jevntblivende en konsentrasjon mellom 0,0001 og 1 mM NH^•

Den ekstrazellulære polymer kan isoleres fra fermen-ter ingsmediet ved ultrafiltrering og/eller felling, eksempelvis med polare oppløsningsmidler som aceton eller lavere alkanoler, eller med salter som magnesiumklorid eller kalsiumklorid og baser som natriumhydroksyd eller kaliumhydroksyd. Før utfellingen kan produktet behandles med zellyserende enzymer som lysozyl eller med proteolytiske enzymer som trypsin eller med begge i rekkefølge for klaring og eggehvitespalting, hvorved det fåes et spesielt rent produkt. Før fellingen av polymeren kan fermenteringsoppløsningen også blandes med reagenser, som utfeller eggehvite og nukleinsyre hvorpå oppløsningen adskilles fra de utfelte stoffer, eksempelvis ved filtrering eller sentrifugering.

Fermenteringen og isoleringen av produktet kan hver gang gjennomføres diskontinuerlig, eller kontinuerlig.

Foretrukkede polymere ifølge oppfinnelsen er sammensatt som følger: Glukose og galaktose i molforhold på ca. 4:1 til 8: 1 som hovedkomponent, og som bikomponenter ca. 4 til 9 vekt% pyruvat, ca. 5 til 15 vekt% succinat, ca. 0,5 til 7 vekt% rhamnose og ca. 0,2 til 5 vekt% mannose.

Oppfinnelsen skal forklares ved hjelp av noen eksempler hvor prosentangivelser og forhold refererer segltil vekt hvis intet.annet er angitt.

Eksempel 1

Fremstilling av blandingskulturen.

I første rekke kultiveres adskilt stamme DSM 2128 og 2130 for følgende medier: 30 g glukose, 3 g mais-svellevann (tørt), 0,5 g MgS04. 7 H20, 1 g KH2P04 og 5 g CaC03 for stammen DSM 2130 og i tillegg 1 g NaNO^ for stammen 2128, hver gang springvann ad 1 liter. For agar-kulturene tilsettes til mediene 1,8 % agar. Dyrkningstiden for agar-kulturene utgjør 2 dager ved 3 0°C. Rystekulturen foregår i 300 ml kolber, hver 100 ml fylling ved 30°C, og en rundryster (rystediamter 5 cm, dreie-tall 18 0 opm), dyrkningstid 24 timer.

Før podning av en fermentererkultur blandes kul-turen av begge stammer 1:1 og overpodes i nevnte medium med NaNO^. Den ansatte blandingskultur podes ennå 2 til 3 ganger etter hver gang 24 timer veksttid i samme. mediet, og ..stabili-seres derved. Blandingsforholdet av de to typer endrer seg deretter ved videre overpodning ikke mer, og forblir stabilt ved regelmessig overpodning minst i 2 år.

Fermentering

Av den ovenfor omtalte stabiliserte blandingskultur anvendes 300 til 5 00 ml som inokulum for en fermenterer med 10 liters innhold som inneholder et fermentasjonsmedium av følgende sammensetning (pr. liter):

Fermenteringen foregår ved 30°C, idet innholdet omrøres med en spiralrører (450 opm). Gjennomluftningen foregikk til begynnelsen med 10 l/min, etter ca. 24 timer med økende viskositet økes luftmengden inntil 18 l/min. pH inn-reguleres på 6,8 med saltsyre og natronlut. Etter 48 til 60 timer er glukosen fullstendig avbygget, idet det pr. liter fermenteringsoppløsning dannes 25 g polymer.

Kulturoppløsningen pasteuriseres ved oppvarming til 85°C før opparbeidelsen, og bakteriecellene avsentrifugeres etter fortynning. Deretter utfelles polymeren ved tilsetning av aceton, idet det var nødvendig ca. 1,5-ganger volum av den vandige oppløsning. Det utfelte produkt tørkes, det inneholder ennå ca. 5 % eggehvite.

I steden for sentrifugering kan bakteriecellene etter kjente fremgangsmåter kjemisk eller enzymatisk oppløses i fermenteringsoppløsningen. I steden for aceton kan utfellingen også foregå med isopropanol eller et annet lavere vannoppløse-lig alkanol.

Når det er ønskelig med et renere produkt kan

i første rekke proteinene og nukleinsyrene utfelles på kjent måte og adskilles, og derpå utfelles polysakkarider som deretter igjen oppløses i vann, og til slutt utfelles.

Den følgende tabell viser viskositeten av det således dannede produkt sammenlignet til xanthan-gummi ved skjær-fall D= 10/sek og D = 424/sek i vandig og saltholdig oppløsning (13 % NaCl + 1 % CaCl2) ved en konsentrasjon på 0,2 % (angivelse i mPa.s, ved 22°C):

Polysakkaridet er sammensatt av følgende monomere: Glukose og galaktose i forhold 6:1 til 7:1 som hovedkomponenter, 5,1 til 7,9 % pyruvat, 6,4 til 8,7 % succinat, 1 til 1,5 % rhamnose og ca. 0,4 % mannose som bikomponenter.

Elementæranalyse ga: 41 % C, 5,6 % H, 45 % 0, 1,7 % N, 0,8 % P:

Eksempel 2

Fermenteringen foregikk som omtalt i eksempel 1.

Etter pasteuriseringen utfelles imidlertid produktet som følger: Pr. 100 g polymer tilsettes og oppløses 64 g magnesiumklorid. Deretter innstilles oppløsningen alkalisk med 51 g natriumhydroksyd, idet magnesiumsaltet utfeller en polymer.

Det utfelte produkt ..fraf iltreres, vaskes med en blanding av

2 volumdeler isopropanol og 1 volumdel 4 M saltsyre, idet det anvendes 15 liter pr. kg utfellingsprodukter. Deretter etter- vaskes med samme mengde isopropanol og deretter tørkes det for magnesiumioner befridde produkt.

I steden for de 64 g magnesiumklorid kan det også anvendes 75 g kalsiumklorid, idet da kalsiumsaltet av polymeren utfelles.

En ytterligere rensning kan foregå som angitt i eksempel 1.

Eksempel 3

For en kontinuerlig fermentering anvendes samme medium som i eksempel 1. Etter en veksttid på 2 0 timer begynner den kontinuerlige dosering av samme medium. Fortynningsgraden utgjør 0,04 pr. time. Samme mengde uttas kontinuerlig og tilføres opparbeidelsen. Alle beskrivende trinn for opparbeidel-se i eksempel 1 gjennomføres nå kontinuerlig, imidlertid bort-faller pasteuriseringen av oppløsningen etter uttak fra fermentereren. Den frasentrifugerte cellemasse tilføres til 90 % i fermentereren og pasteuriseres til 10 % og kasseres. Den fra fermentereren uttatte suspensjon inneholder 2 0-22 g polymer-produkt pr. liter og et restsukkerinnhold under 0,5 %. Bakterie-stammeblandingen forblir uten regulerende inngrep stabil over minst 3 måneder.

Claims (10)

1. Ekstracellulære polysakkarider, oppnåelige ved fermentering ved hjelp av en blandingskultur av flere mikroorganismer, hvorav minst en også i renkultur produserer et polysakkarid.

2. Polysakkarid ifølge krav 1, inneholdende glukose og galaktose i molforhold fra ca. 4:1 til 8:1 som hovedkomponenter og som bikomponenter ca. 4 til 9 vekt% pyruvat, ca. 5 til 15 vekt% succinat, ca. 0,5 til 7 vekt% rhamnose og ca. 0,2 til 5 vekt% mannose.

3. Fremgangsmåte til fremstilling av ekstracellulære polysakkarider ved fermentering ved hjelp av mikroorganismer, karakterisert ved at det anvendes en blandingskultur av flere mikroorganismer, hvorav minst en også i renkultur produserer et polysakkarid.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at en av mikroorganismene er av stammen Pseudomonas maltophilia DSM 213 0.

5. Fremgangsmåten ifølge krav 3 eller 4, karakterisert ved at en av mikroorganismene er stammen Agrobacterium tumefaciens DSM 2128.

6. Fremgangsmåten ifølge en eller flere av kravene 3 til 5, karakterisert ved at den dannede polymer isoleres fra fermenteringsmediet ved ultrafiltrering og/eller felling.

7. Anvendelse av polysakkarider ifølge krav 1 og 2 som viskositetsregulatorer.

8. Pseudomonas maltophilia DSM 2130.

9. Agrobacterium tumefaciens DSM 2128.

10 Mutanter og varianter av stammene ifølge krav 8 og 9 som i blandingskulturer produserer ekstracellulære polysakkarider.