NO831223L - Immunoglobulinpreparater for bruk til behandling av kreft - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører iinmuno- og kjemoterapeutiske produkter og fremgangsmåter for behandling av verter med kreft.

A. Tvungen elektroforese

Tvungen elektroforese er en teknikk hvorved én gammoglobulin-rik fraksjon adskilles elektroforetisk fra heparinisert helblod som sirkulerer i et utenomkroppslig kretsløp (1-5) . Den generelle fremgangsmåten er den samme som den som anvendes ved kunstige nyrer og særlig ved blodelektrodialyse (6).

Tvungen elektroforese (FFE) var opprinnelig tenkt som en elektroforetisk teknikk i stor skala for hurtig fraksjonering av biologiske materialer, hvilket gav adgang til rensingen av isoelektriske proteinbestanddeler (5). Funksjonerings-prinsippene for den tvungne elektroforesen er som følger: ved nøytral pH vil alle plasamproteiner med unntak av gammaglobulin forslutte seg i et elektrisk felt. Dette prinsippet brukes til å utvinne alle plasmaproteiner og til å ads4cille gammaglobulin. Det har vist seg å være et mer allsidig verk-tøy, egnet for undersøkelsene av en rekke elektro-kinetiske membranfenomener slik som elektrofiltrering og dens anvend-

else til vannrensing (7)., elektroadsorbsjon av bakteriofager (8), blodelektrodialyser og den elektroosmotiske konsentrasjon

og/eller avsalting av proteinoppløsninger (9). FFE kan utformes for "on-line"-drift og har vært brukt for å fjerne immunoglobuliner fra hunder for å forhindre eller forsinke avvisning etter nyreimplantasjon (10). Bruken av denne innretningen i behandling av pasienter med kreft har ikke, såvidt oppfinneren kjenner til, vært gjort tidligere.

Under FFE samles det opp en effluent (EIE) som er rik på gammaglobulin,men som også inneholder plasmaproteiner (10).

Før den foreliggende oppfinnelse, har denne effluenten vært kastet uten noen ytterligere behandling. Den foreliggende oppfinnelse retter seg mot oppsamlingen av denne effluent ved hjelp av FFE-innretningen, dens derpå følgende behandling

og tilbakeføringen til verten med kreft.

B. Protein A IgG komplekser

Protein A er en bestanddel i cellevegger til staphylococcus aureus Cowans I som reagerer med Fc-fragmentene i immunoglobuliner fra mange pattedyrarter hvorved det dannes immunkomplekser som fikserer komplement og bryter ned komplementbestanddeler (11-16). Ved tidligere undersøkelser på hunder med spontan bryst-adenocarcinoma, en utmerket modell på brystkreft hos menneske, ble plasma sirkulert over protein A bærende stafylokokker (SpA) som var immobilisert i et mikro-porøst membranfiltreringssystem og tilført plasma som kom fra en kontinuerlig plasma/celle-separator (17). Kort tid etter sirkulasjonen av et plasmavolum over protein A bærende s.taf ylokokker, ble det observert at kreftceller døde etterfulgt av objektive tumorregresjoner. Disse virkninger ble ikke funnet når plasma ble sirkulert over stafylokokker uten protein A (17). Funnene av tumorregresjoner i dette eksperimentelle hundresystemet ble bekreftet i en uavhengig under-søkelse (18). Plasmaperfusjon ble så forfinet og lignende nekrolytiske tumorresponser ble funnet etter plasma-

perfus jon over renset protein A som var immobilisert i en grunnmasse av kollodium og trekull (protein A kollodium trekull, PACC (19) .

Denne form for terapi ble brukt på fem pasienter med bryst adenocarcinoma og akutte tumoriside reaksjoner bir iakttatt kort tid etter perfusjoner over PACC. Etter gjentatte behandlinger ble det observert objektive tumor-tilbakevendende virkninger hos fire av disse pasientene (20).

Tidligere undersøkelser på hunder og mennesker med spontan bryst adenocarcinoma viste (bl.a. ting) de følgende resultater når subjektet ble behandlet med plasma som hadde passert over immobilisert SpA eller PACC (17, 19, 20). Det hurtige angrepet av akutt smerte og synlige morfologiske endringer i brystvegg-tumorer etter utenomkroppslig perfusjon av små volumer plasma over PACC antyder at disse virkninger ble frembragt av faktorer som var generert i plasma etter passering over PACC (17, 19, 20). Fremgangsmåten ble forenklet teknisk ved å eliminere det tilknyttede utenomkroppslige sirkulasjonssystemet og istedet fikk små aliquoter med autologt eller homologt plasma, som tidligere var blitt samlet opp ved årelating, passere over PACC uten å være tilkoplet, etterfulgt av direkte infusjon

i pasienter (20). Pasienter som utelukkende var behandlet med den ikke tilkoplede plasmaperfusjon, viste akutt smerte med lignende morfologiske responser og tumortilbakevendende virkninger som de som ble observert ved det tilkoplede utenomkroppslige systemet (20). Videre var de tumoriside responsene både hos hunder og mennesker ledsaget av serologiske og immunohistokjemiske endringer, nemlig økte fastfase Clq-bindi og C5a nivåer, og minsking i C3 forbundet med avleiringer av IgG og C3 på tumorcellemembraner (17, 20, 21).

SpA har evnen til å binde seg til Fc området i IgG som ikke bare kan resultere i komplementaktivering og andre virkninger in vitro, men også kan gi virkninger in vivo som ligner immunreaksjoner tilveiebragt av antigen-antostoff komplekser. Noen av disse synes å omfatte komplement aktivert av SpA-IgG-komplekser i oppløsning. F.eks. ga SpA administrert i huden til normale menneskeindivider i doser så lave som 10 mikrogram blemme- og rødmereaksjoner påvist etter 30 minutter, og en senere reaksjon med maksimal intensitet etter 24 til 48 timer. På samme måte resulterte så lite som 10 mikrogram SpA gitt intradermalt til marsvin i en signifikant artus-lignende reaksjon og 300 - 400 mikrogram ga en blødningsreaksjon med maksimal intensitet etter 12 til 24 timer (22). Marsvin som var gitt 50 0 til 1000 mikrogram intrakardialt, led av alvorlig anafylaktisk sjokk som kunne forhindres ved på forhånd å gi angihistaminer. Heczko et al (23) fant også at marsvin som var sensitivisert med så lite som 50 mikrogram SpA i fullstendig Freunds hjelpestoff, ga en forsinket reaksjon som var maksimal etter 24 timer, mens den samme dose gitt i fullstendig hjelpestoff eller i saltvann ga en artus-reaksjon som var maksimal etter 6 timer. I motsetning til menneske og marsvin, ga ikke andre arter med IgG som ikke utfeller SpA, hypersensitivitetsreaksjoner når de ble gitt SpA alene. Således oppviste kaniner som var gitt den enkle injeksjonen

av opptil 6 mg SpA og mus som var gitt fra 10 til 500 mikrogram, hverken tidlig anfall eller forsinkede reaksjoner (24, 25). Hos kaniner ble det imidlertid frembragt en direkte artus-reaksjon etter 5 til 10 timer ved administrering av 100 til 180 mg menneske IgG intravenøst etterfulgt etter 10 til 15 minutter av 0,025 til 21,5 mg SpA intradermalt,

og død på grunn av blødning var et faktum 18 til 24 timer etter intradermale injeksjoner av på forhånd dannede utfellinger mellom menneske IgG og SpA (24). Oppløselige komplekser mellom IgG fra kanin og 125^SpA ble hurtig tatt ut fra kretsløpet hos kaniner ved lever og milt, og opptil 49% merkede komplekser ble tatt opp in vitro under en -passering av saltvann over kaninlever (25).

Det er kjent at SpA tilsatt til menneske-, marsvin-, kanin-eller svingeserum forårsaker svak til markert uttømming av komplementaktivitet avhengig av artene (26-29). Blandinger av SpA og normalt eller myeloma IgG eller Fc fragmenter fra menneske eller normalt marsvin IgG aggregert av SpA hadde en lignende virkning (30, 31). Komplekser mellom SpA og begge marsvinunderklasser IgG-^og IgG2fikserte komplement, mens antigen-antistoff-komplekser omfattende IgG^ ikke gjorde det (30, 31). Når SpA ble tilsatt til helsera fra menneske, avtok titerne for de nye bestanddelene av komplement med unntak av C7 som ikke ble bestemt, med fra 3 0% (C8) til 85%

(C3) og optimal inhibering oppsto ved IgG overskudd. På forhånd fremstilte komplekser mellom SpA og Fc-fragmentet til et komplement som fikserer myeloma IgG^, fremstilt under betingelser for maksimum aktivitet, minsket den totale komplement-titeren med 64% og titeren for de enkelte bestanddelene med fra

4% til 99% (C3) (14). SpA inhiberte også binding av Cl til enten varme aggregert IgG eller IgG myeloma 1 proteinet, men hadde ingen virkning på bindingen av Cl til IgG (14). Ut-tømming av komplementaktivitet var avhengig av mengden av SpA i forhold til IgG. Etter hvert som dosen av SpA-serumøkte, var det følgelig et maksimumnivå av komplementaktivering som avtok ved høye SpA-konsentrasjoner (14, 26, 28).

Denne virkning ble fortolket slik at høye konsentrasjoner

av SpA inhiberte Cl-binding. Eksperimenter av Langone et al.

(32, 33, 34)klargjorde virkningen av SpA på antistoffaktivitet. Komplekser mellom IgG og SpA dannet ved relativt høye eller lave doser SpA, opptrådte på samme måte som autentisk IgG. SpA-IgG-komplekser fremstilt med den empiriske formel

( (IgG)2sPA)nopptrådte på samme måte som IgM med hensyn til sinehemolytiske evner og med hensyn til måten de virket sammen med helt komplement eller renset Cl (34). Ved hjelp av fluoresenssluknings- og lysspredningsteknikker ble det påvist at Fc fra kanin hadde to bindingssteder for monovalent fragment B og at det ble dannet komplekser med to til fire molekyler av Fc-fragmenter bundet sammen ved hjelp av SpA (35). Videre forbedrer kompleksdannelse mellom IgG og SpA antistoffaffiniteter signifikant sannsynligvis på grunn av tilknytning på flere steder (13).

Polymorfonukleære leukosytter hos menneske omslutter hurtig

og nedbryter uoppløselige komplekser fremstilt av menneske IgG og SpA (36, 37) og hvite blodceller avgir histamin i nærvær av SpA (38). Graden av fagocytose er avhengig av SpA dosen og var optimal avhengig av de dannede utfellingene, og den ekvivalente frigjøringen av myeloperoksidase samsvarte med fagocytose av komplekser. 125^. merket IgG ble brukt til å vise at opptak var avhengig av konsentrasjonen av neuro-filer, Egenskapene til kompleksene, inkubasjonstiden og nærværet av serkumfaktorer (36).

Foreliggende oppfinnelse viser at protein A-IgG-komplekser dannes etter plasmaperfusjon over PACC. Lignende komplekser fremstilt ved inkubering av protein A med IgG eller serum i forskjellige molare forhold og deretter gitt intravenøst til turnorbærende verter har resultert i tumoricide reaksjoner og tumorregresjoner. Dette utgjør et nytt produkt for bruk ved behandling av kreft.

C : vSurgj^ ring og alkalisering

Det har gjennom mange år vært anerkjent at det å utsette antigen-antostoff-komplekser, enten de er naturlig fore-kommende eller kunstig fremstilte, for ekstreme forhold med hensyn til pH på enten den sure eller alkaliske side vil hovedsakelig resultere i deres fullstendige oppløsning i deres respektive bestanddeler. Det å utsette kunstig fremstilte komplekser av serumalbumin-antiserumalbumin

fra okse for sur pH resulterer i adskillelse i de respektive bestanddeler slik det først ble demonstrert av CampbelJ. et al.

(39). Dette konseptet har vært anvendt på immuologiområdet for å isolere antigener og antistoffer som er til stede i form av et immunkompleks. Fremgangsmåten for adskillelse av antistoffer fra antigen-antistoffkomplekser ved surgjøring og antistoffisolering etter antigenfjerning ved ultrafiltrering ved lav pH ble beskrevet av Sjøgren et al. (40)

i et system med tumor fra mus. Senere ble det funnet potensielt cytotoksiske antistoffer rettet mot antigener med tilknytning til leukemi i serum under det aktutte stadiet av akutt myelogen leukemi. Etter ultrafiltrering ved lav pH var signifikante komplementavhengig cytotoksisitet påvisbar i de fleste av de undersøkte sera (41). Dertil isolerte Dorsett et al. (42) tumorspesifike antistoffer fra utskillelse av ovariecarcinoma fra eggstokkene ved hjelp av saltutfelling og deretter inkubering ved pH 2,8 etterfulgt av nøytralisering av prøvene ved sakte tilsetning av natrium-hydroksyd. Frigjorte antistoffer ble prøvet ved hjelp av indirekte immunofluoresens og oppviste vesentlig økning

i titer. Konseptet ved alkalisering av oppløsninger for å adskille immunkomplekser ble opprinnelig beskrevet av Kabat og Mayer (43) og har vært brukt for dette formål i mange år.

Surgjøringen eller alkaliseringen av avløpsvæsker fra tvungen elektroforese eller turnorbærende plasma og dens bruk i behandlingen av kreft slik det vil bli beskrevet her, har såvidt oppfinneren kjenner til ikke tidligere vært utført eller rapportert.

D. Tumorimmun globulin

Immunoglobulinbruk i klinisk medisin begynte mee bruken av antitoksiner ved Behring og Kitasato (44) og utviklet seg til den kliniske bruken av antitoksiner fra dyr ved profil-oksen av sykdom hos menneske. Bruken av menneske-immunoglobulin preparater for passiv immunisering begynte med undersøkelsene av McKhann og medarbeidere (45, 46) som brukte ammoniumsulfat for å isolere globulinfraksjoner fra morkakeekstrakter. I 1936 ble disse fraksjonene, som viste seg å være effektive for å forhindre eller modifisere meslinger, referert til som immunglobulin (human) (47). Hovedfremskrittet på området kom ved utnyttingen av kald etanol til fraksjoneringen av immunoglobuliner fra menneskeplasma og påvisningen av at fraksjoner II, dvs. immunserumglobulin var effektive til profilaksen av meslinger (48, 49) og hepatitt (50, 51) likesåvel som til behandlingen av immunologiske ufullkommenheter (47) . Utviklingen av immuno-globulinbruken i De forente Stater har for en stor del bestått i innføringen av spesifike immunglobuliner. Produkter slik som stivkrampe-immunglobulin, anti-D globulin og immungolublin mot hundegalskap innehar en forholdsvis sikker status i klinisk medisin. Det nyeste av disse produktene er hepatittisk B globulin og enda flere slik som varicella-zoster immunglobulin er under utforskning. Det finnes nå

preparater for intravenøs bruk av gammaglobulin som om-

fatter de reduserte og alkylerte, de saltfraksjonerte,

beta propiolaktonbehandlede og de pH 4 behandlede preparater (52-57). Disse preparatene har vist seg å være virknings-fulle og har alle vist en stor variasjon av bivirkninger. Bivirkningene synes å reduseres vesentlig ved pH 4 behandling

og en indikasjon forelå om at bivirkninger kunne unngås ved sakte infusjon. Ideelle egenskaper hos gammaglobulin omfatter fraværet av fragmenteringen, fraværet av både aggregering og IgA, og stabilitet hos preparatet. Det bør være egnet for bruk enten intramuskulært eller intravenøst og ikke ha noen hepatitis risiko.

Bruken av tumorspesifike antistoffer for spesifik aktiv immunoterapi har utviklet seg i de følgende retninger.

Prøver med fremmedsera har vært utført og krever administreringen av fremmedprotein i en forlenget periode med dertil hørende risiko for allergiske reaksjoner. Ikke desto mindre hadde Lindstrøm i et tidlig forsøk enkelte kliniske responser på administrering av sera fremstilt i kaniner etter immunisering med myeloid leukemi celler (58). DeCarvalho fremstilte hyperimmun gammaglobulin i hester mot antigener adskilt fra norame antigener i tumorvev ved utfelling av de sistnevnte ved hjelp av antistoffer mot normalt vev. Tretten av 15 leukemi pasienter hadde ved foreløpige tilbakeganger i syk-domsbildet som varte fra 4 uker til 29 måneder etter å ha fått immunserumglobulin (59) . Sekla og kolleger var ikke i stand til å frembringe foreløpig tilbakegang i sykdommen hos fem pasienter ved hjelp av heterologe immunglobuliner fremstilt på en litt forskjellig måte (60). Tsirimbas et al. behandlet fem pasienter med kronisk lymfeleukemi med anti-lymfosyt serum fra hest. Hos 3 av 5 pasienter falt antallet perifere celler til omtrent 40% av den opprinnelige verdien (61). DeCarvalho så objektive bevis for respons hos pasienter med fast tumor ved bruk av globuliner fremstilt som for leukemiene (59) . Marsh et al. administrerte et antitumor serum fra kanin til pasienter med en rekke forskjellige faste tumorer (62). De så ingen klinisk virkning selv om antistoff ble selektivt lokalisert ved autopsi i områder med sarcomaceller. I et nyere forsøk hvor det ble bruk serum fremstilt fra melanoma-immuniserte sjimpanser, iakttok forskerne akutt død som følge av invollssykdom hos to av tre pasienter selv om tilbakegangene var ufullstendige og ble gjort komplekse på grunn av dødelig thrombocytopenia hos en paseient (63).

Også allogene sera har vært undersøkt med hensyn til deres terapeutiske virkning på leukemi. Flere forskere har for-søkt å behandle leukemier og lymphomas med sera som inneholder antistoffer mot menneske lymfosytter. I en under-søkelse av Laslow et al. (64) ble antilymfosyttplasma fremstilt ved å immunisere normale individer mot normale lymfosytter. IgG ble så adskilt fra dette plasma og gitt til tre pasienter med kronisk lymfosyttleukemi. Hos hver-pasient var det en forbigående lymphopenia og minsking i størrelsen på lymfeknuter etter infusjon. Djarassi behandlet fire pasienter med akutt lymfosyttisk leukemi med serum fra en pasient med thalassemia major som var blitt gjort sensi-tiv mot både granulosytter og lymfosytter fra mange individer. Hos alle fire pasienter sank antallet perifere hvite klodlegemer (65). Herberman administrerte serum ned cytotoksiske antistoffer fra en kvinne med flere graviditeter til syv pasienter med lymfoproliferative sykdommer. Pasientene hans svarte med fall i lymfosytt- og platelet antallene gjennomsnittlig 48,8% til 25,5% av verdiene før behandlingen som varte i en dag. To av de fem pasientene hadde svinn av perifert lymfevev. To av fire pasienter hadde mindre bivirkninger slik som feber og frysninger og to hadde ånde-drettsbesvær (66).Allogene sera hvor donorene forsettlig var blitt immunisert mot tumorceller har også vært undersøkt. Brittingham og Chaplin immuniserte en normal donor med leukosytter fra en pasient med kronisk myelosyttisk leukemi. Det normale individet ble så på nytt immunisert 3 år senere med helblod fra en annen pasient med kronisk myelosyttisk leukemi. Antileukosytt-antistoffet som var aktivt mot donor-celler oppstå i det normale individet. Gammaglobulin ble holdt fra denne donor og denne donors plasma ble administrert til de pasienter med leukemi hvis celler var blitt brukt til re-immunisering. Der var ingen åpenbar nyttig viskning på pasientens sykdom (67) . Skirkovich og medarbeidere immuniserte pasienter med leukemiceller fra andre pasienter. Åtte til 15 dager etter immunisering ble plasma byttet to til tre ganger mellom donorpar av pasientene. Seks par barn ble behandlet og tre fullstendig og fem delvis hematologiske remisjoner ble observert. Syv av disse pasientene som svarte på behandlingen, hadde fått steroid terapi såvel som cyto-statisk terapi, men en fullstendig remisjon ble oppnådd med immunoterapi alene (68). Remisjonsplasma hadde også vært gitt for passiv terapi. Skirkovich og medarbeidere samlet opp autologe plasma og leukosytter tidlig under remisjon og administrerte disse til pasienter på senere stadier av remisjon. De hadde en fornemmelse av at remisjonsvarigheten ble forlenget ved denne manøver (69) . Ngu som brukte senere remisjonssera fra pasienter med Burkitts lymphoma frembragte regresjoner hos pasienter med aktive sykdommer (70) . Serum fra pasienter med regresjon av malignant melanoma har av og til indusert regresjon når det ble. administrert til andre pasienter.

Forskere har forsøkt på å utnytte spesifisiteten til antistoff til å overlevere andre cytotoksiske materialer direkte til tumorcellen i modellforsøk på dyr. Klorambucil og dauno-mycin har blitt bundet til antitumor antistoffer (72, 73)

og antistoffer har også vært merket med radioaktive isotoper slik som 131^(74) . Det har også vært konjugert toksiner slik som difteri (75) og enzymer med cytotoksisk potensiale (76). En mulig synergistisk virkning mellom antistoff og kjemoterapi er blirr beskrevet av Segerling et al. og viser at marsvin hepatoma celler som vanligvis er motstandsdyktig

mot dreping av antistoff og komplement, gjøres følsomt etter behandling med kjemoterapeutiske midler (77).

Selv om det er åpenbart at det har vært gjort mye arbeide tidligere med hensyn til administrasjonen<Ø>av immunglobulin-preparater til turnorbærende dyr og mennesker, har resultatene av disse eksperimentene vært blandede. For det første bør det legges merke til at disse behandlingene ikke har vært konsekvent effektive til å behandle tumoren. Det har vært anvendt en rekke forskjellige typer behandlinger som varierer fra bruken av pasientens eget:serum og til bruken av serum fra andre pasienter med lignende sykdommer og helt til bruken av sera fra dyr av forskjellige arter. I den senere tid har det vært gjort forsøk på å behandle pasienter ved å

bruke monoklonale antistoffer generert i mus mot den bestemte tumoren som ikkehas av pasienten. Disse forskjellige forsøkene er bevis på den generelle mangel på suksess i de tidligere teknikker, slik det er åpenbart i publikasjonene nevnt ovenfor. I motsetning til de blandede resultater oppnådd i den tidligere kjente teknikken, er det tumorforbundne immunglobulinpreparatet ifølge foreliggende oppfinnelse i stand til å gi konsekvent tumorisid virkning når det injiseres i turnorbærende verter, både mennesker og dyr. Videre omfatter frembringelsen av disse materialer signifikant færre komplikasjoner enn ved den tidligere kjente teknikk etter som et hvert immunglobulin er holdt fra et hvert medlem av arten kan brukes, hvilket materiale lett kan erholdes ved (f.eks.) å isolere plasma fra verter som har immunkomplekser som inneholder detønskede antistoff, eller erholde antistoffet fra Cohn-fraksjonering av plasmaet erholdt fra verten. Teknikkene som her åpenbares gir anledning til fremstilling

av en mye mer rikelig kilde av generelt effektive tumor-reagenser enn det som på noen mulig måte kunne ha blitt fremstilt ved hjelp av de tidligere kjente teknikkene.

Vi beskriver her et nytt tumorimmunglobulin erholdt fra

serum hos turnorbærende verter samt en fremgangsmåte for å fremstille det. Dette stoffet.oppviser tumoriside virkninger når det administreres til verter med kreft.

E. Komplementaktivering

Komplementsystemet hos menneske består av et mangfoldig

forråd av plasmaproteiner. I alt mer enn 20 bestanddeler deltar i velordnede reaksjonssekvenser som eventuelt resulterer i komplementaktivering. Oppsamlet bevismateriale understøtter påstanden at komplementsystemet tjener som et fundamentalt element i forsvarmekanismen hos normale verter og som en konsekvens derav er komplementaktivering vanlig-

vis forbundet med en rekke patologiske tilstander (78, 79, 80). Det er to hovedmåter betenget det klassiske og det alternative sporet hvorved komplement aktiveres. Disse to sporene kan generelt skilles fra hverandre ved fremgangsmåten hvorved injisiering oppstår. Uansett måten for komplementaktivering er det omdannelsen av den viktige C3-bestanddelen til et C3a og C3b fragment som signaliserer den endelige aktiver-ingen. Som et resultat av aktivering etter det klassiske eller alternative sporet, dannes en C3 konvertase. C3-omdannelse gir opphav til dannelsen av et enzymkompleks

(C5 konvertase) som deretter igjen spalter C5 hvorved det

fåes fragmentene C5a og C5b. C5a går deretter i oppløsning mens C5b delen av molekylet spiller en viktig rolle for inisiering av dannelsen av det lytiske membranangreps-komplekset.

C3a og C5a er molekyler betegnetanaphylatoxiner og er

ekstremt potente bioaktive stoffer som spiller en nøkkel-rolle som mellomprodukter i den akutte betennelsesresponsen (81, 82). Både C3a og C5a deler visse spasmogene egenskaper idet C3a er effektiv i det nanomolare konsentrasjonsområdet og C5a i det subnanomolare konsentrasjonsområdet (83). Det er påvist at begge faktorer øker vaskulær permeabilitet (84, 85) samt induserer frigivelse av histamin fra bindevevceller (86). C5a er en kjemotaktisk faktor og dette glykopolypeptid synes å være en hovedoverfører av nøytrofilt indusert be-tennelse (87). Flere mekanismer antas å være effektive for å begrense den bilogiske aktiviteten av anaphylatoksiner.

En serumeksopeptidase fjerner effektivt en essensiell C-ende arginylrest fra anaphylatoksinmolekylene og setter faktisk både C3a og C5a ute av stand til spasmogen handling innen sekunder etter at de er blitt frigitt til kretsløpet (88). Produktet C5a des Arg beholder likevel en evne til å fremme kjemotaksis (89).

C3a er et enkeltkjedet polypeptid med 77 aminosyrerester

og har en molekylvekt på 9000. C5a anafylatoksin fra menneske er et enkeltkjedet glykopeptid med 7 4 aminosyrerester som inneholder en enkel oligosaccharidenhet knyttet til asparaginresten i posisjon 64. Den samlede molekylvekt for polypeptidet og oligpsaccharidresten er 11.000 (90, 91).

Ved tidligere undersøkelser på mennesker ble det observert at serumnivåene av C5a (og beslektede bestanddeler) ble forhøyet kort tid etter plasmaperfusjonen over kollodium trekull med protein A (21). Nærværet av C5a var forbundet med perifer vasodilatasjon og nærværet av mellomromsvæske (20, 21). I et tilfelle var der bevis for opphopning av blod i lunger på det tidspunktet C5a ble påvist (21). Videre ble det observert at akutte tumoriside reaksjoner hos disse pasientene var forbundet med tilsynekomsten av væskefyllte vesikler over kutanøse tumorsteder som inneholdt polymorfonukleære leukosytter (20) . Etter som C5a er kjent for å gi en økning i vaskulær permeabilitet . og vasodilatasjon og er kjemotaktisk for nøytrofile, kan det bidra til de observerte fysiologiske virkninger etter protein A perfusjon og kanskje forbedre innstrømningen av sirkulerende tumoriside faktorer i tumorøse steder.

Kassel et al. har vist at særlig administrasjonen av ren

C5 til leukemiske mus resulterte i signifikante leukemiske regresjoner (92). AKR mus med spontan leukemi fikk innsprøy-tet normalt serum fra en rekke arter. Leukemiceller ble ødelagt med serum fra stammer av mus som hadde hele spekteret av komplementbestanddeler, men ikke med serum fra murine stammer med genetisk bestemt mangel på C5. Serum fra marsvin, hester og mennesker forårsaket også ødeleggelse av leukemiceller. I det følgende gjengis mekanismene for hvordan C5

ga ødeleggelse av leukemiceller i AKR mus: (a) C5 kan ha en direkte virkning på leukemiceller ved å tilveiebringe et manglende komplementledd som tillater sytotoksiske antistoffer fremstilt av verter og indusere cellelyset, (b)

C5 reagerer på et sted forskjellig fra leukemicelleoverflater, f.eks. med antigen-antistoff komplekser i blodet eller nyren og forårsaker derved frigivelsen av lymfokiner som selv frembringer ødeleggelse av leukemiceller, (c) den anti-leukemiske virkningen av C5 er uavhengig av på forhånd eksisterende immunrespons hvilket tyder på en annen mekanisme for spesifik avliving av leukemiceller.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer tumor-tilknyttede immunglobulin preparater som er nyttige i seg selv eller i kombinasjon med andre former for behandling av kreft. Det er kjernen i et aspekt av den foreliggende oppfinnelse at immunglobulinene i plasma fra individet som skal behandles eller fra andre turnorbærende dyr av den samme arten (inkubert mennesker), kan behandles for å: a) sparte immunglobuliner som er i omløp fra de oppløselige tumorantigenene som er i

omløp og som de har dannet komplekser med;

og

b) samle disse frigjorte immunglobuliner for å fremstille et materiale med forøket tumorisid

virkning når det injiseres i den turnorbærende verten.

Det bør legges merke til at dette spaltingstrinnet kan ut-føres ved hjelp av en hvilken som helst av en rekke kjente spaltingsteknikker, omfattende en vesentlig variasjon av pH fra den som normalt foreligger i serumet, en stor endring i ionestyrken ( slik som ved tilsetning av salter), opp-varming eller lignende, forutsatt at spaltingsteknikken som anvendes må være god nok til å separere immunkompleksene som er i omløp i det ønskede immunglobulin og det oppløselige tumorspesifike antigenet uten i noen vesentlig grad å denatur-ere det ønskede immunglobulin.

En foretrukket teknikk som har vært anvendt for å bevirke denne spaltingen, er behandlingen av det erholdte immun-komplekset med syre eller base under speltingsbetingelser 1 en tilstrekkelig lang tid til effektivt å spalte kompleksene. En pH i området fra ca. 3,2 til 1,5 er, slik det er anerkjent innen teknikken, vanligvis tilstrekkelig til å forårsake denne spalting. Tidsintervaller som ville antas å være virksomme for denne spalting varierer fra omtrent 2 minutter og opptil så lenge som 8 timer eller lengre om ønsket. Oppfinneren har funnet at behandling med syre for å senke pH til omtrent 2,5 i løpet av ca. 5 minutter, etterfulgt av en hurtig nøytralisering til omtrent pH 7,4,

er bruktbart for å fremstille det ønskede materiale. Dersom det anvendes en alternativ spaltingsteknikk, kan det være nødvendig etterpå å behandle materialet for å forårsake den ønskede aggregering av immunglobulinet, dersom imidlertid syrebehandlingen må brukes, oppstår aggregeringen i det vesentlige samtidig under behandlingen.

Som et ytterligere aspekt ved den foreliggende oppfinnelse, åpenbarer vi forskjellige komplekser mellom immunglobuliner og protein A. Disse kompleksene kan være mellom protein A

og immunglobulin fra de turnorbærende verter eller normale imdivider. Disse kompleksene kan være fremstilt ganske enkelt ved å danne protein A med hjelp fra et utvalgt

menneske- eller dyreindivid som enten er en turnorbærende vert eller et normalt individ, men disse kan også være fremstilt ved å sende serum gjennom en kolonne med enten protein A eller protein A-bærende stafylokokker bundet til den faste fasen i kolonnen. I tillegg kan disse kompleksene være fremstilt ved å kombinere protein A med renset IgG-preparater erholdt fra serum fra enten turnorbærende verter eller normale individer. Disse rensede immunoglobulinpreparater kan være erholdt ved (f-eks.) Cohn-fraksjonering, elektroforese eller andre fremgangsmåter som er omtalt i denne beskrivelsen eller som er kjent for en fagmann.

Disse protein A-immunglobulin kompleksene kan være fremstilt

i et rett område av effektive forhold mellom protein A og immunglobulin, idet det eneste kriteriet er at komplekset skal være virksomt ved behandlingen av tumorer. Disse for-holdene kan variere fra 1:1000 protein A/globulin opptil 1: 2 protein A/globulin. Forhold på omtrent 1 til 100 er funnet å være særlig effektive. Disse kompleksene kan passende erholdes ved utfelling slik det er kjent innen teknikken.

En brukbar utfellingsteknikk er ved å bruke slike materialer som er kjent for fagmenn. Disse immunglobuliner kan selv-følgelig være monoklonale antistoffer som er fremstilt i mus eller andre dyr mot den bestemte tumor hos verten eller mot den samme typen tumor hos andre medlemmer av den samme dyrearten.

Ytterligere aspekter ved foreliggende oppfinnelse er de følgende produkter som er nyttige ved behandlingen av verter med kreft: Produkt 1: Et tumortilknyttet immunoglobulin preparat med tumoriside forøkende virkning og som stammer fra plasma hos en normal eller turnorbærende vert, hvilket preparat hovedsakelig omfatter IgG og igMog som har titere for tumortilknyttede antistoffer som minst er det doble av

EIE fra verten,og Clq-binding i fraksjoner som sedimenterer over 7S ved gradientanalyse av sucrosedensitet. Ved uttrykket "tumortilknyttet" er ment immunoglubuliner som reagerer med et antigen som er beslektet med eller knyttet til en tumor men som også kan bindes i andre normale kroppsvev. Det er for øyeblikket anserkjent at disse tumortilknyttede immunoglobuliner er nyttige for påvisning eller behandling av tumorer selv om de ikke er fullstendig spesifike for tumoren alene. Disse tumortilknyttede immunoglobulinpreparater kan passende fremstilles fra den anrikede immunoglobulin-effluenten (EIE) erholdt ved tvungen elektroforese av plasma fra verten ved å utsette plasmaet enten for en vesentlig økning eller en vesentlig senkning av pH sammenlignet med pH i normal plasma i en tidsperiode som er virksom for spalting slik som beskrevet i detalj annet sted i denne søknad. Det således fremstilte materialet oppviset i sammenligning med ubehandlet EIE reduserte nivåer for IgG, IgM

og immunkomplekser, men forøkede titere av tumortilknyttede antistoffer og forøket Clq-binding i tungt sedimenterende fraksjoner.

Produkt 2: Et tumortilknyttet immunoglobulinpreparat med tumorisidforøkende virkning og som stammer fra plasma hos en normal eller turnorbærende vert, hvilket prepart omfatter IgG med små mengder Iga, i det vesentlige fritt for IgM og komplement, som har en titer for tumortilknyttet antistoff på minst 1,5 ganger den til en Cohn-gammaglobulinfraksjon fra verten og som > oppviser forøket Clq-bindende IgG i fraksjoner som sedimenterer over 7S ved gradientanalyse av sucrosedensitet, og som har minimal anti-komplementær virkning. Når det administreres til verter med tumorer,

og særlig tumorer av den samme histologiske type som tumoren i verter som antistoffet stammer fra, induserer preparatet tumorisid reaksjon. Med uttrykket "tumorisud reaksjon" er det her ment at det aktuelle materialet fremmer eller assisterer ved avlivingen av tumorceller. En fremgangsmåte

for fremstilling av dette produkt 2 er å erholde gamma-globulinfraksjonen fra plasmaet hos et menneske eller et dyr ved hjelp av Cohn-fraksjonering eller en av dens kjente varianter. Så snart dette materialet er erholdt, behandles det så som tidligere beskrevet ovenfor med en spaltingsteknikk slik som surgjøring etterfulgt av hurtig nøytralisering. Sammenlignet med den ubehandlede gammaglobulin Cohn-fraksjon har det her beskrevne tumortilknyttede immunglobulin preparatet lavere nivåer av IgG

og IgA, forøket Clq-binding i tungt sedimenterende fraksjoner, forøkede nivåer av tumortilknyttet antistoff of mindre antikomplementær virkning.

Produkt 3: Protein A-IgG preparat med de følgende egen-skaler: (a) omfatter hovedsakelig tunge og lette IgG-kjeder og protein A ved polyakrylamidgel-elektroforese.

(b) identifiseres i fraksjoner som sedimenterer over

7S ved sucrosedensitet-gradient med en forøket Clq-bindings-virkning. (c) spaltes i Clq-bindende fragmenter med lavere molekylvekt under sure betingelser.

(d) er utfellbar med 5% polyetylenglykol.

(e) oppviser anti-komplementær^virkning.

(f) inhiberer Fc-avhengig dannelse av lymfosytt rosett. (g) induserer frigivelse av myeloperoksidase, catepsiner og superoksyd-anioner fra nøytrofiler.

(h) induserer hemagglutinering av kaninerytrosytter.

(i) induserer ikke-spesifik uttømming av komplement.

(j) genereres i normalt og turnorbærende serum etter perfusjon over kollodium trekullkolonner med protein A ved en komplementuavhengig mekanisme og er ikke tilstede i serumet før behandlingen.

Dersom serum som inneholder spesifikt antistoff føres over kollodiumtrekull med protein A, beholder protein A-IgG-kompleksene i serumet etter perfusjonen de ovenfor angitte egenskaper (a) til (j), men erverver de nedenfor angitte enestående egenskaper: Disse preparater er funnet å ha tumortilknyttet antistoffaktivitet i den PEG-utfellbare fraksjonen. Når protein-IgG-preparat føres inn i en turnorbærende vert i en tumorisid virksom konsentrasjon, observeres det tumoriside. reaksjoner og tumorregresjon. Det er funnet spesifike antistoffer i den PEG-utfellbare fraksjonen i sera fra hunder som er immunisert med menneske-brystcarcinoma (MCF-7), og med menneske-erytrosytter. Dette sistnevnte eksperimentet brukes som et modellsystem for å undersøke antistoff-reaksjoner, selv om antigenet som brukes ikke er et tumor-antigen.

Produkt 4: Et tumortilknyttet immunglobulin preparat med tumorisid virkning og som stammer fra plasmaet til en turnorbærende vert som omfatter hovedsakelig IgG og IgM, og som har titere for tumortilknyttede antistoffer på minst det dobbelte av serum fra vertene, forøket Clq-binding i fraksjoner som sedimenterer over 7S ved gradientanalyse av sucrosedensitet, økning i uvirksomt volum og minsking i proteiner som omfattes av fraksjoner på Sephadex G-200 i sammenligning med serumet. Dette fremstilles fra sera hos turnorbærende verter ved å utsette dette enten for en vesentlig økning eller senkning av pH i forhold til normalt plasma i en virksom spalt-ingsperiode.

Sammenlignet med ubehandlet serum har tumorimmunplasma for-økede titere for tumortilknyttede antistoffer, forøket Clq-binding i tungt sedimenterende fraksjoner og forøkede proteinnivåer som kromatograferes i uvirksomt volum på G-200 sammen med minskede nivåer av de fraksjonene som omfattes.

Produkt 5:Zymosanaktivert plasma.

(a) Fremstilt ved inkubasjon av zymosan med normalt eller turnorbærende serum som er fritt for zymosan, som in vivo genererer perifere vasodilatasjonsvirkninger og spasmogene virkninger i overensstemmelse med produktenes komplement-virkning.

Tilleggsaspekter og- formål ved oppfinnelsen er fremgangsmåter for fremstillingen og isoleringen av disse ovenfor nevnte nye produktene som er nyttige ved behandlingen av kreft.

Dette inkluderer for produkt■1 oppsamling av en anriket immunoglobulinfraksjon (EIE) fra tvungen elektroforese av turnorbærende verter som deretter surgjøres eller alkali-seres, for produkt 2 fremstilling av tumorimmungammaglobulin preparat ved surgjøring av Coh-fraksjonert gammaglobuliner erholdt fra turnorbærende verter, og for produkt 3 fremstilling av protein A-IgG-komplekspreparat ved å inkubere protein A

og IgG sammen, utfelle dem med polyetylenglykol eller ammoniumsulfat, eller ved polyetylenglykolutfelling av effluent fra protein A kollodiumtrekull-kolonner og andre utfellings-fremgangsmåter som er kjent for fagmenn.

I tillegg til de ovenfornevnte aspekter og formål omfatter oppfinnelsen bestemte kombinasjoner av trinn som gir tumoravlivende virkninger, deriblant de følgende: Behandlingsmåte 1: Administrering av produkt 1 sammen med protein A etterfulgt av L-asparginase og/eller cytotoksiske midler slik som cyklofosfamid eller adriamycin. Behandlingsmåte 2: Infusjon av komplementaktivert serum (produkt 6) og surgjort plasma (produkt 4) på to etter hverandre følgende dager etterfulgt av L-asparginase eller cyklofosfamid på den fjerde dag.

Behandlingsmåte 3: Infusjon av produkt 2 pluss komplementaktivert serum (produkt 5) på to etterhverandre følgende dager etterfulgt av L-asparginase og cyklofosfamid på den fjerde dag.

Behandlingsmåte 4; Infusjon av produktene 3 og 5 på to etter hverandre følgende dager etterfulgt av cyklofosfamid og/eller adriamycin på den 4 dag.

Behandlingsmåte 5: Bruken av L-asparginase og cyklofosfamid på den første dag etterfulgt av infusjon med produkt 5-bestanddeler og autologt surgjort plasma (produkt 4) på

den andre og tredje dag.

Behandlingsmåte 6: Infusjon av protein A pluss produkt 5

og heterologt anti-tumor antiserum.

Behandlingsmåte 7: Infusjon av produkt 3 pluss heterologt anti-tumor antiserum.

Behandlingsmåte 8: Infusjon av protein A alene.

I tillegg er hvert av produktene 1, 2, 3, 4 og 5 og protein A alene eller i kombinasjon, slik som angitt ovenfor, nyttige ved behandling av verter med kreft.

Andre og ytterligere aspekter, formål, trekk og fordeler

ved oppfinnelsen fremgår av beskrivelsen og kravene.

Fig. 1 er et flytskjema som illustrerer tvungen elektroforese som er nyttig ved fremstilling av den anrikede immuno-globulineffluenten (EIE) . Fig. 2 er en forstørret, delvis oversikt over cellen for

tvungen elektroforese.

Fig. 3 er en grafisk fremstilling som viser Clq-binding i sucrosedensitets gradientfraksjoner etter syrebehandling av de turnorbærende sera. Fig. 4 er et fotografi av en "Coomassie Blue"-farget PAGE-profil av kanin-IgG med høy molekylvekt isolert etter .perfusjon. Fig. 5 er et fotografi av en "Coomassie Blue"-farget PAGE-profil av protein A isolat fra serum etter perfusjon.

Den foreliggende oppfinnelse omfatter nye produkter,

deres fremstilling og fremgangsmåter for behandlingen av kreft, slik som lymfomas og faste tumorer, hvorved -

det fåes signifikante tumorreduksjoner.

Foretrukket utførelsesform: Produkt 1

Tvungen elektroforese ( FFE) og enariket immunoglobulin effluent ( EIE)

Produkt 1 kan fremstilles ved elektroforese etterfulgt av surgjøring og alkalisering eller annen spaltingsteknikk.

I fig. 1 inneholder cellen 8 for tvungen elektroforese endeflater av plast som holder sammen en serie med mellom-stykkker 12 (fig. 2) og har midler for blod- og buffersirkulasjonen samt kontakter 14 for direkte brønnforsyning (ikke vist). Parallelle membraner 16 holdt på plass ved hjelp av mellomstykkene 12 danner en serie trange kanaler som det elektriske feltet opprettes over. Det kan ses fire typer kamre, de to fordypningene 18 i endeplatene 10 inneholder platinaelektrodene (ikke vist), og betjener den eksterne buffersirkulasjonen; en ytterligere kanal betjener sirkulasjonen av internbuffer; en ytterligere kanal inneholder det gjennomstrømmende blod, plasma eller sera og er adskilt fra det utskilte globulinet ved hjelp av membranene eller filterne 16. De anvendte membraner 16 er Visking regenererte cellulosemembraner, som med hensyn

til egenskaper er analoge med Cuprohan membranene som anvendes i kunstige nyrer, men som mekanisk sett er mer resistente. Til fraksjoneringen ble det anvendt millipore filtere med

3,0 og 0,45 mikrometer porøsitet. Elektroforetisk ville alle negativt ladede blodbestanddeler transporteres i en hvilken som helst retning motsatt av strømningsretningen for væsken. Det er balansen mellom disse to vektorene som bestemmer kvaliteten av fraksjoneringen. Renheten av frak-sjonens som fjernes avhenger for en stor del av filtrerings-hastigheten for globulinfraksjonen og den anvendte spenning. Vanligvis er den hurtigst mulige fjerning av gammaglobulin ønsket og som et resultat derav fåes det forurensning,av andre plasmaproteiner. Dersom det ikke anvendes noen spenning, fåes det ingen filtrering av plasmaproteiner gjennom milliporefilteret. I alle eksperimentene ble det anvendt en cellemontasje med fire mellomstykker for blod, idet strømmen var i parallell. Hvert mellomstykke har en effektiv overflate på 500 cm 2. Mellomstykkene for interne buffer er injeksjonsstøpte med fremskytende, riflede strukturer som presser sammen mellomstykkene for plasma-innføringen til en gjennomsnittlig plasmafilmtykkelse på omtrent 7,6 mm og derved begrenser det totale plasmavolumet i apparatet til ca. 200 til 250 ml. Vexas-skjermen for-hindrer membransammenbrudd i kammeret for globulinutstrømning. Trykket i plasmabestanddelene må være høyere enn i alle

de andre kanalene. En spenningsgradient på 6 til 8 volt pr. cm gir en strømtetthet på 0,02 til 0,4 amp/cm. Plasma-strømmen holdes på 15 til 20 ml/mellomstykke mens den interne blodstrømmen er ca. 5 ganger større. Hastigheten for gamma-globulinfjerningen varierer mellom 1,5 og 2,5 ml/meHomstykke.

Fig. 1 er et strømningsskjerna for en celle for tvungen elektroforese som illustrerer driften av innretningen.

En plasmaseparator 20 av en hvilken som helst vanlig brukt eller foretrukket type er tilknyttet med linjen 22 gjennom et luftcellefilter 24 til cellen 8. Ekstern puffer pumpes ved hjelp av pumpen 26 fra beholderen 28 for ekstern puffer til cellen 8 og tilbake igjen slik som vist ved pilene på

de sammenknyttende linjer. Intern puffer pumpes ved hjelp av pumpen 30 fra beholderen 32 for intern puffer til cellen 8

og tilbake slik som indikert ved hjelp av pilene på de sammen-bindende linjene. Det er" anordnet en overstrømningslinje 34 for ekstern puffer for å returnere overskudd av intern puffer til beholderen 32 for intern puffer.

En anriket EIE samples opp fra cellen 8 i linjen 36 og

pumpes inn i beholderen 3 8 ved hjelp av pumpen 40. Plasma returneres fra cellen 8 i linje 42 og ved hjelp av pumpen 44, og forvarmes i plasmaforvarmeren 46.

Denne innretningen brukes på følgende måte på en hund med spontan kreft: En arterie og en vene kanyliseres med katetere eller nåler og helblod pumpes inn i den konti-nuerlige plasma-celleseparatoren. Her oppdeles helblod i faste bestanddeler og plasma ved hjelp av plasma-celleseparåtoren 20. Plasma pumpes så inn i FFE-cellen 8

med en hastighet på 5 til 15 ml/min. FFE-cellen 8 utsetter plasma for elektrisk strøm som beskrevet ovenfor og EIE samles opp i beholderen 38. Plasma som kommer ut fra FFE-cellen 8, gjenforenes deretter med de faste bestanddelene (ikke vist) og sendes tilbake til verten. Ved en rutinebehandling sendes omtrent et beregnet blodvolum gjennom denne enheten ved en strømningshastighet på 10-15 ml/min. og det samles opp enEIEpå omtrent 80 ml/kg hund.

EIE oppsamlet fra FFE utsettes deretter for den følgende biokjemiske fremgangsmåte: pH i EIE titreres til 3,0 med 10 NHCl, holdes der 5 minutter og nøytraliseres deretter hurtig til 7,4 ved dråpevis tilsetning av 10 N NaOH. Alle utfellinger som utvikles fjernes hurtig ved hjelp av sentrifugering ved 1500 x g i 30 minutter ved 4oc. EIE sendes deretter gjennom et 0,45 og et 5 mikrometer sammenfoldet membranfilter og returneres så intravenøst til verten ved en strømningshastighet på 2 ml/min.

Etter behandling med syre og nøytralisering, oppviser EIE

en markert økning i tumortilknyttede antistoffer målt ved indirekte immunofluoresens under anvendelse av hundens egen tumor som substrat. Resultater fra denne behandlingen er vist i tabell I-A. Biokjemisk karakterisering av EIE etter surgjøringen viser et fall i nivåene for IgG, IgM og immunkomplekser målt med lasernefelometri (93) sammenlignet med ikke-surgjorte prøver (tabell IB) Dertil fremkommer det forøkede Clq-bindende nivåer i surgjorte prøver sammen-

lignet med ubehandlet EIE i fraksjoner som sedimenterer over 7S merket, når ubehandlede og surgjorte prøver ut-

settes for sucrosedensitetsgradient fraksjonering og de forskjellige fraksjonene analyseres for Clq-binding.

Bruk av FFE og EIE (surgjort) i behandling av spontan kaninlymfoma ( Behandlingsmåte 1, tabell XIII)

Større morfologiske endringer og toksisitet etter behandlinger I alle prøvede hunder ble tumormassene varme og ødemaktige innen 4 timer etter at et enkelt plasmavolum ble sendt gjennom apparaturen for tvungen elektroforese og oppsamling av omtrent 400 ml av effluenten. Tolv timer senere ble det infusert surgjort EIE (10 ml/kg) pluss protein A (8yg/kg). Etter 4 timer ble lymfeknutene ennå mer hypertermiske og ødemaktige. Førtiåtte timer senere ble dyrene gitt L-asparginase og cyklofosfamid. Tumorregresjoner notert i løpet av de på-følgende dagene nådde nivåer på 6 6 til 95% under nivåene før perfusjon og varte fra 15 dager til 5 måneder med et gjennomsnitt på 45 dager. Hunder behandlet med FFE og administrering av surgjort EIE pluss protein A ga regresjoner på 20 til 35% som varte gjennomsnittlig i 6 til 8 dager. Dyr som mottak L-asparginase og cyklofosfamid alene, oppviste regresjoner på 18 til 25% som varte bare 8 til 10

dager. Hunder som mottok protein A alene, oppviste ingen signifikante regresjoner. Følgelig var den tumoravlivende responsen vesentlig større hos de dyrene som mottok hele behandlingsmåten sammenlignet med de som mottok de immuno-terapeutiske eller kjemoterapeutiske programmene alene.

Resultatene er gjengitt i tabell II.

Hos alle hunder ble det iakttatt temperaturøkninger fra 103 til 107°C kort tid etter elektroforesebehandling som vanligvis avtok innen 6 timer etter perfusjonen. Blodkulturer som ble tatt ut under feberperioder hos fire hunder, av-slørte ingen bakterievekst.

Mikroskopiske endringer på forskjellige tidspunkter etter

FFE og.. EIE ( surgjort) og kjemoterapi

Det ble tatt tumorbiopsieT fra alle dyrene ved forskjellige tidsintervaller etter behandling. I biopsier tatt fra hunder etter behandling med FFE på et tidspunkt da lymfeknutene var ødemaktige, var der åpenbar sammenskrumping av cellekjerner, granulering av cytoplasma og utvidelse av intercellulære rom. Betente celler var ikke frem-tredende i disse prøvene på dette tidspunktet. Prøver erholdt etter administrering av surgjort EIE og protein A hadde mer uttalte endringer i tumorer slik som oppblåsning av cytoplasma, hypergjennomskinnelighet av cytoplasmainn-hold, sammenklumping av kromatien og nukleoler med flekk-dannelser i intercellulære rom, funn som er betegnede for subletale eller letale endringer i tumorceller. Det var minimalt med tilknyttet infiltrering av betennelsesceller.

I prøver som ble tatt omtrent 7 dager etter avslutningen

av behandlingen, var det bevis for utstrakt død i maligne lymfeknuter med åpenbart døde tumorceller og fokal infiltrering med nøytrofiler.

Tumortilknyttede antistoffer, C'3- og immuniglobulin-/

nivåer etter behandling

Før behandling var tumortilknyttede antistoffer enten ikke påvisbare eller knapt nok påvisbare i sera fra verter med kreft. Innenfor 12 timer etter behandling med tvungen elektroforese, var det en økning i tumortilknyttede antistoffer målt ved immunofluoresens. Dette ble ikke ytterligere evakuert ettersom dyr passivt ble gittEIE som inneholdt tumortilknyttede antistoffer. Serum C3 og IgG-nivåer avtok 12 timer etter behandling med tvungen elektroforese i alle hunder som ble prøvet, men vendte tilbake til nivåene fra før behandlingen i løpet av de etterfølgende 4 8 timer. Immuniglobulin M nivåer endret seg ikke signifikant.

Hematologiske og serologiske endringer

Evaluering av leukosyttantall, plateletantall og hemato-krittverdier viste ingen signifikante endringer for disse

parameterne før og etter fullførelsen av den 4 dager lange behandlingen. Dertil var det ingen signifikante endringer i serumnivåene av natrium, kalium, klorid, kalsium, fosfor, SGPT, SGOT, BUN eller kreatinin etter behandling.

Foretrukket utførelsesform: Produkt 2

Preparat av tumor- immuniglobulin

Produkt 2 (preparat av tumor-immunglobulin) egnet for intra-venøs bruk kan fremstilles fra seraene til turnorbærende verter ved modifikasjoner av fremgangsmåter tidligere beskrevet av Cohn et al. (94) og Kistler og Nitschmann (95). Fremgangsmåten er skjematisk skissert i tabell III. Fremgangsmåten for plasmafraksjonering er gjengitt nedenunder:

Plasmakilde

Plasma ble avledet fra perifert helblod hos menneskepasienter. Omtrent 5 ml plasma samlet opp i sur citratdekstrose ble tatt ut og klaret ved sentrifugering i en hastighet på 2600 g i 20 minutter ved 0°C.

Fremstilling av utfelling 1:

pH i det klareste plasma bestemmes og justeres til 7,2_

om nødvendig ved tilsetning av 0,8M natriumacetat pH 4,0 buffer mens temperaturen ble holdt på 0°C.

Førtiseks ml kald 95% étanol tilsettes sakte til det klarede plasma hvorved det oppnås en sluttetanolkonsentrasjon på 8%. Suspensjonen avkjøles under tilsetningen til en temperatur

på 0°C. Den synlige utfellingen som for det meste besto av fibrinogen, fjernes ved sentrifugering ved 2 600g i 2 0 minutter ved 0-4°C. Den fjernede masse kalles utfelling 1.

Fremgangsmåte ved plasmafraksjonering for fremstilling av anti- tumor IgG

Fremstilling av utfelling 2

En 2 ml aliquot av supernatanten fra utfelling 1 titreres til pH 5,8 med 0,8 M natriumacetat pH 4,0 for å bestemme mengden natriumacetatbuffer som kreves for å få en pH på 5,8 i super-natantsuspensjonen. Hele suspensjonen justeres deretter til pH 5,8 med den samme buffer.

Omtrent 72 ml kald 95% etanol tilsettes til pH 5,8 suspensjon for å få en sluttetanolkonsentrasjon på 19%. Suspensjonen avkjøles under tilsetningen til -5°C. Suspensjonen omrøres forsiktig i 30 min. etterfulgt av fullførelsen av etanol-tilsetningen og pH i oppløsningen holdes ved 5,8. Suspensjonen sentrifugeres så ved 6000 ganger g i 25 minutter ved 0°C.

Massen tas ut av sentrifugeskålene og veies. Massen merkes utfelling 2.

Fremstilling av supernatant 3

Massen fra utfelling 2 suspenderes på nytt i 10 ml isvann

pr. g utfelling. Ca. 25% av vannet bør være i form av fine iskrystaller. Denne suspensjonen lar man bli helt enhetlig. pH i suspensjonen justeres til 4,8 ved å tilsette en pH 4,0 buffer satt sammen av en volumdel 0,005 M Na2HP04

og 6 volumdeler 0,05 M eddiksyre (buffer A). Ionestyrken økes så ved å tilsette pH 4,8 buffer satt sammen av en volumdel 0,05 M eddiksyre (buffer B). Den nødvendige mengde av denne buffer er 4,8 ml pr. g utfelling 2 minus volumet av den tidligere tilsatte pH 4,0 buffer A for å justere pH.

Til fraksjoneringen økes så pH i suspensjonen til pH 5,1

ved å tilsette en pH 6,2 buffer laget av en volumdel 0,05

M Na2HP04og 0,833 volumdeler 0,o5M eddiksyre (buffer C). Ionestyrken justeres så på nytt ved tilsetningen av en

pH 5,1 buffer satt sammen av 1 volumdel 0,05M Na2HP04■og 1,25 volumdeler 0,05M eddiksyre (buffer D). Den nødvendige mengde buffer D er 4,9 ml/g utfelling 2 minus det volumet av buffer

C som ble brukt til pH justering. Til slutt forstynnes suspensjonen til et totalt volum på 19,5 ml/g utfelling 2 med isvann. Kald 95% etanol tilsettes så til suspensjonen for å oppnå en total etanolkonsentrasjon på 12%. Suspensjonen holdes ved 0°C i 30 minutter etterfulgt av sentrifugering ved 14000 x g i 25 minutter ved 0°C. Utfellingen kastes og supernatanten tas vare på og merkes supernatant 3.

Fremstilling av gammaglobulin utfelling

Ionestyrken til supernatant 3økes så til 0,04 med konsentrert NaCl idet det brukes et forholdsvis salt apparat for måling av ledningsevne.

En 2 ml aliquot av supernatant 3 titreres til pH 7,2 med

IN NaOH for å bestemme mengden IN NaOH som kreves for å justere pH i hele suspensjonen. IN NaOH tilsettes så til suspensjonen i den passende mengde for å bringe pH til 7,2.

95% etanol tilsettes så for å oppnå en total etanol-konsentras jon på 25%. Suspensjonen avkjøles til -7°C

under denne tilsetningen. Man lar suspensjonen omrøres forsiktig i 30 min. ved -7°C etterfulgt av sentrifugering ved 15.000 x g i 30 minutter ved -7°C. Utfellingen er her den ønskede gammaglobulin fraksjonen.

Fremstilling av tumor- immunglobulin

Massen som inneholder gammaglobulin suspenderes på nytt i fosfatbuffret saltvannsoppløsning (PBS) og gjøres 0,3M i glycinbuffer. pH senkes så til 2,5 med 0,IN HCl. Suspensjonen inkuberes så i 5 minutter ved 27°C etterfulgt av nøytralisering til pH 7,3 med 0,1NNaOH. Preparatet sendes så gjennom et 2 mikrometer filter og administreres intravenøst med 5 ml/min.

Fysikalsk- kjemiske karakteristika for tumor- immunglobulin Tumor-immunglobulin (surgjort Cohn fraksjon) analysert med lasernefelometri (93) består av IgG med en liten mengde IgA,men ikke noe IgM eller C3-. Sammenlignet med ikke-surgjort Cohn fraksjon er der mindre IgG og IgA (tabell IV).

Tumortilknyttede antistoffer ble analysert i hver av to porsjoner tumor-immunglobulin erholdt fra 2 mennesker med brystadenocarcinoma. Under anvendelse av indirekte immuni-fluoresens mot et brystcarcinomasubstrat, overskred titere for sluttpunkt-fluoresens 1:70.000 i begge prøvene som ble undersøkt. Ikke-surgjorte prøver av de samme porsjonene hadde sluttpunkt-titere på mindre enn 1:50.000.

Tumor-immunglobulin ble undersøkt for tumorspesifik binding tilMCF-7 brystadenocarcinoma celler ved hjelp av radioaktiv immunologisk analyse i fraksjoner erholdt fra sucrosedensitetsgradient og sammenlignet med fraksjoner fra ikke-surgjort Cohn fraksjon. Tumor-immunglobulinet hadde en økning i tumortilknyttet bindingsaktivitet i fraksjoner utover 7S merket. På samme måte økte Clq-binding i fraksjoner større enn 7S sammenlignet med de ikke surgjorte fraksjoner (fig. 3). Følgelig forflyttes både tumortilknyttet binding og Clq-binding til tungt (>7S) sedimenterénde fraksjoner etter surgjøring i tumor-immunglobulinet. Antikomplementær virkning av tumor-immunglobulin undersøkt ved hjelp av fremgangsmåten til Romer et al (9 6) var mindre enn hos den ikke-surgjorte fraksjonen i et område som er sammenlignbart med det hos andre intravenøse gammeglobulin-preparater (tabell V).

Undersøkelser utført ved hjelp av fremgangsmåte til Romer (96). Positiv kontroll uten sera induserte 100% hemolyse. Agregert IgG induserte antikomplementær virkning som var mindre enn 1.

Virkningsevnen hos tumor-immunglobulin fremstilte fra autologe turnorbærende sera ble demonstrert etter infusjon av 4 00-500 mg sammen med zymosanaktivert normalt hundeserum (behandlingsmåte 3, tabell XiV) i turnorbærende verter. Kort tid etter infusjon i to hunder, en med spontan brystadenocarcinoma og en med melanoma, ble det iakttatt akutt vevsdød i tumorstederkarakterisert vedhyperemi og utstrakt vevsdød i tumorområder med sårdannelse. Mikroskopisk oppviste tumorsteder spredt tumorcelledød med fokale områder med neutrofil infiltrering.

Foretrukket utførelsesform: Produkt 3

Fremstilling av protein A- IgG

Protein A-IgG komplekser (produkt 3) kan fremstilles ved å la

5 til 50 ml plasma fra verter med kreft eller normalt plasma passere over protein A fra staphylococcus aureus Cowans I

(som inneholder 1,0 mg immobilisert protein A) immobilisert i kollodium-trekull, eller det kan isoleres fra effluentseraene ved tilsetning av 5% polyetylenglykol eller ved hjelp av andre fremgangsmåter for utfelling av protein med høy molekylvekt som er kjent for fagmenn innen teknikken. Den resulterende utfelling suspenderes på nytt i normal saltvannsoppløsning og dialyseres mot fosfatbufferet saltoppløsning hvoretter det administreres intravenøst til turnorbærende verter. Fremgangsmåten er vist i tabell VI.

Protein A-IgG komplekser fremstilles uten å bruke kollodium-trekullkolonner med protein A ved å inkubere protein A (10-1000 mikrogram) med normalt serum eller plasma (1-3 ml) eller IgG (10-10 mg) i 30 min. ved 27°C under tilsetning av et ytterligere volum (50-10 ml) med normal saltvannsoppløsning og deretter infusere denne blandingen intravenøst i turnorbærende verter. Den følgende tabell VII illustrerer den ytterligere fremgangsmåte for å fremstille protein A-IgG komplekser.

Fysikalsk-kjemiske karakteristika for protein A-IgG komplekser som har passert gjennom kollodium-trekull (PACC) kolonner med protein A, eller immobiliserte staphylococcus aureus Cowans 1 ( Spa) kolonner ( SAC)

Sera fra hunder med spontan brystcarcinoma fikk passere over Spa immobilisert i et mikroporøst membranfilter (0,2 mikro,eter) eller protein A kollodium-trekull. Det følgende ble iakttatt.

Resultater

Endringer i Clq-binding i sera etter perfusjon

over SAC eller PACC

Sera fra 5 normale hunder og 6 hunder med brystadenocarcinoma fikk passere over SAC og prøver tatt ut før og etter perfusjonen ble analysert med hensyn på nivåer av Clq-bindings-virkning ved hjelp av radioaktivimmunologisk analyse slik som beskrevet. Det var en konsekvent økning i Clq-binding over verdier fra før behandling (tabell VIII). Den første minskning i Clq-binding kan skyldes en fortynningsvirkning og/eller fjerning av immunkomplekser for Clq-binding og IgG og protein A kollodium-trekull (PACC). Generelt var nivåene for Clq-binding i turnorbærende serum før perfusjon høyere enn i normalt serum før perfusjon og nettoøkningen i de turnorbærende sera var større (gjennomsnittlig økning 382 - 378 S.D. mikrogram ACG ekvivalenter/ml) enn i normalt serum (gjennomsnittlig økning: 114 186 S.D. mikrogram ACG ekvivalenter).

I motsetning til økningene i Clq-bindende virkning som ble funnet i serum som hadde passert over SAC, ble konsentrasjoner av hunde-IgG enhetlig redusert til under nivåene før perfusjon på samme måte som nivåene etter perfusjon for IgM (tabell VIII). For å fastslå om protein A på SAC kan være av betydning for frembringelsen av forøket Clq-binding, fikk sera fra normale hunder og hunder med brystadenocarcinoma passere over SAC

eller staphylococcus aureus stamme Wood 46 (SAW) uten protein A slik som beskrevet under overskriften "fremgangsmåte" og effluentprøver ble undersøkt med hensyn på Clq-binding. Prøver som hadde passert gjennom SAC kolonnene oppviste en økning til over nivåene for Clq-binding før perfusjon mens effluent-prøver fra SAW-kolonnene oppviste minimale endringer i forhold til nivåer før behandling. På samme måte som ved undersøkelsene nevnt ovenfor, gjenspeiler den første minsking i Clq-binding delvis fortynningsvirkninger og immunkompleksfjerning av SAC eller SAW.

Sera fra normale hunder og hunder med brystadenocarcinoma

over PACC slik som beskrevet under "fremgangsmåter" i 7 av 7 turnorbærende sera og 5 av 7 normale sera var der en økning i Clq-binding i effluent sera (tabell IX). I motsetning til perfusjon over SAC, var der ingen signifikante endringer i nivåene for IgG, IgM, IgA i sera som hadde passert over PACC (tabell IX).

Delvis karakterisering av komplekser frembragt i sera etter perfusjon over PACC

Ettersom det er påvist at protein A binder huride-IgM og- IgA, analyserte vi for disse bestanddeler samt IgG og C3 i kompleksene i sera etter perfusjon. For dette formål ble sera før og etter perfusjon inkubert med Clq-belagte rør for å binde kompleksene. Som en kontroll ble sera som hadde passert over hunde-albumin istedetfor protein A immobilisert i kollodium-trekull, inkubert på samme måte med Clq-belagte rør. Rørene ble vasket og over-skudde 125.J.F (ab ') 2 fragmenter som er spesifike for hunde-IgG, IgM, IgA eller- C3 ble tilsatt og bundet radioaktivitet målt. Bindingsnivåer etter perfusjon for anti-IgG og anti-IgM økte omtrent 20% over verdiene før perfusjon, men der var ingen signifikante endringer i anti-IgA eller anti-C3 binding. Resultatene var de samme for turnorbærende og normale sera,

og lignende økninger i anti-IgG bindende virkning ble påvist i sera etter perfusjon fra en ytterligere turnorbærende og en normal hund. Derimot ble IgG-bindende virkning redusert med 15% i serum som fikk passere over hundealbumin mens binding av andre bestanddeler i det vesentlige forble uendret.

Normale og turnorbærende menneskesera fikk på samme måte

passere over PACC, ble inkubert i Clq-belagte rør og prøvet for binding av 125IF(ab')2fragmenter som er spesifike for menneske-IgG, IgM, IgA og Cr. Resultatene viser økninger i anti-IgG, IgM og C3, men ingen IgA-binding.

For å undersøke sedimentasjonskarakteristika til det Clq-bindende IgG frembragt i sera etter perfusjon over PACC,

ble effluentprøver fra før og etter perfusjon fra normale eller turnorbærende sera ultrasentrifugert i sucrosedensitets-

gradienter og fraksjonene ble analysert med hensyn på Clq-bindende IgG. Begge sera oppviste forøkte nivåer av Clq-bindende IgG i fraksjoner større enn 7S sammenlignet med tilsvarende fraksjoner fra sera før perfusjon. Lignende økninger i Clq-binding i disse gradientfraksjoner ble iakttatt når F(ab<1>)2fragmenter som er spesifike for gammekjeder i hunde-IgG, ble brukt til å påvise bundet IgG.

IgG-kompleksene med høy molekylvekt i hundesera etter perfusjon ble så isolert ved fraksjonering på G-200 kolonne-kromatografi og passering av fraksjonen fra toppen for uvirksomt volum over en immunoabsorbent som inneholder gammekjede-spesifikt anti-hunde-IgG fra kanin:., Proteinet som var holdt tilbake ble eluert, nøytralisert, konsentrert og redusert før analyse med PAGE. PAGE-profiler farget med Coomassie Blue avslørte entydige polypeptider med molekylvekt på 50.000 og 25.000 som kom ut sammen med gamme- og lette kjeder fra hunde-IgG. Et svakt farget polypeptid med molekylvekt^på 75.000 som kom ut sammen med mu immunoglobulin-kjeden fra hunde IgM, ble også funnet og skyldes sannsynligvis hunde-IgM som er til stede i det isolerte komplekset. 10 mikrogram av de isolerte IgG-kompleksene med en hly molekylvekt under-søt med doble diffusjonsprøver, oppviste et enkelt precipitinbånd med geit anti-helserum fra hund som dannet en identitets-linje med spesifik gammekjede anti-hund-IgG fra kanain. Disse undersøkelser indikerte at det ble dannet en type med høy molekylvekt som inneholdt hunde IgG og IgM, under perfusjon av sera over PACC.

Frigivelse av protein A fra PACC ved hjelp av serum og serumbestanddeler

Selvom Clq-bindende IgG med høy molekylvekt ble dannet under perfusjon av serum over PACC, avslørte PAGE-analyse av eluater ikke noe bånd som utvetydig kunne karakteriseres som protein A etter som autentisk protein A forflyttes til en posisjon som er nesten sammenfallende med hunde-gammekjeder. Frigiv else av protein A i serum under perfusjon ble derfor undersøkt ved å bruke spormerket 125^-protein A i PACC som en markør. Resultatene viste at 125^-protein A ble frigitt fra PACC ved perfusjon med sera samt med oppløsninger av albumin eller IgG fra tre forskjellige arter. I tillegg var elueringen ikke spesifik for protein A ettersom de samme oppløsningene også frigjorde 125^-hundealbumin som var blitt immobilisert i kollodium-trekull på en lignende måte som protein A. Basert på mengden'radioaktivitet fritt fra PACC, ble det beregnet at 0,0025 til 0,005 mg (0,25 til 0,5%) protein A ble desorbert fra 1 mg immobilisert protein A etter perfusjon med 10 ml serum.

Protein A ble ytterligere identifisert i serum som hadde passert over PACC på følgende måte: PEG-utfellinger fra sera etter perfusjon som hadde passert over PACC eller SAC, ble fraksjonert på G-100 ved pH 3,0. Fraksjonene som ble tatt vare på (molekylvekt 100.000) ble nøytralisert, konsentrert og analysert med PAGE. Coomassie Blue merkede PAGE profiler av disse prøvene avslørte 2-4 tydelig adskilte polypeptidbånd hvorav et forflyttet seg sammen med renset protein A.

I ytterligere undersøkelser fikk hundeserum som inneholdt hunde-IgG passere over PACC som inneholdt 125-j.-merket protein A som en markør. Serumet ble etter perfusjonen behandlet

med 5% PEG for å utfelle et hvert 125^protein A-IgG-kompleks og deretter analysert med PAGE. Det ble funnet en radio-

aktiv topp som svarer til protein A markøren. Det ble også iakttatt noen radioaktive protein A typer med lavere molekylvekt som kan skyldes 125j protein A fragmenter.

I videre undersøkelser ble normale hundesera som hadee passert over PACC behandlet med 5% PEG for å utfelle protein A-IgG komplekser. Den oppløste utfellingen ble fraksjonert på Sephadex G-100 under dissosiasjonsbetingelser og fraksjonen

som ble tatt vare på, ble utfelt med (NI^^SC^. Den på nytt

oppløste utfellingen ble sendt over sepharose 4B hvortil det var bundet menneske IgG. Det bundne materiale ble eluert og konsentrert. Nærværet av protein A i eluatet ble antydet med doble undersøkelser som viste et precipitinbånd med normalt menneske serum, men ikke med normalt kyllingserum som ikke bindes til protein A.

Indentifisering av protein A i komplekser med høy molekylvekt For å identifisere protein A i sucrosedensitets-fraksjoner

med høy molekylvekt fra effluentsera etter perfusjon, ble de følgende undersøkelser utført. Normale hundesera fikk passere over PACC og sera etter perfusjonen som inneholdt eluert 125j protein A ble fraksjonert på sucrosedensitetsgradient.

125^ protein A ble funnet i et bredt sprekter av fraksjoner fra 7S til 19S sammenlignet med fritt 125-j. protein A som har en topp under 7S merket. Dette antyder at protein A elueres fra PACC i en form med høy molekylvekt som klart adskiller seg fra fritt protein A.

Sera etter perfusjonen som inneholder 125^protein A ble ultrasentrifugert slik som beskrevet og dets sedimentasjons karakteristika sammenlignet med de til renset fritt protein A. Radioaktivt merket protein A i etterperfusjonsprøvene

ble fordelt i gradientfraksjoner med høyere molekylvekt sammenlignet med fritt protein A. Parallell sucrosedensitets-gradientfraksjoner av etterperfusjonssera hadde forøket Clq-bindende IgG sammenlignet med sera før behandling. Dette antyder at protein A som elueres fra PACC i etterperfusjonssera forelå i komplekser sammen med immunoglobuliner og kan ha bidratt til den forøkede Clq-binding observert i sucrose-densitetsgradientfraksjoner etter perfusjon.

For å bestemme om 131I protein A eluert fra PACC etter serumperfusjon kunne bindes til Clq-belagte rør, ble det følgende eksperiment utført: 10 ml av normale eller turnorbærende sera

131

fikk passere over PACC som inneholdt I protein A. Effluent-

131

prøvene som inneholdt eluert I protein A, ble konsentrert til et volum på 10 ml og deretter ble 0,5 ml inkubert med

131

Clq-belagte rør. Fritt I protein A ble anvendt som en kontroll. Resultater viser omtrent 7 ganger økning i binding

131

av li PACC effluent sammenlignet med binding av fritt 131

I protein A. Følgelig hadde noe av det protein A som

ble eluert fra PACC etter serumperfusjon, fått Clq-bindende egenskaper, hvilket antyder at det var blitt frigjort i en form bundet til immunoglobuliner.

I ytterligere eksperimenter ble normale eller turnorbærende hunde- eller menneskesera sendt over PACC. Prøver fra før behandlingen og fra effluenten (0,5) ble inkubert med Clq-belagte

125

rør. Rørene ble vasket og affinitetsrenset I kyllm<g>-antiprotein A ble tilsatt slik som beskrevet. Resultatene viser signifikante økninger i binding av antiprotein A i (a) 2 av 3 og 3 av 5 prøver fra henholdsvis normale hunder og mennesker etter behandling, (b) 4 av 4 og 4 av 6 prøver fra henholdsvis turnorbærende hunder og mennesker etter perfusjon.

I ytterligere undersøkelser ble 50 ml normale hundesera

sendt gjennom kolonner som inneholdt<1>25I protein A eller 125

I hundealbumm sammen med umerket protein A immobilisert

i collodium-trekull. Effluentfraksjoner som inneholdt radioaktivtetstoppen ble slått sammen. Til 10 ml aliquoter av disse toppene ble det tilsatt et like stort volum med 50%

(NH.)„S04, 5% PEG eller 10% trikloreddiksyre. Resultatene

. "<125

viste at 70-80% av det I-merkede protein A var utfellbart med (NH4)2S04 og PEG sammenlignet med bare 5-10% for fritt protein A. Derimot var mindre enn 10% av frigjort albumin utfellbart med (NH4)2S04 eller PEG. Disse funn antyder at protein A, men ikke albumin opptrer i kompleks sammen med immunoglobuliner i effluent etter perfusjon.

Molekylformler for Clq-bindende komplekser

som inneholder IgG og protein A

For å bestemme om hunde IgG fra hundeserum ble bundet sammen

i Clq-bindende komplekser som er tilstede i serum etter perfusjon, ble det følgende eksperiment utført: 10 ml normalt

131

hundeserum som inneholdt I hunde-IgG ble sendt over PACC

125

som inneholdt I protein A. Effluenten ble konsentrert og deretter inkubert med Clg-belagte rør. Basert på de spesifike aktiviteter til det merkede protein A og IgG, beregnet vi at den empiriske formen for de Clq-bindende komplekser lå nært opptil IgG2PA. Den omtrentlige molekylvekt til disse kompleksene ble bestemt til å være 680.000 ved hjelp av kromatografering over sepharose 6B. Basert på disse verdier og den empiriske formel, svarer molekylformelen til [(IgG^PA^.

Når det gjelder menneske serum, fremkom det en topp nær ved molekylvekten for IgG i tillegg til toppen for den høye molekylvekten som svarer til kompleksene funnet i hundeserum. Både denne toppen og fraksjonen med den høye molekylvekten oppviste Clq-bindende virkning som lå over kontrollnivåene.

På grunn av vanskeligheten med å bestemme molekylvekten

til komplekser i dette området med denne fremgangsmåten,

kan det ikke utpekes en molekylformel for disse små kompleksene .

Fremstilling av protein A- IgG konjugater in vitro

Protein A-IgG konjugater ble fremstilt med forskjellige molare forhold mellom protein A og IgG og ble analysert med nefelometri etter inkubering ved 2 7°C i 60 min.

Maksimal lysspredning ble funnet ved molare forhold

mellom protein A og IgG på 1 til 2. Det var lavere verdier ved molare forhold på 1 til 10 og større. Komplementbindende egenskaper for protein A-IgG komplekser fremstilt i forskjellige molare forhold ble undersøkt i en anti-komplementær analyse (96) . Maksimum anti-komplementær virkning ble funnet ved molare forhold mellom protein A og IgG på fra 1:100 til 1:1000. Protein A-IgG komplekser

fremstilt i forskjellige molare forhold ble undersøkt med hensyn på evne til å indusere frigivelse av sideprotease, myeloperoksidase og betaglucuronidase fra hundenøytrofiler (98). Det optimale protein A-IgG forhold for frigivelse av disse enzymer var 1_100 med avtagende nivåer for katepsin-frembringelse ved forhold på 1_10 eller mindre.

Spesifike antistoffer i PEG-utfellbart IgG

frembragt under PACC perfusjon

Antiserum fra hund som var spesifikt for menneske erytrosytter og et antiserum fra" hund som er spesifikt for MCF-7 brystadenocarcinoma celler fra menneske, ble fremstilt. Hvert av disse sera og normalt hundeserum ble behandlet

med 5% PEG for å fjerne immunoglobulinagregater og endogene immunkomplekser og deretter latt passere over PACC. Serum fra etter perfusjonen ble behandlet med 5% PEG og

det utfelte proteinet analysert med hensyn på antistoffvirkning mot MCF-7 celler, murine fibrosarcoma celler (L-celler) og brystadenocarcinoma celler fra hund. Tabell-ene X og XI viser et etter PACC perfusjon ble spesifike antistoffer gjenvinnbare i den PEG-utfellbare fraksjonen av immunsera som overskred nivåene i den PEG-utfellbare fraksjonen i normalt serum etter perfusjon.

For å undersøke sedimentasjonskarakteristika til de antistoff ho Idige aggregatene, ble serum fra etter perfusjonen utsatt for sucrosedensitet gradient ultrasentrifugering og analysert med hensyn på antistoffvirkning ved hjelp av radioaktiv immunologisk analyse. Antisera fra etter perfusjonen oppviste spesifik binding i fraksjoner fra 7S

til 19S som overgikk binding i disse fraksjoner hos normalt serum.

Antiserum fra hund som var utsatt for perfusjon og som

var spesifikt for menneske-erytrosytter ble utfelt med 5% PEG og undersøkt med hensyn til spesifik agglutinering av menneske-erytrosytter og sammenlignet med PEG utfellinger fra normalt hundeserum som var utsatt for perfusjon. Tabell XII viser at anti-menneske erytrosyttsera fra hund forårsaker signifikante agglutineringsreaksjoner i motsetning til agglutinering med lignende mengder utfellinger fra normalt hundeserum.

Antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet

( ADCC) i PEG- utfellinger etter perfusjon

PEG-utfellinger fra anti-menneske-RBC fra hund og normalt hundeserum etter perfusjon ble brukt til å belegge menneske erytrosyttmål og analysert for ADCC ved å bruke hundeerytrosytter som effektorceller. PEG-utfellinger fra immunserum oppviste mer enn 300% større cytotoksisitet enn normalt serum som effektorer: målforhold på 1_1.

Innvirkningen av komplement ved frembringelsen av Clq- bindende IgG under perfusjon over PACC

For å bestemme om hundekomplement var essensielt for frembringelse av det Clq-bindende IgG under serumperfusjon over immobilisert protein A, ble normalt hundeserum, oppvarmet eller ikke oppvarmet ved 56°C i 60 min., behandlet med 5% PEG for å fjerne immunoglobulinaggregater og deretter latt passere over PACC. Oppvarmede og ikke oppvarmede sera oppviste sammenlignbare økninger i Clq-binding i effluentsera fra etter perfusjonen. Videre ble det frembragt lignende mengder Clq-binding når normale eller med-fødte C3-manglende hundesera ble behandlet på samme måte med 5% PEG og deretter latt passere over PACC. Følgelig ble Clq-bindende IgG oligomerer frembragt i sera etter perfusjon over PACC ved hjelp av komplementuavhengige mekanismer.

Biologiske virkninger av det PEG-utfellbare IgG med

høy molekylvekt som frembringes under PACC perfusjon Normale og turnorbærende sera ble behandlet med 5% PEG for

å fjerne immunoglobulinaggregater og endogene immunkomplekser og deretter latt passere over PACC. Effluentprøve etter perfusjonen ble så behandlet en annen gang med 5% PEG for å utfelle det frembragte IgG med høy molekylvekt. Dette ble så bedømt med hensyn til forskjellige funksjonelle biologiske virkninger.

For å fastslå om de frembragte IgG-oligomerer som inneholder protein A-IgG konjugater og sera fra etter perfusjonen kunne inhibereFc-avhengig lymfosyttrosettdannelse, ble de PEG-utfelte IgG-oligomerer i sera fra etter perfusjonen inkubert med hundelymfosytter som deretter ble analysert med hensyn på evne til å danne rosetter med menneske-erytrosytter som var gjort følsomme (9 9). PEG-utfellbare IgG-oligomerer i etterperfusjonssera fra normale og turnorbærende hunder oppviste sammenlignbar inhibering av rosettdannelse som varierte fra 8 til 31% sammenligmet ned 47% inhibering med aggregert hunde-IgG.

For å bestemme om IgG-oligomerene som inneholdt protein A-

IgG konjugater og etterperfusjonsserum kunne aktivere og forbruke komplement, ble de PEG-utfelte IgG-oligomerene i etterperfusjonssera inkubert med en komplementkilde fra marsvin og deretter analysert med hensyn på evne til å

formidle lyset i en komplementavhengig hemalyttisk analyse

(96). De PEG-utfellbare IgG-oligomerene i etterperfusjonsserum fra normale og turnorbærende hunder var sammenlignbare med hensyn til deres evne til å aktivere og forbruke komplement.

For å bestemme om IgG-oligomerene som inneholdt protein A-

IgG konjugater fra etterperfusjonssera kunne stimulere suberoksyd-anionfrigivelse ved hjelp av polymorfonukleære celler fra mennesker (PMN), ble etterperfusjonsseraene inkubert med PMNog mediene ble analysert med hensyn på suberoksyd frembringelse med kjemiluminisens (100, 101). PEG-utfellbare IgG-oligomerer i etterperfusjonssera fra normale og turnorbærende hunder var sammenlignbare med hensyn til deres evne til å stimulere suberoksydanion-frembringelse ved hjelp av hunde-PMN-er.

Den cytotoksiske virkningen av PEG-utfellingene fra etter-perf us jonssera ble evaluert. PEG-utfellbare oligomerer som inneholdt protein A-IgG konjugater både fra turnorbærende og normale sera induserte cytotoksisitet som var ikke spesifik ettersom en lignende grad av lyse ble funnet når målceller slik som brystadenocarcinoma, murine L-celle og menneske erytrosytter ble anvendt. Cytotoksisiteten syntes imidlertid å være komplementavhengig ettersom C3-manglende sera frembragte signifikant mindre cytotoksisitet enn hva de tilsvarende normale sera gjorde når de ble prøvd mot brystcarcinomaceller, murine L-celler og menneske-erytrosytter.

Biologiske virkninger av syntetiske protein A- IgG komplekser

A. Kjemiluminesens

Det er gjort fremskritt i kjemiluminesensundersøkelser under anvendelse av syntetiske protein A-IgG komplekser. Syntetiske komplekser ble opprinnelig fremstilt ved å tilsette protein A til serum eller til rent hunde- eller menneske-IgG som induserer kjemiluminesensvirkning. Disse kompleksene oppviste lignende virkning enten de ble fremstilt i serum eller ved tilsetning av protein A til rent menneske-IgG. Supernatantene fra uoppløselige komplekser fremstilt enten fra serum eller IgG var i det vesentlige inaktive. Kontroller som omfattet rent protein A, IgG og serum alene, var inaktive med hensyn til kjemiluminesens. Tilsetning av en frisk kompiementkilde til komplekser som var fremstilt enten fra serum eller friskt IgG, syntes ikke å øke kjemiluminesensvirkningen signifikant. Derimot var kompleksene fremstilt fra serum i nærvær av EDTA ikke så aktive med hensyn til aggregometri som kompleksene fremstilt fra serum i fravær av EDTA. Supernatanter fra komplekser fremstilt enten fra serum eller IgG var inaktive. En ikke-fraksjonert blanding av supernatant pluss komplekser eller en blanding satt sammen av isolerte utfellinger og supernatanter var mer aktive enn utfellingene alene. Dette indikerer nærværet av faktorer i supernatanten som ikke i seg selv er aktive,men som er i stand til å øke aktiviteten i de uoppløselige kompleksene.

B. Aggregometri

Syntetiske komplekser har gitt følgende resultater: inkubering av protein A-IgG kompleksene fremstilt enten med IgG eller serum sammen med eller uten EDTA gir signifikant aggregering av granulosytter. Kompleksene som fremstilt i fravær av EDTA, er imidlertid mye mer virksomme enn de som er fremstilt i nærvær av EDTA. Supernatantene fra disse kompleksene er inaktive, men på nytt tilsatt til utfellingen syntes de å resultere i signifikant forøkning av aktivitet ekvivalent med den hos den ikke-fraksjonerte blandingen. Disse funn tyder på at supernatanten forsterker aktiviteten

i de uoppløselige kompleksene. I denne sammenheng er det påvist høye nivåer av C3a og C5a ved hjelp av radioaktiv immunologisk analyse i supernatantene fra kompleksene.

Et viktig punkt når man skal skille mellom virkningene,

er det følgende : oppløselige komplekser fremstilt ved å tilsette forholdsvis store mengder protein A til serum-fremstilte komplekser som ikke er virksomme i aggregometri, men som har nivåer av C3a og C5a som er sammenlignbare med de til supernatantene fra de uoppløselige utfellingene.

C. Kompiementundersøkelser

Syntetiske komplekser som inneholder protein A-IgG fremstilt enten fra serum eller rent IgG aktiverer helkomplementvirkning enten i hunde- eller i menneskeserum. Komplementforbruk kommer opp i 40 til 70% hos hund. Uoppløselige komplekser fremstilt enten fra menneske- eller hundeserum eller fra C3-manglende serum, eller menneske- eller hunde-IgG forbruker opptil 90% av den totale komplementaktiviteten slik som vist i tabell XVII. Enten uoppløselige eller oppløselige komplekser fremstilt fra høye nivåer av protein A tilsatt til serum frembringer opptil 20 til 30 mikrogram C3a pr. ml serum. Denne nærmer seg en 40% omdannelse av totalt C3 i serum til C3a.

De samme supernatantene inneholder opptil 8 00 ng C5a/ml serum. Komplekser som er blitt vasket og tilsatt til friskt serum, fortsetter å frembringe C3a og C5a virkning. Når disse kompleksene først er fremstilt, synes de å være i stand til ikke bare å frembringe C3a først og fremst i serum som de ble fremstilt fra, men etter å være overført til friska serum, er de også i stand til å frembringe ytterligere C3a og C5a slik som vist i tabell XVIII. F.eks. frembringer utfellinger enten fra serum eller rent IgG tilsatt til friskt serum opptil 2500 ng C5a/ml. Fra eksperimentelle undersøkelser er C5a kjent for å indusere hypotensjon, vasodilatasjon og forøket kapilærpermeabilitet. Lignende responser ble dokumentert in vivo under akutte kliniske betingelser etter perfusjons-behandlinger. Foreløpige undersøkelser viste forhøyede nivåer av C5a i serumprøver fra våre pasienter erholdt på

et tidspunkt etter perfusjon når trykkene avtop. I en til-leggsundersøkelse hvor det ikke ble iakttatt noen endring i C5a nivåer, var der ingen signifikant endring i kardiovaskulære parametre. Disse funn tyder på at anafylatoksiner frembragt fra PA-IgG konjugatene delvis kan telle med når det gjelder de observerte kardiovaskulære virkningene.

In vivo virkninger av protein A- IgG konjugater

Tre hunder med spontane tumorer ble gitt protein A-IgG komplekser ( behandlingmåte 9, tabell XVIII) fremstilt ved å inkubere 1 mg protein A med 3 ml autologt serum i 3 0 min. ved 27°C. Normal saltvannsoppløsning ble så tilsatt for å bringe blandingen til et sluttvolum på 5 ml og den ble infusert intravenøst med en hastighet på 1 ml/min. Infusjonene ble gitt 3 til 5 ganger ukentlig med i alt 7 til 15 behandlinger. Kort tid etter infusjonen ble synlige tumorer blodfyllte og ødemaktige. Ved gjentatte infusjoner ble det observert objektive regresjoner slik som angitt nedenunder (tabell XIII).

Protein A-IgG kompleksene bestående av 100 mikrogram protein A pluss 25 ml autologt hundeserum ble gitt sammen med anti-tumor antisera fra kanin (20 ml) og zymosamaktivert normalt hundeserum (behandlingsmåte 4, tabell XIV) på 2 etter hverandre følgende dager. Dyrene fikk hvile på den tredje dag og deretter ble cyklofosfamid og/eller adriamycin gitt på den 4-dagen. Dette resulterte i akutte tumoriside virkninger hos 2 hunder med brystadenocarcinoma. Ved gjentatt administrering, oppviste 2 hunder mer enn 50% tumorreduksjoner (tabell XIV).

In vivo-virkninger av protein A-IgG konjugater

fremstilt fra normale hundesera

Etter å ha fastslått ut fra fysikalsk-kjemiske undersøkelser

av PAGC effluent at protein A-IgG konjugater oppsto, søkte vi å prøve effektiviteten til konjugatene på hunder med forskjellige spontane hundetumorer. Fem hunder med forskjellige spontane tumorer ble gitt protein A-IgG komplekser. Den anvendte sosering av PA-IgG var utledet fra undersøkelser av

mengde PA-IgG som ville indusere synlige morfologiske endringer i tumoren, og forholdet mellom PA og IgG ble utledet fra in vitro undersøkelser hvor et forhold på 1:100 mellom PA:IgG resulterte i optimal frigivelse av myeloperoksidase og katepsiner fra hundenøytrofiler. Disse ble fremstilt ved å inkubere protein A (11 mikrogram/kg) med normalt hundeserum (0,2 mg/kg) i 60 minutter ved 37°C. Normal saltvannsoppløsning ble så til-

satt for å bringe blandingen til et sluttvolum på 10-15 ml og den ble infusert intravenøst ved en hastighet på 1 mg/min. Infusjonene ble gitt 2 til 4 ganger ukentlig med i alt 7 til 16 behandlinger. Kort tid etter infusjonene ble tumorene blodfyllte og ødemaktige. Ved gjentatte infusjoner ble det observert objektive tumorregresjoner slik som vist i tabell XV. I noen tilfeller ble en subterapeutisk dose med kjemoterapi lagt til infusjonsbehandlingen etter at tumoren oppviste inflammatoriske endringer indusert av PA-IgG infusjonene. Under disse betingelser ble det også observert tumorregresjoner, slik som vist i tabell XVI.

Selvfølgelig er et aspekt ved den foreliggende oppfinnelse fremgangsmåten for å behandle en vert med kreft ved å administrere en tumorisid dose av et preparat som bindes til Fc reseptor i Fc-bærende leukosytter og derved forårsake frigivelse av i det minste et cytotoksisk materiale fra leukosyttene.

Toksisitetsundersøkelser med protein A-IgG

konjugater på normale hunder

Det ble utviklet en modell i hunden for å undersøke de toksiske virkninger av konjugater som stammer fra inkubering av fritt protein A med hundeplasma og for å korrelere disse funn med de som ble observert og tidligere er beskrevet.

I disse undersøkelsene ble det forsøkt å karakterisere patofysiologien til disse reaksjonene, eksaminere serologiske mediatorer, studere virkninger av farmakologisk blokkering og andre fremgangsmåter for å svekke responsen, og til slutt å trekke sammenligninger med reaksjonen på mennesker.

Fire grupper ble undersøkt, Gruppe 1 ble protein A-IgG konjugater over en periode på 3 minutter. Gruppe 2 ble gitt protein A-IgG konjugater over en periode på 30 minutter. Gruppe 3 var hunder hvor granulosyttene var fjernet, som

ble gitt de samme behandlingene som gruppe 2. Gruppe 4 ble gitt histaminblokkerende medisinering før de mottok den samme behandlingen som gruppe 2.

De følgende parametre ble undersøkt:

(a) Venstresidig ventrikulær DP/DT

(b) Hjertesegment lengde-kontraktilitet (c) Gjennomsnittlig blodtrykk i aorta (d) Toppverdi for venstresidig ventrikulært systolisk

blodtrykk

(e) Strømning i kransarteriet

(f) Strømning i nyrearterie

(g) Strømning i lårarterie

(h) Strømning i lungearterie

Resultater har vist at med hurtig infusjon av protein A-IgG konjugater oppsto det hurtige avvik i alle de ovenfor nevnte parametre med en sakte tilbakevending til grunnverdien. Med sakte infusjon av protein A-IgG komplekser var der igjen reduksjon i alle parametre med en topp etter 15 minutter som varte i 45- 60 minutter og vendte tilbake til grunnverdien. Den viktigste første manifestasjon syntes å være reduksjon

i venstresidig ventrikulær DP/DT og segmentlengde med sekun-dære virkninger på gjennomsnittlig blodtrykk i aorta. Fjerning av granulosytt hos hunder som mottok den samme behandlingen som gruppe 2, resulterte i en minsking av de observerte kardiovaskulære virkningene. Bruk av histaminblokkering hadde liten virkning på svekking av de kardiovaskulære responsene.

Undersøkelse av patologien til forskjellige vev etter infusjon viste at de mest slående endringer syntes å være i lunge med alveolær ødem og cellulære uttømninger i alveolrommet.

I disse undersøkelsene oppviste hunden et kardiovaskulært toksisitetsspor som var forskjellig fra det som vi observerte hos mennesker. Minskingen i blodstrømning i hovedårene synes å skyldes en reduksjon i hjertekontraktilitet mens undersøkelser på menneske under akutte betingelser viste en økning i hjerte-effekt med reduksjon i systemisk vaskulær motstand som årsak til hypotensjonen. Hos begge er der bevis for endringer i vaskulærpermeabilitet. Tabell XVII angir data for virkningen av protein A på hemo-lyttisk aktivitet av alt komplement og tabell XVIII angir data for C3a- og C5a-frembringelse fra syntetiske komplekser.

Foretrukket utførelsesform: Produkt 4

( surgjort turnorbærende sera)

9 ml/kg av autologe sera eller plasma fra turnorbærende verter surgjøres til pH 2,5 ved dråpevis tilsetning av ION HC1 og holdes i 5 min. ved 27°C. Serumet nøytraliseres deretter hurtig til pH 7,4 ved tilsetning av ION NaOH og sentrifugeres ved 1500 x g i 30 minutter ved 4°C. Supernatantserumet fjernes deretter og gis intravenøst med en hastighet på

1 ml/min.

Endringer i hovedbestanddelene i menneskeplasma etter sur-gjøring og hurtig nøytralisering ved hjelp av den ovenfor nevnte fremgangsmåte er gjengitt nedenunder i tabell XVIIIA. Det vil ses at det er en reduksjon av totalt protein og glubulinfraksjonen samt i fibrinogen, mens andre parametre forblir i det vesentlige uendrede. Tabell XVIIIB viser reduksjoner i menneske-immunoglobuliner G, M og A etter behandling av plasma med syre.

Autologt surgjort serum fra turnorbærende verter oppviser en signifikant økning i tumortilknyttede antistoffer målt ved indirekte immunofluoresens under anvendelse av hver hunds egen tumor som substrat (tabell XIX).

Endringer i tumortilknyttede antistoffer i sera fra hunder med brystcarcinoma etter surgjøring ble undersøkt i en radioaktiv immunologisk analyse hvor en vevskulturlinje av hunde-brystadenocarcinoma ble brukt som sikremål og 125^. protein A som indikator for å påvise cellebundet hunde IgG. I 10 under-søkte sera resulterte surgjøring til pH 2,5 etterfulgt"av hurtig nøytralisering i økninger i tumortilknyttede bidnings-nivåer på 120 63%(S.D.) over verdiene for ubehandlet serum.

Analyse med Sephadex G-200 kromatografi av helserum fra

et menneske med brystadenocarcinoma før og etter surgjøring viste følgende: (a) surgjort serum oppviste stor økning i volum uvirksomt protein og en relativ reduksjon i protein i den undersøkte fraksjonen sammenlignet med ubehandlet serum, (b) tumor-tilknyttet binding målt ved radioaktiv immunologisk analyse viste 948% økning i den undersøkte fraksjonen og 134% økning i volum av uvirksom fraksjon sammenlignet med ubehandlet serum.

Analyse av surgjort helserum etter sucrosedensitets

gradient ultrasentrifugering viste at Clq-bindings nivåene ble øket opptil 400% i fraksjoner større enn 7S sammenlignet med ubehandlet serum. Følgelig synes det som

om surgjøring av turnorbærende serum gir en økning i tumor-tilknyttede antistoffer og frembringelsen av proteiner med høy molekylvekt.

Surgjort serum i behandling av spontane tumorer Autologe surgjorte sera fra turnorbærende hunder gis sammen med zymosanaktivert normalt hundeserum på den første dag og på nytt innen 24 timer senere (andre dag). Dyret får hvilke på den tredje dag. På den fjerde dagen gis cyklofosfamid intravenøst (behandlingsmåte 2, tabell XVIII). Resultatene av denne behandling på fem hunder er vist i tabell XX. En virksom variasjon som gir svært betydelige tumoriside virkninger er som følger: L-asparginase og cyklofosfamid gis til verten på den første dagen og når maksimum regresjon av tumoren er oppnådd, gis zymosanaktivert normalt hundeserum (100 ml/ og på forhpnd behandlet autologt plasma (9 ml/kg) som er surgjort og alkalisert, og L-asparginase og cyklofosfamid administreres på den følgende dagen (behandlingsmåte 5, tabell XXII). Resultatene er gjengitt i den følgende tabell

XXI .

Foretrukket utførelsesform: Produkt 5 (Zymosanaktivert plasma) Administreringen av normalt hundeserum etter inkuberingen med zymosan, et stoff som er kjent for å aktivere komplement-sekvensen og frembringe komplement-biprodukter, har resultert i de følgende in vivo virkninger: (a) vasodilatasjon og minsking i blodtrykk og tachycardia.

(b) spasmogene virkninger på glatte muskler.

Disse virkninger kan delvis tilskrives komplement-biprodukter, nemlig anafylotoksiner C3a og C5a.

For å aktivere komplement i normalt helserum fra hund, inkuberes zymosan (5 g) med serum (100 ml) i 10 min. ved 27°C. Zymosanet fjernes deretter ved sentrigufering ved 1500 x

g i 30 min. Det komplementaktiverte serum infuseres deretter intravenøst inn i den turnorbærende verten ved en hastighet på 10 mg/min.

Ved forskjellige behandlingsmåter som anvendes for behandlingen av spontane hundetumorer, har zymosanaktivert normalt hundeplasma vært anvendt som en terapeutisk tilleggsbehandlings-måte. Tumoriside eller tumor-tilbakedannende virkninger har oppstått når zymosanaktivert hundeplasma har blitt administrert sammen med (a) tumor-immunglobulin-preparat, (b)

protein A-IgG komplekser, (c) surgjorte eller alkaliserte plasma. Tumoriside virkninger eller regresjoner har vært iakttatt for L-asaparginase, cyklofosfamid eller adriamycin gis kort tid etter administrering av hver av disse produkter.

Foretrukket utførelsesform: Protein A

Protein A er en bestanddel i celleveggen hos Staphylococcus aureus Cowans I og har en evne til å reagere med Fc-område eller immunoglobuliner hos mange pattedyrarter. Når det injiseres i turnorbærende hunder, har det vært iakttatt anti-tumor virkning. Protein A ble infusert i doser på 10-80 mikrogram/kg (behandlingsmåte 8, tabell XXII). Dette -har resultert i forbigående tumorreduksjoner på 5 til 20% hos fire dyr mens en annen oppviste en tumorisid respons. To andre viste ingen virkning.

Flerdimensjonell immunoterapi

Bruken av disse produktene alene, i kombinasjon med hverandre eller sammen med forskjellige kjemoterapeutiske midler har resultert i svært sterke tumoriside reaksjoner og tumor-regres joner hos hunder med forskjellige spontane tumorer. Behandlingsmåtene som er anvendt for å frembringe disse virkningene, er vist i tabell XXII og bruken av forskjellige produkter i disse behandlingsmåtene og de erholdte resultater er beskrevet i de foretrukne utførelsesformer. Den foreliggende oppfinnelse er derfor vel egnet og tilpasset til å oppnå formålene, og har de nevnte samt tilknyttede fordeler og trekk. Selv om alle eksemplene som her er. [gjengitt, er for spontane tumorer hos hunder, bør det legges merke til at disse tumorene utgjør anerkjente og utmerkede modeller for sine motsvarigheter hos mennesker, Den vellykkede terapien i hundemodellen med protein-kollodium-trekul1 systemet (17, 19)ble nylig overført til mennesker hvor det ble oppnådd objektive tumorregresjoner hos fire av de fem første behandlede pasientene (20). Følgelig antas de her gjengitte data for hunder med tumorer å forutsi vellykkede resultater også når samme fremgangsmåtene og preparatene anvendes på mennesker med spontane tumorer.

Selv om beskrivelsen av den foreliggende oppfinnelse særlig har vært åpenbaret med hensyn til bruken av syrebehandling som den adskillende teknikken, vil det forstås at andre ekvivalente, kjente adskillingsteknikker, slik som be&krevet ovenfor, anses som en del av den foreliggende oppfinnelse og lett kan brukes slik det lett vil forstås av en fagmann på området.

1. Bier, M. In Electrophoresis, (ed. M. Bier), Acaderaic

Press, New York, New York, 1959, p. 263.

2. Bier, M. In Membrane Process for Industry, Southern

Research Institute, Birmingham, Ala., 1966, p. 218.

3. Bier, M. Sixth Intern. Congress Biochem., New York,

1964 .

4. Bier, M. , Science 125:1084 , 1957.

5. Hanning, K. In Electrophoresis, Vol. II, Academic

Press, New York, New York, 1967, p. 423.

6. Bier, M., Brucknew, G.C., and Roy, H.E. Trans. Amer.

Soc. Artif. Int. Organs 13:227, 1967.

7. Bier, M., and Mourlek, S.P. In Proe. Third Annual

American Water Resources Conference, 1967, p. 524.

8. Bier, M., Bruckner, G.C., Cooper, F.C., and Roy, H.E. Concentration of Bacteriophage by Electrophoresis in Transmission of Viruses by Water Route, New York, 1-967, p. 57. 9. Bier, M. In Symposium on Electrodialysis, Electrochemical Society, Boston, Mass., 1968. 10. Bier, M., Beavers, D.C., Merriman, W.G., Merkel, F.K.,

Eisenman, B., and Starzl, T.Z. Trans. Amer. Soc.

Artif. Int. Organs, Vol. XVI, 1970.

11. Forsgren A., Sjoquist J. J. Immunol. 1966, 97:822.

12. Kronvall G., Frommel D. Immunochem. 1970, 7:124.

13. Kessler, S.W. J. Immunol. 1975, 115:1617.

14. Stalenhem G. , Gotze 0., Cooper N..R. , Sjoquist J. , Muller-Eberhard, H.J. Immunochem._1973, 10:501. 15. Vallota, E.H., Muller-Eberhard, H.J. J. Exp. Med. 1973,

137:1109.

16. Stalenham, Castensson, S. FEBS Letters 1974, 14:79.

17. Terman, D.S., Yarnamoto, T., Mattioli, M. , Cook, G.,

Tillquist, R., Henry, J., Poser, R., Daskal, Y. J.

Immunol. 1980 124:795. 18. Holohan, T., Bowles, C, Deisseroth, A, Proe. Am. Assoc.

Cancer Res., Am. Soc. Clin. Oncol. 21:241 abstract.

19. Terman DS, Yarnamoto T, Tillquist RL, Henry JF, Cook

GL, Silvers A, Shearer WT: Science 1980, 209:1257.

20. Terman DS, Young YB, Shearer WT, Ayus C, Lehane D,

Mattioli C, Espada R, Howell JF, Yarnamoto T, Zaleski HI,

Miller L, Frommer P, Fedlman L, Henry JF, Tillquist R,

Cook G, Daskal Y: N Engl J Med 1981, 305:1195.

21. Young JB, Ayus JC, Miller LK, Webster RO, Miller RR,

Terman DS: Circulation 1981, 64:325 abstract.

22. Martin, RR, Crowder, JG, White AJ, J. Immunol. 99

269, 1967.

23. Gustaf sen, GT, S.talenheim G, Forsgren A, Sjoquist, J,

J. Immunol. 100, 530, 1968. 24. Heczko, PB, Grov A, Oeding P, Acta Pathol. Microbiol.

Scand. Section B, 81, 731, 1973.

25. Gustafsen, GT, Sjoquist J, Stalenheim, G., J. Immunol. 98, 1178, 1967. 26. Masuda, S and Kondo I, Microbiol. Immunol. 23, 1223, 1979. 27. Kronvall, G and Gewurz, Clin. Exp. Immunol. 7, 211,

1970.

28. Stalenhemin, G., Acta. Pathol. Microbiol. Scand.. Section

B, 79, 665, 1971.

29. Sjoquist, J and Stalenheim, G., J. Immunol. 103, 467

1969.

30..Stalenheim, G, Gotze 0, Cooper N, Sjoquist J, Muller-Eberhard H,Immunochemistry, 10, 501, 1973. 31. Stalenheim G, Maimheden-Ericksson, I, FEBS Lett. 14 82, 1971. 32. Stalenheim G and Castensson S, FEBS Lett. 14, 79, 1971. 33. Langone, JJ, In Methods in Enzymology, Academic Press,

Inc. N.Y., 70, 356, 1980.

34. Langone, JJ, J. Immunol. Methods. 34, 93, 1980c.

35. Langone, JJ, Boyle, MDP, Borsos, T., J. Immunol. 121, 333, 1978. 36. Lancet D. , Isenman D.,. Sjodahl J. , Sjoquist J., Pecht I.,

Biochem. Biophys. Res. Commun. 85, 608, 1978.

37. Hallgren, R and Stalenheim, Immunology, 30, .755, 1976. 38. Hallgren, R and Stalenhéim G., Immunology 35, 13, 1978.

39. Martin RR and White A, J. Immunol. 102, 437, 1969.

40. Campbell D.S., Luescher.E., and Lerman L.S.,.Nati. Acad.

Sciences 37:575, 1951.

41.. Sjogren H.O.., Hellstrom I., Bansal S.C., and Hellstrom

K.E., Proe. Nati. Acad. Sciences 68:1372, 1971.

42. ' Faldt R., Ankerst J., Int. J. Cancer 26:309, 1980.

43. Dorsett, Ioachim, Stolback, Int. J. Cancer 16:779,

1975.

44. ' Kabat, E.A., Mayer, M.M., Experimental Immunochemistry

CC, Thomas, Springfield, IL, 1948, p. 480.

45. Behring; Kitasato, Dtsch. Med. Wochenschr. 16:1113,

1890.

46. McKhann, CF.; J. Infect. Dis. 52:268, 1933.

47. McKhann, CF., Green, A.A.; Coady, H. J. Pediatr. 6:603, 1935. 48. Eley, R.C; Green, A.A. ; McKhann, CF., J. Pediatr. 8:135, 1936. 49. Stokes, J., Jr., Maris, E.P.; Gellis, S.S., J. Clin.

Invest. 23:531, 1944.

50. Ordman, C.W.; Jenning, C.G., Jr.; Janeway, C.A., J.

Clin. Invest. 23:541, 1944.

51. Stokes, J.; Neefe, J.R., J.A.M.A. 127:144, 1945.

52. Gellis, S.S.; Stokes, J., Jr.; Brother, G.M.; Hall,

W.M.; Gilmore, H.R.; Beyer, E.; Morrissey, R.A., J.A.M.A.

128:1062, 1945.

53. Bruton, O.C., Pediatrics 9:722, 1952.

54. Eibl, M., In Immunoglobulins: Characteristics and Uses of Intravenous Preparations (eds. B.M. Alving, J.S.

Finalyson), U.S. Department of Health, and Human Services,

pp. 23, 1979.

55. Ochs, H.D., In Immunoglobulins: Characteristics and'

Uses of Intravenous Preparations (eds. B.M. Alving, J.S.

Finalyson), U.S. Department of Health, and Human Services,

pp. 9, 1979.

56. Condie, RM, In Immunoglobulins: Characteristics and

Uses of Intravenous Preparations (eds. B.M. Alving, -J.S.

Finalyson), U.S. Department of Health, and Human Services,

pp. 179, 1979. 57. Skvaril, F., Barandun, S., In Immunoglobulins: Characteristics and Uses of Intravenous Preparations (eds. B.M. Alving,

J.S. Finalyson), U.S. Department of Health, and Human Services, pp. 201, 1979.

58. Seiler, FR, In Immunoglobulins: Characteristics and

Uses of Intravenous Preparations (eds. B.M. Alving, J.S.

Finalyson), U.S. Department of Health, and Human Services,

pp. 207, 1979.

59. Funakoshi, S., In Immunoglobulins: Characteristics and

Uses of Intravenous Preparations (eds. B.M. Alving, J.S.

Finalyson), U.S. Department of Health, and Human Services,

pp. 219, 1979.

60. Lindstrom, G.A., Acta Med. Scand. Suppl. 22, 1, 1927.

61. de Carvalho, S., Cancer, 16, 306, 1963.

Hnevkovsky, 0., Neoplasma 14, 641, 1967.

63. Tsirimbas, A.D., Pichlmayr, R., Horninung, B., Pfisterer,

H., Thierfelder, S., Brendel, W., and Stitch, W., Klin

Wschr. 46,583,1968.

64. Marsh, B., Flynn, L. and Enneking, W., J. Bone and Joint

Surgery 54A, 1367, 1972. 65. Parks, L.C., Smith, W.J., Beebe, B., Winn, L., Rafajko,

R., Rolley, R., and Williams G., Melville, Proe. Amer.

Cancer Res. and Amer. Soc. Clin. Oncology 16, 134, 1975. 66.Laszlo, J., Buckley, C.E., and Amos, D.B., Blood, 31,

104, 1968.

67. Djerassi, I., Clinical Pediatrics 7, 272, 1968.

68. Herberman, R.B., Oren, M.E., Rogentine, G.N., and Fahey,

J.L., Cancer 28, 365, 1971. 69. Brittingham, T.E., and Chaplin, H., Cancer 13,412 1960. 70. Skurkovich, S.V., Kisljak, N.S., Machonkova, L.A., and

Begunenko, S.A., Nature 223, 509 1969.

71. Skurkovich, S.V., Makhaonova, L.A., Reznichenko, F.M.,

and Chervonskiy, G.I., Blood 33, 186, 1969.

72. Ngu, V., Brit. Med. J. 1, 345, 1967.

73. Ghose, T., and Nigam, S.P., Cancer 29, 1398, 1972.

74. Levy, R., Hurwitz, E., Maron, R., and Sela, M., Cancer

Res. 35, 1182, 1975.

75. Vial, A.B., and Callahan, W., Cancer 10, 999, 1957.

76. Moolton, F.L., and Cooperband, S.R., Science, 169, 68

1970.

77. Parker, C.W., Pharmacol. Rev. 25, 325, 1973.

78. Segerling, M. , Ohanian, S.H.,- and Borsos, T. , Cancer

Res. 35, 3195, 1975. 79. Ruddy S., Gigli I, Austen KF: N. Engl J Med 287:489, 545,592,642, 1972. 50. Wilson MR, Arroyaye CM, Nakamura RI-1, Vaughn JH, Tan EM:

Clin Exp Immunol 26:11, 1976.

81. Verhaeqen H, DeCock W, DeCree J, Verbruggen F: Cancer 38:1608, 1976.

82. Ryan GB, Majno G: Am J Pathol 86:183, 1977.

83. Hugli TE, Muller-Eberhard HJ: "Advances of Immunology,"

26. New York: Academic Press, 1978, pp. 1.

84. Cochrane CG, Muller-Ebarhard HJ: J. Exp Med 127:371,

1968.

85. Lepow IH, Willm-Kretschmer K, Patrick RA, Rosen RS, Am J

Pathol 61:13, 1970.

86. Vallota EH, Muller-Eberhard HJ: J Exp Med 137:1109,

1973. 87. Johnson AR, Hugli TE, Muller-Eberhard HJ: Immunology 28:1067, 1975. 88. Hugli TE: "The Chemistry and Phsyiology of Human Plasma

Proteins." New York: Pergamon Press, 1979 pp. 225.

89. Bokisch VA, Muller-Eberhard HJ: J Clin Invest 49:2427,

1970.

90. Chenoweth DE, Hugli TE: J Immunol- 124:1517, 1980.

91. Hugli TE: J Biol Chem 250:8293, 1975.

92. Fernandez HN, Hugli TE: J Biol Chem 253:6955, 1978.

93. Kassel, R.L., Old, L.J., Carswell, E.A., Fire, N.C.,

Hardy, W.D., J. Exp. Med. 138, 925, 1973.

94. Cohn E.J., J. Amer Chem Soc 68:459, 1946.

95. Kistler P. and Nitschmann Hs., Vox Sang 7:414, 1962.

96. Killingsworth, L.M. and J. Savoy, 1972 Manual nephelometric methods for immunochemical determination of immunoglobulins

IgG, IgA and IgM in human serum Clin Chem 18:335.

97. Mancini, G., A.O. Carbonara and J.F. Heremans, 1965

Immunochemical quantitation.of antigens by single radial

immunodiffusion. Immunochem. 2:235.

98. Romer, J., A. Gardi and P. Kistler, 1979 Assay of anticomplemer activity in solutions of immunoglobulins. Develop. Biol.

Standard 44:147.

99. Laemmli, U.K. 1970 Cleavage of structural proteins during assembly of the head of backteriophage T4. Nature

232:52.

100. Ishiyama, H., K. Okuyama, K. Masuda and J. Yasuda, 1978

Effects of human immunoglobulin preparations on Fc rosette formation between anti-D coated erythrocytes and

lymphocytes. Z. Immun.-Forsch 154:387.

101. Webster, R.O. and P.M. Henson 1978 Rapid micromeasurement

of neutrophil exocytosis. Inflammation 3:129.

102. Anderson, D.C., M. S. Edwards' and CL. Baker 1980 Luminol-enhanced chemiluminescence for evaluation of type III

group B streptococcal opsonins in human sera. J. Infect.

Dis. 141:370.

103. Johnston, R.B., Jr., J.E.Lehmeyer and L.A. Guthrie, 1976

Generation of superoxide anion and chemiluminescence by • human monocytes during phagocytosis in contact with.

surface bound immunoglobulin G. J. Exp. Med. 143:1551.

104. Levy P.C, Shaw, G.M., and LoBuglio A.F., J. Immunol.

Vol. 123, No. 2, 594, 1979.

105. Koren, H.S. and Williams M.S., J. Immunol. Vol. 121, No.

5, 1956, 1978.

Claims (28)

1. Immunpreparat mot tumorer,karakterisertved at de omfatter plasma fra en av en normal og en turnorbærende vert og har de følgende egenskaper: (a) består overveiende av IgG og IgM med mindre mengder albumin, (b) Clq-binding i fraksjoner som sedimenterer over 7S på sucrosedensitets-gradient, (c) gir tumoriside reaksjoner når det infuseres i den turnorbærende verten, (d) har reduserte nivåer av IgG, IgM og immunkomplekser, og forøket Clq-binding i fraksjoner som sedimenterer over 7S på sucrosedensitets-gradienten, sammenlignet med ubehandlet anriket immunoglobulin-effluent som stammer fra tvungen elektroforese av plasmaet, og (e) titere for tumorspesifike antistoffer større enn 20.000 når plasmaet er fra en turnorbærende vert.

2. Immunogolublinpreparater mot tumorer,karakterisert vedat de stammer fra en av en normal og en turnorbærende vert og har de følgende egenskaper: (a) omfatter immunoglobulin G med en liten mengde IgA og er i det vesentlige fri for IgM og komplement, (b) oppviser forøket Clq-binding IgG i sedimenterende fraksjoner større enn 7S ved sucrosedensitets-gradient, (c) har minimal anti-komplementær aktivitet, (d) gir tumoriside reaksjoner når det administreres til den turnorbærende verten, og (e) har lavere nivåer for IgG og IgA og økt Clq-binding i fraksjoner større enn 7S, sammenlignet med ikke-surgjort Cohn fraksjonert gammaglobulin, og (f) har økte nivåer av tumorspesifike antistoffer og mindre antikomplementær aktivitet når preparatet stammer fra en turnorbærende vert.

3. Protein A-IgG preparat,karakterisertved at det har de følgende egenskaper: (a) omfatter i overveiende grad tunge og lette IgG-kjeder og protein A ved polyacrylamidgel-elektroforese, (b) identifiseres i tungt sedimenterende 7S eller større enn 7S-fraksjoner på sucrosedensitets-gradient med forøket Clq-bindingsaktivitet, (c) dissosierer til Clq-bindende fragmenter med lavere molekylvekt under syrebetingelser, (d) er utfellbare med 5% polyetylenglykol eller andre kjente immunoglobulinutfellende fremgangsmåter, (e) har anti-komplementær virkning, (f) inhiberer Fc-avhengig dannelse av lymfosytt-rosett, (g) induserer neutrofiler til å aggregere og frigi myeloperoksidase, catepiner og auperoksyd-anioner, (h) induserer hemagluttinering av hundeerytrosytter, (i) induserer komplement-aktivering med frembringelse av anafylatoksiner, (j) induserer ikke-spesifik komplementavhengig cytotoksisitet i brystadenocarcinomaceller fra hund, murine L-celler og menneske-erytrosytter, og (k) frembringer ved samvirket mellom plasma og enten fritt eller ikke-kovalent bundet protein A ved komplement uavhengig mekanisme og er ikke tilstede i serum før behandlingen.

4. Protein A-IgG preparat,karakterisertved at det har de følgende egenskaper: (a) omfatter i overveiende grad tunge og lette IgG-kjeder og protein A ved polyacrylamidgel-elektroforese, (b) identifiseres i tungt sedimenterende 7S eller større enn 7S-fraksjoner på sucrosedensitets-gradient med økt Clq-bindende virkning, (c) dissosierer i Clq-bindende fragmenter med lavere molekylvekt under sure betingelser, (d) er utfellbart med 5% polyetylenglykol eller ved andre kjente fremgangsmåter for utfelling av immunoglobuliner, (e) har anti-komplementær virkning, (f) inhiberer Fc-avhengig dannelse av lymfosytt-rosett, (g) induserer neutrofiler til å frigi myeloperoksidase, catepiner og superoksyd-anioner, (h) induserer hemagglutinering i hundeerytrosytter, (i) inneholder antistoffer som beholder sin anti-gen affinitet og har for relativt forøkede cytotoksiske evner i nærvær av komplement, og (j) gir tumoriside^reaksjoner og tumorregresjoner når det infuseres i turnorbærende verter i forskjellige molare forhold til protein A-IgG komplekser.

5. Immunoplasma-preparat mot tumorer,karakterisert vedat det har de følgende egenskaper: (a) titere for tumortilknyttede antistoffer ved indirekte immunofluoresens som er større enn 10.000 og opp til 50.000, (b) tumortilknyttede bindingsnivåer ved radioaktiv immunologisk analyse som er forøket med 85% over ubehandlet -plasma, (c) økning i Clq-binding i fraksjoner som sedimenterer over 7S på sucrosedensitets-gradient, (d) økning i uvirksomt volum og minsking i proteiner i de fraksjoner som er tatt med på Sephadex G-200, (e) gir tumoriside reaksjoner når det infuseres i turnorbærende verter, og (f) sammenlignet med ubehandlet plasma har immunplasmaet mot tumorer forminskende nivåer av IgG, IgM, IgA og fibrinogen, forøket Clq-binding i tungt sedimenterende fraksjoner og forøket proteinnivåer ved kromatografering på G-2 00 i uvirksomt volum sammen med forminskede nivåer i fraksjonene som er tatt med.

6. Fremgangsmåte for å behandle en vert med kreft,karakterisert vedå administrere til verten en effektiv kreftbehandlende mengde av et zymosanaktivert plasmapreparatserum fra en av en normal og en turnorbærende vert inkubert i zymosan, men fri for zymosanet, idet preparatet frembringer som in vivo-virkninger perifer vasodilatasjon og spasmogene virkninger i overensstemmelse med virkning av komplement-biprodukter.

7. Fremgangsmåte for å behandle en kreftbærende vert,karakterisert vedå administrere til verten en effektiv kreftbehandlende mengde av preparatet ifølge kravene 1,2,3,4 eller 5.

8. Fremgangsmåte for å fremstille preparatet ifølge krav 1,karakterisert vedå utsette plasmaet for et elektrisk felt og en elektrisk spenning som bevirker erholdelsen fra plasmaet av en effluent med en anriket fraksjon som inneholder immunoglobuliner , utsetter effluenten for tilstrekkelig surgjøring eller alkalisering til å adskille antigen-antistoff-komplekser og derved frigjøre de tumorspesifike antistoffer, nøytralisere effluenten, og filtrere utfellinger fra den nøytraliserte effluenten.

9. Fremgangsmåte for å fremstille preparatet if.ølge krav 2,karakterisert vedå surgjøre gammaglobulin enten fra et normalt eller et turnorbærende serum, nøytralisere det surgjorte gammaglobulin, og filtrere utfellinger fra det nøytraliserte gammaglobulin.

10. Fremgangsmåte for å fremstille preparatet ifølge krav 3,karakterisert vedå isolere protein A-IgG komplekset enten fra turnorbærende eller normalt plasma etter perfusjon over immobilisert Staphylococcus aureus protein A ved utfelling over protein A-IgG komplekset fra plasmaet etter perfusjonen.

11. Fremgangsmåte for å fremstille preparatet ifølge krav 3,karakterisert vedå inkubere protein A med IgG.

12. Fremgangsmåte for å fremstille preparatet ifølge krav 3,karakterisert vedå inkubere protein A med IgG og isolere det erholdte protein A-IgG komplekset.

13. Fremgangsmåte for å fremstille preparatet ifølge krav 12,karakterisert vedat IgG-et har tumorspesifisitet.

14. Fremgangsmåte for å fremstille preparatet ifølge krav 6,karakteri~sert ved å inkubere serum fra enten en normal eller en turnorbærende vert i zymosan og deretter fjerne zymosanet.

15. Fremgangsmåte for å behandle en vert med kreft,karakterisert vedå administrere til verten en effektiv cancerbehandlende mengde av preparatet ifølge krav 1 og deretter, administere til verten en effektiv kreftbehandlet mengde av L-asparginase og et cytotoksisk middel etter en tidsperiode på ikke mindre enn ca. 2 4 timer fra administreringen av preparatet ifølge krav 1.

16. Fremgangsmåte for å behandle en vert med kreft,karakterisert vedå administrere til verten en effektiv kreftbehandlende mengde av preparatet ifølge krav 5 og zymosanaktigvert plasma på to etter hverandre følgende dager, og deretter, administrere en effektiv kreftbehandlende mengde L-asparginase og et cytotoksisk middel til verten etter en tidsperiode på ikke mindre enn ca. 24 timer fra administreringen av preparatet ifølge krav 5 og et zymosanaktivert plasma.

17. Fremgangsmåte for å behandle en vert med kreft,karakterisert vedå administrere til verten en effektiv kreftbehandlende mangde av preparatene ifølge kravene 2 og 5 på to etter hverandre følgende dager, og deretter administrere en effektiv kreftbehandlende mengde av L-asparginase og et cytotoksisk middel til verten etter en tidsperiode på ikke mindre enn ca. 24 timer fra administreringen av preparatene ifølge kravene 2 og 5.

18. Fremgangsmåte for å behandle en vert med kreft,karakterisert vedå administrere til verten en effektiv kreftbehandlende mengde av L-asparginase og et cytotoksisk middel etterfulgt av administrering til verten av en effektiv kreftbehandlende mengde av preparatet ifølge krav 5 og et zymosanaktiMert plasma og deretter administrere en effektiv kreftbehandlende mengde L-asparginase og et cytotoksisk middel til verten etter en tidsperiode på ikke mindre enn ca. 2 4 timer fra administreringen av - preparatet ifølge krav 5 og det zymosanaktiverte plasma.

19. Fremgangsmåte for å behandle en vert med kreft,karakterisert vedå administrere til verten en effektiv kreftbehandlende mengde av preparatet ifølge krav 3 og et zymosanaktivert plasma på to etter hverandre følgende dager, og deretter administrere til verten en effektiv kreftbehandlende mengde cyklofosfamid og adriamycin etter en tidsperiode på ikke mindre enn 24 timer fra administreringen av preparatet ifølge krav 3 og det zymosanaktiverte plasma.

20. Fremgangsmåte for å behandle en vert med kreft,karakterisert vedå administrere til verten en effektiv kreftbehandlende mengde av et zymosanaktivert plasma og komplekser av heterologt anti-tumor IgG pluss protein A på to etter hverandre følgende dager, og deretter administrere en effektiv kreftbehandlende mengde L-asparginase, cyklofosfamid eller adriamycin etter en periode på ikke mindre enn 24 timer fra administreringen av det zymosanaktiverte plasma.

21. Fremgangsmåte for å behandle en vert med kreft,karakterisert vedå administrere til verten en effektiv kreftbehandlende mengde av preparatet ifølge krav 3 pluss heterologt anti-tumor IgG på to etter hverandre følgende dager, og deretter administrere en effektiv kreftbehandlende mengde av L-asparginase og minst et cytotoksisk middel til verten ikke mindre enn 24 timer fra slik administrering.

22. Fremgangsmåte for å behandle en vert med kreft,karakterisert vedå administrere til verten en effektiv kreftbehandlende mengde av Staphyld-coccus aureus Cowans I protein A.

23. Fremgangsmåte for å behandle en vert med kreft,karakterisert vedå administrere til verten en effektiv kreftbehandlende mengde av minst et av preparatene ifølge kravene 1,2, 3,4 og 5, eller zymosanaktivert plasma, og deretter administrere til verten en effektiv kreftbehandlende mengde av minst et kjemoterapeutisk middel.

24. Fremgangsmåte for å behandle en vert med kreft,karakterisert vedå administere til verten en kombinasjon av en effektiv kreftbehandlende mengde av minst to av preparatene ifølge kravene 1,2,3,

4 og 5, eller et zymosanaktivert plasma.

25. Fremgangsmåte for å behandle en vert med kreft,karakterisert vedå administrere til verten en blanding av en effektiv kreftbehandlende mengde av minst to av preparatene ifølge kravene 1,2,3,4 og 5, eller et zymosanaktivert plasma, og deretter administere til verten en effektiv kreftbehandlende mengde av minst et kjemoterapeutisk middel.

26. Fremgangsmåte for å behandle en vert med kreft,karakterisert vedå administrere til verten en virksom kreftbehandlende mengde av plasma aktivert med zymosan i en virksom mengde for aktivering av vertens komplementsystem.

27. Fremgangsmåte for å behandle en vert med kreft,karakterisert vedå administrere til verten en virksom kreftbehandlende mengde av et preparat som bindes til Fc-reseptor av Fc-bærende leukosytter og derved forårsake frigivelse av minst et cytotoksisk materiale fra leukosyttene.

28. Fremgangsmåte for å behandle en vert med kreft,karakterisert vedå administrere en virksom kreftbehandlende mengde av minst et av preparatene valgt fra preparatene ifølge kravene 1,2,3,4, og 5, og Staphylococcus aureus protein A.