NO812233L - Nye peptider og anvendelse av peptider. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår anvendelsen av peptider med den generelle formel I

hvor R1 betegner His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-5 10 Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-,

15 20

og R 2 betegner'OH, peptidkjeden -Phe-Val-Gln-Trp-Leu eller

25 -Met-Asn-Thr eller en tilsvarende peptidkjede som er identisk med de to sistnevnte peptidkjeder, med det forbehold at én eller flere av aminosyrene .er utelatt, eller salter derav. Forbindelser med formel I oppviser interessante og overraskende farmakologiske egenskaper.

Det er kjent at glukagon, som er et polypeptidhormon bestående av 29 aminosyrer, oppviser flere farmakologiske virkninger. Anvendelse av glukagon for behandling av hypoglykemi skyldes forbindelsens metabolske virkning. Glukagon oppviser videre en spasmolytisk virkning på glatt muskulatur og en hemmende virkning på mavesyresekresjon. Det har nu overraskende vist seg at forbindelser med formel I kvantitativt oppviser samme spasmolytiske virkning og samme hemmende virkning på mavesyresekresjon som glukagon, selv om forbindelser med formel I ikke oppviser noen, eller bare en mindre, ubetydelig metabolsk virkning. Forbindelser med formel I kan således betraktes som overlegne i forhold til glukagon når det bare ønskes en spasmolytisk virkning eller inhibering av mavesyresekresjon.

Det har f.eks. vist seg at glukagon^_2^, glukagon^_2g og des (22-26)glukagon når det gjelder inhiberende virkning på amplityden av elektrisk stimulerte marsvin-ileum-kontraksjoner in vitro har omtrentlig samme aktivitet som glukagon. 10 M glukagon gir 83 4% (X ± sd, N = 3) inhibering sammenlignet med 78 5% for glukagon^_2• Virkningen av 10 er henholdsvis 50 3% og 52 5% og av 10~<7>M 27 t 3% for hvert peptid.

Glukagon^_2^ har dessuten omtrentlig samme aktivitet

som glukagon med hensyn til reduserende virkning på intestinal motilitet in vivo på kaniner. 100-200 \ xq glukagon og

77-154 ug glukagon^_2^ administrert intravenøst som bolus til bedøvede kaniner som veier 2,5-3,0 kg, gir en inhibering

av intestinal motilitet som begynner .1 minutt efter administreringen og som varer ca. 10 minutter.

De metabolske virkninger av glukagon^_2^, glukagon^_2g og des(22-26)glukagon er, som eksempelvis vist ved deres lipolytiske virkning in vitro på frie fettceller fra rotter og deres virkning in vitro på aktiveringen av adenylatcyclase, ubetydelige sammenlignet med glukagons metabolske virkninger. Det er ikke funnet metabolske virkninger efter administrering til rotter in vivo.

Det er vist at glukagon frigjør insulin fra isolert, perfusert rottepankreas, men glukagon^_2^har ikke en slik effekt når det tilføres i samme konsentrasjon som glukagonet. Glukagon1_21forårsaker dessuten ikke - i motsetning til glukagon - hyperglykemi eller frigjør insulin in vivo hos rotter.

I katter med kroniske mavefistler hemmer glukagon^_2^

så vel som glukagon pentagastrinstimulert mavesyresekresjon.

1 ug/kg -pentagastrin administrert subkutant til katter med

mavefistel fremkaller en øket mavesyresekresjon på 856 1 71 pEq (Eq betegner ekvivalent) syre (X S.E.M., N = 18). Når 2 ug/kg glukagon^_2^administreres subkutant samtidig med 1 ug/kg pentagastrin er økningen i syresekresjon bare 417 104 pEq syre (N = 6).

Glukagon"^_2^og glukagon er omtrent like kraftige

med hensyn til avslappende virkning på submaksimalt kontra-herte kanin-galleblære-preparater in vitro, og begge forbindelser gir øket gallestrøm hos rotter in vivo. Når en galleblærestrimmel kontraheres med 0,1Mg/ml cholecystokinin-oktapeptid, frembringer 10 — 6M glukagon 39% avslapning og 10 glukagon^_2^<4>1% avslapning. ED^-verdien er for begge

peptider 2,7 x 10~^M. Forbindelser med formel I kan derfor ha en potensiell anvendelse for behandling av galle- og,

på grunn av deres generelle spasmolytiske egenskaper - eventuelt urinveis-stens-pasienter. Når det gjelder denne anvendelse er den kjennsgjerning at forbindelsene med. formel I ikke har noen, eller bare har en mindre ubetydelig metabolsk effekt, en vesentlig fordel.

Forbindelser med formel I eller salter derav kan derfor anvendes som diagnostikum. Indikasjonene for anvendelse av forbindelser med formel I eller salter derav vil f.eks. være galle- og urinveissten, spasmer i fordøyelsessystemet og mavesår eller nærmere angitte undersøkelsesmetoder så som radiologi (røntgenundersøkelse), endoskopi (direkte iakt-tagelse av mave- og tarmområdet) og hysterosalpingograf1.

Forbindelser med formel I kan omdannes til farmasøytiske preparater og administreres, fortrinnsvis til mennesker, analogt med kjente metoder.

Forbindelser med formel I eller salter derav kan som diagnostikum anvendes analogt med anvendelsen av glukagon

for samme formål. Forbindelser med formel I eller salter derav kan administreres intravenøst, intramuskulært eller subkutant i doser i området fra ca. 1 til ca. 1000Mg/kg kroppsvekt, fortrinnsvis fra ca. 10 til ca. 100Mg/kg kroppsvekt, selv om lavere eller høyere doser kan administreres. Den nødvendige dose avhenger av pasientens tilstand og behandlingens varighet. Det kan anvendes en høyere dose til galle- og urinveisstens-pasienter og mavesårspasienter, og.i disse tilfeller kan det administreres flere doser av forbindelsene, f.eks. parenteralt (f.eks. som en kontinuerlig infusjon), nasalt eller rektalt.

Forbindelser med formel I kan eventuelt administreres

oralt, f.eks. ved anvendelse av spesielle tilsetninger.

For parenteral administrering oppløses forbindelser

med formel I i destillert vann, og pH-verdien innstilles på ca. 6-8. For å lette frysetørring og for å oppnå et egnet produkt kan laktose settes til oppløsningen. Oppløsningen sterilfUtreres og fylles i hetteglass. Oppløsningen fryse-tørres derefter, og hetteglassene lukkes under aseptiske betingelser.

For nasal administrering anvendes en oppløsning i en sprayboks til nasalt bruk eller en annen forstøvningsapparatur. Forbindelsene med formel I oppløses i destillert vann, og pH-verdien innstilles på ca. 6-8 ved tilsetning av natrium-fosfat og sitronsyre som buffer. For å oppnå en isotonisk oppløsning med en egnet viskositet tilsettes natriumklorid, sorbitol og glycerol. Oppløsningen administreres ved anvendelse av egnet forstøvningsapparatur eller en plast-sprayboks. Oppløsningen kan konserveres ved anvendelse av kjente konserveringsmidler, og det kan tilsettes kjente overflate-aktive stoffer.

For nasal administrering ved anvendelse av en aerosolsprayboks blandes peptidene med egnede bestanddeler, omfattende en blanding av halogenkarboner, dvs. monofluor-triklormetan, difluordiklormetan og tetrafluordikloretan, for å oppnå en blanding med et damptrykk som gir en klart bestemt, enkel dose når blandingen administreres ved hjelp av en aerosolsprayboks.

Nasalt administreres forbindelser med formel I fortrinnsvis i et doseområde mellom ca. 0,1 og ca. 100 ug/kg kroppsvekt, fortrinnsvis mellom 1 og 10 ug/kg kroppsvekt pr. enhetsdose. Denne dose kan administreres flere ganger pr. døgn.

Stikkpiller for rektal administrering fremstilles ved å blande forbindelser med formel I med en inaktiv bestanddel så som kakaosmør eller med en basis så som Polysorbat 85, propylenglykolmonostearat og hvit voks.

Forbindelser med formel I og salter derav kan fremstilles ved å anvende metoder som generelt er kjent innen peptid-syntese. Forbindelser med formel I kan - kort angitt - oppbygges fra et beskyttet glukagonfragment, f.eks. beskyttet glukagon^_^£., og et beskyttet peptid inneholdende de resterende aminosyrer i denønskede forbindelser med formel I. Fremstilling av beskyttet glukagon^_^,- er beskrevet i Res. Discl. 1979, 247. Peptider inneholdende flere enn aminosyrene 16-21 i glukagon kan bygges opp fra et beskyttet glukagonfragment, f.eks. beskyttet glukagon^g_2^ og et beskyttet peptid inneholdende de resterende aminosyrer. Anvendelse av egnede beskyttelsesgrupper og aktiveringer under peptidsyntésene er kjent for fagmannen. Det foretrekkes å anvende beskyttelsesgrupper som lett kan fjernes.

Glukagon1_21, glukagon-L_2g og des (22-26 ) glukagon kan således fremstilles ved å koble det beskyttede glukagonfragment:

med henholdsvis de beskyttede glukagonfragmenter: ved den blandede anhydrid-metode under anvendelse av isobutyl-klprformiat. Fra de på denne måte erholdte, fullt beskyttede peptider kan beskyttelsesgruppene fjernes under sure betingelser, f.eks. ved behandling med trifluoreddiksyre inneholdende 10% 1,2-etanditiol. De rå peptider kan renses ved ionebytterkromatografi, f.eks. QAE-Sephadex A-25, efterfulgt av avsalting, f.eks. gelfiltrering på Sephadex G-25. De rensede peptider kan isoleres ved frysetørring. De beskyttede glukagon-mellomproduktfragmenter IV og V kan fremstilles ved kobling av det beskyttede glukagonfragment: med henholdsvis de beskyttede glukagonfragmenter:

under anvendelse av den blandede anhydridmetode, hvorefter den N-terminale Bpoc-gruppen kan fjernes selektivt under milde, sure betingelser, f.eks. ved behandling med HC1 (0,2N) i metanol/N,N-dimetylformamid.

De beskyttede peptidfragme.ntene III, VI, VII og VIII kan fremstilles ved trinnvis forlengelse av kjeden under anvendelse av konvensjonelle metode så'som den aktive ester-metode eller blandede anhydridmetode for koblingen.

Peptider med formel I, hvor R 2betegner peptidkjeden

-Phe-Val-Gln-Trp-Leu eller -Met-Asn-Thr, i hvilken én eller 25

flere aminosyrer er utelatt, kan fremstilles på tilsvarende måte som beskrevet ovenfor, med den unntagelse at én eller flere av de aktuelle aminosyrer utelates i de beskyttede peptidfragmenter med formel VII og VIII.

En fremgangsmåte for fremstilling av glukagon^_2^er beskrevet i J. Biol. Chem. 247, 2133, nemlig fordøyelse av svine-, okse- eller fåreglukagon med karboksypeptidase A. Glukagon^_2g er kjent fra Metabolism _2_5, Suppl. 1, 1315.

En foretrukket undergruppe av forbindelser med formel I er forbindelser hvor aminosyresekvensen er identisk med en kontinuerlig del av aminosyresekvensen i glukagon. Som eksempler på spesifikke forbindelser innenfor denne klasse av forbindelser, kan angis forbindelser med formel I hvor R 2 er Phe, Val, Gin, Trp, Leu, Met, Asn eller Thr. En foretrukket forbindelse med formel I er glukagon^_2idet denne oppviser ekstra gode farmakologiske egenskaper og lett kan fremstilles, f.eks. fra natrulig glukagon.

Foreliggende oppfinnelse angår videre hittil

ukjente forbindelser med den generelle formel I<1>

1 2

hvor R har den ovenfor angitte betydning og R' har samme

betydning som R 2 , med de forbehold at R' 2 ikke betegner

-Phe-Val-Gln-Trp-Leu eller OH eller et salt derav.

25

Forbindelser med formel I' kan - kort angitt - fremstilles ved å behandle en forbindelse med den generelle formel IX

hvor R3 betegner Adoc-His (Adoc) -Ser (Bu1") -Gln-Gly-Thr (Bu*1) -

5 Phe-Thr (Bu1) -Ser (Bu1) -Asp (OBu1) -Tyr (Bu1) -Ser (Bu1) -Lys (Boe) - 10

Tyr( Bu1)-Leu-Asp(OBu1)-Ser(Bu1)-Arg(HX)-Arg(HX)-Ala-Gln-

15 20 Asp(OBu<1>)-,

R 4betegner peptiddelen -Phe-Val-Gln-Trp-Leu-,

25

fra hvilken én eller flere av aminosyrene er utelatt, peptiddelen -Met-Asn-ThrfBu<1>)- eller tilsvarende peptiddeler som er identiske med nevnte del, med det forbehold at én eller flere av aminosyrene er utelatt, og

X betegner klor eller brom, med en syre så som trifluoreddiksyre.

Som eksempler på salter av forbindelser .med formel I kan angis natrium-, kalium-, magnesium-, kalsium- og sinksalter

og syreaddisjonssalter med organiske eller uorganiske syrer så som maursyre, metansulfonsyre, saltsyre og svovelsyre. Fore-trukne salter av forbindelsene med formel I er fysiologisk og farmasøytisk godtagbare salter.

Foreliggende oppfinnelse angår også farmasøytiske preparater inneholdende en forbindelse med formel I eller et salt derav og ett eller flere farmasøytisk godtagbare bærestoffer, fortynningsmidler, fortrinnsvis vann, og/eller tilsetningsstoffer. Som eksempler på slike bærestoffer kan angis konvensjonelle konserveringsmidler, f.eks. p-hydroksy-benzoesyre-metylester og -propylester og natriumklorid.

Den her anvendte nomenklatur er i overensstemmelse med den som er angitt i J. Biol. Chem. 2 47 , 977 og Biochem. J. 104, 17. For korthets skyld er glukagon-(1-21)-heneikosapeptid her betegnet glukagon1_2-L , glukagon- (1-26 ) -heksakosapeptid er betegnet glukagon^^g og des-pentapeptid-(22-26)-glukagon er betegnet des(22-26)glukagon. Bpoc betegner 1-(bifenyl-4-yl)-1-metyletoksykarbonyl, Adoc betegner 1-adamantyloksykarbonyl, Bu<1>betegner tertiært b-utyl og Boe betegner tert-butyloksy-karbonyl.

Oppfinnelsen belyses nærmere ved følgende eksempler:

Eksempel 1

des (22-26)glukagon.

1 g Adoc-His(Adoc)-Ser(Bu<1>)-Gln-Gly-Thr(Bu<1>)-Phe-Thr(Bu1) - 5

Ser(Bu<1>)-Asp(OBu<1>)-Tyr(Bu<1>)-Ser(Bu<1>)-Lys(Boe)-Tyr(Bu<1>)-Leu-10

Asp(OBu<1>)-Ser(Bu<1>)-Arg(HBr)-Arg(HBr)-Ala-Gln-Asp(OBu<1>)-Met-15 20 Asn-Thr(Bu<1>)-OBu<1>oppløses i 25 ml trifluoreddiksyre inneholdende 10% 1,2-etanditiol, og reaksjonsblandingen får stå ved 15°C i 3 timer. 200 ml tetrahydrofuran tilsettes derefter langsomt, og bunnfallet isoleres, vaskes med tetrahydrofuran og tørres i vakuum. Det resulterende produkt kan renses ved ionebytterkromatografi på QAE-Sephadex A-25 og avsaltes ved gelfiltrering på Sephadex G-25.

Eksempel 2

Et preparat til parenteral administrering inneholdende

1 mg glukagon^_21pr. ml kan fremstilles på følgende måte:

1 g glukagon^_2^ og 99 g laktose oppløses i 1 liter destillert vann, og pH-verdien innstilles på 7,0. Opp-løsningen sterilfiltreres derefter. Den sterile oppløsning fylles i 10 ml hetteglass på en slik måte at hvert hetteglass inneholder 1,0 ml oppløsning. Oppløsningene frysetørres derefter, og hetteglassene lukkes under aseptiske betingelser.

Produktet i hetteglassene skal før administrering oppløses i 1,0 ml sterilt vann.

Eksempel 3

Et preparat for parenteral administrering inneholdende

10 mg glukagon^_2^ pr. ml kan fremstilles på følgende måte:

10 g glukagon^_2^og 90 g laktose oppløses i 1 liter destillert vann, og oppløsningen fremstilles på analog måte som beskrevet i eksempel 2.

Eksempel 4

Rektale stikkpiller fremstilles ved å blande 1 mg glukagon^_2^med 4 g kakaosmør.

Eksempel 5

En nasal plast-sprayboks kan fremstilles på følgende

måte:

0,5 g glukagon^_2^oppløses i ca. 95 ml 0,01M fosfatbuffer (pH 7,4) som er gjort isotonisk ved tilsetning av glycerol.- Oppløsningen konserveres ved tilsetning av 0,01% benzalkoniumklorid og 0,05% EDTA, hvorefter 0,5% polyoksy-sorbat tilsettes. Det tilsettes en isotonisk fosfatbuffer, slik at det resulterende volum blir 100 ml, og oppløsningen sterilfiltréres. 15 ml av denne oppløsning fylles i en plast-sprayboks som gir 0,5 mg glukagon^_2^når den aktiveres.

Forsøk A: Spasmolytisk virkning

En hannkanin som veier 2,56 kg bedøves med nembutal

efter å ha fastet natten over. Plasseringen til den ballongen som anvendes for måling av intestinal motilitet er 1 m fra pylorus i jejunum. Motiliteten registreres før og efter intravenøs administrering av 77 ug glukagon^_2^i 1 ml 0,9% saltvann inneholdende 0,1% humant serumalbumin. Den oppnådde virkning er nær atoni i tarmen. Virkningen begynner 1 minutt efter administrering og varer 11 minutter.

Forsøk B: Spasmolytisk virkning .

En hannkanin som veier 2,32 kg, behandles med følgende doser som beskrevet i eksempel A: 77tjg glukagon^_2^i l ml av den i forsøk A angitte oppløsning ga intravenøst ingen målbar spasmolytisk virkning.

154 ug glukagon^_2^i 1 ml av den i forsøk A angitte oppløsning hadde intravenøst tvilsom virkning. 308 ug glukagon^_2-|_ i 1 ml av ovennevnte oppløsning hadde en tydelig spasmolytisk virkning, idet den nesten medførte fullstendig atoni. Virkningen begynte 2 1/2 minutt efter administreringen og varte i 6 minutter.

Til sammenligning ble glukagon administrert til samme kanin. 200 ug glukagon hadde intravenøst ingen målbar virkning, men 400 \ iq glukagon ga imidlertid en tydelig virkning som var sammenlignbar med den virkning som 308 pg glukagon^_2^ga..

Forsøk C: Mavesyresekresjonshemmende virkning

I en hannkatt som veier ca. 4,5 kg, og som er forsynt

med en kronisk mavefistel, stimuleres mavesyresekresjonen med 4,5 ug pentagastrin ("Pentavlon") i et volum på 1 ml

.0,9% saltvann inneholdende 0,1% humant serumalbumin subkutant

i halsen. I 8 forsøk administreres 1 ml placebo (0,9% saltvann med 0,1% humant serumalbumin) subkutant gjennom en annen kanyle i halsen samtidig med administreringen av pentagastrin. I 2 forsøk administreres 9 Mg glukagon^_2^i 1 ml av ovennevnte oppløsning samtidig med administreringen av pentagastrin. Mavesyresekresjonen oppsamles med intervaller på 15 minutter

og titreres med 0,01N NaOH.. Økningen i syresekresjon efter administreringen av pentagastrin beregnes som pEq syre som er utskilt i løpet av 1 1/2 time efter administreringen, idet den opprinnelige syresekresjon før administrering av pentagastrin skal fratrekkes. Efter administreringen av 4,5 pg pentagastrin samt placebo varøkningen i mavesyresekresjon 729 1 89 \ iEq syre (X 1 S.E.M., N = 8). 4,5 ug pentagastrin samt 9 pg glukagon^^-^ga en økning i syresekresjon på 238 pEq i ett forsøk og 231 pEq i et annet forsøk.

Forsøk D: Virkning på gallegjennomstrømning

I kaniner med katetre i gall.egangen ga administrering av glukagon og glukagon^_2et fall i gallegjennomstrømningenøyeblikkelig efter administreringen, hvilket sannsynligvis avspeiler en senkning i galleblærens tonus. Denne senkning i gjennomstrømningen ble efterfulgt av en økning i galle-gjennomstrømningen til mengder som var større enn før administreringen, hvilket avspeiler en øket produksjon av galle.

En rex-kanin som veier 2,0 kg forsynes med kateter i-galletrakten under neumbutal-bedøvelse dagen før forsøket.

På forsøksdagen oppsamles gallen i perioder på 15 minutter.

De oppnådde resultater fremgår av følgende tabell:

Efter 45 minutters forløp administreres subkutant

200 pg glukagon i en ml 0,9% saltvann inneholdende 0,1% humant serumalbumin. Efter 120 minutters forløp administreres subkutant 154 Mg glukagon.^_2^ i en ml av ovennevnte oppløsning. Efter 195 minutters forløp administreres placeboet

(kfr. forsøk C).

Forsøk E: Akutt toksisitet

10 mg glukagon^_2^administrert intravenøst som bolus

til NMRI-mus som veier 20 g (dvs. en dose på 500 mg/kg kroppsvekt) hadde ingen skadelige virkninger. Det forekom ingen dødsfall.

Claims (5)

1. Anvendelse av forbindelser med den generelle formel I

hvor R1 betegner His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-5 10 Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-, 15 20 og R 2betegner OH, peptidkjeden -Phe-Val-Gln-Trp-Leu eller 25 -Met-Asn-Thr eller en tilsvarende peptidkjede som er identisk med de to sistnevnte peptidkjeder, med det forbehold at én eller flere av aminosyrene er utelatt, eller salter derav som diagnostikum.

2. Anvendelse ifølge krav 1,karakterisertved at R 2betegner en peptidkjede inneholdende aminosyrer i nøyaktig samme rekkefølge som finnes i en kontinuerlig del av glukagon.

3. Anvendelse ifølge krav 1 eller 2,karakterisert2 ved at R betegner Phe, Val, Gin, Trp, Leu, Met, Asn eller Thr.

4. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat R 2 betegner OH, -Phe-Val-Gln-Trp-Leu eller -Met-Asn-Thr. 25

5. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1, 2 eller 4,karakterisert vedat R 2 betegner OH.