NO810423L - Fremgangsmaate ved bestemmelse av carcinoembryonalt antigen - Google Patents

Description

Bestemmelsen av karcinoembrycmisk antigen (i.det-følgende I kalt CEA) er velkjent. Det er likeledes velkjent at visse IikI ke-spesifikke interfererende substanser, som er tilstede j! !i'prøven som skal undersøkes, i stor grad må fjernes eller j

nøytraliseres for at en nøyaktig og ømfindtlig bestemmelse<\>kan gjennomføres. i ' 1I

l

<En .rekke fremgangsmåter er kjent hvorved mulige interferer-ehde substanser som er tilstede i prøven av den biologiske væske, f.eks. i serum- eller plasmaprøven, kan fjernes eller nøytraliseres før bestemmelsen av CEA. Det betyr selvfølgelig m.h.t. tid, kostnader og enkelhet ved gjennomføring av prøven at det er en fordel å forenkle de nødvendige operasjon-er for fjerning av slike interfererende substanser i en gitt prøve.

i

Ved bestemmelse av CEA ifølge Freedman et al (US-pat. nr. 3,663,684) behandles blodprøven først med et glycoprotéin- j løsningsmiddel hvori CEA er løselig, hvorpå den resulterende, løsning klares. Eksempler på slike løsningsmidler omfatter i perklorsyre, trikloreddiksyre, fosforwolframsyre o.l. : Behandlingen av blodprøven med glycoprotein-løsningsmidlet skjer i den hensikt å fjerne fellbare normalproteiner og.de interfererende antigenmaterialer. Gjennom etterfølgende sentrifugering av prøven fjernes de utfelte interfererende proteiner.

Først nylig har Hirai, Cancer Research 37,2267-2274, Juli 1977, og Kim et al, Clinical Chemistry 25, No. 5, 773-776, 1979, beskrevet en prøve for forbehandlingsmetode ved hvilken prøven underkastes en varmebehandling istedet for ekstraksjon med et glycoprotein-løsningsmiddel, så som perklorsyre.

Den sistnevnte publikasjon beskriver en prøvebehandling,,

i hvor den interfererende substans fjernes gjennom puffing av prøven til en pH på 4,tf- 5,o med acetatpuffer og oppvarming av prøven i ca. 10-20 min. ved omtrent 70-80°C. j :Denne varmebehandlingen-bevirker i nærvær av en puffer j li S<1>

med høy ionestyrke og ved sur pH varmedenaturering av de' interfererende proteiner som koagulerer. Det er derfor nød-vendig at prøven for fjerning av det koagulerte materiale sentrifugeres. Denne fremgangsmåte er forsåvidt ufordelaktig,

i idet tilstedeværende CEA i prøven kan holdes tilbake i det ! koagulerte materialet og derved fjernes fra prøven som'skal undersøkes, hvorved nøyaktigheten av den etterfølgende, bestemmelse påvirkes. j

Ifølge foreliggende oppfinnelse har man funnet en fremgangs-; måte for forbehandling av en humanserum- eller plasmaprøve j for etterfølgende bestemmelse av CEA, hvilken er raskere, enklere og mindre komplisert enn de tidligere kjente prepara-tive metoder og som har den ytterligere fordel at prøvenjikke må sentrifugeres.

Ifølge foreliggende oppfinnelse beskrives en fremgangsmåte for forbehandling av prøver fra humanserum eller plasma for bestemmelse av karcinoembryonisk antigen (CEA), som er rask, bekvem og mindre komplisert enn de metoder som tidligere er anvendt. Metoden ifølge foreliggende oppfinnelse består i at man fortynner prøven med vann og oppvarmer til en temperatur som ligger under den hvorved ionestyrken og prøvens pH ville koagulere de tilstedeværende proteiner, dvs. en temperatur på ca. 85 - 105°C, fortrinnsvis ca. 95°C. Oppvarming av prøven skjer i en relativt kort tid.

Ved varmetrinn ifølge foreliggende oppfinnelse oppvarmes serum- eller plasma-prøven fra en pasient som skal undersøkes i ca. 3-30 min., fortrinnsvis i ca. 5-10 min. Varigheten hvorunder prøven holdes på den ovennevnte temperatur er ikke særlig kritisk. Det er bare nødvendig at prøven oppvarmes j til den ovenfor nevnte temperatur og fortrinnsvis holdes; ved denne temperatur en kort tid, f.eks. i 5 - 10 min. Av denne grunn er varigheten av oppvarmingen bare angitt

illustrerende, det er bare nødvendig at prøven oppvarmes.tiT ;den ønskede temperatur erg holdes en kort tid ved denne temperatur for å sikre at hele prøven har nådd den ønskede..

temperatur. Ifølge foreliggende oppfinnelse må - som tid-. ligere nevnt - prøven oppvarmes til en temperatur som liggerj ! under den ved hvilken ikke noen proteiner koagulerer ved! laV| 'ionestyrke og nøytral til lett alkalisk pH. I

Fortynningen av prøven med vann er nødvendig for å holde;ionestyrken i prøven lav, dvs. maksimalt ved en ionestyrke på 1/8 av den normale fysiologiske ionestyrke. Selvom springvann k<*>an anvendes i fortynningstrinnet, foretrekkes destillert eller ionefritt vann. Normalt anvendes en fortynning på ca. 1:8 til 1:50, idet en foretrukket fortynning er 1:16. Den j således fortynnete prøve har en lav ionestyrke og en nøy-tral eller lett alkalisk pH, dvs. en pH på ca. 7 - ca. 9. Det ble funnet at ved ovenfor nevnte fortynningsområde er det normalt ikke nødvendig å fortynne prøven med puffer-! holdig vann. For optimalisering avømfindtligheten i den'etterfølgende bestemmelse kan det likevel være fordelaktig å tilsette vannet som benyttes for fortynningen en . puffer ' for å sikre at pH holdes på et svakt alkalisk nivå. Så fremt en puffer anvendes ved fortynningen av prøven, er vanlig alkaliske puffere, så som f.eks. en tris(hydroxymetyl)amino-' metanpuffer egnet. Det må anvendes en tilstrekkelig del puf-;fer til å sikre at prøvens pH er svakt alkalisk, dvs. ligger i et pH-område fra ca. 7,5 - ca. 9,0.

I tillegg til den nevnte fordel at prøven i motsetning til de vanlige varmebehandlinger ikke må sentrifugeres, viser forbehandlingsmetoden ifølge oppfinnelsen den videre fordel at den etterfølgende bestemmelse med mindre mengder av prøve,, dvs. omtrent 100 pl, kan gjennomføres, hvilket er mindre■enn de som tidligere ble ansett som praktiske. Såldes anvendes f.eks. ved nåværende vanlig radioimmunologisk metode for CEA en 0,5 ml prøve. Reduksjonen av prøvevolumet for bestemmelsen av CEA i sammenligning med de kjente bestemmelsesmetoder fører ikke til noe betydelig tap i ømfindtligheten til bestemmelsen. De betydelige innsparinger m.h.t. om-kostninger som oppnås gjennom anvendelsen av forbehandlingsmetoden ifølge oppfinnelsen muliggjør en CEA-bestemmelse r, i relativt stor målestokk, f.eks. for masseundersøkelser. i En fullstendig CEA-bestemmelse under anvendelse av forbehandlingsmetoden ifølge oppfinnelsen kan utføres på ca. 4 timer. Dette betyr en betydelig forbedring i sammenligning med de vanlige CEA bestemmelsesmetoder, ved hvilke en dialyse anvendes som må utføres natten over. CEA bestemmelsen under ! anvendelse av forbehandlingsmetoden ifølge foreliggende opp-, finnelse gir ytterligere et betydelig fremskritt m.h.t. opp-j finnelsesområdet til bestemmelsen overfor de kjente bestem- | melsesmetoder, hvilket skal omtales senere.

i Forbehandlingsmetoden ifølge foreliggende oppfinnelse om-.fatter i det vesentlige fortynningen av plasma- eller serum-, prøve til en fortynning fra ca. 1:8 til ca. 1:50, fortrinns-! vis ca. 1:16, og oppvarming av den fortynnede prøven til:en temperatur som ligger under den ved hvilken proteinene i] prøven koagulerer, dvs. til en temperatur på ca. 85 - ca.

105°C, fortrinnsvis 95°C. Det nøyaktige prinsipp ifølge hvilke ved denne metode innflytelsen til de interfererende proteiner i prøven oppheves, hvilke hittil måtte fjernesj fysikalsk, er ikke klart.

Prøven som forbehandles ifølge foreliggende oppfinnelse lar

. • ' ■ I

man deretter avkjøle til romtemperatur, hvorpå man utfører j en egnet bestemmelsesmetode for CEA. Valget av en bestemt type immunomåling for CEA som så skal anvendes, er ikke kritisk.tGenerelt foretrekkes en radioimmun- eller en enzymimmun-fremgangsmåte, idet en radioimmun-metode er særlig foretrukket.

Generelt omfatter en bestemmelse av CEA de følgende skritt: a) Forbehandling av serum eller plasma-prøven fra en pasient, så som forut beskrevet, for å nøytralisere de muligens interfererende materialer; i b) Tilsetning av et overskudd av CEA-antistoffer til prøven som skal undersøkes og inkubering i en forutbestemt tid? j i c) Tilsetning av markert CEA til prøven og inkubering i en forut bestemt tid*, ! i d) Tilsetning av et insolubiliseringsmiddel til blandingen av b) og c) under dannelse av en fastfase som inneholder! j ahtistoff-bundet CEA og en flytende fase som inneholder ; i ubundet CEA<*>e) Adskillelse av de faste og flytende faser;

1 l

f) Bestemmelse av andelen av markeringsmiddel enten i den i faste eller den flytende fase<*>og

.i

g) Bestemmelse av innholdet av CEA i prøven gjennom sammenligning med en standard. i

i

i Ved den ovenfor nevnte bestemmelsesmetode anvendes begrepet ' "nøytralisering" av muligens interferende materialer. Begrepet "nøytraliserende" refererer både til prøvef orbehandlingen ifølge oppfinnelsen og de tidligere kjente metoder ved hvilke de interfererende materialer kan fraskilles fysikalsk, da den ønskede effekt jo i begge tilfeller er den samme. I prinsippet betyr altså begrepet "nøytralisering" at de interfererende

materialer fjernes.

Som tidligere nevnt kan markeringsmidler som anvendes for ! markering av CEA i foran nevnte bestemmelse være ethvert immunologisk fordragelig markeringsmiddel, hvilket tillater en kvantitativ bestemmelse så som f.eks. en radioisotop, et ensym, et fluoressens eller en kjemiluminessens e.l.

Enzym- og radioisotop-markeringsmidler er foretrukket, hvorunder sistnevnte er særlig foretrukket.

i

I i

Blant radioisotopene som normalt anvendes ved radioimmun-.metoder, er isotopene av jod foretrukket, idet jod-125 er særlig foretrukket. •

i t

Insolubiliseringsmidlet som anvendes for å danne en fast;fase

i' som inneholder antigenbundet CEA og en flytende fase som|inneholder ubundet CEA kan være ethvert materiale som er kjent for dette formål. Således f. eks. kan visse alifatiske alko--holer, ionebyttere, harpikser og uorganiske salter samt også'antistoffer som er rettet mot CEA-antistoffer bevirke dannelse av en proteinfelling som inneholder antigenbundet CEA. Et foretrukket insolubiliseringsmiddel er et andre antistoff, dvs. et antistoff som er rettet mot CEA-antistoffene i immobilisert form, dvs. i insolubilisert form.

Under hensyn til den forannevnte immobilisering av det andre antistoffet kan enhver kjent teknikk for insolubilisering av en immunologisk komponent så som f.eks. partikler av forskjel-lig størrelse, -småkuler, staver eller strimler av et bære-materiale anvendes. Såfremt en '-polymer anvendes som insolu-biliseringsmateriale, f.eks. en styrenpolymer eller kopolymer,

i kan - avhengig av polymerens individuelle egenskaper - mer ;

enn en av de ovenfor nevnte former anvendes. Et særlig foretrukket materiale for immobilisering av det andre antistoffet er ikke-sintret poly(vinylidenfluorid) som f.eks. kan anvendes i form av fine partikler eller som film. Antistoffet kan være bundet til det immobiliserbare materiale eller kan bindes etter konvensjonelle metoder til dette

De spesielle forhold, inkubasjonstider og temperaturer, som må taes hensyn til for en gitt CEA-bestemmelse må ansees for alminnelig kjente i lys av de tallrike publikasjoner ved-rørende CEA. Men hensyn til bestemmelsen av CEA i en radioimmunologisk fremgangsmåte under anvendelse av den nye for- • behandlingsmetode ifølge foreliggende oppfinnelse, har. man funnet at det i sammenligning med kommersielle CEA-bestem-meiser er mulig uten tilsvarende tap av ømfindtlighet, å i i

i anvende betydelig mindre volumer av reagenser<p>g prøver. ] Dette muliggjør anvendelsen av mindre reagensrør, avlesnings-enheter o.l. Ved anvendelse av prøveforbehandlingen ifølge foreliggende oppfinnelse består en videre fordel i at omtrent en femgangers reduksjon av andelen av CEA-antistoffer ' kan foretas. Dette betyr i sammenligning med den kommersielle CEA-radioimmunologiske fremgangsmåte at antiserunu-til > I ii CEA behøver å standardiseres sjeldnere, hvilket betyr vesentlige innsparinger mht. til tid og arbeid. CEA-bestemmelsen" etter forbehandling av prøven ifølge foreliggende oppfinnel-j se viser en videre fordel overfor de vanlige kommersielle CEA-radioimmunologiske metoder, idet de sistnevnte bare er nøyaktige ned til omtrent 20 ng/ml CEA. Ved kjemoterapi-j ' overvåkning og bestemmelse av høyere andeler av CEA er det nødvendig å anvende en annen type bestemmelse, dvs. en direkte bestemmelse for overvåkning av slike høyere andeler. Denne sistnevnte typen av bestemmelsesmetode kan anvendes for nøy-aktige CEA-konsentrasjoner, som begynner ved et minimum på ca. 4 0 ng/ml, hvilket betyr at mellom denne typen bestemmelsesmetode og den kommersielle radioimmunologiske metode for ;

CEA blir et rom på omtrent 20 ng/ml åpent. Bestemmelsen av' CEA etter forbehandlingen av prøven ifølge foreliggende opp-, finnelse tillater en nøyaktig avlesning av CEA inntil konsentrasjoner på ca. 100 ng/ml, hvilket betyr at det ovennevnte rom utfylles. Videre betyr det en vesentlig innsparing mht. tid og penger for pasienten, da det ikke er nødvendig å utføre en andre bestemmelse for å måle CEA-konsentrasjoner som ligger vesentlig over 20 ng/ml.

Innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse ble det funnet at bare 0,1 ml av prøven som skulle undersøkes må anvendes ved gjennomføringen av bestemmelsen og at omtrent£ul CEA-antiserum må settes til prøve og til standard. Foretrukne reak-sjonstider for reaksjonen med antiserumet og den etterfølg-ende reaksjon med det markerte CEA er fra omtrent 80 min. til 2 timer, idet 90 min. er særlig foretrukket. Denne inku-basjon utføres ved..en te-mperatur på ca. 45°C. Ved anvendelse, av et enzym som markeringsmiddel, må eventuelt inkubasjons- tiden og den spesielle temperatur tilpasses for å unngå en inaktivering av enzymet såfremt enzymet er labilt ved de ovenfor angitte temperaturer. Ved anvendelse av et immobili- i sert andre antistoff som insolubiliseringsmiddel inkuberes j prøvene fortrinnsvis ved romtemperatur i ca. 15 - 30 min., 1 fortrinnsvis i ca. 20 min. Bestemmelsen av CEA i prøven ut-føres på vanlig måte ved sammenligning med en standardkurve. j Avlesningen av konsentrasjonen av markeringsmiddel utføres avhengig av typen av markeringsmiddel, likeledes etter kjente metoder, f.eks. under anvendelse av et gamma-sintillasjons- j spektrometer, når et radionuklid- markeringsmiddel anvendes.. i i De etterfølgende eksempler illustrerer oppfinnelsen videre. J Såfremt ikke annet er angitt, er alle temperaturer gitt i!

°C<1><\>Cm.

EKSEMPLER i

1. Den komm ersielle bestemmej.se for CEA utføres som følger: Plasmaprøver (0,5 ml; i dublett) av pasienter som man tror<1>har kolonkarzinom ekstraheres med 2,5 ml kald 1,2 molarer j pr. klorsyre ved blanding i en mixer av Vortextype i SO I

i I sek. og sentrifugeres så 20 min. ved 1000 x g. Utkommet j samles og plasseres i en dialyseslange og dialyseres så mot !

io.hefr.itt vann, idet vannet skiftes 3 ganger og man venter minst 3 timer mellom hvert skifte. En sluttdialyse utføres under anvendelse av en ammoniumacetatpuffer med pH ca. 6,5. Etter dialysen plasseres innholdet fra dialyseslangen i prøve-røret, hvoretter 25 ul kommersielt tilgjengelig CEA-anti- j serum tilsettes under blanding med en Vortexmikser. Rørene ! inkuberes 30 min. ved 45°. Til hvert rør settes under blanding 25 ul<125>J-CEA, hvorpå rørene igjen inkuberes 30 min. ved 45°. 2,5 ml Zirkonylfosfatgel (pH 6,25) settes til hvert rør, hvorpå man sentrifugerer 5 min. ved 1000 x g. Etter fjerning^

i av supernantantene settes 5 ml. ammoniumacetatpuffer med pH 6,25 under blanding til hvert rør. Rørene sentrifugeres på nytt som ovenfor beskrevet, og supernantantene fjernes.<1>

125

Andelen av J-CEA i gjenværende gel bestemmes i 1 .min. ved telling i et gamma-sintillasjons-spektrometer.

En standardinhiberingskurve fremstilles som følger:

Til par av prøverør settes 5,0 ml av en 1:10 fortynner av EDTA-puffer (pH 6,5) med ionefritt vann. I hvert rør plasseres en CEA-standarddose, dvs. 0,10,25,50 og 100 yil tilsvarende 0, 1,25, 3,125, 6,25 og 12,5 ng/ml CEA-aktivitet, og rørinn-holdene blandes med en mikser av Vortextypen. Rørene behand- ; les så som ovenfor angitt med antiserum til CEA og 1- 25J-CEA. Man avleser og oppstiller en kurve, som tjener til sammenligning for resultatene som erholdes med pasientplasmaer.

I 1 Eksempel 2 j

En bestemmelse av CEA under anvendelse av forbehandling av prøven ifølge foreliggende oppfinnelse utføres som følger: j

Plasmaprøver (0,1 ml) fortynnes med 1,5 ml. ionefritt vann og blandes i en mikser av Vortextypen. Rørene stilles 10 min. i et vannbad på 95°, hvoretter man fjerner dem fra vannbadet og lar dem avkjøle til romtemperatur. Under røring med en Vor- j texmikser tilsettes hvert rør 5 yl kommersielt CEA-antiserum. Rørene inkuberes 90 min. ved 45°. Under1 blanding tilsettes

125 ' hvert rør 2 5 pl J-CEA, hvoretter rørene igjen inkuberes 90 min. ved 45°. Til hvert rør settes 500 pl av en vandig suspensjon av et antistoff mot CEA-antiserumet, hvilket ble insolubilisert ved absorpsjon på partikler av poly(vinyliden-fluorid). Rørene blandes igjen og inkuberes 20 min. ved rom-' temperatur. Rørene sentrifugeres så 10. min.ved'1000 x g. Supernantantene dekanteres, hvoretter radioaktiviteten til rørene bestemmes i et gammazintillasjons-spektrometer.

i

En standardinhiberingskurve oppstilles som følger.:

i

Til par av prøverør settes 0,1 ml rekonstituert, lyofilisert, humant plasma, som ble fortynnet med 1,5 ml ionefritt vann. Innholdet i rørene røres med en Vortextypemikser og inkuberes så 10 min. ved 95°. Til hvert par rør settes en CEA-standarddose, dvs. 0, 5, 10, 25, 50 og 100 pl, tilsvarende 0, 0,625, 1,25, 3,125 , 6,25 og 12,5 ng/ml CEA-aktivitet, hvorpå man blander med en mikser av Vortextypen. Rørene behandles som

125

ovenfor angitt med antiserum til CEA, J-CEA og insolubili-serte andre antistoffer. Etter avlesning oppstilles en kurve som tjener til sammenligning av resultatene, hvilke erholdtes med plasmaprøver fra pasienter.

I tabell I sammenlignes resultatene for de prøver som erholdtes ifølge den vanlige dialysemetode ifølge eksempel 1, med de resultater som erholdtes-med- metoden ifølge foreliggende oppfinnelse etter eksempel 2. i<!> Resultatene i tabell 1 viser klart at i konsentrasjoner inntil 20 ng/ml korrelerer metodene fra eksempel 1 og 2 godt med hverandre (korrelasjonskoeffisient tilsvarer 0,963; stigning (slope) tilsvarer 1,03).

Eksempel 3

Ved prøver som ble bestemt ifølge fremgangsmåten i eksempel j I og hvilke viste det resultat at CEA-konsentrasjonen i 1 j prøven ligger over 2 0 ng/ml, ble den kommersielle fremgangs måte for bestemmelse av slike konsentrasjoner utført som > i følger:<;>

Plasmaprøver (5.0 ul) settes til prøverør som inneholder 5 ml;, ammoniumacetatpuffer (0,01M acetat) med pH 6,8. ■ Til hver -ij rør settes 25 ul CEA-antiserum, hvoretter man blander med en mikser av Vortextypen. Rørene inkuberes ved 4 5° i 30 min. Til hvert rør .settes så 25 ul<125>J-CEA, hvorpå rørene igjen, inkuberes 3 0 min ved 4 5°.' 2,5 ml sirkonylfosfatgel med pH 6/2 5 settes til hvert rør, hvoretter rørene sentrifugeres 5 min. ved 1000 x g. Etter fjerning av supernantantene tilsetter, man under blanding 5 ml ammoniumacetatpuffer med pH 6,25. Rørene sentrifugeres igjen som forut beskrevet og: super-125 . ; nahtantene fjernes. Andelen av bundet J-CEA i gjenværende gel bestemmes gjennom telling med et gamma-sintillasjons-spectrometér i 1 min.

En standardinhiberingskurve^ opps.tilles som følger: Til hvert par av forsøksrør settes 5,0 ml av en 0,01M acetatpuffer med pH 6,8.VTil hvert rør settes 50 ul normalt humant

t

plasma, hvorpå man blander -grundig., Til hvert par rør settes en CEA-standarddose, dvs, 0, 10, 25, 50 og 100 pl tilsvarende ;6 1, 25 , 3,125, 6,25 og 12,5 ng/ml CEA-^aktivitet, hvorpå man. blander med mikser av Vortextypen> Rørene behandles deretter som ovenfor beskrevet med antiserum til CEA og<12><5>J-CEA., Etter avlesning oppstilles en kurve som tjener til sammenligning av resultatene som erholdtes med pasientplasmaer.

s

De samme prøver analyseres tilsvarende fremgangsmåten i foreliggende oppfinnelse, dvs. ifølge eksempel 2. En sammenligning av de erholdte resultater vises i tabell II.

De resultater som erholdes i tabell II viser at man etter i forbehandlingen av prøvene ifølge foreliggende oppfinnelse ,kan måle konsentrasjoner av CEA over 20 ng/ml nøyaktig.I

Gjennomførte forsøk ved hvilke prøver som ble bestemt i dette eksemplet ble fortynnet til en konsentrasjon under 20 ng/ml ' ,CEA og bestemmelse av CEA konsentrasjonen til disse fortynnede prøver ifølge metoden til eksempel 1, har vist at metod-■ - ■ i en ifølge foreliggende oppfinnelse tillater en nøyaktigere bestemmelse av høyere CEA-konsentrasjoner enn den kommersielt tilgjengelige fremgangsmåten.

i 1 i

Claims (5)

1. I 1. Fremgangsmåte ved forbehandling av en human serum-eller plasmaprøve, hvilke skal anvendes for bestemmelse av konsentrasjon av carcinoembryonisk antigen, k a r a k tie r|-iisertved at man tilsetter prøven tilstrekkelig! vann for en fortynning fra ca. 1:8 til 1:50, oppvarmer den \ fortynnede prøve i ca. 3-3 0 min. ved en temperatur som lig- J

   l ger under den' hvorved proteinene i prøven ville koagulere, j hvorved materialene i prøven som ville interferere med den nevnte bestemmelsesmetode nøytraliseres.
2. 2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakteri-j sert ved at man bringer prøven til en fortynning jpa j ca. 1:16. j<1>
3. 3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat den fortynnede prøven oppvarmes i et tidsrom fra ca. 5-10 min. i i;
4. 4. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1-3, ;karakterisert vedat den fortynnede prøven oppvarmes til en temperatur mellom ca. 85 og 105°C.
5. 5. Fremgangsmåte ifølge krav 4,karakterisert vedat prøven oppvarmes til en temperatur på ca. 95c>6. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1-5, ikarakterisert vedat vannet som anvendes for fortynning av prøven inneholder en tilstrekkelig mengde av en egnet puffer til å pufre prøven til en pH fra ca. 7,5 , -■9. i