NO814410L - Fremgangsmaate for fremstilling av lipid-membranstrukturer - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av vesikler/liposomer hvori en oppløsning inneholdende lipider, amfifiler og andre lipofile materialer som er istand til å danne vesikler, i et løsningsmiddelsystem dispergeres i en vandig oppløsning

og deretter..i det minste en del av dette løsningsmiddel-system strippes av, og det særegne ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er at løsningsmiddelsystemet omfatter i det minste to organiske komponenter, S, og S2, hvori:

(a) S er meget oppløselig i den vandige løsning,

(b) S2er hydrofob

(c) S2er mer flyktig enn den vandige oppløsning

(d) De lipofile materialer er ikke fullstendig opp^.

løselige i S2alene

(e) Blandingen av S, og S2danner en grenseflate

overfor den vandige oppløsning og,

f

(f) De lipofile materialer kan oppløses i en blanding av S, og S.^.

Disse og andre trekk .ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen fremgår av patentkravene.

Oppfinnelsen vedrører således en fremgangsmåte for frem:^. stilling av lipide membranstrukturer (dvs. vesikler, blærer) eller liposomer, i det følgende: enkelt benevnt "vesikler".

Vesikler er mikroskopiske kuler med en maksimal diameter

av størrelsesorden omtrent 10 000 Å og foretrukket med en diameter mellom omtrent 300 og omtrent 2000 Å, avgrenset av en vegg dannet av et eller flere bimolekylære lag av en forbindelse inneholdende en hydrofil polar gruppe og en

hydrofob ikke-polar gruppe. Vesiklene inneholder en vandig væske, f.eks. en vandig oppløsning av en biologisk-aktiv substans og eksisterer generelt i en kolloidal dispersjon i et vandig medium, f.eks. en saltoppløsning. Vesikler utgjør en metode for innkapsling av vandige væsker og er spesielt nyttige for tilførsel av biologisk-aktive substanser til levende organismer, mens destruksjon eller de-aktivering av disse substanser unngås, f.eks. i blod-strømmen, før substansene ankommer til stedet for deres biologiske aktivitet i kroppen. Således har EDTA vært innkapslet i vesikler og injisert som behandling for tungmetallforgiftning,se Rahman, et al, J. Lab. Clin. Med., 83 (49, 640-647 (1974) og US-patentskrift 3.932.657. Liposomer inneholdende insulin har vært foreslått for oral tilførsel, se Patel, et al., FEBS Letters, 62, 1, 60-63 (1976) og Syd-Afrikansk Patentskrift 73/1850. Aktinomycin er blitt innkapsler i liposomer og anvendt ved kreft/kjemiterapi, se Proceedings of The Society for Experimental Biology and Medicine, 146, 1173-1176 (1974) . Vesikler med målsetning til leveren, ved bruk av digalaktocyl-diglyseridenheter, inneholdende farmasøytiske midler som insulin eller interferon er også foreslått i US-patentansøkning nr. 75.310 i navnet Geho, inngitt 13. september 1979. The New England Journal of Medicine, 23 September 1976, sidene 704 til 710 og 30 september 1976, sidene 756-770, inneholder en utførlig rapport om liposomer, deres-anvendelse ved.tilførsel av medisiner,

og inkluderer forskjellige henvisninger til de typer av farmasøytiske midler som er blitt innkapslet i liposomer.

Det kjennes innen teknikken minst 3.,typer av prosesser for fremstilling av vesikler, nemlig ved injeksjon, ultralyd, og dialyse. Hver metode har vesentligeoulemper med hensyn til fremstilling av godt avgrensede vesikler med styrte fysikalske/kjemikalske egenskaper og/eller med hensyn til oppskallering for fremstilling av kommersielle mengder av vesiklene. Ved ultralyd-prosessen oppløses lipidmaterialet i en organisk fase og den organiske fase fjernes deretter-under dannelse av en tynn lipidfilm,

den vandige fase tilsettes dertil og endelig utsettes

systemet for ultra-sonisk energi, se Huang, Biochemistry, 8,344 (1969) og Europeisk Patentansøkning 79200542.3

med publikasjonsnummer 0009842 publisert 16. april 1980. Disse prosesser er vanskelige å._reprodusere, krever til-førsel av høy .energi til vesikkél-systemet, og gir vesikler med vide variasjoner i deres fysikalske egenskaper, f.eks. størrelse og innesluttet volum. Når vesikler fremstilles som en doseform for farmasøytiske preparater kan slike faktorer klart ha kritisk betydning. Ved dialyseprosessen oppløses lipidmaterialer i en detergentsubstans, f.eks. natriumcholat, og vesikler dannes når detergent-substansen fjernes ved dialyse., Bare en begrenset klasse av detergentsubstanser, dvs. cholatsalter er brukbare ved dialyseprosessen og disse detergentsubstanser er meget vanskelige å fjerne fullstendig fra sluttproduktet. Prosessen er videre langsom og dårlig egnet for kommersiell oppskallering, se Rhoden og Goldin, Biochemistry, 81,

4173 (1979). I injeksjonsprosessen injiseres lipidmaterialet i en organisk fase gjennom en hul nål inn i en vandig fase, se Batzri et al., Biochemica et Biophysica Acta, 298, 1015-1019 (1973), Deamer, et al, Biochemica, Biophysica Acta, 443, 629-654 (1976) og Kremer, et al, Biochemistry, 16, 3932-3935 (1977). Disse prosesser

er meget vanskelige å pppskalérea kommersielt og krever videre forholdsvis strenge reaksjonsbetingelser med sterk omrøring og høy temperatur, noe som kan være skadelig for det farmasøytisk aktive material som innkapsles.

Fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse er en modifisert injeksjonsprosess og tillater fremstilling av vesikler mens den tilveiebringer en lang rekke fordeler i forhold til de tidligere kjente prosesser, og mer spesifikt: (a) Vesiklene fremstilles under milde betingelser,

dvs. under overgangstemperåturen for lipid-materialene og uten av det er nødvendig med

-Sterk omrøring,

(b) Vesikler oppnås som innesperrer den vandige fase effektivt og opprettholder deres innhold effektivt, (c) Det oppnås vesikkeldispersjoner med god

kolloidal stabilitet,

(d) Det oppnås vesikler med lett-reproduserte

fysikalske egenskaper, og

(e) Fremgangsmåten for fremstilling av vesiklene er kontinuerlig og kan lett oppskalleres

til kommersielt nivå.

(

Det er følgelig et formål for den foreliggende oppfinnelse

å tilveiebringe en effektiv prosess med de nevnte fordeler, for fremstilling av vesikler, spesielt vesikler inneholdende farmasøytisk^aktive materialer.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen begynner med fremstilling av polare lipider og/eller amfifiler, istand til å danne vesikler, i et spesifikt definert løsningsmiddel-system. De mest foretrukne lipider for bruk i den foreliggende oppfinnelse inkluderer di-stearoyl^lecitin, di-palmitoyl-lecitin eller blandinger av disse materialer. Naturlig lecitin (fosfatidyl-cholin: vitellin), omfatter

en blanding*av di-glyceridene av fettsyrer (f.eks. stearin-syre. palmitinsyre, myristinsyre, linolsyre og oljesyre) knyttet til cholinesteren av fosforsyre og finnes i alle levende dyr og planter. Lecitin har strukturen

hvori hver R'COO-substituent er en fettsyrerest.

Lecitin som fås i handelen er overveiénde soyabønne-lecitin, oppnådd som et biprodukt ved fremstilling av soyaolje, se Stanley i K.S. Markley, Soybeans, bind II (Interscience, New York 1951) sidene 593-647. Soya-bønnelecitin inneholder palmitinsyre 11,7%, stearin-

syre 4,0%, palmitoleinsyre 8,6%, oleinsyre, 9,8%,

linolsyre 55%, linolensyre 4,<0%,><C>20<-C>22-syrer (inkluderende arachidonsyre) 5,5%. Syntese av et blandet syre-alfa-lecitin er omhandlet av deHaas, von Denen, Tetrahydron Letters 1960 (9)1. Syntetisk L-alfa-distearoyl-lecitin ("distearoyl-lecitin") fremstilles kommersielt ved hydro-genering av eggeplommelecitin. L-alfa-dipalmitoyl-c . 1 . lecitin er identisk med et naturlig fosfatid fra hjerne, lunger og milten. Amfifile materialer er materialer som gjerne vil migrere til grenseflater. Disse molekyler inkluderer generelt både en polar og en ikke-^polar del. Eksempler på amfifiler som er istand til å danne vesikler inkluderer langkjedede dialkyl-dimetyl-ammoniumforbindelser, blandinger av langkjede fettsyrer og overflateaktive midler, og kationiske materialer inneholdende to kvaternære ammoniumsentre separert av en lang alkylkjede. Foretrukne amfifiler brukbare ved utførelsen av den foreliggende forbindelse inkluderer distearyl-dimetyl-ammoniumforbind--eiser som distearyl, dimetylammoniumklorid, og ditalg-dimetylammoniumforbindelser som f.eks. ditalg- dimetylammoniumklorid.

Grunnmassen i vesikkelmembranen er sammensatt av forbindelser, heri benevnt som lipofile materialer, som de primære strukturelle lipider og/eller amfifiler, sammen med stabiliseringsmidler, måleretningsmidler og hvilke som helst andre passende forbindelser.

Når lipider er de primære komponenter i vesiklene, innlemmes fortrinnsvis små mengder på omtrent..l til 5 vekt%

av en blandbar amfifil i grunnmassen for å øke stabiliteten av det endelige vesikkelprodukt. Ved en foretrukket utførelsesform av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen

innlemmes digaklaktocyl-diglycerid (måleretningsmiddel) cholesterol og sphingosin (stabiliseringsmidler) i en grunnmasse primært sammensatt av di-palmitoyl-lecitin.

Løsningsmiddelsystemet utgjør et vesentlig trekk ved oppfinnelsen og må inneholde i det minste to organiske komponenter, og S2, og disse komponenter må tilfreds-stille alle de kriterier som er angitt i det etterfølgende, under de temperatur- og trykk-betingelser hvorunder fremgangsmåten gjennomføres.

(.a) S^. og S9 må velges slik at de sammen oppløser

de lipofile materialer, f.eks. i form av enten enkle molekyler, miceller, inverterte miceller, eller som en mikroemulsjon med romtemperatur og trykk (eller mer spesielt ved den temperatur/ trykk hvorunder fremgangsmåten gjennomføres).

Når lipidmaterialet anvendt i fremgangsmåten

er di-stearoyl-lecitin eller di-palmitoyl-lecitin kan S, ikke være metylacetat eller eter, basert på dette kriterium.

s

(b) Den organiske fase (blandingen av og S^)

i fravær av de lipofile materialer, må ikke i de mengdeforhold som anvendes ved fremgangsmåten, være fullstendig oppløselig i den vandige

fase, dvs. den organiske fase må danne en grense-plate overfor den vandige fase. (c) må være meget oppløselig i den vandige fase.

Oppløseligheten kan måles ved fordelingskoeffisi-enten, som er lik mengdeforholdet mellom mengden av som inngår i den vandige fase i forhold til den mengde av S1som går inn i S2, idet det forutsettes at begge faser har like volum, med romtemperatur og trykk (eller mer spesielt med den temperatur og det trykk hvorunder fremgangsmåten gjennomføres). For å være brukbar ved den foreliggende oppfinnelse må fordelingskoeffisi-enten for S, være større enn omtrent 0,1 (dvs.

mer enn 10% av S^må være oppløselig i den vandige fase, foretrukket er den større enn omtrent 0,5 og mest foretrukket større enn omtrent 10. Basert på dette kriterium kan ikke S.. være

pentanol ellerhøyere alkanoler under normale temperatur- og trykkbetingelser. (d) S2må være hydrofob, dvs. den må';danne en grenseflate med den vandige oppløsning.

(e) S2må være mer flyktig enn den vandige fase,

for at den skal kunne strippes selektivt fra den vandige fase ved et senere trinn i fremgangsmåten . (f) S2må selv ikke fullstendig oppløses ved lipofile materialer. Som et resultat av dette kriterium kan ikke kloroform anvendes somjS2hvor det lipofile material er di-stearoyl- eller di-palmitoyl-lecitin.

Basert på de ovennevnte kriterier er samlet foretrukne løsningsmidler S^metanol, etanol, isopropanol, propanol og blandinger derav. Spesielt foretrukne S, er etanol og isopropanol. Foretrukne løsningsmidler S2inkluderer cykloheksan, heksan, pentan, isopentan, 2,2-dimetylbutan, 1,1,2-triklortrifluoretan og blandinger derav,idet foretrukne S2er pentan, isopentan eller 2,3-dimetyl-butan. Andre løsningsmidler, i tillegg til S^ og S2kan inkluderes i den organiske fase, så lenge? som egenskapene av og S2 i løsningsmiddelsystemet, individuelt og som en blanding, er definert i samsvar med de.ovennevnte kriterier og ikke endres ved nærværet av disse ytterligere løsnings-midler.

Ved sammensetning av den lipofile oppløsning ( i den organiske fase) vil det lipofile material generelt være tilstede i en mengde mindre enn omtrent 10 mg pr. ml vandig fase anvendt. Foretrukket vil de lipofile materialer være tilstede på fra omtrent 0,1 til omtrent 2 mg pr. ml vandig fase. Mengden av som anvendes avhenger av mengden av lipofilt material som anvendes ved fremgangsmåten og S, er tilstede i en mengde tilstrekkelig til å oppløse det lipofile material i S2-Foretrukne to-komponent løsningsmiddelsystem inneholder fra omtrent 5 til omtrent 50 vekt% av S-j^ og foretrukket inneholder de fra omtrent 50 til omtrent 95 vekt % S^.

Den annen oppløsning som anvendes ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er en vandig oppløsning og inneholder foretrukket et material, oppløst i det vandige medium, som skal innkapsles i vesiklene. Det skal be-merkes at disse materialer ikke nødvendigvis må inkluderes i den vandige oppløsning. Således kan f.eks.

selve membranen av det bimolekylære lag være farmasøytisk-aktivt eller et separat farmasøytisk aktivt middel (som f.eks. lipidoppløselige steroidale hormoner som f.eks. østrogen, innlemmes i lipid-membrandelen av vesiklene. Foretrukne vandige oppløsninger ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen inneholder farmasøytisk aktive midler eller diagnostisermidler, som f.eks.: (1) Radionuklider, spesielt teknet.i.um-99m, thallium-201, indium-113m, indium-111, fluor-18, strontium-85 og jod-125. (2) Tungmetall-chelatorer, spesielt etylen-diamin-tetraacetater og dietylen triamin-pentaacetater.

(3) Insulin, eller insulin-derivater

(4) Antivirale midler, som f.eks. dem som anvendes ved hepatitt.

(5) Interferon,

.(6) Hormoner, f.eks. østrogener, glukagon og katecholaminer,

(7) Essensielle aminosyrer, og

(8) Nukleotider (f.eks. ATP).

Forskjellige andre enzymer,.. medisiner, vitaminer og makromolekyler, f.eks. som angitt i Gregoriadis, New England Journal of Medicin, 295, 13, at 704-709, kan

også tilføres til mennesker og laverestående dyr under anvendelse av vesikkelstrukturen fremstilt i samsvar med oppfinnelsen. Inkludert blant slike materialer er metoteksat, bleomycin, actinomycin D og lignende. Blandinger av disse materialer kan anvendes. Foretrukne vesikler, fremstilt ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen, innlemmer interferon eller insulin.

Mengden av farmasøytisk aktive eller diagnostiske materialer inkludert i den vandige oppløsning, vil avhenge av slike faktorer som naturen og styrken av det spesielle material, det lipofile material som anvendes ved tildannelse av vesiklene og dosestørrelsen av den vesikkel-blanding som skal i.tilføres. Disse vesikler kan være-målrettet til spesielle organer i kroppen, avhengig av den sykdom som skal.jbehandles og det farmasøytiske middel som inneholdes. I tillegg til disse farmasøytiske eller diagnostiske materialer kan vesiklene også inneholde andre membran-forlikelige materialer som f.eks. cholesterol, ionoforer eller målretningsmidler idet disse materialer kan inkluderes i de lipofile eller vandige oppløsninger i samsvar med oppfinnelsen etter ønske. Vesikler målrettet til leveren er beskrevet i US-patentansøkning nr. 75.310, Geho, inngitt 13. september 1979.

Den vandige oppløsning bufres foretrukket til mer enn pH 6 for å lette vesikkeldannelsen. Bruken av en farmasøytisk aktiv forbindelse ved vesikkeldannelsen kan kreve bufring av oppløsningen til en spesiell pH-verdi som er optimal for denne forbindelse. Et foretrukket system ved denne prosess anvender en nøytral fosfat-buffer når insulin er det farmasøytiske middel I.som inne- sluttes. Når den lipofile og den vandige oppløsning er blitt fremstilt, dispergeres den lipofile oppløsning i den vandige oppløsning. Dispersjonen kan oppnås på en hvilken som helst måte som ikke innbefatter høye skjær-eller kompresjonskrefter. F.eks. de fleste konvensjo-nelle dyser, innkorporerende en eller to tilførsels-strømmer, kan anvendes for å dispergere den lipofile oppløsning i den vandige oppløsning. Den lipofile opp-løsning kan dispergeres i en gassformet fase før kon-takten med den vandige oppløsning. En dispersjon kan også dannes ved å injisere denn lipofile oppløsning gjennom en enkel munning, f.eks. en hypodermisk nål, direkte inn i den vandige oppløsning. Den foretrukne metode er imidlertid å danne dispersjonen ved å føre den lipofile oppløsning gjennom en samling av små åpninger, med porediameter mellom omtrent 0,03 mikrometer og omtrent 200 mikrometer, mest foretrukket mellom 0,03 og 20 mikrometer, som f.eks. porene i et mikroporøst filter, f.eks."nukropore" polykarbonatmembran, som kan fås i handelen fra Nuclepore Corp., Pleasanton, California. Bruken av slike små pore-åpninger er i skarp kontrast til tidligere kjente, injek-r sjonsprosesser som anvender sprøytenåler med porestørrelser opp til 2 størrelsesordener større enn de mest foretrukne porestørrelser.

Ved tildannelse av dispersjonen av den lipofile oppløsning

i den vandige oppløsning kan strømningstakten av de to separate faser reguleres ved hjelp av en pumpe som tilveiebringer en stabil strøm, som f.eks. en peristaltisk pumpe, en doseringspumpe, en stempelpumpe eller en injeksjons-pumpe. Tørt nitrogen kan anvendes for å tilveiebringe tilstrekkelig trykk til å pumpe oppløsningene. Temperaturen av de to separate oppløsninger og dispersjonen bør kontrolleres slik at de er omtrent likt, og dette kan gjøres under anvendelse av vannbad. Det lipofile material kan utfelles nær injeksjonsmunningen hvis de to faser be-finner seg ved vesensforskjellige temperaturer. Generelt er den temperatur hvor dispersjonen dannes omtrent 10 til 20°C under kokepunktet av S2.

Når foretrukne løsningsmidler S2anvendes, f.eks. pentan, isopentan eller 2,2-dimetylbutan, er temperaturene for dannelse av dispersjonen fra omtrent 10°C til omtrent 35°c. Vesikler kan fremstilles med forsiktig omrøring av dispersjonen. Vedben foretrukket prosess omrøres imidlertid dispersjonen i området fra omtrent 100.til omtrent 400 omdreininger pr. minutt. Vesentlig mer turbulent omrøring ved fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse er forbundet med en lavere inneslutnings-virkningsgrad. Dette er i motsetning til den tidligere kjente teknikk, under anvendelse av en-komppnent-løsningsmiddel-systemer (vanligvis etanol) som gir meget små mengder av uni-lamelære vesikler med mindre mer energi tilføres (f.eks. ved kraftig omrøring eller ultralydanvendelse). Vanligvis er denne del Lav prosessen (dvs. tildannelse av dispersjonen) gjennomført ved omtrent atmosfæretrykk, selv om trykkbetingelsene om ønsket kan varieres.

Etter at den lipofile og den vandige oppløsning er blandet-strippes S2fra systemet, under dannelse av en suspensjon av vesikler. Strippingen kan fortsettes foretrukket inn-

til hovedsakelig all S2er fjernet fra systemet. Stripping bør generelt gjennomføres ved å heve temperaturen i dispersjonen på en styrt måte. Dette forhindrer lipidet fra å skumme, noe som kunne redusere innesluttet volum og utbytte. Temperaturen holdes under overgangstemperaturen for vesikkel-grunnmassen. Dette kan gjennomføres ved å strippe systemet under et undertrykk. Strippetrinnet kan gjennomføres under anvendelse av en porsjonsenhet som hever temperaturen i dispersjonen i et eneste trinn eller en rekke av stempelstrømnings-enheter, erkjent som terskler, som hever temperaturen i dispersjonen i trinn-økninger. Resterende løsningsmiddel inneholdt i dispersjonen fjernes generelt enten ved lang oppholdstid i porsjonsenheten eller ved kort oppholdstid under et vakuum.

Det endelige trinn i fremgangsmåten krever bruk av separa-sjonsprosesser, vel kjent innen teknikken, for å fjerne

S^, multilamenære strukturer, medisinsk material som

ikke er innesluttet i vesiklene og om nødvendig elektrolytter, fra systemet. S1kan fjernes ved vakuum-destillasjon, dialyse, membranfiltrering, gel permeasjons-kromatografering eller ved hjelp av ionebytting. Hvis vil ha membranfiltrering, gel-permeasjons-kromatografering eller ved hjelp av ionebytting. Hvis S1vil ha liten skadelig virkning på de endelige farmasøytiske produkter, behøver det dog ikke å fjernes fra systemet. Multilamenære strukturer kan om ønskes fjernes fra produktet ved membranfraksjonering, gel-permeasjonskromatografering eller sentrifugering. Elektrolytter og ikke-innesluttet medisin kan fjernes ved vakuum-destillasjon, dialyse-membranfiltrering, gel-permeasjons-kromatografering eller utfelling. Typiske elektrolytter, som f.eks. natrium-klorid, fjernes foretrukket ved hulfiberfiltrering. Foretrukket økes stabiliteten av vesikkelsuspensjonen ved å varmebehandle vesiklene ved å heve oppløsningstemperaturen over overgangstemperaturen av lipidet (f.eks. til omtrent 60 til 6 5°C hvis vesikkelmembranen er sammensatt fullstendig av di-stearoyllecitin). Også konserveringsmidler tilsettes foretrukket før eller etter separeringsprosessen.

Det resulterende produkt er en kolloidal suspensjon av vesikler i en vandig oppløsning, foretrukket inneholdende en farmasøytisk aktiv komponent, egnet for tilførsel til mennesker og laverestående dyr. De følgende eksempler illustrerer fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen og alle prosentandeler og mengdeforhold som er angitt deri,

er på vektbasis med mindre annet er angitt.

EKSEMPEL I

1 del dipalmitoyl-lecitin (DPL) ble blandet med 16 deler etanol (S^) og 108 deler isopentan (S2) til å danne lipofil-oppløsningen. DPL ble først oppløst i varm etanol og isopentan ble deretter tilsatt. Den vandige oppløsning bestod av 0,9% NaCl og 100 mikrogram/ml Reheis-bovininsulin.

Dispersjonen ble tildannet i.en rustfri stålbeholder (dispergeringsinnretning) ved å føre den lipofile opp-løsning gjennom en sirkulær. "Nuclepore" polykarbonat-membran (membrandiameter = 2,5 cm, porediameter 0,05 mikrometer, poredensitet = omtrent 6 x 10 8 /centimeter 2, membrantykkeIsen = mikrometer) og i kontakt med den vandige oppløsning. Den lipofile oppløsning ble blandet inn i den vandige fase i en takt på 0,5 ml/minutt. Den vandige oppløsning strømmet inn i dispergeringsinnretningen i en takt på 2 ml/minutt og hadde en oppholdstid i dispergeringsinnretningen på omtrent 1 minutt. Den dannede dispersjon ble forsiktig omrørt med en omrøringstakt på omtrent 10 omrøringer pr. sek. Begge oppløsninger ble holdt ved 15°C ved hjelp av et bad med konstant temperatur. Temperaturen i dispersjonen ble så hevet fra 15°C til 45°C i trinn på 10°c, i en rekke på 3 terskler. Oppholdstiden i hver terskel var 3 minutter. Dispersjonen ble holdt-i en porsjons-strippeinnretning i omtrent 1 time etter at den hadde kommet ut fra tersklene. Tørt nitrogen strømmet samtidig over tersklene under denne prosess,

i en takt på omtrent 1 liter pr. minutt. Fremgangsmåten ble gjennomført ved atmosfæretrykk. Dispersjonen inneholdende de dannede vesikler ble sentrifugert ved 20 000 g i omtrent 1 time for å fjerne multilamelære partikler.

Det resulterende produkt var en kolloidal dispersjon av insulinholdige unilamelære vesikler. Mer enn en enhet insulin var innesluttet pr. milligram lipid og mindre enn 5 ppm. isopentan ble funnet i sluttproduktet. Den midlere'diameter av de dannede vesikler var omtrent 400 Å.

Den ovennevnte prosess ble gjentatt uten insulin og hvor DPL ble erstattet med en blanding av 90% distearoyl-lecitin, 1% stearylamin og 9% kolesterol. Vesikler som ikke inneholdt noe farmasøytisk aktivt middel ble dannet.

Omtrent lignende resultater oppnås hvor prosessen ble gjentatt uten insuling hvor isopentanet (S2) ble erstattet med "Freon TF" Tl,1/2-trifluortrikloretan).

Lignende resultater oppnås når den ovennevnte prosess

ble gjentatt uten insulin men hvor etanol (S^) ble erstattet med isopropanol.

Lignende resultater ble også oppnådd når den ovennevnte prosess ble gjentatt uten anvendelse av insulin-, men hvor porsjons-strippeinnretningen og ikke tersklene ble anvendt for å strippe bort S^-

Omtrent lignende resultater ble også oppnådd hvor den prosess som er beskrevet ovenfor ble gjennomført, uten insulin, og hvori polykarbonat-membranet ble erstattet med en tilpasset rustfri stålskive med 150 mikrometers porer og en poredensitet på omtrent 400 porer/cm 2.

EKSEMPEL II'

2000 ml av en suspensjon av distearyl-dimetylammoniumklorid-vesikler i vann ble fremstilt under anvendelse av den modifiserte injeksjonsprosess ved den foreliggende oppfinnelse, som beskrevet i det følgende. I sluttproduktet var distearyl-dimetylammoniumkloridet tilstede i en mengde på omtrent 0,2%.

4,2 g distearyl-dimetylammoniumklorid (Arosurf TA-100,

som fås i handelen fra Ashland Chemical Company, Columbus, Ohio) ble oppløst i 105 ml etanol (S^) og fortynnet til

700 ml med isopentan { S^)• Denne lipofiloppløsning og en separat oppløsning av 2000 ml destillert vann ( den vandige oppløsning ) ble separat avkjølt til omtrent 15°C

i et vannbad. Under anvendelse av peristaltiske pumper ble den lipofile oppløsning og vann pumpet inn i en dispergeringsinnretning i takt på 3 ml/minutt henholdvis 9 ml/minutt under dannelse av en dispersjon av den lipofile organiske fase i vann. Oppholdstiden av dispersjonen i dispergeringsinnretningen var omtrent 1 minutt. Lipo-filoppløsningen ble sendt gjennom en 47 mm diameter, 0,05 mikrometer porestørrelses-membran av fabrikat "Nuclopore" ved tildanning av dispersjonen. Dispergerings-agitatoren ble så rotert med omtrent 2 omdreininger pr. minutt for å omrøre produktet ettersom det dannet seg.

Dispersjonen ble så via et rør av "teflon" ført til

en kollektor holdt ved 45°C. Produktet ble holdt ved 45°C i 18 timer under omrøring med 2 omdreininger pr.

sekund for å fjerne S2- Produktet ble så samlet og lagret ved romtemperatur.

Tynnsjikt-kromatograferingsanalyse av dette produkt indi-kerte at di-stearyl-dimetyl-ammoniumkloridinnholdet var mer enn 90% av det som kunne forventes hvis alt di-stearyl-dimetylammoniumklorid var gått inn i dispersjonen. Størrelsesanalyse av produktet, under anvendelse av en metode som f.eks. fryse-frakturanalyse, viste at det største antall partikler hadde diameter 300-500 Å.

Det var meget få partikler under 250 Å. Over 500 Å forekom et stort antall partikler i suspensjonen men deres antall minsket med økning i størrelsen inntil 2200 Å hvor meget få partikler ble oppdaget. Den midlere rot-kube partikkel-diameter var omtrent 1000 Å. Dette produkt fremviser ikke noen synlige tegn på aggregasjon eller avsetning ved lagring i romtemperatur i 2 måneder.

EKSEMPEL III

Vesikler kan også fremstilles ved en metode under anvendelse av en modifisert dispergeringsinnretning, kjent som en audio-dispergeringsinnretning. Denne dispergeringsinnretning er forskjellig fra de i det foregående beskrevne disper-geringsinnretninger ved at et vibrerende diafragma (foretrukket stål) er anbragt bak membranen av "Nuclepore" på lipidsiden. Diafragmaet vibreres ved hjelp av akustisk energi under prosessen og drivelementet kan f.eks. være en hodetelefon-mikrofon (f.eks. 1/2 av en AKG, modell K40, hodetelefonsett med 200 ohm impedans, 200 mW max.) drevet av en signalgenerator og- en forsterker.

Ved en typisk bruk av denne audio-dispergeringsinnretning, som eksemplifisert i det foregående, var den audioenergi som ble anvendt 180 mW ved 100 Hz. Apparatet og metoden var den samme som anvendt i eksempel 1, med unntagelse av som angitt i det etterfølgende. En lipofil-oppløsning, 1 del di-stearoyl-le citin (DSL) oppløst i 24 deler etanol og 102 deler isopentan ble dispergert gjennom "Nuclepore"-membranen inn i den vandige oppløsning (0,9% saltopp-løsning). Strømningstaktene vra 0,5 ml/minutt for den lipofile oppløsning og 2 ml/minutt for den..vandige oppløsning. Oppholdstiden for dispersjonen i dispergeringsinnretningen var omtrent 12 sekunder. Den eneste omrøring ble besørget av den vibrerende membran og be-vegelsen av dispersjonen ettersom den passerte gjennom kanalene i dispergeringsinnretningen. Temperaturene av oppløsningene og ved rensing/separeringstrinnene var som beskrevet i eksempel I.

Utbyttet av sluttprodukt var 0,35 mg DSL/ml dispersjon og den midlere diameter av vesiklene var 620 Å og det inne-sluttede volum ble bestemt som 1,88 mikroliter/mg DSL.

Omtrent lignende resultater oppnås når den anvendte frekvens varierte mellom omtrent 30 Hz og omtrent 3000 Hz.

EKSEMPEL IV

1 del lipofilt material (60%dipalmitoyl-lecitin (DPL),.

31% kolesterol, 7% digalaktocyl-diglyserid og 2% spingosin) ble blandet med 21 deler etanol (S1) og 70 deler isopentan (S2) til å danne lipofiloppløsningen. Lipofil-materialet ble først oppløst i varm etanol og isopentan ble deretter tilsatt. Den vandige oppløsning bestod av 100 U/ml Novo bovin-insulin. Dispersjonen ble tildannet i en sylindrisk rustfri stålbeholder.. (dispergeringsinnretning) ved å føre lipofiloppløsningen gjennom en sirkulær "Nuclepore" polykarbonat-membran (membrandiameter = 2,5 cm, porediameter = 0,05 mikrometer, poredensitet er omtrent 6 x 10 8 /cm 2, membrantykkelse = 5 mikrometer) og i kontakt med den vandige oppløsning. Den lipofile oppløsning ble pumpet inn i den vandige fase i en takt på 2 ml/minutt.

Den vandige oppløsning ble pumpet inn i dispergeringsinnretningen i en takt på 8 ml/minutt med en oppholdstid på omtrent 7 minutter. Den således dannede dispersjon ble blandet ved omtrent 250 omdreininger pr. minutt for å sikre intim kontakt mellom de to forskjellige faser.

Begge oppløsninger ble holdt ved 18°C før innføringen

i den første dispergeringsinnretning som er holdt under et nitrogenteppe ved 20°c. Produktet fra den første dispergeringsinnretning ble pumpet i en takt på omtrent 10 ml/minutt inn i en annen identisk dispergeringsinnretning og gjennom en sirkulær "Nuclepore" polykarbonat-membran (porediameter = 0,2 mikrometer) for å oppnå den ønskede partikkelstørrelsesfordeling og aggregasjonstil-stand. Dette produkt ble også omrørt ved omtrent 250 omdreininger pr. minutt og hadde en oppholdstid i dispergeringsinnretningen på omtrent 11 minutter. Dispergeringsinnretningen ble holdt ved 30°C og ble utsatt for en kontinuerlig tørr nitrogenstrøm ved omtrent 20 liter pr. minutt. De ovennevnte betingelser var for å letter fjernelse av S2og vesikkeldannelse.

Produktet fra den annen dispergeringsinnretning fikk flyte over i .en porsjons-strippeinnretning holdt ved 45°C og som også var underkastet en kontinuerlig nitrogenstrøm på omtrent 10 til 20 liter pr. minutt. Oppholdstiden ble bestemt til 60 minutter for å fullføre vesikkel-dannelsesprosessen. Omrøring ble anvendt for å lette ytterligere fjernelse av S2. Temperaturen i porsjons-strippeinnretningen og inneholdt produkt ble så hevet til 60°C i 20 minutter for å varmebehandle vesiklene. Produktet ble sentrifugert ved 20 000 gil time for å fjerne ikke-vesikkel-lipid og multilamelære partikler.

Sentrifugert produkt ble fortynnet 1:1 med en fosfatbuffer-oppløsning og behandlet med en icnebytterharpiks for å fjerne eksogent insulin. Produktet ble deretter filtrert for å fjerne harpiksen. Sluttproduktet var en kolloidal dispersjon av unilamelære vesikler inneholdende omtrent 1 enhet insulin pr. milligram lipofilt material.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av vesikler/liposomer hvor en oppløsning inneholdende lipider, amfifiler og andre lipofile material, istand til å danne vesikler, i et løsningsmiddelsystem dispergeres i en vandig oppløsning og deretter i det minste en del av løsningsmiddelsystemet strippes av, karakterisert ved at løsningsmiddel-systemet oppfatter i det minste to organiske komponenter og S2 hvori: (a) S-^ er meget oppløselig i den vandige oppløsning, (b) S2 er hydrofob, (c) S2 er mer flyktig enn den vandige oppløsning, (d) de lipofile materialer er ikke fullstendig.' oppløselige i S2 •alene, (e) blandingen av S og S2 danner en grenseflate overfor den vandige oppløsning, (f) de lipofile. materialer kan oppløses i en blanding av S1 og S2 .

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at fordelingskoeffisi-enten av S, i den vandige oppløsning er større enn 0,5.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert v^ed at den lipofile opp-løsning injiseres i den vandige oppløsning.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 til 3, karakterisert ved at den lipofile opp-løsning injiseres i den vandige oppløsning gjennom en eller flere åpninger med en diameter på 0,03 til 200 mikrometer.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 til 4, karakterisert ved at løsningsmiddel-systemet omfatter fra 5 til 5 0 vekt% av S1 .

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 til 5, karakterisert ved at løsningsmiddel-systemet omfatter fra 50 til 95 vekt% S2 .

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 til 6, karakterisert y.e. d at i det minste et farmasøytisk aktivt middel oppløses i den vandige oppløsning.

8. Fremgangsmåte som angitt, i krav 1 til 7, Kara k'.teri sert ved at velges fra gruppen bestående av metanol, etanol, propanol, isopropanol og blandinger derav.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 til 8, karakterisert ved at S 2 velges fra gruppen bestående av heksan, cykloheksan, 2,2-dimetylbutan, pentan, isopentan, 1,1,2-triklortrifluoretan og blandinger derav.

10. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 til 9, karakterisert ved .at etter at lipid-oppløsningen er dispergert i den vandige oppløsning heves temperaturen i dispersjonen på styrt måte for å fjerne hovedsakelig all S2 -