NO751303L - - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte til

dyrking av heteroploide cellelinjer fra menneskelever.

Man kjenner til at visse typer menneskelig vev kan dyrkes in vitro som vevkulturer, og enkelte av disse omdannes til cellelinjer som kan dyrkes og overføres flere ganger i rime-lig målestokk. Slike vevkulturer som har vært' utsatt for vesentlige kromosomforandringer og er blitt heteroploide er særlig nyttige, .siden slike cellelinjer er kontinuerlige og kan

overføres og formeres i meget stor målestokk praktisk talt uendelig, og således tjene som basis for industriell fremstilling av virus og tilsvarende vaksiner. Flere typer patogene virus infiserer leveren og formeres i denne, og.det har vært stor etterspørsel etter kontinuerlige cellelinjer som er i stand til å opprettholde slike virus.

Bare diploide cellelinjer av fibroblaster har hittil vært fremstilt fra leverceller, men disse hadde begrenset leve-tid. Til nå har man ikke avledet kontinuerlige heteroploide cellelinjer fra menneskeleverceller som har beholdt deres karakteristika, hvilket ville gjøre det mulig for forskere å undersøke patogener i slike celler, dyrke dem i kontinuerlige kulturer og derved åpne muligheten for fremstilling av antigene stoffer fra de formerte og isolerte viruser for vaksinering og diagnose. En hensikt med foreliggende oppfinnelse er å frem-stille en slik cellelinje, spesielt en levercellelinje av menneskeepitelceller som inneholder glykogen og morfologisk og som i morfologi og biokjemisk aktivitet ligner -funksjonelle leverceller in vivo.

Ifølge oppfinnelsen fremstilles således en heteroploid cellelinje av menneskelever-epitel, med betegnelsen WRL 68, som danner individuelt adskilte øyer eller enkeltklumper når de dyrkes på vekstmedium, har en morfologi som ligger nær opptil hepatocytter fra menneske lever og har generasjonstid høyst 2 4 timer, gir øket glykogenproduksjon i nærvær av 1 % glukose i mediet, og'kan underholde virus.

Cellelinje WRL 6 8 er innlevert ved Wellcome Collection of Micro-organisms and Cultures, Beckenham, Kent, England, og hos American Type Culture Collection ved Rockville, Maryland, USA (ATCC nr. CL48).

Typen av cellelinjer fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse er heteroploid, d.v.s. rekken av typiske menneske-kromosomer er overveiende ikke-diploid eller abnormal, i antall mellom 63 og 91,' med middeltall ca. 72. Under det optiske mikroskop er cellene polygonale og epitelaktige av utseende og ligner hepatocytter.

For at oppfinnelsen skal forstås lettere og hovedtrek-kene 'hos cellene gjenfinnes, skal det nå beskrives de trekk som er synlige under optisk mikroskop og elektronmikroskop av cellelinjer WRL 68, i forbindelse med de vedlagte figurer, hvor: Fig. 1 er. en tegning av en enkelt celleklump som viser de hovedtrekk som er synlig under optisk mikroskop ved forstørrelse 2.400 . Fig. 2 er en tegning av det som kan sees under elektronmikroskop når et snitt forstørres 19.000 ganger og under-søkes.

På fig. 1 vises enkeltceller C med avrundede kjerner

■ som inneholder opptil 5 mukleoler NI. Cytoplasma CP omgir hver kjerne N. Fig. 2 viser at under elektronmikroskopet ser man at cytoplasma CP inneholder mange granulater MB som sannsynligvis • består av lipider. Mitochondria M er meget tallrike og det

samme gjelder glykogen CL. Utseendet under elektronmikroskop er også meget likt det typiske menneskehepatocytter, og skiller seg sterkt fra vanlig oppbygning hos fibroblastceller.

Slike vesentlig identiske cellelinjer som kan fremstilles av fagfolk ved å modifisere eller formere (clone) de beskrevne cellelinjer uten forandring av cellelinjens eller 'kulturens morfologiske og funksjonelle egenskaper, ligger innenfor oppfinnelsens ramme. Selv om de angitte offisielle preparatbanker er de enkleste kilder til cellelinjer fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, er det ikke helt umulig eller usannsynlig at lignende og funksjonelt i det vesentlige identiske cellelinjer av menneskelever-epitel kan fremstilles ifølge andre metoder eller ved lignende uventede tilfeldighe-ter. Slike funksjonelt i det vesentlige identiske cellelinjer er biologiske ekvivalenter til cellelinje WRL 68 og er også innenfor oppfinnelsens generelle ramme.

Cellelinje WRL 68 er såvidt vi kjenner til fremstilt gjennom en fullstendig uventet og original spontandannelse når levervev fra menneske-embryo ble trypsinisert og anbragt i Eagle's'Minimum Essential Medium (H. Eagle, Science 1959, 130, 432), blandet med 10 % kvegserum ved 37°C i noen måneder.

Cellelinjen vokser raskt i standard kulturmedium.

Man kan med fordel bruke Eaglé's Minimal Essential eller Basal Media (H. Eagle,"J. Exp. Med., 1955, 102, 595), siden disse lett kan fåes. Som vanlig kan disse media tilsettes kvegserum, særlig kalveserum. Fortrinnsvis økes det vanlige innhold av aminosyrer og vitaminer med en faktor på ca. to. Medium 199 (j.F. Morgan og medarbeidere, Proe. Soc. Exp. Biol. Med., 1950 73, 1) kan også brukes. Generasjonstiden er vanligvis ca. 15 timer under gunstige forhold, ved 37°C. Cellelinjen danner ikke kontinuerlige matter men vokser som øyer eller enkeltklumper som ligner leverlobuler. Middeldimensjonen for disse klumper, er mellom 2 og 3 mm, eller ca. 3 mm.

Biokjemisk produserer cellelinjer 'fremstilt ifølge oppfinnelsen glykogen som de funksjonelle celler, hepatocyttene

i leveren. Som alle kontinuerlige heteroploide linjer fra mennesker, er de kreftdannende (oncogene) når de påføres hamster-kinnlommer.

Cellelinjene kan brukes for dyrking av forskjellige menneskelige og dyriske virus. Disse omfatter DNA-virus som vaccinia-virus, adenovirus og herpes-virus, RNA-virus som poliomylitt-virus, HeLa-celletilpassede echovirus, parainflu-enza-1 (Sendai)-virus, katte-enteritis-virus og orbovirus som Semliki skog virus, Sindvis virus.

Ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en fremgangsmåte for dyrking av en heteroploid cellelinje fra menneskelever-epitel som ovenfor definert, som består i å opprettholde og dyrke cellene i kulturmedium. Den fremstilte heteroploide cellelinje av menneskelever eller dens kultur kan benyttes til dyrking av virus hvorved cellelinjen inokuleres med virus som cellene er følsomme for og dyrke cellelinjen som angitt.

Virus som er dyrket på denne måten er egnet for videre-behandling på kjent måte, f.eks. ved å overføre til samme eller andre cellekulturer for fremstilling av rendyrkede eller fortynnede arter og en levende vaksine. Det antigene virusmateriale- som dyrkes i henhold til oppfinnelsen kan også inaktiveres på kjent måte for produksjon av en inaktivert vaksine. Levende eller inaktiverte vaksiner foreligger vanligvis sammen med et farmasøytisk bæremiddel i flytende eller fast form.

En annen mulighet er at den fremstilte cellelinjen kan brukes til forskning, f.eks. for undersøkelse av de metabolske prosesser i leveren, eller for produksjon av glykogen eller av enzymer som vanligvis produseres av leveren in vivo. Videre kan cellene være verter for menneske-hepatitis-virus som ikke hittil har vært dyrket med hell i noen kultur in vitro.

Følgende -eksempler illustrerer oppfinnelsen:

Eksempel 1

En prøve av heteroploid levercellelinje WRL 68 inne-5.6

holdende ca. 10 til 10 celler ble overført til medisinske flatbunnede kolber inneholdende Eagle's Minimal Essential Medium, med tilsetning av 10 volum-% kalveserum. Etter 3 dager ved 37°C iakttok man maksimal utvikling av klumper. 0,5 ml suspensjon adenovirus 11 i Eagle<1>s Basal Medium, inneholdende ca. 10 -TCID 50 (tissue culture infective doses = vevkultur-infeksjonsdoser) ml, ble blandet med cellene og virusen adsorberte en 1/2 time. . Overskuddet av virus ble vasket av med nøytralmedium (uten serum) og kulturen ble inkubert ved 37°C.

Man iakttok en cytomatisk virkning typisk for adenovirus etter 3 dager. Kulturen ble deretter frosset og tint for frigivelse av virus fra cellene. Cellemassen ble frafiltrert og nærvær av virus i mediet ble demonstrert ved hemaglutinering med røde blodlegemer fra. patasaper. Titeren var 128, hvilket angir maksimal fortynning som fremdeles viser hemaglutinering.

Adenovirus-arter 4, 5, 7 og 15 ble også dyrket i cellelinjen og ga tilfredsstillende titre.

Eksempel 2

Listerarten av vaccinia-virus ble adsorbert på en kultur av heteroploide levercellelinjer som beskrevet i eksempel 1. Man fant en typisk cytopatogen virkning etter inkubering i 24 timer ved 37°C. Cellelinjen var også følsom for Jenner-arten av vaccinia-virus og man fikk en lignende cytopatisk virkning.

Eksempel 3

Følgende virus ble også med hell dyrket på heteroploid levercellelinje WRL 68 som beskrevet i de ovenstående eksempler: Poliomyelitvirus, echovirus 2, 7, 9, 11, 15, 17,'20, 23 og 25, som på forhånd var tilpasset HeLa-cellekulturer, Sendai-virusherpes-virus, katte-enteritis-virus, San Carlos-virus, og-arbovirus som Semliki-skogvirus og Sindbis-virus .-Disse virus oppviser tilfredsstillende antigenitet etter tilpassing til heteroploid cellelinje av menneskelever. Slike og andre a'ktive virus kan derfor dyrkes på den fremstilte cellelinje og presenteres som en vaksine sammen med farmasøytisk akseptable bærere, etter passende inaktivering eller fortynning i henhold til velkjente metode-r.

Claims (3)

1. Fremgangsmåte for dyrking av en heteroploid cellelinje av menneskelever-epitel, slik som linje WRL 68 med ATCC nr. CL 48,karakterisert ved- at cellene holdes eller dyrkes i et næringsmedium, fortrinnsvis "Eagle's Minimal Essential" eller "Basal medium" eller "Medium 199".

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at mediet tilsettes kvegserum, fortrinnsvis kalveserum.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at den vanlige mengde aminosyrer og vitaminer økes med en faktor på ca. to.