NO742557L - - Google Patents

Description

Vaksine mot Mareks sykdom.

Oppfinnelsen angår vaksiner for immunisering av fjærkre mot Mareks sykdom (leukose type II), og spesielt vaksiner som er immunogene og non-patogene for Mareks sykdom, fremgangsmåter for fremstilling av slike vaksiner, og metoder til immunisering-av fjærkre med vaksinene.

Neoplasia er en av det mest vanlige sykdommer hos fjærkre.

De fleste fjærkre-svulsttyper har deres histogenese i "blodsystem-et og er klassifisert som fjærkre-leukose-komplekse. Minst to forskjellige virustyper, nemlig en RNA-virus (p.bgså kalt RIF-virus) og en DNA-herpes-virus (blant kvilke JM-virus ble forst isolert fra nons som prototyp), kan forårsake leukotiske svulster. Den etiologiske separasjon og identifiseringen av disse sykdommer har fort til betegnelsen lymfoid leukositt eller type I lymfoid leukositt for RNA-virus-svulster og Mreks sykdom eller type II lymfoid leukosittfor DNA-virus-sykdommer.

De fleste naturlige svulster hos fjærkre er av typen Mareks sykdom. For tiden anslår man at tapene som skyldes fjærkre-svulster ligger på ca. 200 millioner dollar pr. år i

U.S.A.

Infeksjoner av Mareks sykdom i fjærkreflokker er både vanlig og utbredt. Nesten alle utegående flokker smittes i noen grad. De fleste noner smittes i ung alder og er smittet kronisk. Selv om smittegraden er opptil 100% i de fleste tilfeller, kan neoplasitt som et resultat av slik smitte bare finnes i meget liten grad i noen flokker og opptil over 50% i andre flokker.

Det har vært forsket mye for å finne frem til behand-linger og forebyggende tiltak for Mareks sykdom, men inntil nylig forelå ingen tilfredsstillende vaksine.

U.S. patent nr. 3.642.574 beskriver en vaksine fremstilt ut fra kalkun-herpes-virus (HVT) som er ikke-patogen for noner og som via mekanismer som ennå ikke er kjent beskytter vaksinerte hbns mot utvikling av svulster fra Mareks sykdom.

Vaksinen beskrevet i U.S. patent nr. 3.642.574 fikk umiddelbart stor anvendelse så snart den var tilgjengelig for fjærkreoppdrettere, på grunn av sykdommens alvor og fordi det til da ikke fantes noen alternativ behandling.

Imidlertid har HVT-vaksinen- nylig vist seg å være tvilsom som tilfredsstillende losning på problemet med Mareks sykdom siden dens virkning til forhindring av svulst i mange tilfeller synes å være mindre enn opprinnelig angitt. Dette kan skyldes at HVT-vaksinen ikke produserer noe betydelig nivå av beskyttende eller nøytraliserende antistoffer mot infeksjoner. Man har funnet at inokulering av hbns med HVT-vaksine resulterer i kronisk viremi, til forskjell fra immunitet som undertrykker eller eliminerer infeksjonen. Videre er hbns vaksinert med HVT-vaksine ikke immune mot en meget kraftig virus-infeksjon til Mareks sykdom og den beskyttelse som ytes av HVT-vaksinen er mer "kosmetisk" enn reell. Videre har opprinnelige uttalelser om at HVT ikke vokste i pattedyrceller nå vist seg usikre..

U.S. patent nr. 3.590 128 beskriver en vaksine for lymfoid leukositt type I, til forskjell fra vaksine mot Mareks sykdom.

U.S. patent nr. 3.674.861 beskriver en fortynnet vaksine mot Mareks sykdom fremstilt ved serieoverfbringer av virus i fjærkreeeller.

Det vil fremgå av dette at det er et enormt behov for en effektiv vaksine mot Mareks sykdom og .spesielt for slike vaksiner som vil hindre eller eliminere infeksjon hos vaksinerte nons.

I henhold til oppfinnelsen tilveiebringes således en vaksine som, når den administreres på riktig måte, er immunogen og non-patogen for Mareks sykdom hos fjærkre, og særlig hbns.

En virulent stamme av virus som forårsaker Mareks sykdom, identifisert som JM-V-stammen ble utviklet ved hurtig overforing av JM-virus i hons over flere hundre overfbringer. Denne JM-V-stammen er ekstremt patogen for hbns og LD^Q-dosen for de fleste genetiske arter hbner er 10^ pr. ml når virusen gis parenteralt som blod-inokulum, idet injiserte fugler gjen-nomgår en lymfe-svulstvekst i lbpet av 3 - 6 dager etter inokuleringen.

Man fant at en dag gamle kyllinger som fikk en stor dose JM-V-virus vanligvis bukket under. Når man imidlertid gav en mindre dose JM-V-virus, overlevet enkelte kyllinger og utviklet fra 1.000 - 10.000 nøytraliserende antistoffer. Disse overlevende kyllinger med hbyt innhold av antistoffer var relativt immune for senere utsettelse for JM-virus, men bruk av JM-V-stammen antas ikke å være noen brukbar immuniseringsmetode pga. den ekstremt patogene natur for JM-V-stammen.

En vaksine må for å være tilfredsstillende forst av alt være sikker overfor den vaksinerte fuglen. Den bor også fremkalle hbye nivåer av nøytraliserende antistoffer slik at den viremi som er et resultat av vaksineringen er midlertidig for at den vaksinerte fuglen kan være uten virus når den slaktes og skal brukes til mat.

Vaksinen i henhold til foreliggende oppfinnelse opp-fyller disse kriterier.

En prove av nevnte virulente stamme av virus for Mareks sykdom, identifisert som JM-V-stammen, er innlevert

som en kultur av denne levende organisme med sorteringsnummer VR-736 til American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A. Organismen vil i det fblgende kalles stamme eller preparat nr. VR-736. Som tidligere nevnt er denne organismen immunogen, men ekstremt patogen for fjærkre.

Preparat VR-736 vokser bra i fjærkreembryo. En fremgangsmåte til forandring av preparatet eller stammen i henhold til foreliggende oppfinnelse slik at den blir ikke-patogen for hons og kyllinger består i serieoverfbring gjennom plommesekken i fjærkreembryo. Man starter med blod fra en dbdende kylling som på forhånd er inokulert med VR-736, ca. 0,1 ml av dette blod innfores inne i plommesekken i et fjærkrefoster. 4-6 dager gammelt. Ca. 7 dager etter inokulering tas 0,1 ml av plommen fra det infiserte foster ut og innfores på nytt i serie i et friskt 4-6 dager gammelt foster. Man gjentar frem-gangsmåten over omtrent 50 overfbringer. Materialet som hostes på et relativt fremskredent infisert stadium er kraftig anti-gent og produserer beskyttende antistoffer i kyllinger mot virus som gir Mareks sykdom (JM-stammen), og vil beskytte kyllinger mot infeksjoner ute på marken.

Hostet materiale fra senere overfbringsstadier kan stabiliseres med SPGA eller andre egnede stabilisatormedia og fryses i flytende nitrogen til kort for bruk, og da fortynnes med et farmasbytisk bæremedium til bnsket styrke. Det hostede materiale kan eventuelt frysetbrkes på kjent måte.

Innhbstet materiale inneholdende modifisert virus

fra VR-736, frosset eller frysetbrket som beskrevet ovenfor, kan fortynnes med et farmasbytisk egnet bærestoff, f.eks. fosfatpufret saltvann eller tryptosefosfatmedium som kan inneholde "Arlacel A", "Bayal F", Freunds-medium etc, for det gis til fjærkre. Det fortynnede preparat kan injiseres parenteralt eller gis på annen måte til kyllinger som er fra en dag gamle og opptil voksen alder, avhengig av de resultater som bnskes og den aktuelle flokken. Som det vil beskrives mer detaljert senere, kan voksne hbnekyllinger immuniseres aktivt med opp-

finnelsens vaksine og disse vil kongenitalt overfore beskyttende antistoffer til avkommet og på denne måten unngår man å vaksinere de utklekkede kyllingene individuelt når disse skal oppdrettes til broilere som slaktes omtrent 7 uker gamle. De kongenitale antistoffer er bare effektive i 3 - 5 uker, men den korte tiden mellom tapet av kongenital immunitet og slaktetidspunktet er ikke langt nok til at det kan dannes vesentlige svulster.

Oppfinnelsens idé består i å forandre den hoypatogene stamme nr. VR-736 til en ikke-patogen,. men stadig kraftig immunogen stamme eller preparat ved serieoverfbring gjennom f.eks. fjærkrefosterets plommesekk.

Det er et formål med oppfinnelsen å tilveiebringe

en effektiv vaksine for Mareks sykdom hos fjærkre.

Det er videre en hensikt med oppfinnelsen å fremlegge en slik vaksine' som er sikker (ikke-patogen) og som gir virus-frie vaksinerte dyr.

At disse og andre hensikter og fordeler med oppfinnelsen oppnås ifolge oppfinnelsen vil fremgå av den folgende detaljerte beskrivelse og foretrukne utforelser, i forbindelse med de vedlagte tegninger hvor: Fig. 1 - 4 viser kurver over antistoff-responsen ved

bruk av vaksinen ifolge oppfinnelsen.

JM-V-preparat nr. VR-736 ble fremstilt ved hurtig overforing av virus som forårsaker JM Mareks sykdom via en dag gamle kyllinger. De organiske vev som ble utvalgt for de forste av disse serieoverfbringer var tidlige svulstdannelser fra lever, milt, nyrer, gonader og blod. Disse organer ble valgt fordi det er i disse organene hos hons at tumur-antistoffer produseres. Blod ble benyttet etter en del innledende overforinger.

Den resulterende JM-V-stamme nr. VR-736 er meget patogen for hons og kyllinger som det fremgår av den folgende tabell I hvor man ser den stadig synkende periode som forloper for in-okulerte kyllinger med okende overfbringsantall, for kyllingene dor. Man ser at etter 400 overføringer er alle inokulerte-kyllinger dode etter 5 dager, hvilket viser den ekstremt dbde-lige natur for preparat nr. VR-736.

Man fant imidlertid at hons som ble gitt en ikke- dødelig, men infektiv dose av preparat nr. VR-736 og overlevde, produserte nøytraliserende antistoffer mot Mareks sykdom-virus. Selv om det således ble vist at det virulente preparat VR-736 fremkalte et hoyt nivå av nøytraliserende antistoffer, var det også klart at det trengtes' en modifisering av det virulente preparat for å fremstille en sikker vaksine.

Man fant også at et cellefritt produkt fremstilt ved å ultralydbehandle blod infisert med JM-V, fulgt av sentrifu-gering og filtrering gjennom et "Millipore"-filter 0,45/U ville danne nøytraliserende antistoffer hos fjærkre. Cellefritt materiale fremstilt på denne måten bevirket en beskyttelse hos overlevende fugler mot påfolgende JM-angrep, men en vesentlig prosent av fugler inokulert med dette cellefrie preparat dbde etter inokuleringen slik at man ikke anså cellefri JM-V så brukbar som vaksine mot bMareks sykdom. Det var altså atter tydelig at for å fremstille en tilfredsstillende vaksine måtte man finne en eller annen metode til å redusere JM-V-preparatets patogene natur.

Preparat nr. VR-736 (0,1 ml helt blod fra dodende kylling) ble injisert i plommesekkene 4-7 dager gamle fjærkre-fostere og derpå hostet 7 dager etter inokulering og overfort

på nytt i fugleembryo. Etter et tilstrekkelig antall overføringer fant man at preparatet var modifisert til et punkt hvor det ikke lenger var patogent for kyllinger. Man fant nå overraskende at dette modifiserte, ikke-patogene preparat hadde beholdt den sterke immunogene karakter slik at dette modifiserte middel er meget brukbart som vaksine mot Mareks sykdom. Lignende resultater kan oppnås hvis en fibroblastkultur opprettes fra en

fosteroverfbring og materialet fra fibroblastkulturen overfores på nytt til et kulturmedium in vitro.

Det nbyaktige antall overfbringer som er nbdvendig

for å fremstille et ikke-patogent reagens avledet av VR-736

er ikke bestemt ettersom forandringen fra patogen til ikke-patogen både er gradvis og upresis. Etter 10 overfbringer er imidlertid dødeligheten betraktelig redusert og etter 40 overfbringer synes preparatet å være tilstrekkelig modifisert.

Ca. 50 overfbringer anbefales for ekstra sikkerhet. Det nød-vendige antall overfbringer er et antall som tilveiebringer en ikke-patogen vaksine i motsetning til det patogene utgangsstoff (VR-736).

Det har vært ubetydelige tap ved Mareks sykdom blant

ca. 2.000 kyllinger vaksinert med modifisert reagens fremstilt etter 50 overfbringer via hbnseembryo og senere utsatt for virus som gav Mareks sykdom hos ubehandlede dyr, mens tapene var betraktelig blant hbns vaksinert med HVT-vaksine og utsatt for virus på samme måte.

Dette illustreres ved hjelp av folgende tabell II,

hvor virkningen av JM og JM-V (preparat nr. VR-736) er vist for separate grupper, av en dag gamle kyllinger, den ene gruppen ble'vaksinert ved injeksjon av 2.000 platedannende enheter av HVT-vaksine og den andre gruppen ble injisert med 10 CEID^q av vaksine i henhold til foreliggende oppfinnelse som ble fremstilt ved 50 overfbringer av preparat nr. VR-736 gjennom fuglefostere og gav det modifiserte ikke-patogene, men sterkt immunogene materiale. Anbefalt dose for markedsført HVT-vaksine er 1.000 platedannende enheter.

I ovenstående tabell ble en forsokskylling betraktet som "angrepet" hvis den enten dbde eller viste lymfesvulst-lignende sår av typen Mareks sykdom. CLD, CID og CEID er for-kortelser for respektivt letal-kyllingdose (chick lethal dose), infeksjons-kyllingdose (chick infeetive dose) og kyllingføster-infeksjonsdose (chick embryo infeetive dose).

Vaksinen ifolge oppfinnelsen kan også brukes til vaksinering av utklekkingshons og fuglene vil overfore kongenital immunitet til avkommet, som varer i 3 - 5 uker i middel, og etter dette tidsrom er kyllingene immunologisk bedre istand til å mote markinfeksjoner med Mareks sykdom. Siden broilere vanligvis slaktes ca. 7 uker gamle, vil slike broilere for slakt ikke ha tid til å utvikle vesentlige tumordannelser hvis de eventuelt infiseres med Mareks sykdom etter at den kongenitale immunitet er borte.

En foretrukket plan for immunisering av fjærkreflokker hvor fuglene skal drettes opp ut over noen få ukers alder er å vaksinere honsemoren parenteralt med f.eks. 100 CEID^q av vaksinen ifolge oppfinnelsen og å vaksinere avkommet omtrent 1 dag gammelt for å gi dyret immunitet etter at den medfodte immunitet er borte. En ytterligere vaksinering av avkommet ca. 3 uker gammelt eller noe senere forsterker immuniteten.

Den folgende tabell III viser virkningen av passive (hunnlige) antistoffer på virusangrep av cellefri JM-virus på kyllingavkom fra kylling-modre vaksinert med 100 CEID^q cellefritt JM-V-materiale, sammenlignet med kyllinger fra noner

vaksinert med 5.000 platedannende enheter av kjent HVT-vaksine,

og sammenlignet med kyllinger fra uvaksinerte noner. Angrepet bestod i alle. tilfeller av 0,1 ml JM-virus (10^'<8>CID^q pr. ml)

i angitt fortynning. Som det fremgår av nedenstående tabell var cellefritt JM-V-materiale mye mer effektivt til å gi passiv immunitet til avkom fra vaksinerte noner enn kjent HVT-vaksine. Videre viste forsok på reisolering av JM-virus at virusnivået

hos kyllinger fra noner vaksinert med cellefritt JM-V-materiale var. meget lite sammenlignet med den HVT-vaksinerte gruppen. Dette illustrerer dramatisk den antistoff-respons som kan oppnås med JM-V-materiale. Som tidligere nevnt, er imidlertid cellefritt JM-V ikke fullstendig sikkert, og selv om overlevende dyr be-skyttes, vil en viss prosent do pga. Mareks sykdom ved vaksinering med umodifisert JM-V.

Forholdet vedrorende den foreliggende vaksinens sikkerhet i forhold til umodifisert cellefri JM-V-materiale illustreres klart av folgende tabell IV som viser antall overlevende kyllinger vaksinasjon en dag gamle, fulgt av en for-sterkende vaksinasjon etter tre uker med umodifisert cellefri JM-V, sammenlignet med antall overlevende kyllinger ved vaksinasjon i henhold til oppfinnelsen. I hvert tilfelle ble 100 CID^Q-vaksine benyttet pr. kylling for den fbrste vaksinasjon og den andre vaksinasjon. De fuglene som dbde gjorde dette som et resultat av vaksinasjonen, hvilket viser de farer som er forbundet ved bruk av umodifisert materiale sammenlignet med sikkerheten som oppnås ved å benytte foster-overfort materiale i henhold til oppfinnelsen.

I ovenstående tabell angir tallene antall overlevende/ antall vaksinerte for hver gruppe.

Enkelte av de overlevende fra begge grupper av vaksinerte dyr©(vaksinert med cellefri JM-V og med foster-serie-overfbrt materiale) samt en gruppe dyr vaksinert med HVT., ble derpå utsatt for 2.000 IA-q JM-V-virus 6 uker gamle. Som man ser av tabell V, gav både cellefritt og embryo-overfort materiale total beskyttelse, mens HVT gav en tydelig, men ikke fullstendig beskyttelse sammenlignet med uvaksinerte kontrolldyr.

I alle tilfeller betegner tallene overlevende/forsbksdyr.

Immun-responsen (serums-nbytraliserings-styrke) for mottagelige P-linje-kyllinger vaksinert en dag gamle og tre

..uker gamle med 2.000 PFH kjent HVT-vaksine eller 100 CEID^q av vaksine i henhold til oppfinnelsen eller naturlig marksmittet med Mareks sykdom fremgår av fig. 1. Som man ser av fig. 1

er immun-responsen ved vaksinering i henhold til oppfinnelsen mye stbrre enn for uvaksinerte fugler eller fugler behandlet med HVT-vaksine.

Immun-responsen (serium-nbytraliseringsrstyrke) for mottagelige kyllinger av P-linje-avkom og resistent N-linje-avkom med stort eller lite innhold av passive (arvede), antistoffer, vaksinert en dag gamle og tre uker gamle med 0,1 ml embryomateriale etter 18 og 21 overfbringer, respektivt, via kylling-embryo med utgangspunkt i blod fra en dbdende kylling som på forhånd var inokulert med VR-736, er vist på fig. 2. Som.det fremgår mistet uvaksinerte kontrolldyr, både N- og P-linje-kyllinger, hurtig det meste av start-immuniteten og hadde etter tre uker meget' lave antistoffnivåer. Fig. 3 illustrerer antistoffnivået for P-linje og N-linje-kyllinger ved indirekte fluorescering, hvilke kylling-serier inneholdt hby konsentrasjon eller lav konsentrasjon av passive (arbede) antistoffer, vaksinert en dag gamle og etter tre uker med embryo-vaksine avledet fra VR-736 i henhold til oppfinnelsen. Det fremgår at antistoffkonsentrasjonen er mye hbyere for dyr vaksinert med oppfinnelsens vaksine enn for ubehandlede fugler. Fig. 4 illustrerer graden av og varigheten av aktiv immunrespons, målt ved serumnbytralisering mot JM-virus in vitro, på 18 måneder gamle P- og N-linje-kyllinger inokulert intramuskulært med 100 CEID,-n vaksine fremstilt som cellefritt

50

JM-V-materiale. Graden av immun-respons sees å være mye hoyere

for både P- og N-linje-kyllinger etter vaksinering og immun-responsen holder seg som det fremgår over en lengre periode,

hvilket igjen illustrerer antistoff-responsen på inokulering med JM-V-avledet materiale.

Vaksinen i henhold til oppfinnelsen kan behandles

på vanlig måte. Som tidligere nevnt kan det hostede eggeplomme-sekkmateriale etter mange overfbringer med utgangspunkt i VR-736 brukes direkte, f.eks. ved å ta ut 0,1 ml materiale og injisere dette i et dyr. Dette materiale har en styrke på omkring Hr CEID^q pr. ml.

For bruk i stbrre målestokk bor det hostede materiale

fra eggeplommen fortrinnsvis stabiliseres med en av de mange kjente stabiliseringssammensetningér. f.eks. med et likt volum stabilisator inneholdende 7% DMSO, 10% kvegfosterserum og resten medium 199. Temperaturen på det stabiliserte utvundne materi-

ale bor senkes med en hastighet på 1°C pr. minutt til -60°C og lagres i flytende nitrogen. For bruk bor det frosne, stabili-

serte materiale tines hurtig i vann ved romtemperatur og for-

tynnes med et farmasbytisk fortynningsmiddel som 1/4 sterk tryptosefosfatmedium eller fosfatpufret saltvann ved pH 7,2. Mengden fortynningsmiddel er typisk 100 - 1.000 ganger volumet av opp-tint materiale, avhengig av vaksinens"styrke og bruksmåten.

Vaksinen kan eventuelt frysetbrkes for lettere lagring

og behandling og vaksinen kan fåes i cellefri form ved å knuse cellene ved ultralydbehandling, frysetining etc.

Vaksinen kan gis på mange måter, deriblant subkutant, intremuskulært eller intraabddmmalt ved injeksjon med ca. 10 -

100 kyllingfoster-infeksjonsdoser på 50% (CEID^q), eller ad andre naturlige infeksjonsveier som per os, via respirasjons-systemet eller byet, i hvilke tilfeller 100 - 1.000 CEID^q kan være nbdvendig for å oppnå effektive resultater. En spesielt hensiktsmessig metode består i å lage en aerosolspray som inneholder vaksinen i et lukket rom som inneholder fuglene som skal

vaksineres.

Et særlig viktig trekk ved oppfinnelsen er at et reagens (VR-736) som er istand til å indusere eksepsjonelt kraftig antistoff-respons hos vert-dyret er behandlet inntil preparatet har mistet den patogene evne samtidig som det har beholdt evnen til å indusere antistoff-respons hos vertsfuglen, hvilket gjor det mulig å fremstille en vaksine som både er sikker og effektiv.

Den ovenstående detaljerte beskrivelse av en foretrukket utforelse av oppfinnelsen skal ikke begrense denne ut over de vedlagte krav.

Claims (9)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en immunogen og ikke-patogen vaksine for immunisering av fjærkre mot Mareks sykdom, karakterisert ved at man overforer et virulent reagens i form av ATCC nr. VR-736 til fjærkre-embryo, hoster dette fostermateriale etter flere dager, serieoverforer det hostede materialet inntil reagenset viser seg ikke-patogent for levende fjærkre og utvinner materialet som er immuno-gent og ikke-patogent for Mareks sykdom hos fjærkre.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det hostede materiale serieoverfbres via fjærkre-embryo.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det hostede materiale serieoverfbres via cellekulturer in vitro.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, karakterisert ved at fostermaterialet hostes etter ca. 1 uke og overfores på nytt .til plommesekken i fjærkre-embryo med omkring en ukes mellomrom inntil man har fått et materiale som er ikke-patogent for en dag gamle kyllinger.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at fostermaterialet hostes og overfores gjennom minst 40 overfbringer.

6. Fremgangsmåte for behandling av fjærkre, karakterisert ved at man gir en vaksine avledet fra en virus i form av ATCC No.

VR-736, samt et farmasbytisk bæremedium, til nevnte fjærkre, i tilstrekkelig mengde til å danne hbye konsentrasjoner av antistoffer hos dette fjærkre, som hindrer utvikling av Mareks sykdom, og gir vaksinen til oppdrett-fuglenes avkom i en effektiv mengde slik at avkommet forblir immunt mot Mareks sykdom etter utlopet av den normale medfodte immunitet.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, karakterisert ved at vaksinen gis parenteralt til oppdrett-fuglene og deres avkom.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, karakterisert ved at vaksinen gis til avkommet som aerosolspray innen-for et avgrenset område.