NO329111B1 - Forbindelse, immunologisk adjuvanssammensetning omfattende denne, vaksinesammensetning omfattende et antigen og en adjuvansforbindelse samt anvendelse av et antigen og en adjuvansforbindelse - Google Patents

Description

IMMUNOLOGISK AD JUVANSFORBINDELSE

Foreliggende oppfinnelse vedrører en forbindelse, en immunologisk adjuvanssammensetning omfattende denne, vaksinesammensetning omfattende et antigen og en adjuvansforbindelse samt anvendelse av et antigen og en adjuvansforbindelse.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Vaksiner har vist seg å være vellykkede, høyt aksepterbare metoder for forebygging av smittsomme sykdommer. De er kostnadseffektive og induserer ikke antibiotisk resistens mot målpatogenet eller påvirker normal flora tilstede i verten. I mange tilfeller, som for eksempel ved induksjon av antiviral immunitet, kan vaksiner forebygge en sykdom for hvilken det ikke finnes noen kurative eller forbedrende behandlinger tilgjengelig.

Vaksiner fungerer ved å utløse immunsystemet for å iverksette en respons til et middel eller antigen, typisk en smittsom organisme eller en del derav som innføres i kroppen i en ikke smittsom eller ikke patogen form. Når først immunsystemet er blitt "initiert" eller sensitivert til organismen, vil senere eksponering av immunsystemet for denne organisme som et smittsomt patogen resultere i en hurtig og robust immunrespons som ødelegger patogenet før det kan formere seg og infisere nok celler i vertsorganismen til å utløse sykdomssymptomer.

Midlet eller antigenet anvendt for å initiere immunsystemet kan være hele organismen i en mindre smittsom tilstand, kjent som en "svekket" organisme, eller i noen tilfeller komponenter av organismen, som for eksempel karbohydrater, proteiner eller peptider som representerer forskjellige strukturelle komponenter av organismen.

I mange tilfeller er det nødvendig å forsterke immunresponsen til antigenene tilstede i en vaksine for å stimulere immunsystemet i en tilstrekkelig grad til å gjøre en vaksine effektiv, dvs. gi immunitet. Mange protein- og de fleste peptid- og karbohydratantigener tilført alene, utløser ikke en tilstrekkelig antistoffrespons til å gi immunitet. Slike antigener må frembys til immunsystemet på en slik måte at de gjenkjennes som fremmede og vil utløse immunrespons. For å oppnå dette er det utviklet tilsetningsstoffer (adjuvansmidler) som immobiliserer antigener og stimulerer immunresponsen.

Det best kjente adjuvansmiddel, Freunds komplette adjuvansmiddel, består av en blanding av mycobakterier i en olje/vann-emulsjon. Freunds adjuvansmiddel virker på to måter, først ved å øke celle- og humoralformidlet immunitet, og dernest ved å blokkere hurtig spredning av antigeneksponeringen ("depot-virkningen"). På grunn av hyppige toksiske, fysiologiske og immunologiske reaksjoner til dette materiale, kan imidlertid Freunds adjuvansmiddel ikke anvendes i mennesker.

Et annet molekyl som har vist seg å ha immunstimulerende- eller adjuvansmiddel-virkning er endotoksin, også kjent som lipopolysakkarid (LPS). LPS stimulerer immunsystemet ved å utløse en "iboende" immunrespons - en respons som har utviklet seg til å gjøre en organisme i stand til å gjenkjenne endotoksin (og de innvaderende bakterier hvorav dette er en komponent) uten behov for at organismen tidligere er eksponert. Mens LPS er for giftig til å være et mulig adjuvansmiddel blir molekyler strukturmessig relatert til endotoksin, som for eksempel monofosforyllipid A ("MPL") testet som adjuvansmidler i kliniske forsøk. Hittil er imidlertid det eneste FDA-godkjente adjuvansmiddel for bruk i mennesker aluminiumsalter ("alun") som anvendes som "depot" for antigener ved utfelling av antigenene. Alun stimulerer også antigenenes immunrespons.

Inoue et al. beskriver, i Immunochemical Studies of Phospholipids II: Syntheses of Cardiolipin and Its Analogues, Chem,. Pharm. Bull., 1968, vol. 16, no. 1, side 76-81, fremstillingen av cardiolipin og cardiolipinanaloger som skiller seg fra forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse. Forbindelsene som beskrives reagerer med Wassermann antistoff og benyttes ved påvisning av syfilis.

Inoue et al. beskriver, i Immunological Studies of Phospholipids IV: The Reactivities of Antisera against natural Cardiolipin and synthetic Cardiolipin Analogues-containing Antigens, Chem. Phys. Lipids, 1969, vol. 3, side 70-77, likeledes cardiolipiner og cardiolipinanaloger. Det ble blant annet funnet at det kan foreligge immunologiske forskjeller mellom cardiolipin antigen og antigener inneholdende syntetiske analoger.

Det er således et erkjent behov på området for forbindelser som kan tilføres sammen med antigener for å stimulere immunsystemet til å generere en mer robust antistoffrespons til antigenet enn det ville sees hvis antigenet ble injisert alene eller med Alun.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

I et aspekt er den foreliggende oppfinnelse rettet mot nye forbindelser som fungerer som immunologiske adjuvansmidler når de administreres sammen med antigener som for eksempel vaksiner for bakterielle og virale sykdommer.

I et annet aspekt er foreliggende oppfinnelse rettet mot nye sammensetninger av adjuvansmiddel som omfatter minst en adjuvansforbindelse ifølge oppfinnelsen.

I et tredje aspekt er oppfinnelsen rettet mot nye vaksinesammensetninger som omfatter et antigen og minst en av adjuvansforbindelsene ifølge oppfinnelsen.

Ved et ytterligere aspekt er den foreliggende oppfinnelse anvendelse av en effektiv mengde av et antigen og en effektiv mengde av en adjuvansforbindelse for fremstilling av et medikament for å stimulere en immunrespons mot nevnte antigen.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Figur 1 er en graf som viser resultatene av et in vitro forsøk for induksjon av cytokin frigivelse ved hjelp av forbindelsen 100,184, eller 186 ifølge oppfinnelsen. Figur 2 er en graf som viser stimulering av alkalisk fosfataseuttrykking fra en induserbar reporterkonstruksjon med TNF-promoteren (TNF-PLAP) i THP-1-celler ved hjelp av forbindelsene 106 og 126 i fravær og nærvær av 10 % serum. Figur 3 er en graf som viser stimulering av IL-10 frigivelse fra normale musesplenocyter ved hjelp av forbindelse 104,106,124,126,160 og 162 ifølge oppfinnelsen. Figur 4 er en graf som viser stimulering av interferon-gamma frigivelse fra normale musesplenocyter ved hjelp av forbindelse 104,106,124,126,160 og 162 ifølge oppfinnelsen. Figur 5 er en graf som illustrerer resultatene av serum titreringsanalyse for bestemmelse av mengden antistoff som produseres i respons til albuskjell hemocyanin i fravær av og nærvær av forbindelsene 100,116,126,160 og 184 ifølge oppfinnelsen. Figur 6 er en graf som illustrerer resultatene av serum titreringsanalyse for å bestemme mengden av antistoff produsert i respons til tetanus toksoid i fravær og nærvær av forbindelsene 100,116,126,160 og 184 ifølge oppfinnelsen.

DETALJERT BESKRIVELSE AV DE FORETRUKNE UTFØRELSESFORMER

Foreliggende opprinnelse er rettet mot nye forbindelser med formel I

hvori:

RI er valgt fra gruppen bestående av

(a) C(O); (b) C(0)-Ci-i4 alkyl-C(O), hvori C1.14 alkyl eventuelt er substituert med hydroksy, C1-5 alkoksy, C1.5 alkenylendioksy, C1. 5 alkylamino, eller C1.5 alkylaryl, hvori aryldelen av C1.5 alkylaryl eventuelt er substituert med C1.5 alkoksy, C1.5 alkylamino, C1.5 alkoksyamino, C1.5 alkylamino, C1.5 - C1.5 alkoksy, -O-C1-5 alkylamino-Ci.5 alkoksy, -O-C1.5 alkylamino-C(O)-C1.5 alkyl C(0)OH, -O-C1-5 alkylamino-C(0)-Ci.5 alkyl-C(0)-Ci.5 alkyl; (c) C2 til C15 rettkjedet eller forgrenet alkyl som eventuelt er substituert med hydroksy eller alkoksy; og (d) -C(0)-C6-i2 arylen-C(O)- hvori arylen eventuelt er substituert med hydroksy, halogen, nitro eller amino;

a og b er uavhengig 0,1,2, 3 eller 4;

d, d', d", e, e' og e" er uavhengig et helt tall fra 1 til 4;

X<1>, X<2>, Y<1> og Y<2> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av null, oksygen, NH og N(C(0)CM alkyl), ogN(CM alkyl)2;

W<1> og W<2> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av karbonyl, metylen, sulfon og sulfoksid;

R<2> og R<5> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av:

(a) C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkyl som eventuelt er substituert med okso, «hydroksy eller alkoksy; (b) C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkenyl eller dialkenyl som eventuelt er substituert med okso, hydroksy eller alkoksy; (c) C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkoksy som eventuelt er substituert med okso,

hydroksy eller alkoksy;

(d) -NH-C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkyl, hvori alkylgruppen eventuelt er

substituert med okso, hydroksy eller alkoksy; og

(e)

hvori Z er valgt fra gruppen bestående av O og NH, og M og N er uavhengig valgt fra gruppen bestående av C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkyl, alkenyl, alkoksy, acyloksy, alkylamino og acylamino;

R<3> og R<6> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkyl eller alkenyl eller eventuelt substituert med okso eller fluor;

R<4> og R<7> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av C(0)C2 til C2o rettkjedet eller forgrenet alkyl eller alkenyl; C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkyl; C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkoksy; C2 til C2o rettkjedet eller forgrenet alkenyl; hvori alkyl-, alkenyl- eller alkoksygruppene uavhengig og eventuelt kan være substituert med hydroksy, fluor eller d til C5 alkoksy;

G1, G2, G<3> og G<4> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av oksygen, metylen,amino, tiol, -NHC(O)-, og -N(C(0)CM alkyl);

eller G<2>R<4> eller G<4>R<7> kan sammen være et hydrogenatom eller hydroksyl;

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Den foreliggende oppfinnelse omfatter også immunologiske adjuvanssammensetninger omfattende en forbindelse med formel I

hvori:

R<1> er valgt fra gruppen bestående av

(a) C(O); (b) C(0)-Ci-i4 alkyl-C(O), hvori Ci.14 alkyl eventuelt er substituert med hydroksy, C1.5 alkoksy, C1.5 alkenylendioksy, C1.5 alkylamino, eller C1.5 alkylaryl, hvori aryldelen av C1.5 alkylaryl eventuelt er substituert med C1.5 alkoksy, C1-5 alkylamino, C1.5 alkoksyamino, C1.5 alkylamino-Ci-5 alkoksy, -O-C1.5 alkylamino-Ci.5 alkoksy, -O-C1.5 alkylamino-C(0)-Ci-5 alkyl C(0)OH, -O-C1.5 alkylamino-C(0)-Ci.5 alkyl-C(0)-Ci.s alkyl; (c) C2 til C15 rettkjedet eller forgrenet alkyl som eventuelt er substituert med hydroksy eller alkoksy; og (d) -C(0)-C6-i2 arylen-C(O)- hvori arylen eventuelt er substituert med hydroksy, halogen, nitro eller amino;

a og b er uavhengig 0,1, 2, 3 eller 4;

d, d', d", e, e' og e" er uavhengig et helt tall fra 1 til 4;

X<1>, X2, Y<1> og Y<2> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av null, oksygen, NH og N(C(0)CM alkyl), ogN(CM alkyl)2;

W<1> og W<2> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av karbonyl, metylen, sulfon og sulfoksid;

R og R er uavhengig valgt fra gruppen bestående av:

(a) C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkyl som eventuelt er substituert med okso, hydroksy eller alkoksy; (b) C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkenyl eller dialkenyl som eventuelt er substituert med okso, hydroksy eller alkoksy; (c) C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkoksy som eventuelt er substituert med okso,

hydroksy eller alkoksy;

(d) -NH-C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkyl, hvori alkylgruppen eventuelt er

substituert med okso, hydroksy eller alkoksy; og

(e)

hvori Z er valgt fra gruppen bestående av O og NH, og M og N er uavhengig valgt fra gruppen bestående av C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkyl, alkenyl, alkoksy, acyloksy, alkylamino og acylamino;

R og R er uavhengig valgt fra gruppen bestående av C2 til C2o rettkjedet eller forgrenet alkyl eller alkenyl eller eventuelt substituert med okso eller fluor;

R<4> og R<7> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av C(0)C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkyl eller alkenyl; C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkyl; C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkoksy; C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkenyl; hvori alkyl-, alkenyl- eller alkoksygruppene uavhengig og eventuelt kan være substituert med hydroksy, fluor eller Ci til Cs alkoksy;

G1, G2, G3 og G<4> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av oksygen, metylen,amino, tiol, -NHC(O)-, og -N(C(0)CM alkyl);

eller G<2>R<4> eller G<4>R<7> kan sammen være et hydrogenatom eller hydroksyl;

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

I foretrukne forbindelser ifølge oppfinnelsen er en eller flere av de følgende tilstede: Hver av a og b er 2; hver av X<1> og Y<1> er NH; R<1> er C(O) eller C(0)-CM4 alkyl-C(O); hver av d' og e' er 1; hver av d" og e" er 1; X er O eller NH, mer foretrukket NH; og W er C(O); eller hver av d' og e' er 2.

I videre foretrukne utførelsesformer er R' C(0)Cm4 alkyl-C(O), hvori Cuh alkyl er substituert, for eksempel med en C1.5 alkoksygruppe.

I en mest foretrukket utførelsesform er oppfinnelsen rettet mot forbindelse ER 803022, ER 803058, ER 803732, ER 804053, ER 804057, ER 804058, ER 804059, ER 804442, ER 804680 og ER 804764, og blandinger inneholdende disse forbindelser.

Oppfinnelsen er også rettet mot en vaksinesammensetning som er kjennetegnet ved at den omfatter et antigen og en adjuvansforbindelse med formel I som omtalt ovenfor i henhold til krav 10.

Videre omfatter oppfinnelsen anvendelse av en effektiv mengde av et antigen og en effektiv mengde av en adjuvansforbindelse med formel I som angitt ovenfor for fremstilling av et medikament for å stimulere en immunrespons mot nevnte antigen i henhold til søknadens selvstendige krav 13.

Definisjoner

Karbonyl som anvendt heri er en (C=0) del.

Dikarbonyl, som anvendt heri, er en del med strukturen (C=0)-alkyl-(C=0) eller (C=0)-aryl-(C=0), som er bundet til et molekyl gjennom karbonatomene i begge de terminale karbonyldeler.

Okso, som anvendt heri, er en =0 gruppe.

Alkylester, som anvendt heri, er en del med strukturen 0-(C=0)-alkyl, som er bundet til et molekyl gjennom det ikke-dobbeltbundne oksygen i estergruppen.

Alkenylester, som anvendt heri, er en del med en struktur 0-(C=0)-karbonkjede, der karbonkjeden inneholder en karbon til karbonbinding som er bundet til et molekyl gjennom det ikke-dobbeltbundne oksygen i estergruppen.

Betegnelsen "alkylen" angir en bivalent rettkjedet eller forgrenet alkylhydrokarbongruppe.

Betegnelsen "alkenylen" angir en bi valent, rettkjedet eller forgrenet hydrokarbongruppe med en enkelt karbon til karbon dobbeltbinding.

Betegnelsen "dialkenylen" angir en bivalent, umettet, rettkjedet eller forgrenet hydrokarbongruppe med to karbon til karbon dobbeltbindinger.

Betegnelsen "arylen" refererer til en bivalent, aromatisk gruppe.

Forkortelsen "Boe" som anvendt heri, angir t-butyloksykarbonyl.

Som anvendt heri med henvisning til forbindelser og blandinger ifølge oppfinnelsen, refererer betegnelsen "type 1" til de forbindelser ifølge oppfinnelsen som tilsvarer formel I i det foregående hvor verdiene av a og b er de samme; verdiene av d og e er de samme; verdiene av

11 9 9

d' og e' er de samme; verdiene av d" og e" er de samme; X og Y er de samme; X og Y er 19 9 ^ 13 "X f* de samme; W og W er de samme; R og R er de samme; G og G er de samme; R og R er de samme; G<2> og G<4> er de samme; og R<4> og R<7> er de samme. 'Type 2" som anvendt heri, refererer til forbindelser eller blandinger tilsvarende formel I hvor hvilke eller hvilken som helst av de følgende gjelder: Verdiene av a og b er forskjellige, verdiene av d og e er forskjellige, verdiene d' og e' er forskjellige, verdiene av d" og e" er forskjellige, X<1> og Y<1> er forskjellige; X<2> og Y<2> er forskjellige; W<1> og W<2> er forskjellige; R2 og R<5> er forskjellige; G<1> og G<3> er forskjellige; R<3> og R<6> er forskjellige; G2 og G<4> er forskjellige eller R<4> og R<7> er forskjellige. ;I tilfellet av en terminologikonflikt er den foreliggende fremstilling den bestemmende. ;Generelle svntesemetoder ;1. Syntese av diamidforbindelser ;Generelt blir 2-amino-l,3-dihydroksypropan eller (±) serinol omdannet til 2-azido forbindelse ved reaksjon med trifluormetansulfonylazid etterfulgt av beskyttelse som per-acetatet for lett manipulering. Den resulterende forbindelse deacetyleres, etterfulgt av reaksjon med en passende aktivert primær alkohol av en dioldel. Den primære alkoholdel av produktet fra denne reaksjon blir så beskyttet, for eksempel ved å anvende TBDPSC1, etterfulgt av reaksjon med fosgen og deretter allylalkohol, for å gi en fullstendig beskyttet diol. Den beskyttede diol blir så behandlet for å spalte den beskyttende gruppe fra den primære alkohol. Den ubeskyttede alkohol omsettes med et passende funksjonalisert fosforyleirngsmiddel med formel(l 1), som indikert i eksemplene, for å danne en fosfatesterforbindelse. Azidodelen av produktet reduseres og omsettes så med en aktivert acylform for å danne et amid. Det beskyttede terminale amin på det funksjonaliserte fosfat avbeskyttes og omsettes deretter med et fosgen eller en dikarboksylsyre i nærvær av et dehydratiserende middel som for eksempel EDC. Fosfatgruppene i den resulterende forbindelse blir så avbeskyttet og gir et racemisk amid. ;2. Syntese av chirale diamidforbindelser av type 1 ;Generelt blir en chiral aminosyreester med den ønskede struktur beskyttet med en benzimidatester. Den beskyttede forbindelse omsettes med et reduksjonsmiddel, for eksempel DIBAL eller liknende for å redusere syredelen av aminosyren til en alkohol. Den resulterende alkoholforbindelse omsettes med en passende aktivert primær alkohol av en diolenhet, etterfulgt av avspalting av benzimidatbeskyttelsesgruppen, og gir en aminodiol. Diolen blir så omsatt med et passende syreklorid til å gi et diolamid. ;Diolamidet blir så omsatt med en passende funksjonalisert fosforyleringsreagens ved den frie primære hydroksylgruppe. Den resulterende forbindelse forestres ved den sekundære alkoholgruppe med en passende acyldel. N-BOC-gruppen blir så avspaltet fra aminogruppen, innført ved hjelp av det fosforylerende reagens (11), og gir en fosfatesterforbindelse med et fritt primært amin. Dette produkt blir så omsatt med fosgen eller en dikarboksylsyre i nærvær av et dehydratiserende middel til å gi et diamidprodukt. De beskyttede fosfatgrupper i diamidproduktet blir igjen avbeskyttet, typisk med palladium (0) og fenylsilan. ;3. Syntese av chirale diamidforbindelser av type 2 ;Chirale diamidforbindelser av type 2 syntetiseres hovedsakelig som beskrevet for chirale diamidforbindelser av type 1 opptil punktet umiddelbart etter avspalting av den beskyttende gruppe fra den primære aminogruppe i fosfatesterforbindelsen. Ved dette punkt blir en dikarboksylsyre som har en av sine syredeler beskyttet, omsatt med den primære amingruppe, til å gi et monoamid. Den beskyttende gruppe på den andre karboksylsyre blir deretter avspaltet og gir en fri karboksylsyre som så kan omsettes med et primært amin fra et alternativt, passende substituert fosfatsystem, i nærvær av et dehydratiserende middel til å gi et diamid av type 2, som så kan behandles for å avbeskytte fosfatgruppen eller gruppene til å gi en ønsket forbindelse ifølge oppfinnelsen. ;I det spesielle tilfellet med chirale ureaforbindelser av type 2 ifølge oppfinnelsen, blir den primære aminogruppe av N-BOC-aminogruppen i fosfatesteren avbeskyttet og deretter omsatt med triklormetylklorformiat eller liknende, for å danne en isocyanatforbindelse. Isocyanatet blir så omsatt med et primært amin fra et alternativt, passende substituert fosfatsystem til å gi et ureaprodukt av type 2. Dette produkt kan så behandles for å avbeskytte fosfatgruppen eller gruppene. ;4. Glyseroldiamidanaloger ;Disse forbindelser ifølge oppfinnelsen har en esterdel knyttet til det karbonatom som er beta til fosfatgruppen i stedet for en amiddel. ;Generelt fremstilles disse forbindelser ved forestering av en beskyttet, chiral glyserol med en aktivert primær alkohol av en dioldel, etterfulgt av forestering av den sekundære alkoholdel, og deretter avbeskyttelse av glyseroldelen til å gi en ny diol. Den primære hydroksylgruppe i diolen blir så beskyttet og den sekundære hydroksylgruppe kondenseres med en acyldel til å gi en diester. Det primære hydroksyl avbeskyttes etterfulgt av forestering med et fosforylerende middel hvorav forbindelsen (11) i det følgende er et eksempel. Etter avbeskyttelse av aminogruppen innført ved det fosforylerende middel omsettes produktet med fosgen eller en dikarboksylsyre ved anvendelse av et dehydratiserende middel som for eksempel EDC. Etterfølgende avbeskyttelse av fosfatgruppen gir forbindelser ifølge oppfinnelsen. ;I syntesen beskrevet generelt i det foregående kan substituenten ved R<1> i forbindelsen ifølge oppfinnelsen lett varieres ved å anvende forskjellige dikarboksylsyreforbindelser. Slike syrer kan kobles til aminogruppen i fosfatestermellomproduktet i reaksjonsskjemaet skissert i det foregående, enten ved anvendelse av et dehydratiserende middel som for eksempel EDC, eller ved å aktivere dikarboksylsyren ved syntetisering, for eksempel det tilsvarende disyreklorid. ;Substituentene representert ved de variable R<2> og R<5> i formel I i det foregående kan lett varieres ved å utnytte en passende aktivert syre eller et syreklorid ved amiderings- eller forestringsreaksjonen av heteroatomet representert ved X eller Y i formel I. ;Substituentene representert ved de variable R<3> og R<6> i formel I kan varieres ved å anvende et mellomprodukt inneholdende det ønskede antall karbonatomer og som også inneholder en aktivert karbonfunksjonalitet, for eksempel et halogen eller sulfonat (OSO2CH3, OSO2CF3, OSO2CH2C6H4-P-CH3), som kan omsettes med azidodiol-, aminoalkohol- eller glyserol-utgangsmaterialer. ;Substituentene representert ved variable R<4> og R<7> i formel I i det foregående kan varieres ved anvendelse av en passende aktivert syre eller et syreklorid ved foresteringen av den sekundære hydroksylgruppe anvendt i reaksjonsskjemaene skissert i det foregående. ;Verdiene av a og b i forbindelsene med formel I kan varieres ved anvendelse av den passende N-BOC beskyttede aminoalkohol når det fosforylerende middel syntetiseres, for eksempel ved hjelp av forbindelse (11) i det følgende. Verdiene av variablene d og e i forbindelser med formel I kan modifiseres ved anvendelse av de passende 2-aminodiol- eller 2-hydroksydiol-utgangsmaterialer. \;Adjuvansmiddel og vaksinesammensetning og tilførsel ;Den foreliggende oppfinnelse er også rettet mot adjuvansmiddelsammensetninger omfattende adjuvansforbindelser ifølge oppfinnelsen, så vel som vaksine og andre immunstimulerende sammensetninger som omfatter adjuvansforbindelsene ifølge oppfinnelsen. Metoder for stimuleringen av en immunrespons til et spesielt antigen kan oppnås ved hjelp av foreliggende oppfinnelse. ;De vertsdyr hvortil adjuvansforbindelsen og de adjuvansmiddelholdige vaksinesammensetninger, ifølge den foreliggende oppfinnelse med fordel tilføres, inkluderer mennesker så vel som ikke-humane pattedyr, fisk, reptiler, etc. ;Typisk anvendes et antigen i blanding med adjuvansforbindelsene ifølge oppfinnelsen. I andre sammensetninger av adjuvansmiddelet ifølge foreliggende oppfinnelse kan det være nyttig ved noen anvendelser å anvende et antigen, kovalent knyttet til en amino-, karboksyl-, hydroksyl-og/eller fosfatdel av adjuvansforbindelsene ifølge oppfinnelsen. Den spesifikke sammensetning av terapeutisk aktive blandinger ifølge den foreliggende oppfinnelse kan således gjennomføres på en hvilken som helst passende måte som vil gjøre adjuvansmiddelet biotilgjengelig, sikkert og effektivt i det individ der sammensetningen tilføres. ;Oppfinnelsen omfatter bredt terapeutiske vaksinesammensetninger som omfatter (i) ett terapeutisk effektivt antigen eller vaksine; og (ii) en adjuvansforbindelse ifølge oppfinnelsen. ;En slik terapeutisk blanding kan for eksempel omfatte minst ett antigenisk middel valgt fra gruppen bestående av: (A) levende, varmedrepte eller kjemisk svekkede virus, bakterier, mykoplasmaer, fungi og protozoer; (B) fragmenter, ekstrakter, subenheter, metabolitter og rekombinante konstruksjoner av (A); (C) fragmenter, subenheter, metabolitter og rekombinante konstruksjoner av ;mammaliaproteiner og glykoproteiner; ;(D) tumorspesifikke antigener; og ;(E) nukleinsyrevaksiner. ;Den terapeutiske blanding kan derfor utnytte ent hvilken som helst egnet antigen- eller ;vaksinekomponent i kombinasjon med en adjuvansforbindelse ifølge oppfinnelsen, for eksempel et antigenisk middel valgt fra gruppen bestående av antigener fra patogene og ikke-patogene organismer, virus og fungi, i kombinasjon med et adjuvansmiddel ifølge oppfinnelsen. ;Som et ytterligere eksempel kan slike terapeutiske blandinger passende omfatte proteiner, peptider, antigener og vaksiner som er farmakologisk aktive for sykdomstilstander og betingelser som for eksempel vannkopper, gul feber, valpesyke, kolera, fjærkrekopper, skarlagensfeber, difteri, tetanus, kikhoste, influensa, rabies, kusma, meslinger, munn- og klovsyke og poliomyelitt. I den resulterende vaksinesammensetning, omfattende (i) et antigen, (ii) minst en adjuvansforbindelse ifølge oppfinnelsen, er antigenet og adjuvansforbindelsen hver tilstede i en mengde effektiv til å utløse en immunrespons når sammensetningen tilføres et vertsdyr, embryo eller egg vaksinert dermed. ;Det er også mulig at forbindelsene ifølge oppfinnelsen kovalent bindes til vaksineantigener, for eksempel over en amino-, karbonyl-, hydroksyl- eller fosfatdel. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan bindes ved hjelp av metoder for å knytte adjuvansmiddelblandingen ifølge oppfinnelsen til vaksineantigener er forstått av vanlige, fagkyndige personer i betraktning av denne beskrivelse. Adjuvansmiddelblandingene kan knyttes til vaksiner ved hvilken som helst av metodene beskrevet i P. Hoffman et al., Biol. Chem. Hoppe- Sayler, 1989, 370:575-582; K.-H.Wiesmuller et al., Vaccine, 1989,7:29-33; K.-H- Wiesmuller et al., Int. J. Peptide Protein Res., 1992,40:255-260; J.-P. Defourt et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 1992, 89:3879-3883; T. Tohokuni et al., J. Am. Chem. Soc., 1994, 116:395-396; F. Reichel, Chem. Commun., 1997, 2087-2088; H. Kamitakahari, Angew. Chem. Int. Ed. 1998, 37:1524-1528; W. Dullenkopf et al., Chem. Eur. J., 1999, 5:2432-2438; ;De resulterende vaksinesammensetninger, inkluderende (i) et antigen, og (ii) en adjuvansforbindelse, blir vanlig anvendt for å indusere en immunologisk respons i et dyr, for eksempel ved å tilføre dyret vaksinesammensetningen, i en mengde tilstrekkelig til å frembringe en antistoffrespons i dette dyr. ;Tilførselsmåtene kan omfatte bruken av hvilke som helst egnede midler og/eller metoder for å avgi adjuvansmiddelet, den adjuvansmiddelholdige vaksine, eller adjuvansmiddelet og/eller antigenet til en eller flere korporlige steder på vertsdyret, hvor adjuvansmiddelet og assosierte antigener er immunstimulerende effektive. Tilførselsmåter kan inkludere parenterale tilførselsmetoder, som for eksempel subkutan (SC) injeksjon, transkutan, intranasal (IN), oftalmisk, transdermal intramuskulær (IM), intradermal (ID), intraperitoneal (IP), intravaginal, pulmonal og rektal tilførsel, så vel som ikke-parenteral, for eksempel oral tilførsel. ;Dosemengden og egnede doseformer for adjuvansmiddelet og vaksineblandingene ifølge den foreliggende oppfinnelse, kan lett bestemmes av de fagkyndige uten for mye eksperimentering, ved bruk av konvensjonelle antistofftiter bestemmelsesmetoder og konvensjonelle bioeffektivitetsÆioforlikelighets protokoller, og avhengig av det spesielle antigen eller terapeutisk middel som anvendes sammen med adjuvansmiddelet, den ønskede terapeutiske virkning, og den ønskede tidsvarighet for bioaktiviteten. ;Adjuvansmiddelet kan fordelaktig tilføres vertsdyret sammen med hvilket som helst andre egnede farmakologisk eller fysiologisk aktive midler, for eksempel antigeniske og/eller andre biologisk aktive substanser. ;Sammensetninger ifølge oppfinnelsen kan inkludere ytterligere komponenter som saltoppløsning, olje, squalen, olje-vann dispersjoner, liposomer og andre adjuvansmidler som for eksempel QS-21, muramyl peptider, Freunds ufullstendige adjuvansmiddel og liknende. ;Svnteseeksempler ;Alle reaksjonsprodukter i syntesemetodene beskrevet i det følgende ga tilfredsstillende NMR-spektra og tynnsjiktkromatografiprofiler på silikagel. All kromatografi ble utført på silikagel og elueringen overvåket ved hjelp av tynnsjiktkromatografi. Alle fullførte reaksjoner ble bestemt ved hjelp av tynnsjiktkromatografisk analyse. Alle reaksjoner ble gjennomført under nitrogen ved romtemperatur med mindre annet spesielt er angitt. Alle reaksjonsløsningsmidler var vannfrie med mindre annet er angitt. Den typiske opparbeidelse for de kjemiske reaksjoner beskrevet i det følgende inkluderer vandige vaskinger, tørking over vannfritt natriumsulfat og fjerning av løsningsmiddel under redusert trykk. ;Eksempel 1: Suksinat-1 ;;En oppløsning av natriumazid (107,67 g) i 250ml vann ble tilsatt 300 ml metylenklorid. Blandingen ble avkjølt til 0 °C og trifluormetansulfonsyreanhydrid (57 ml) ble tilsatt dråpevis med 0,32 ml/minutt takt. Blandingen ble omrørt i ytterligere 6 timer ved 0 °C og lagret ved -20 °C i 72 timer. Blandingen ble oppvarmet til 10 °C etterfulgt av ekstraksjon med metylklorid.i en "teflon"-skilletrakt. De kombinerte organiske lag ble tørket (magnesiumsulfat). Den ovennevnte suspensjon ble sakte filtrert inn i den omrørte oppløsning av (+)-2-amino-l,3dihydroksypropan (1) (9,89 g) i metanol (200 ml) og 4- N. N-dimetylaminpyridin (DMAP, 54g) ved 10 °C. Den resulterende reaksjonsblanding ble omrørt i 17 timer ved romtemperatur. ;Løsningsmiddelet ble fjernet under redusert trykk og resten oppløst i pyridin (200 ml) og avkjølt til 0 °C. Eddiksyreanhydrid (50 ml) ble tilsatt dråpevis og blandingen omrørt i 20 timer ved romtemperatur. Ytterligere eddiksyreanhydrid (20 ml) ble tilsatt og etter 4 timer ble blandingen helt ut på is og opparbeidet på den vanlige måte. Kromatografi ga 16 g diacetat (2) som olje. ;Diacetatet (2) (16 g) ble oppløst i metanol (150 ml) og natriummetallet (2,0 g) ble sakte tilsatt. Blandingen ble omrørt i 90 minutter og "Dowex" 50-8 harpiks ble tilsatt inntil pH var mindre enn eller lik 7. Blandingen ble filtrert etterfulgt ved konsentrasjon av filtratet og kromatografi til å gi 6,73 g av diol (3). ;En suspensjon av natriumhydrid (1,24 g av en 60 % oljedispersjon vasket tre ganger med heksaner og tørket under nitrogen) i dimetylformamid (DMF, 200 ml), ble dråpevis tilsatt azidodiolen (3) (6,73 g) i THF (100 ml), etterfulgt ved dråpevis tilsetning av 3-Æ-hydroksy-l-O-tosyl-l-dekanol (4) (tosylat, 9,44 g) i THF (100 ml). Blandingen ble omrørt i 16 timer, fortynnet med metanol (200 ml), omrørt med "Amberlite" 125 H+ i 25 minutter og konsentrert til tørrhet. Kromatografi ga 4,37 g av (5). ;En oppløsning av diolen (5) (5,32 g) i metylenklorid (30 ml) ble tilsatt trietylamin (TEA, 6 ml) og DMAP (spor), etterfulgt av t-butyldifenylsilylklorid (TBDPSC1, 5 ml) og blandingen ble omrørt over natten. Blandingen ble opparbeidet som vanlig. Kromatografi ga 3,6 g sekundær alkohol (6) som en olje. ;En oppløsning av den sekundære alkohol (6) (2,95 g) i toluen (30 ml) ble tilsatt pyridin (1,8 ml) etterfulgt av en sakte tilsetting av fosgen (14,5 ml av en 1,93 M oppløsning i toluen) ved 0 °C. Etter omrøring ved 0 °C i 20 minutter ble allylalkohol (3,1 ml) dråpevis tilsatt. Etter en ytterligere omrøring i 60 minutter ved romtemperatur ble reaksjonsblandingen opparbeidet på vanlig måte. Kromatografi ga 3,24 g beskyttet alkohol (7) som en olje. ;En oppløsning av beskyttet alkohol (7) (1,29 g) i metylenklorid (3 ml) ble tilsatt flusssyre (HF, 4 ml) i acetonitril (12 ml). Blandingen ble omrørt over natten og opparbeidet på vanlig måte. Kromatografi ga 150 mg av alkoholen (8) som en olje. ;En oppløsning av alkohol (8) (150 mg) i metylenklorid (0,6 ml) ble tilsatt tetrazol (74 mg) og det fosforylerende reagens (11) (175 mg). Etter 30 minutter ble okson (323 mg) i en avkjølt THF (0,5 ml)-vann (0,5 ml) oppløsning tilsatt til den avkjølte reaksjonsblanding. Etter 3 timer ble reaksjonsblandingen opparbeidet på vanlig måte. Kromatografi ga 242 mg av (9) som en olje. ;For å fremstille det fosforylerende reagens (11) ble en oppløsning av destillert diisopropylamin (9,0 ml) i metylenklorid sakte tilsatt tetrazol (4,51 g) ved romtemperatur, etterfulgt av omrøring i 1,5 timer. Allylfosforodiamidit (10) (20,5 ml) ble dråpevis tilsatt i en takt på 6,5 ml/time, etterfulgt av omrøring i ytterligere 3 timer. iV-BOC-2-aminoetanol (10,36 g) i metylenklorid (50 ml) ble dråpevis tilsatt den ovennevnte reaksjonsblanding med en takt på 8,4 ml/time, etterfulgt av omrøring i ytterligere 18 timer. Den hvite suspensjon ble filtrert gjennom "Celite" 545 med to 20ml vaskinger med metylenklorid. Filtratet ble konsentrert, etterfulgt av en suspensjon og filtrering av resten med heksaner (200 ml). Det resulterende heksanfiltrat ble konsentrert til tørrhet og azeotropdestillert med to 10-ml porsjoner av toluen til å gi råproduktet (11) (21,54 g) som en olje. En suspensjon av ditiofenoltinn (1,3 g) i metylenklorid (7,8 ml) ble tilsatt tiofenol (400 ul) etterfulgt av TEA (543 ul). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 15 minutter etterfulgt av stans i omrøringen slik at resten fikk avsette seg på bunnen av kolben. 1,0 ml av den ovennevnte oppløsning ble tilsatt til en oppløsning av azidet (9) (242 mg) i metylenklorid (0,5 ml) og blandingen ble omrørt i 30 minutter. Reaksjonsstans med 0,1 N NaOH etterfulgt av den vanlige opparbeidelse ga 193,1 mg av aminet (12) som en olje. ;En tørket oppløsning av aminet (12) (193 mg) og acylsyre (som kan fremstilles ifølge Christ et al., U.S.Pat.Nr. 5 530 113) (132 mg) i metylklorid ble tilsatt l-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimidhydroklorid (EDC, 93 mg). Etter omrøring ved romtemperatur i 90 minutter ble reaksjonen stanset og blandingen ble behandlet på vanlig måte til å gi 232 mg beskyttet fosfat (13) som en olje. ;En oppløsning av det beskyttede fosfat (13) (232 mg) i metylenklorid (1 ml) ble tilsatt trietylsilan (TES, 120 ul) og trifluoreddiksyre (TFA, 1,2 ml) etterfulgt ved omrøring i 30 minutter. TFA ble fjernet under redusert trykk etterfulgt ved azeotrop destillasjon med 3,5-ml porsjoner av toluen. 20 ml metylenklorid ble tilsatt og blandingen ble opparbeidet på vanlig måte til å gi 174 mg av det fri amin (14) som en olje. ;En tørket oppløsning av det frie amin (14) (174 mg) i metylenklorid (0,5 ml) ble tilsatt ravsyre (12,1 mg) og EDC (59 mg). Etter 1 time ble reaksjonsblandingen opparbeidet på vanlig måte. Kromatografi ga 143,1 mg av blokkert difosfat (15) som en olje. ;En oppløsning av blokkert difosfat (15) (177,9 mg) i avgasset kloroform (1,7 ml) i et tørkeskap ble først tilsatt fenylsilan (PhSiH3, 50 ul), og deretter tetrakis-trifenylfosifnpalladium (0) (Pd(PPH3)4, 70 mg). Etter 1 time ble reaksjonsblandingen fjernet fra tørkeskapet og kloroform metanol: vann 2:3:1 ble tilsatt og blandingen omrørt i 1 time. Blandingen ble helt ut på en dietylaminoetylcellulose (DEAE) kromatografikolonne. Eluering av kolonnen med en lineær gradient på 0,0 M til 0;1 M ammoniumacetat i kloroform:vann 2:3:1, ekstraksjon av de ønskede fraksjoner med et likt volum av kloroform, konsentrasjon til tørrhet og tilsetning av 0,1 N NaOH (175 ul) etterfulgt av frysetørking ga 136,2 mg av (16) som et hvitt, fast stoff. ;Eksempel 2: Chiralt malonat - type 1 ;;En avkjølt oppløsning av kaliumkarbonat (165 g) i vann (575 ml) ble tilsatt metylenklorid (200 ml) etterfulgt av etylbenzimidathydroklorid (17) (100 g) og blandingen ble omrørt i 8 minutter. Lagene ble separert og det vandige lag ekstrahert med metylenklorid. De organiske lag ble kombinert, tørket og løsningsmiddel fjernet under redusert trykk til å gi 83 g av (18). En oppløsning av L-serin metylesterhydroklorid (19) (41,6 g) i 1,2-dikloretan (450 ml) ble tilsatt etylbenzimidat (18) (36 g). Blandingen ble oppvarmet til tilbakeløp i 20 timer, avkjølt, filtrert gjennom diatomejord, og konsentrert til tørrhet til å gi 56 g av etylester (21) som et hvitt, fast stoff. ;En iskald oppløsning av etylester (21) (56 g) i THF (500 ml) ble dråpevis tilsatt diisobutylaluminiumhydrid (DIBAL, 545 ml av en 1 M oppløsning i heksan). Blandingen ble oppvarmet til romtemperatur over natten og deretter forsiktig helt ut på en vandig oppløsning av Rochelle-salt (500 g i 1,01 vann). Blandingen ble omrørt i 1 time og opparbeidet på vanlig måte. Kromatografi ga 25,5 g av alkohol (22) som et hvitt, fast stoff. ;En suspensjon av vasket natriumhydrid (5,3 g av en 60 % oljedispersjon) i DMF (200 ml) ble tilsatt alkoholen (22) (24 g) i 250 ml av THF. Etter 30 minutter ble tosylatet (4) tilsatt i 250 ml THF i løpet av 2,5 timer og omrørt over natten. Blandingen ble avkjølt i is, metanol ble tilsatt, løsningsmiddelet fjernet under redusert trykk og kromatografert til å gi 4,32 g alkohol (24) som en olje. ;Alkoholen (24) (4,3 g) ble oppløst i 4 N vandig saltsyre og oppvarmet under tilbakeløp i 20 timer. Blandingen ble avkjølt, filtrert, ekstrahert med eter, gjort alkalisk med natriumhydroksid og ekstrahert to ganger med kloroform. De kombinerte kloroformlag ble tørket og løsningsmiddelet fjernet til å gi 2,88 g diol (25) som en olje. ;Diolen (25) (2,88 g) ble oppløst i mettet vandig natriumbikarbonat (45 ml) og THF (25 ml) og blandingen ble omrørt i 5 minutter. Myristoylklorid (3,4 ml) ble dråpevis tilsatt over en periode på 25 minutter og deretter ble reaksjonsblandingen omrørt i ytterligere 1 time. Reaksjonsblandingen ble opparbeidet på vanlig måte og kromatografert til å gi 3,7 g av alkohol (26) som en olje. ;En oppløsning av alkoholen (26) (1,78 g) i metylenklorid (140 ml) ble tilsatt tetrazol (683 mg), etterfulgt av det fosforylerende reagens (11) (1,6 ml). Etter 30 minutter ble blandingen avkjølt på is og THF (105 ml) ble tilsatt etterfulgt av en "Oxone"-oppløsning (3 g i 90 ml vann). Etter 5 minutter ble isbadet fjernet og blandingen omrørt i 30 minutter. Reaksjonsblandingen ble opparbeidet på vanlig måte og kromatografert for å gi 2,99 g av alkohol (27) som en olje. ;En oppløsning av alkoholen (27) (3,9 g) i metylenklorid (126 ml) ble tilsatt EDC (10,8 g), DMAP (66 mg) og dodecylsyre (1,62 g) og omrørt over natten. Ytterligere syre (1,6 g), EDC (1 g) og DMAP (0,5 g) ble tilsatt. Etter 3 timer ble reaksjonsblandingen opparbeidet på vanlig måte og kromatografert til å gi 2, 07 g AT-BOC-beskyttet amin (28). ;En oppløsning av det iV-BOC-beskyttede amin (28) (187,3 mg) i metylenklorid (1,5 ml) ble tilsatt TES (240 ul) og TFA (300 ul) og blandingen ble omrørt i 45 minutter. Toluen ble tilsatt og løsningsmiddelet fjernet under redusert trykk. Resten ble oppløst i metylenklorid og opparbeidet på vanlig måte til å gi 154 mg av amin (29) som en olje. ;En iskald oppløsning av aminet (29) (75,6 mg) og malonsyre (4,8 mg) i metylenklorid (0,5 ml) ble tilsatt EDC (27 mg), etterfulgt av fjerning av kjølebadet. Etter 1 time ble tilsatt et spor av DMAP. Etter 2,5 timer ble blandingen direkte kromatografert til å gi 54,1 mg av dimert produkt (30). ;En oppløsning av dimeren (30) (54 mg) i avgasset kloroform (2 ml) ble tilsatt PhSitb (14 og Pd(PPH3)4 (18 mg) etterfulgt av fjerning av kjølebadet. Etter 1 time ble reaksjonen brakt til opphør med kloroform metanol: vann (2:3:1) og helt ut på en DEAE cellulose kromatografikolonne og kromatografert til å gi et halvfast stoff. Faststoffet ble oppløst i sterilt vann og 0,1 N vandig natriumhydroksid (306 ul) ble tilsatt og blandingen frysetørket til å gi et hvitt, fast stoff (31) (25 mg). ;Eksempel 3: Chiralt malonat - type 2 ;;En oppløsning av D-serin metylesterhydroklorid (32) (25 g) i dikloretan (270 ml) ble tilsatt etylbenzimidat (20) (24 g). Etter 20 timer under tilbakeløp ble blandingen avkjølt til romtemperatur, filtrert gjennom diatomerjord og løsningsmiddelet fjernet under redusert trykk til å gi 34 g metylester (33) som et hvitt, fast stoff. ;En iskald oppløsning av etylesteren (33) (34 g) i THF (300 ml) ble tilsatt dråpevis en oppløsning av DIBAL i heksan (1,0 M, 322 ml). Blandingen ble oppvarmet til romtemperatur over natten og ble så helt ut i en vandig oppløsning av Rochelle-salt. Blandingen ble så omrørt i 1 time og opparbeidet. Kromatografi ga 18,6 g av alkohol (36) som et hvitt, fast stoff. ;En suspensjon av vasket natriumhydrid (4 g av en 60 % oljesuspensjon) i DMF (100 ml) ble tilsatt en oppløsning av alkoholen (36) (8,6 g) i THF (40 ml). Blandingen ble omrørt i 1 time og en oppløsning av tosylatet (23) (17,5 g) i THF (40 ml) ble tilsatt. Blandingen ble omrørt over natten og deretter ble ytterligere tosylat (23) tilsatt (5 g) og blandingen ble omrørt i ytterligere 4 timer. Metanol ble tilsatt den avkjølte reaksjonsblandingen, løsningsmiddelet ble fjernet under redusert trykk og resten ble kromatografert til å gi 1,03 g av alkohol (37) som et fast stoff. ;Alkoholen (37) (1,03 g) ble oppløst i 4 N vandig saltsyre (25 ml) og blandingen ble oppvarmet til 100 °C i 20 timer. Ytterligere saltsyre (5 ml) ble tilsatt og tilbakeløpet fortsatte i 6 timer. Blandingen ble avkjølt, vasket med eter, gjort alkalisk med 1 N vandig natriumhydroksid, og ekstrahert (3x) med kloroform. De kombinerte kloroformlag ble tørket og løsningsmiddelet fjernet under redusert trykk til å gi 553 mg av aminodiol (39). ;En oppløsning av aminodiol (39) (553 mg) i THF (3 ml) ble tilsatt mettet vandig natriumbikarbonat (6 ml) etterfulgt av myristoylklorid (628 ul). Etter 5o minutter ble reaksjonsblandingen opparbeidet på vanlig måte. Kromatografi ga 389 mg av amid-diol (41) som en olje. ;En oppløsning av amid-diolen (41) (531 mg) i metylenklorid (40 ml) ble tilsatt tetrazol (203 mg) og blandingen ble omrørt i 5 minutter. Deretter ble det fosforylerende reagens (11) (482 mg) tilsatt. Etter 20 minutter ble tilsatt ytterligere fosforylerende reagens (11) (100 mg), og etter ytterligere 20 minutter ble 100 mg mer tilsatt. Etter ytterligere 20 minutter ble 50 mg mer tilsatt. Etter 20 minutter ble blandingen helt ut i en kald oppløsning av THF (30 ml)/"oxone" (1,07 g)/vann (30 ml). Blandingen ble omrørt ved 0 °C i 5 minutter og deretter i 20 minutter ved romtemperatur idet reaksjonsblandingen etter denne tid ble opparbeidet på vanlig måte. Kromatografi ga 852 mg av fosfatalkoholen (42) som en olje. En oppløsning av fosfatalkoholen (42) (3,9 g) i metylenklorid (126 ml) ble tilsatt EDC (10,8 g), DMAP (66 mg) og dodecylsyre (1,62 g). Reaksjonsblandingen ble omrørt over natten. Ytterligere syre (1,6 g), EDC (1 g) og DMAP (0,5 g) ble tilsatt. Etter 3 timer ble reaksjonsblandingen opparbeidet på vanlig måte og kromatografert til å gi 2,07 g av det beskyttede amin (43). ;En oppløsning av det beskyttede amin (43) (194 mg) i metylenklorid (1,5 ml) ble tilsatt TES (240 ul), og TFA (300 ul). Blandingen ble omrørt i 20 minutter og ytterligere TES (50 ul) og TFA (50 (al) ble tilsatt. Etter 1 time ble toluen tilsatt og løsningsmiddelet ble fjernet under redusert trykk og deretter ble blandingen opparbeidet på vanlig måte. Det rå, frie aminproduktet (44) ble anvendt omgående i den neste reaksjon. ;En iskald oppløsning av det frie amin (29) (43,5 mg) i metylenklorid (250 ul) ble tilsatt mono-t-butylmalonat (8,3 ul), EDC (12,4 mg) og spor av DMAP. Isbadet ble fjernet og etter 2 timer ble reaksjonsblandingen opparbeidet på vanlig måte. Kromatografi ga 44 mg av amid (45). ;En oppløsning av amidet (45) (44 mg) i metylenklorid (0,5 ml) ble tilsatt TES (90 ul) og TFA (100 ul). Etter 2 timer ble toluen tilsatt og løsningsmiddelet fjernet under redusert trykk. Blandingen ble opparbeidet på vanlig måte til å gi 44,2 mg av fri syre (46). ;En iskald oppløsning av den fri syre (46) (41 mg) og det fri amin (44) (26,3mg) i metylenklorid (500 ul) ble tilsatt EDC (13 mg) og blandingen ble omrørt i 30 minutter. Ytterligere EDC (5 mg) og PMAP (2 mg) ble tilsatt og etter 1 time ble reaksjonsblandingen opparbeidet på vanlig måte. Kromatografi ga 32,7 mg av den koblede for bindelse (47) som en olje. ;En oppløsning av den koblede forbindelse (47) (32,7 mg) i avgasset kloroform (1,5 ml) i et tørkeskap ble tilsatt PhSiH3 (8,5 ul) og Pd(PPh3)4 (11 mg). Blandingen ble fjernet fra tørkeskapet og avkjølt i is. Etter 5 minutter ble isbadet fjernet og etter 1 time ble kloroform:metanol:vann (2:3:1) tilsatt og blandingen omrørt i 15 minutter og lagret i fryseren over natten. Blandingen ble så helt ut på en DEAE kromatografikolonne. Kromatografi ga 13,9 mg av en forbindelse (48) som et hvitt pulver etter 0,1 N NaOH behandling etterfulgt av frysetørking. ;Eksempel 4: Chiral ureaforbindelse - type 1 ;;En oppløsning av amin (44) (46,1 mg) i toluen ble tilsatt mettet natriumbikarbonat (0,5 ml) etterfulgt av fosgen (15 ul) av en 1,93 M oppløsning i toluen). Etter 30 minutter ble ytterligere fosgen (10 ul) tilsatt. Etter 2 timer ble ytterligere fosgen (5 ul) tilsatt. Reaksjonen ble brakt til opphør med vandig natriumbikarbonat og opparbeidet på vanlig måte til å gi 29,6 mg urea (49) med beskyttede fosfater. ;En oppløsning av ureaforbindelsen med beskyttede fosfater (49) (29,6 mg) i avgasset kloroform (1,5 ml) i et tørkeskap ble tilsatt PhSiH3 (8 ul). Reaksjonskaret ble fjernet fra tørkeskapet og anbrakt på is. Pd(PPli3)4 (10 mg) ble tilsatt og etter 5 minutter ble isbadet fjernet. Etter 1 time ble reaksjonen brakt til opphør ved tilsetting av kloroform metanol: vann. Blandingen ble omrørt i 15 minutter og lagret over natten i fryseren. Den ble kromatografert på DEAE til å gi 24,1 mg av forbindelsen (50) som et hvitt pulver etter 0,1 N NaOH behandling etterfulgt av frysetørking. ;Eksempel 5: Chiral ureaforbindelse - type 2 ;;En iskald oppløsning av triklormetylklorformiat (2,6 ul) i metylenklorid (200 ul) ble tilsatt en oppløsning av fritt amin (29) (35 mg) og l,8-bis-(dimetylamino)-naftalen i metylenklorid (200 ul). Etter 5 minutter ble isbadet fjernet. Etter 15 minutter ble ytterligere metylenklorid tilsatt og blandingen ble opparbeidet på vanlig måte. Kromatografi ga 9,4 mg isocyanat (51) som en olje. ;En oppløsning av isocyanat (51) (9,4 mg) i metylenklorid (0,2 ml) ble tilsatt en oppløsning av aminet (44) (10,3 mg) i metylenklorid. Etter 15 minutter ble reaksjonsblandingen opparbeidet på vanlig måte. Kromatografi ga 5,5 mg av den koblede forbindelse (61) som en olje. ;En oppløsning av den koblede forbindelse (61) (25,2 mg) i avgasset kloroform (0,5 ml) i et tørkeskap ble tilsatt PhSiH3 (6,6 ul) og Pd(PPh3)4 (8,8 mg). Blandingen ble fjernet fra tørkeskapet og avkjølt i is. Etter 5 minutter ble isbadet fjernet og etter 1 time ble kloroform:metanol:vann (2:3:1) tilsatt og blandingen ble omrørt i 15 minutter og lagret i fryseren over natten. Blandingen ble så helt ut på en DEAE kromatografikolonne. Kromatografi ga 7,5 mg av (62) som et hvitt pulver etter 0,1 N NaOH behandling etterfulgt av frysetørking. ;Eksempel 6: Chiral glyserolanalog av type 1 ;;En omrørt suspensjon av natriumhydrid (145,5 mg av 60 % oljedispersjon vasket med heksaner) i DMF (12 ml) ble tilsatt (S)-(+)-alkohol (63) (0,41 ml) i 8 ml av THF dråpevis i løpet av en 1-times periode. Blandingen ble omrørt i ytterligere 30 minutter etterfulgt av en dråpevis tilsetting av tosylatet (4) (0,789 g) i 10 ml THF i løpet av en 10-minutters periode. Den resulterende reaksjonsblanding ble omrørt over natten. Den vanlige opparbeidelse ga 0,6 mg av det ønskede addukt (65). ;En oppløsning av laurinsyre (1,40 g), EDC (1,35 g), DMAP (0,04 g) og alkoholadduktet (65) (0,564 g) i 4 ml metylenklorid ble omrørt i 15 timer ved romtemperatur. Saltløsning og mettet vandig bikarbonat (1:1) ble tilsatt og blandingen ble ekstrahert med metylenklorid. Blandingen ble opparbeidet på vanlig måte og kromatografert. Den ønskede fraksjon ble oppløst i 20 ml eddiksyre:vann (4:1) og omrørt i 15 timer. Løsningsmiddelet ble fjernet under redusert trykk og resten kromatografert til å gi 0,77 g av den halvfaste diol (66). ;En oppløsning av diolen (66) (0,22 g), DMAP (6,3 mg), TEA (lOOmyl) og TBDPSC1 (164 ul) ble omrørt i 24 timer ved romtemperatur. Metanol (2 ml) og spor av vandig saltsyre ble tilsatt, etterfulgt av ekstraksjon med metylenklorid. Blandingen ble opparbeidet på vanlig måte. Resten ble kromatografert til å gi 0,3 g av. alkoholen (67) som en olje. ;En oppløsning av alkoholen (67) (0,3 g), DMAP (5,5 mg), EDC (258 mg), myristinsyre (308 mg) i metylenklorid (4 ml) ble omrørt i 18 timer ved romtemperatur, etterfulgt av tilsetting av saltløsning og mettet natriumbikarbonat. Blandingen ble opparbeidet på vanlig måte og kromatografert til å gi 0,4 g silylbeskyttet eterprodukt (68). ;En oppløsning av den silylbeskyttede eter (68) (195 mg) i acetonitril (2,7 ml) ble tilsatt 48 % flusssyre (0,756 ml). Etter 30 timer ble mettet natriumbikarbonat tilsatt og blandingen opparbeidet på vanlig måte. Kromatografi ga 94,7 mg av fri alkohol (69). ;En oppløsning av den fri alkohol (69) (57 mg) i metylenklorid (0,5 ml) ble tilsatt tetrazol (15,6 mg) og fosforylerende reagens (11) (40 mg) ved romtemperatur. Etter 4 timer ble blandingen avkjølt til 0 °C etterfulgt av tilsetting av "Oxone" (82 mg) i THF (0,5 ml):vann (0,6 ml). Blandingen ble oppvarmet til romtemperatur og omrørt i 80 minutter. Den endelige reaksjonsblandingen ble opparbeidet på vanlig måte. Kromatografi ga 72 mg av beskyttet fosfat (70). ;En oppløsning av det beskyttede fosfat (70) (72 mg) i metylenklorid (1 ml) ble tilsatt TES (120 ul) og trifiuoreddiksyre (0,6 ml), etterfulgt av omrøring i 1 time. TFA ble fjernet under redusert trykk etterfulgt av azeotrop destillasjon med 10 ml toluen. 20 ml metylenklorid ble tilsatt og blandingen ble opparbeidet på vanlig måte til å gi 0,52 g av en olje. ;Det rå amin ble oppløst i metylenklorid (0,7 ml), etterfulgt av tilsetting av malonsyre (4,5 mg) og EDC (25,6 mg). Blandingen ble omrørt over natten og opparbeidet på vanlig måte til å gi 32,5 mg av det dimere produkt (71). ;Den beskyttede dimeren (71) (32,5 mg) fra den foregående reaksjonen ble oppløst i avgasset kloroform (2 ml) og PhSiH3 (8,6 ul) ble tilsatt i et tørkeskap. Blandingen ble fjernet fra tørkeskapet og Pd(PPh3)4 (22,6 mg), på forhånd veiet i tørkeskapet, ble tilsatt. Etter 2 timer ble blandingen kromatografert på DEAE til å gi 27,9 mg hvitt, fast stoff (72) etter tilsettingen av 1 N natriumhydroksid (34,2 ul) etterfulgt av frysetørking. ;Fremstilling av ER-804253 ;;Alkoholen (558 mg) ble oppløst i metylenklorid (5 ml), avkjølt til 0 °C og trietylamin (0,466 ml) ble tilsatt under en nitrogenatmosfære. Etter omrøring i 5 minutter ble metansulfonylklorid (0,142 ml) tilsatt dråpevis. Blandingen ble omrørt i ytterligere 5 minutter ved 0 °C og deretter oppvarmet til romtemperatur. Etter omrøring i ytterligere 1 time ble blandingen opparbeidet med mettet natriumbikarbonat, ekstrahert med etylacetat og ekstrakten vasket med vann, fortynnet vandig saltsyre, vann, saltløsning, tørket og løsningsmiddelet fjernet til å gi 630 mg. ;Mesylatet (630 mg) og natriumazid (299 mg) ble oppløst i DMSO (6 ml) og oppvarmet til 60 °C i 90 minutter. Etter avkjøling til romtemperatur ble reaksjonsblandingen fortynnet med metylenklorid, vasket med vann og saltløsning. Etter ekstraksjon av de vandige vaskeløsninger ble den kombinerte, organiske fase tørket, konsentrert, renset over silikagel ved bruk av et 4:1 forhold mellom heksaner og etylacetat og de tørkede produktfraksjoner ga 420 mg. ;Azidet (295 mg) ble oppløst i etanol (5 ml) og Lindlar-katalyst (200 mg) ble tilsatt. Etter omrøring under en atmosfære av hydrogengass ved atmosfærisk trykk ble den filtrerte oppløsning tørket til å gi 274 mg. ;Aminet (930 mg) ble oppløst i THF (10 ml) og mettet natriumbikarbonat (22 ml). Etter omrøring i 5 minutter ble lauroylklorid (0,712 ml) tilsatt dråpevis i løpet av 20 minutter. Den endelige blanding ble ekstrahert med kloroform, tørket til å gi 1,45 g. ;Amidet (1,11 g) ble oppløst i metanol (14 ml) og tilsatt 4 N saltsyre (8 ml). Blandingen ble omrørt i 1 time ved 50 °C og deretter konsentrert. Metanol (16 ml) og 40 % natriumhydroksid (8 ml) ble tilsatt og blandingen ble tilbakeløpt i 1 time. Den ble avkjølt, ekstrahert med metylenklorid og ekstraktet vasket med vann, tørket og løsningsmiddelet fjernet til å gi 930 mg. ;Aminoalkoholen ble oppløst i THF (6 ml) og mettet natriumbikarbonat tilsatt (13 ml). Etter 5 minutter ble blandingen avkjølt til 0 °C og myristoylklorid (300 ul) tilsatt. Etter 30 minutter ble blandingen opparbeidet på vanlig måte til å gi 430 mg. ;Alkoholen (101,7 mg) ble oppløst i iskaldt metylenklorid og fosforylerende reagens 11 (90 (il) ble tilsatt, og blandingen omrørt i 30 minutter. Iskaldt "Oxone" (166,3 mg) ble tilsatt og blandingen omrørt i 30 minutter. Reaksjonen ble brakt til opphør med tiosulfat. Blandingen ble opparbeidet på vanlig måte og kromatografert til å gi 174 mg (ikke renset). ;Det beskyttede amin fra den ovennevnte reaksjon ble oppløst i iskaldt metylenklorid (1 ml), trifluoreddiksyre (1 ml) ble tilsatt, og blandingen omrørt i 1 time. TFA ble fjernet og blandingen renset til å gi 106,7 mg. ;Aminet ble oppløst i metylenklorid (3 ml) og mettet natriumbikarbonat oppløsning (3 ml) ble tilsatt. Blandingen ble avkjølt i is, og fosgen i toluen (0,55 ekv.) ble tilsatt dråpevis. Blandingen ble omrørt i 20 minutter og opparbeidet til å gi 112,3 mg. ;En blanding av det blokkerte fosfat (40,5 mg) i iskaldt kloroform (2,6 ml) ble tilsatt fenylsilan (10,7 mg) og tetrakistrifenylfosfinpalladium [0] (28,7 mg) og blandingen ble omrørt i 1 time. Blandingen ble kromatografert på en DEAE kolonne til å gi 27,7 mg av ER-804253. ;Fremstilling av ER-804130 ;;En oppløsning av amidet (3 g) i THF (65 ml) ved -78 °C ble tilsatt en ekvivalent butyllitium, etterfulgt av en oppløsning av nonanoylklorid i THF (6 ml). Vandig ammoniumklorid ble tilsatt og blandingen opparbeidet på vanlig måte til å gi 5,35 g. ;En oppløsning av alkoholen (5 g) i iskaldt metylenklorid (100 ml) ble tilsatt trietylamin (4,1 ml) og mesylklorid (2,1 ml). Blandingen ble omrørt i 4 timer og opparbeidet på vanlig måte til å gi 6,99 g. ;En oppløsning av mesylatet (6,99 g) i iskald DMF (100 ml) ble tilsatt kaliumbromid. Blandingen ble oppvarmet til romtemperatur og omrørt i 5 timer. Blandingen ble opparbeidet på vanlig måte til å gi 4,63 g av en klar olje. ;En oppløsning av amidet (2,8 g) i THF (15 ml) ble tilsatt til en -78 °C oppløsning av natrium bis-trimetylsilylamid i THF (15 ml). Etter 1 time ble bromidet tilsatt og blandingen ble oppvarmet til romtemperatur, opparbeidet på vanlig måte til å gi 1,02 g. ;En oppløsning av olefinet (1,02 g) i EtOAc ble tilsatt palladium på karbon (126 mg) og blandingen ble anbrakt under hydrogen. Etter 4 timer ble blandingen opparbeidet på vanlig måte til å gi 1,0 g. ;En oppløsning av aminet (1,0 g) i iskald THF (20 ml) ble tilsatt vann, hydrogenperoksyd og litiumhydroksid. Den neste dag ble blandingen opparbeidet på vanlig måte til å gi 590 mg av syren. ;En oppløsning av syren i iskald THF (10 ml) ble tilsatt diboran:THF kompleks og blandingen ble sakte oppvarmet. Etter 7 timer ble fortynnet saltsyre forsiktig tilsatt og blandingen opparbeidet på vanlig måte. Råmaterialet ble oppløst i iskald eter og LAH-oppløsning (2 ml av IM) ble tilsatt. Etter 5 minutter ble blandingen opparbeidet på vanlig måte til å gi 556 mg av alkoholen. ;En -78 °C oppløsning av oksalylklorid (2,2 ml) i metylenklorid (10 ml), ble tilsatt DMSO (1,1 ml) og etter 2 minutter ble alkoholen (556 mg) tilsatt i metylenklorid (5 ml). Etter 20 minutter ble trietylamin (1 ml) tilsatt og blandingen ble oppvarmet til 0 °C. Blandingen ble fortynnet med eter og opparbeidet på vanlig måte til å gi 567 mg. ;Wittig-reagenset (679 mg) ble suspendert i THF (10 ml) og KHMDS-oppløsning (4 ml av 0,5M) ble tilsatt. Etter 20 minutter ble blandingen avkjølt til -78 °C og aldehydet (567 mg) i THF (5 ml) ble tilsatt. Etter 15 minutter ble blandingen opparbeidet på vanlig måte til å gi 342 mg. ;En oppløsning av enoleteren (342 mg) i acetonitril (3,5 ml) og vann (0,15 ml) ble tilsatt jodhydrogensyre. Etter 4 timer ble blandingen opparbeidet på vanlig måte til å gi 325 mg. En oppløsning av aldehydet (325 mg) i metanol (10 ml) ble tilsatt natriumborhydrid (38 mg). Etter 3 timer ble reaksjonsblandingen opparbeidet på vanlig måte til å gi 303 mg av alkoholen. ;En iskald oppløsning av alkoholen (303 mg) i metylenklorid (10 ml) ble tilsatt trietylamin (150 ul) og mesylklorid (76 ul). Etter 4 timer ble reaksjonsblandingen opparbeidet på vanlig måte til å gi 352 mg. ;En oppløsning av oksazolin (1 ml) i iskald THF (5 ml) ble tilsatt kalium t-butoksidoppløsning (2,2 ml av IM). Etter 30 minutter ble mesylatet tilsatt i THF (5 ml) og blandingen ble omrørt i 8 timer. Den vanlige opparbeidelse ga 318,5 mg. ;En oppløsning av oksazolinet i metanol (8 ml) og saltsyre (4 ml av 4M) ble oppvarmet til 50 °C i 90 minutter. Ytterligere metanol ble tilsatt og løsningsmiddelet fjernet. Resten ble oppløst i metanol (8 ml) og nalriumhydroksidoppløsmng (4 ml) og hurtig oppvarmet til 50 °C. Blandingen ble avkjølt og ekstrahert med kloroform. Den vanlige opparbeidelse ga 114 mg. En oppløsning av aminet (114 mg) i THF (2 ml) og mettet vandig natriumbikarbonat (2 ml) ble tilsatt syrekloridet. Etter 30 minutter ble ytterligere syreklorid tilsatt. Etter 30 minutter ble reaksjonsblandingen opparbeidet på vanlig måte til å gi 146 mg. ;En oppløsning av tetrazol (48 mg), det fosforylerende reagens (122 mg) i iskaldt metylenklorid (2 ml), ble tilsatt alkoholen (146 mg). "Oxone" (230 mg) i vann (1 ml) og THF (2 ml) ble tilsatt. Etter 90 minutter ble tiosulfat anvendt for å avbryte reaksjonen. Standard opparbeidelse ga 140 mg. ;En oppløsning av substratet i iskaldt metylenklorid ble tilsatt trietylsilan (370 ul) og trifluoreddiksyre (110 ul). Etter 5 minutter ble de flyktige bestanddeler fjernet til å gi 148 mg. ;En oppløsning av aminet (66,9 mg) i iskaldt metylenklorid (0,8 ml) ble tilsatt mettet vandig natriumbikarbonat (0,8 ml) og fosgenoppløsning (20 ul av 1,93M). Etter 1 time ble ytterligere fosgen (10 ul) tilsatt. Etter 30 minutter ga den vanlige opparbeidelse 47,7 mg. ;Til en oppløsning av fenylsilan (15 ul), tetrakistrifenylfosfinpalladium [0] (24,8 mg) i iskald kloroform ble substratet tilsatt under en inert atmosfære. Etter 5 minutter ble blandingen påført en DEAE-kolonne og kromatografert til å gi 31 mg av ER-804130. ;Fremstilling av ER-804558 ;;En oppløsning av aminet (325 mg) i metylenklorid ble tilsatt trietylamin (321 ul) og 1-dodecansulfonylklorid. Etter 3 timer ga vanlig opparbeidelse 384 mg. ;En oppløsning av den beskyttede alkohol (384 mg) i THF (4 ml) ble tilsatt tetrabutylammoniumfluorid (123 mg) og eddiksyre (29 ul). Etter 2 timer ga den vanlige opparbeidelse 180 mg. ;Resten av syntesen ble fullført som skissert i det foregående for andre forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen, dvs. fosforylering, avblokkering, kobling med fosgen og avbeskyttelse med fenylsilan og palladium. ;Fremstilling av ER-804442 ;Diolaminet ble mono-beskyttet som dets t-butyl-difenylsilyleter skissert i det foregående. ;Aminet (2,6 g) og benzofenonimin (1,1 ml) ble blandet og oppvarmet til 40 °C i 4 dager til etter kromatografi å gi 3,3 g. ;En oppløsning av iminet (3,3 g) ble i iskald metylenklorid tilsatt laurinsyre (1,5 g), EDC (1,7 g) og DMAP (155 mg). Neste dag ble reaksjonsblandingen opparbeidet på vanlig måte til å gi 3,15 g. ;En oppløsning av iminet (3,14 g) i eter, ble tilsatt 1 N vandig saltsyre tilsatt. Neste dag ble reaksjonsblandingen opparbeidet på vanlig måte til å gi 2,81 g. ;En oppløsning av triklormetylklorformiat (12 ul) i iskaldt metylenklorid (250 ul) ble tilsatt dodecylamin (18 ul) og diisopropyletylamin (27 ul). Etter 30 minutter ble løsningsmiddelet fjernet. Resten ble oppløst i iskaldt metylenklorid, hvortil aminet (55,6 mg) og ytterligere diisopropyletylamin (13 ul) ble tilsatt. Etter 2 timer ga den vanlige opparbeidelse etter kromatografi 60,9 mg. ;Dette produkt ble avbeskyttet med fluorid, fosforylert, avbeskyttet med TFA, dimerisert med fosgen og avblokkert med fenylsilan og palladium som skissert i det foregående til å gi ER-804442. ;Fremstilling av ER-804221 ;;En iskald oppløsning av glysin (8,26 g) i vandig natriumhydroksid (4,4 g i 60 ml) ble tilsatt lauroylklorid (21,8 g). Etter 1 time ble syre tilsatt og blandingen opparbeidet på vanlig måte. Omkrystallisering fra etylacetat ga 9,7 g. ;En iskald oppløsning av aminet (1,4 g) i metanol ble tilsatt TFN3 (trifiinazid) (20 mg). Neste dag ble ytterligere azid tilsatt. Etter 2 timer ble reaksjonsblandingen opparbeidet på vanlig måte til å gi 1,14 g etter kromatografi. ;En oppløsning av alkoholen (1,14 g) i metylenklorid ble tilsatt t-butyldifenylsilylklorid (1,09 ml), trietylamin (1,8 ml) og DMAP (50 mg). Etter 3 timer ga den vanlige opparbeidelse 1,4 g. ;En oppløsning av alkoholen (1,4 g) i iskald metylenklorid ble tilsatt laurinsyre (826 mg), EDC (1,05 g) og DMAP (33 mg). Neste dag ga den vanlige opparbeidelse etter kromatografi 778 mg. ;En oppløsning av azidet (778 mg) i THF ble tilsatt eddiksyre (77 ul) og TBAF (323 mg). Neste dag ga den vanlige opparbeidelse etter kromatografi 428 mg. ;En oppløsning av azidet (460 mg) i metylenklorid ble tilsatt tetrazol (165 mg), det fosforylerende reagens (390 mg), og etter 30 minutter, "Oxone" i vann (722 mg i 3 ml). Reaksjonen ble brakt til opphør med tiosulfat. Vanlig opparbeidelse etter kromatografi ga 392 mg. ;Det beskyttede aminet (460 mg) ble oppløst i metylenklorid og trifluoreddiksyre (394 ul) og trietylsilan (308 ul). Etter 1,5 time ga den vanlige opparbeidelse 392 mg. ;En iskald oppløsning av aminet i metylenklorid (5,5 ml) ble tilsatt mettet natriumbikarbonat (5,5 ml), og fosgen (164 ul av en 1,93M oppløsning i toluen). Etter 15 minutter ga den vanlige opparbeidelse etter kromatografi 342 mg. ;En iskald oppløsning av azidet (187 mg) i metylenklorid ble tilsatt tinnreagenset (1,5 ml) som var fremstilt som skissert i U.S. patent skrift 5 756 718. Etter 30 minutter ble blandingen kromatografert til å gi 187 mg. ;En iskald oppløsning av ureaforbindelsen (55 mg) i metylenklorid ble tilsatt syren (59 mg) ;(fremstilt som i det foregående) og EDC (44 mg). Neste dag ble ytterligere EDC (5 mg) og syre (5 mg) tilsatt. Etter 2 timer ga den vanlige opparbeidelse 45,7 mg. ;Normal fjerning av beskyttelsesgruppene med fenylsilan og palladium ga ER-804221. ;ER-804222 ble fremstilt på liknende måte, bortsett fra at kondensasjonsproduktet mellom laurylklorid og glysin, 15-metylmyristinsyre ble anvendt. ;Fremstilling av ER-804281 ;;En iskald oppløsning av den beskyttede alkohol (8,3 g) i acetonitrihvann ble tilsatt CAN (41,4 ;g). Etter 1 time ga den vanlige opparbeidelse 5,7 g. ;En oppløsning av alkoholen (5,63 g) i 4 N HCl-oppløsning ble oppvarmet til tilbakeløp i 1 time, avkjølt, nøytralisert med natriumhydroksid og opparbeidet på vanlig måte til å gi 2,1 g. ;En iskald oppløsning av alkoholen (2,2 g) i metylenklorid ble tilsatt imidazol (0,7 g), t-butyldifenylsilylklorid i 15 ml av metylenklorid. Neste dag ga vanlig opparbeidelse 1,54 g. ;En oppløsning av alkoholen (1,93 g) i metylenklorid (40 ml) ble tilsatt benzofenonimin (0,8 ml). Etter 1 dag ble blandingen oppvarmet til tilbakeløp over natten. Den vanlige opparbeidelse ga 1,67 g. ;En iskald oppløsning av alkoholen (1,67 g) i metylenklorid ble tilsatt DMAP (159 mg), EDC (0,99 g) og laurinsyre (1,04 g). Etter 1 dag ga vanlig opparbeidelse 74 % utbytte. ;En iskald oppløsning av iminet (2,9 g) i eter (50 ml) ble tilsatt 1 N HC1 (50 ml). Neste dag ga vanlig opparbeidelse 2,09 g. ;En oppløsning av aminet (1,24 g) i dikloretan ble tilsatt natriumcyanborhydrid (178 mg) og tetradecanal (411 mg). Neste dag ga vanlig opparbeidelse 1,5 g. ;En iskald oppløsning av aminet (221 mg) i dioksan ble tilsatt allylklorformiat (40 mg) og 308 (il av 1 N NaOH-oppløsning. Etter 2 timer ga vanlig opparbeidelse 200 mg. ;En iskald oppløsning av den beskyttede alkohol (365 mg) i THF ble tilsatt TBAF (1924 ul) og eddiksyre (122 (al). Neste dag ga vanlig opparbeidelse 271 mg. ;Dette materialet ble fosforylert, deblokkert med TFA, dimerisert med fosgen og de allylbeskyttende grupper fjernet med fenylsilan og palladium som beskrevet i det foregående tilågiER-804281. ;Fremstilling av ER-804339 ;;En iskald oppløsning av ER-804281 (7 mg) i metylenklorid ble tilsatt trietylamin (5 ul), DMAP (0,6 mg) og acetylklorid (1,8 ul). Etter 4 dager ga vanlig opparbeidelse 1,1 mg. ;Fremstilling av ER-804674 ;;En oppløsning av ER-804281 (12,7 mg) i THF (1,0 ml) ble tilsatt metyljodid (9,2 mg) og ;natriumbikarbonat (6,8 mg). Blandingen ble omrørt i 5 dager og natriumbikarbonat (14 mg) og ytterligere metyljodid (8 ml) ble tilsatt. Etter enda 3 dager ble ytterligere bikarbonat (28 mg) og Mel (16 ul) tilsatt. Etter enda 6 dager ble blandingen opparbeidet til å gi 9,1 mg av produktet. ;Fremstilling av ER-804596 ;;En oppløsning av alkoholen (393 mg) i metylenklorid (2 ml) ble tilsatt diisopropylamin (210 ul), tetrazol (105 mg) og fosforylerende middel (som beskrevet ovenfor) (488 mg). Etter 2 1/5 timer ga vanlig opparbeidelse det ønskede produkt. ;En oppløsning av diolen (73 mg) i avetonitril ble tilsatt tetrazol (175 mg), azidet (1 ekvivalent). Etter 3 timer ble blandingen avkjølt og ozon (1229 mg) tilsatt. Neste dag ga vanlig opparbeidelse det ønskede produkt. ;En iskald oppløsning av den beskyttede alkohol (92,9 mg) i acetonitril:vann (6 ml: 1,5 ml) ble tilsatt CAN (358 mg). Etter 1 time ga vanlig opparbeidelse 68,5 mg. ;En iskald oppløsning av diolen (68,5 mg) i metylenklorid ble tilsatt laurinsyre (76,5 mg), DMAP (4,7 mg) og EDC (73 mg). Neste dag ga vanlig opparbeidelse 76,5 mg. Azidene ble redusert ved bruk av tinnreagenset beskrevet ovenfor. Diaminet ble acylert med dodekanoylklorid, og de beskyttende grupper fjernet med fenylsilan og palladium som beskrevet ovenfor til å gi ER-804596. ;Fremstilling av ER-804732 ;;Alkoholen (7,04 g) ble oppløst i metylenklorid (300 ml) med trietylamin (11,13 ml) og deretter avkjølt til 0 °C under en nitrogenatmosfære. Metansulfonylklorid (3,69 ml) ble tilsatt dråpevis og reaksjonsblandingen ble deretter omrørt ved romtemperatur i 1 time. Vanlig opparbeidelse ga 5,551 g. ;Den mesylerte forbindelse (1,114 g) ble oppløst i DMF (30 ml) etterfulgt av natriumazid (0,9337 g). Reaksjonsblandingen ble oppvarmet til 57 °C og omrørt i 16 timer og deretter til 104 °C og ytterligere 3 timer. Etter avkjøling til romtemperatur ble blandingen opparbeidet på vanlig måte og ga 0,466 g. ;Den beskyttede aminoalkohol (0,466 g) ble hydrolysert ved bruk av 4 N HC1 (15 ml) ved 107 °C i 3 timer. Etter avkjøling til romtemperatur ble reaksjonsblandingen filtrert og ekstrahert med etyleter, tørket, konsentrert og anvendt i den neste reaksjon. ;Den rå aminoalkoholen ble oppløst i THF (5 ml) med mettet natriumbikarbonat (6 ml) og avkjølt til 0 °C. Myristoylklorid (0,79 ml) ble tilsatt dråpevis og blandingen ble deretter oppvarmet til romtemperatur og omrørt i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble opparbeidet ved bruk av de vanlige metoder og ga 0,751 g. ;Alkoholen (0,185 g) ble oppløst i DMF (3,0 ml) med imidazol (0,077 g) og tert-butyldifenylsilylklorid (0,197 ml). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 16 timer hvoretter den vanlige opparbeidelse ga 0,320 g. ;Azidet (0,975 g) ble oppløst i metanol (20 ml) med 10 % palladium på karbon (0,180 g). Blandingen ble omrørt under en atmosfære av hydrogengass under atmosfærisk trykk i 2 timer hvoretter gassen ble evakuert og blandingen filtrert over "Celite" 545 og konsentrert. Rensing ved bruk av de vanlige metoder ga 0,873 g. ;DMSO (1,5 ml) ble tilsatt dråpevis til oksalylklorid (0,92 ml) i metylenklorid (30 ml) ved -78 °C. Etter omrøring i 15 minutter ble alkoholen (1,727 g) i metylenklorid (30 ml) tilsatt dråpevis og blandingen ble omrørt i ytterligere 30 minutter. Trietylamin (4,90 ml) ble tilsatt dråpevis, reaksjonsblandingen ble oppvarmet til 0 °C og reaksjonen avbrutt ved anvendelse av mettet ammoniumklorid. Rensing av det rå produkt ved bruk av silikagelkromatografi med 20 % etylacetat i heksaner ga 1,653 g. ;Det primære amin (0,135 g) og aldehyd (0,077 g) ble oppløst i 1,2-dikloretan (5 ml) og tilsatt natriumcyanborhydrid (0,032 g). Reaksjonsblandingen ble omrørt i 20 timer, tilsatt eddiksyre (0,02 ml) og opparbeidet på vanlig måte til å gi 0,103 g. ;Det sekundære amin ble oppløst i 1,4-dioksan (15 ml), avkjølt til 0 °C og sakte tilsatt 1 M natriumhydroksid (3,0 ml). Etter omrøring i 10 minutter ble allylklorformiat (0,236 ml) tilsatt dråpevis, og reaksjonsblandingen ble oppvarmet til romtemperatur og omrørt i 16 timer. Vanlig opparbeidelse ga 0,613 g. ;Parametoksybenzyleteren (0,613 g) ble oppløst i et forhold 4 til 1 mellom acetonitril og vann (15 ml), avkjølt til 0 °C og deretter ble CAN (1,525 g) tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 0 °C i 2 timer, og deretter opparbeidet på vanlig måte til å gi 0,357 g. ;Alkoholen (0,357 g) ble oppløst i metylenklorid (5 ml) med laurinsyre (0,184 g), EDC (0,175 g) og avkjølt til 0 °C. 4-dimetylaminopyridin (0,012 g) ble tilsatt og den resulterende blanding ble omrørt ved romtemperatur i 2 timer. Opparbeidelse på vanlig måte ga 0,436 g. ;Den silylbeskyttede alkoholen (0,211 g) ble oppløst i THF (5 ml) med eddiksyre (0,03 ml). Tetrabutylammoniumfluorid (0,115 g) ble tilsatt i en porsjon og reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 16 timer. Vanlig opparbeidelse ga 0,150 g. ;Dette materialet ble fosforylert, avblokkert med TFA, dimerisert med fosgen og de allylbeskyttende grupper fjernet med fenylsilan og palladium som beskrevet ovenfor til å gi ER-804732. ;Fremstilling av ER-804680 ;;Aldehydet (1,54 g) ble oppløst i THF (28 ml), avkjølt til 0 °C og tilsatt 2-metyl-2-buten (14 ml) og tertbutylalkohol (28 ml). En omrørt suspensjon av natriumkloritt (3,70 g) og natriumtrihydrogenfosfat (4,09 g) i vann (42,7 ml) ble tilsatt den ovennevnte blanding og omrørt ved 0 °C i 1,5 time. Den ferdige reaksjonen ble fortynnet med etylacetat (100 ml) og vasket med 10 % natriumbisulfit, saltoppløsning, konsentrert og silikagelkromatografert til å gi 1,55 g. ;Aminet (0,553 g) og syre (0,381 g) ble blandet i metylenklorid (8 ml) og avkjølt til 0 °C, deretter ble EDC (0,230 g) tilsatt og reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 72 timer. Vanlig opparbeidelse ga 0,567 g. ;Metoksybenzyleteren (0,567 g) ble oppløst i et forhold 1 til 1 mellomacetonitril og vann (16 ml) med metylenklorid (8 ml) og avkjølt til 0 °C. CAN (1,53 g) ble tilsatt og reaksjonsblandingen ble omrørt i 1 time hvoretter den ble opparbeidet på vanlig måte til å gi den rå alkohol. ;Den rå alkohol fra det foregående ble oppløst i metylenklorid (15 ml) med laurinsyre (0,280 ;g) og 4-dimetylaminopyridin (0,017 g). Reaksjonsblandingen ble avkjølt til 0 °C og EDC (0,267 g) ble tilsatt i en porsjon, hvoretter reaksjonsblandingen ble oppvarmet til ;romtemperatur og omrørt i 16 timer. Vanlig opparbeidelse ga 0,622 g. ;;Silyleteren (0,563 g) ble oppløst i THF (10 ml) med eddiksyre (0,087 ml). Tertbutylammoniumfluorid (0,330 g) ble tilsatt og reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 16 timer. Opparbeidelse på vanlig måte ga 0,384 g. ;Dette materialet ble fosforylert, avblokkert med TFA, dimerisert med fosgen og de allylbeskyttende grupper fjernet med fenylsilan og palladium som beskrevet ovenfor til å gi ER-804780. ;Fremstilling av ER-804679 ;;Det beskyttede sekundære amin (0,071 g) ble oppløst i avgasset kloroform (3 ml) med fenylsilan (0,017 ml) og eddiksyreanhydrid (0,014 ml). Reaksjonsblandingen ble avkjølt til 0 °C og deretter tilsatt tetrakistrifenylfosfinpalladium (0) (0,002 g). Reaksjonsblandingen ble oppvarmet til romtemperatur og omrørt i 30 minutter. Den ferdige reaksjonsblanding ble fortynnet med metylenklorid, vasket med vann, tørket, konsentrert og kromatografert til å gi 0,068 g. ;Silyleteren ble avbeskyttet i THF (5 ml) med eddiksyre (0,025 ml) med tilsetting av tertbutylammoniumfluorid (0,092 g). Etter omrøring ved romtemperatur i 16 timer ble reaksjonsblandingen opparbeidet på vanlig måte til å gi 0,120 g. ;Dette materialet ble fosforylert, avblokkert med TFA, dimerisert med fosgen og de allylbeskyttende grupper fjernet med fenylsilan og palladium som beskrevet ovenfor til å gi ER-804679. ;Fremstilling av ER-804764 ;DMSO (0,33 ml) ble tilsatt dråpevis til oksalylklorid (0,203 ml) i metylenklorid (10 ml) ved -78 °C. Etter omrøring i 15 minutter ble alkoholen (0,993 g) i metylenklorid (3 ml) tilsatt dråpevis og omrørt for ytterligere 30 minutter. Trietylamin (1,08 ml) ble tilsatt dråpevis, reaksjonsblandingen ble oppvarmet til 0 °C og reaksjonen ble brakt til opphør ved bruk av mettet ammoniumklorid. Rensing av det rå produkt ved bruk av silikagelkromatografi med 20 % etylacetat i heksaner ga 0,743 g. 1,6 M n-butyllitium i heksaner (1,5 ml) ble tilsatt dråpevis til fosfoniumsaltet (0,797 g) i THF (10 ml) ved 0 °C. Etter omrøring i 30 minutter ble aldehydet (0,734 g) i THF (15 ml) tilsatt dråpevis. Etter omrøring ved romtemperatur i 1 time ble reaksjonsblandingen opparbeidet på vanlig måte til å gi 0,193 g. ;Enoleteren (0,193 g) ble hydrolysert med 57 % hydrogenjodid (0,1141) i acetonitril (2 ml). Etter omrøring ved romtemperatur i 2 timer ble reaksjonen brakt til opphør med mettet natriumbikarbonat, ekstrahert med metylenklorid og tørket til å gi 0,211 g rått aldehyd. Det rå aldehydet (0,211 g) ble oppløst i metanol (3 ml) og natriumborhydrid (0,033 g) ble tilsatt ved 0 °C. Etter omrøring i 30 minutter ble reaksjonsblandingen fortynnet med vann, ekstrahert med metylenklorid, tørket, konsentrert og renset ved silikagelkromatografi til å gi 0,148 g. ;Dette materialet ble fosforylert, avblokkert med TFA, dimerisert med fosgen og de allylbeskyttende grupper fjernet med fenylsilan og palladium som beskrevet ovenfor til å gi ER-804764. ;Fremstilling av ER-804772 ;;Den kommersielt tilgjengelige diol (1,486 g) ble blandet med acetalet (1,864 g) ogpara-toluensulfonsyre (0,195 g) i DMF (10 ml). Etter omrøring i 20 timer ved romtemperatur under en nitrogenatmosfære ble reaksjonen brakt til opphør med mettet natriumbikarbonat, ekstrahert med metylenklorid, tørket og konsentrert via høyvakuum. Silikagelkromatografi av det resulterende råprodukt ved bruk av 10 % etylacetat i heksaner ga 2,084 g. ;Acetalet (2,084 g) ble avkjølt til -78 °C under en nitrogenatmosfære i metylenklorid (30 ml) etterfulgt av dråpevis tilsetting av 1,0 M DIB AL i heksaner (14,3 ml). Etter ytterligere DIB AL ;(14 ml) ble tilsatt, ble reaksjonsblandingen omrørt i 1 time, oppvarmet til romtemperatur og reaksjonen brakt til opphør med natrium, kaliumtartarat. Vanlig opparbeidelse ga 2,1 g. ;Alkoholen (1,286 g) ble blandet med trietylamin (0,883 g) i metylenklorid (15 ml) og avkjølt til 0 °C. Metansulfonylklorid (0,575 g) ble tilsatt dråpevis etterfulgt av omrøring i 20 minutter ved 0 °C og romtemperatur i 2 timer. Vanlig opparbeidelse ga 1,496 g. ;Alkoholen (1,495 g) i DMF (10 ml) dråpevis ble tilsatt en omrørende suspensjon av vasket 60 % natriumhydrid (0,257 g) i DMF (20 ml) ved 0 °C. Etter omrøring i 3 timer ble mesylatet (0,925 g) i DMF (10 ml) tilsatt dråpevis. Etter omrøring i ytterligere 3 dager ble reaksjonen brakt til opphør, og reaksjonsblandingen opparbeidet på vanlig måte ga 0,905 g. ;Som med eksempler angitt ovenfor, ble den /røra-metoksybenzylbeskyttende gruppe hydrolysert med CAN, den beskyttede aminoalkohol ble hydrolysert ved bruk av vandig HC1 og deretter KOH, acylering av aminet med tetradekanoylklorid, silylering av den primære alkohol med TBDPS, acylering av den sekundære alkohol med dodekanoylklorid og hydrolyse av silylbeskyttelsesgruppen ved bruk av TBAF for å gi den primære alkohol. Dette materialet ble fosforylert, avblokkert med TFA, dimerisert med fosgen og de allylbeskyttende grupper fjernet med fenylsilan og palladium som beskrevet ovenfor til å gi ER-804772. ;Fremstilling av ER-804947 ;;Alkoholen (0,263 g) i THF (5 ml) ble tilsatt dråpevis til vasket 60 % natriumhydrid (0,216 g) i DMF (2,0 ml) ved romtemperatur under en nitrogenatmosfære. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 30 minutter deretter benzylbromid (0,272 ml) med en katalytisk mengde (0,05 g) av tetrabutylarnmoniumjodid. Den endelige reaksjonsblandingen ble omrørt i ytterligere 1 time hvoretter blandingen ble brakt til opphør og opparbeidet på vanlig måte til å gi 0,365 g. ;Den beskyttede aminoalkohol (0,189 g) ble hydrolysert ved bruk av 4 N saltsyre (2,5 ml) fulgt av 40 % natriumhydroksid (2,5 ml) som tidligere beskrevet til å gi 0,121 g. ;Aminoalkoholen (0,121 g) ble oppløst i metylenklorid (2 ml) med mettet natriumbikarbonat (2 ml). Etter avkjøling til 0 °C ble myristoylklorid (0,199 ml) tilsatt dråpevis. Etter fortsatt omrøring i 2 timer ble blandingen opparbeidet på vanlig måte og ga 1,81 g. ;Alkoholen (0,181 g) ble oppløst i metylenklorid (5 ml) med syren (0,180 g) og l-[3-(dimetylamino)propyl]-3-etylkarbodiimid, EDC (0,133 g). Blandingen ble avkjølt til 0 °C og 4-dimetylaminopyridin ble tilsatt etterfulgt av omrøring i 16 timer ved romtemperatur. Vanlig opparbeidelse ga 0,310 g. ;Parø-metoksybenzyleteren (0,305 g) ble oppløst i acetonitril (8 ml) med vann (2 ml) og avkjølt til 0 °C. Ceriumammoniumnitrat (1,110 g) ble tilsatt og reaksjonsblandingen ble omrørt i 2 timer, hvoretter vanlig opparbeidelse ga rå alkohol. ;Den rå alkohol ble oppløst i metylenklorid (8 ml) med laurinsyre (0,126 g) og 4-dimetylaminopyridin (0,011 g). Etter avkjøling til 0 °C ble EDC (0,119 g) tilsatt og blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 16 timer. Vanlig opparbeidelse ga 0,355 g. ;Benzyleteren (0,355 g) ble oppløst i etylacetat (50 ml) med palladiumhydroksid (0,048 g) og eddiksyre (0,25 ml). Reaksjonsblandingen ble anbrakt under 3,5 kg/cm<2> hydrogenatmosfære og rystet i 10 timer. Opparbeidelse på vanlig måte ga 0,255 g. ;Dette materialet ble fosforylert, avblokkert med TFA, dimerisert med fosgen og de allylbeskyttende grupper fjernet med fenylsilan og palladium som beskrevet ovenfor til å gi ER-804947. ;BIOLOGISKE EKSEMPLER ;Eksempel 7: Induksjon av cytokiner (in vitro) ;Det er ingen anerkjente in vitro prøver som kan anvendes som indikator på adjuvansaktivitet. Et molekyls manglende evne til å utløse stimulerende respons i makrofager er imidlertid en sterk indikasjon på at molekylet ikke sannsynlig vil være et immunoadjuvansmiddel. Av denne grunn kan evnen av forbindelser til å stimulere frigivelse av TNF-alfa og andre cytokiner fra immune celler være indikative på deres evne til å stimulere en immunrespons som kan resultere i adjuvansaktivitet. ;A. Prøver i humant fullblod ;Det mest tilgjengelige humane system for å teste forbindelsesaktivitet på monocytter/makrofager er i fullblod. Forskjellige konsentrasjoner av forbindelser ifølge oppfinnelsen ble tilsatt til 10x stamløsninger i 50 (il Ca.""", Mg<*-> fri Hank's balanserte saltoppløsning (HBSS) etterfulgt av 50 ul HBSS i 400 ul heparinisert fullblod oppnådd fra normale, frivillige (18-51 år gamle; vekt 50-105 kg) i brønnene på plast-analyseplater, for et totalt volum på 500 ul/brønn (sluttkonsentrasjon av fullblod var 80 %). Etter en 3-timers inkubasjon med forsiktig risting ved 37 °C i en 5 % CO2 atmosfære, ble analyseplatene sentrifugert ved 1000 x g i 10 minutter ved 4 °C og plasma ble avsuget og frosset ved -80 °C. Plasmaprøver ble analysert for TNF-alfa ved hjelp av ELISA (Genzyme Corp., Cambridge, MA). Hvert analysepunkt ble testet i triplikat.

Som vist i figur 1 stimulerer forbindelser, slik som 100,184 og 186 blodoverførte celler til å frigi TNF-alfa. Denne stimulatoriske aktivitet kan sammenliknes med aktiviteten av 10 ng/ml endotoksin (eller LPS) tilstede i liknende inkubasjoner i den samme analyse. Som vist i tabell 1 er aktiviteten av forbindelser (testet ved 10 uM) i området fra inaktive (som f. eks. forbindelsen 110) til forbindelser som viser større aktivitet enn LPS-standard.

B. Dyrkede humane cellelinjer

Liknende resultater kan oppnås når forbindelser ifølge oppfinnelsen testes i en

celledyrkingsmodell. I denne prøve testes forbindelser ifølge oppfinnelsen på deres evne til å stimulere sekresjon av alkalisk fosfatase fra THP-1-celler som er blitt transfektert med genet for sekretert alkalisk fosfatase under kontroll av TNF-alfa-promoteren, som beskrevet i detalj i Goto et al., Molecular Pharmacology 49; 860-873 (1996). I denne analyse kan imidlertid virkningene ved å fjerne serum<1-> en tilstand som mer sannsynlig etterlikner et subkutant miljø

- bedømmes. Som vist i figur 2 og beskrevet i tabell 1 indikerer resultatet fra disse prøver at forbindelser ifølge oppfinnelsen stimulerer induksjon av gener under kontroll av TNF-alfa-promoteren når de tilsettes celler i fravær av så vel som i nærvær av serum.

C. Murine splenocyter

Forbindelsers evne til å stimulere cytokin frigivelse fra splenocyter kan bedømmes i en musemodell. Miltceller høstet fra C57BL/6-mus dyrkes i 24 timer i RPMI1640 celledyrkingsmedium inneholdende 5 % FBS, 1 mM natriumpyruvat, 2mM L-glutamin, 100 U/ml penicillin/streptomycin og 50 uM beta-merkaptoetanol, ved forskjellige konsentrasjoner av testforbindelse i 20 til 24 timer, hvoretter celledyrkingssupernatanten testes på nærvær av cytokiner.

Miltceller høstet fra mus ble dyrket i 24 timer med testforbindelse og supernatanten ble testet på frigivelse av cytokiner. Som vist i figurene 3 og 4, blir frigivelse av cytokiner som IL-10 og interferon-gamma fra splenocyter stimulert av forbindelser slik som 104,106,124,126, 160 og 162.

Disse analyser anvendte en heterogen populasjon av celler avledet fra milten. Dette gjør det mulig at cytokininduksjon kan bevirkes både ved direkte virkninger av testforbindelser på

celler og ved mer indirekte stimulering av cytokine "kaskader" der frigivelse av cytokin av en type celle kan indusere frigivelse av andre cytokiner i andre celler tilstede i de samme media. Det er mulig at dette cytokin "miljø" er ansvarlig for en del av disse robuste immunresponser.

Eksempel 8: In vivo induksjon av antistoffrespons

Den mest kritiske test av adjuvansaktivitet er bestemmelsen om tilsettingen av en forbindelse til et antigenpreparat øker immunresponsen ved å forhøye nivået av antistoffer som genereres til dette antigen når forbindelsen tilføres et levende dyr.

Initiale forsøk involverte injeksjonen av mus (Balb/c) med forbindelser ifølge oppfinnelsen pluss et peptid konjugert til en bærer som for eksempel albuskjell hemocyanin. Peptidet valgt for disse undersøkelser er et peptid (Pl8) som tilsvarer aminosyrene 308-322 av V3-sløyfen av HIV UIB gpl20 protein. Pl8 21aa-peptidet, tilsvarende aminosyrene 308-322 av V3-søyfen i HIV UIB gpl20 proteinet, er blitt rapportert å være immunogenisk. Dette peptid med glysin/alanin/glysin spacer rester pluss en aminoterminal cysteinrest ble syntetisert ved hjelp av Genosys (Woodlands TX). Peptidsekvensen er som følger: CGA GIRIORGPGRAFVTIGKG der de understrekede aminosyrene representerer den native sekvens. Peptidet ble isolert til mer enn 80 % renhet ved bruk av HPLC av leverandøren. Dette peptid ble koblet via cysteinresten til bovint serum albumin (BSA) og albuskjell hemocyanin (KLH) ved bruk av maleimidaktivert konjugasjon (Pierce Immunochemical;cat#77107). Det KLH-konjugerte peptid ble anvendt som immunogenet og BSA-konjugatet som det "screening" mål-antigen for Pl8 spesifikke antistoffer. Den indikerte mengde av KLH-P18-konjugat ble rutinemessig anvendt sammen med 300 ug testforbindelse, alun eller PBS ble injisert med 2 eller 3 ukers mellomrom (som indikert), inn i Balb/c-hannmus (Charles River Laboratories) omtrent 6-8 uker gamle (18-25 g). Alle injeksjoner var subkutane på baksiden av halsen med 200 ul av en blanding av antigen pluss adjuvansmiddel i PBS tilført hver annen uke (3 uker for polysakkarider eller influensa) for totalt tre injeksjoner. Mus ble blodtappet en eller to uker etter andre og tredje injeksjon. Blodprøver er betegnet når de er tatt (dvs. sekundær blodtapping er en uke etter den andre proteininjeksjon eller to uker etter de andre polysakkaridinjeksjoner, tertiær blodtapping er etter den tredje injeksjon av antigen/adjuvansmiddel. Blod ble samlet etter kutt i nålevenen og dråper samlet i Becton Dickinson mikrotainer-type serum separatorrør. Serum ble separert fra de røde celler ved mikrosentrifugering og testet ved hjelp av ELISA for antigenspesifikke IgG-nivåer.

Immunrespons til peptidet kan testes ved enzymtilknyttet immunosorbent analyse (ELISA) som kan kvantitere nivåer av serumantistoff som binder til P! (-peptid, konjugert til et ytterligere ikke-kryssreagerende protein som for eksempel bovint serum albumin (P18-BSA) og som er påført en ELIS A-plate.

Som vist i figur 5 og tabellene 2 og 3, viste mus injisert med de forskjellige forbindelser sammen med KLH-P18 antigen større respons (høyere nivåer av antistoff) enn de som ble injisert med bare P18-KLH-peptidkonjugatet. Adjuvansaktivitet er også blitt oppnådd med forbindelser ifølge oppfinnelsen når disse testes med andre antigener. Forbindelser som 100,116,126,160,184 og 186 kan stimulere antigenspesifikk antistoffproduksjon med opptil 26,8 ganger (tabell 4) til influenza X-31-antigen. Økninger i respons sees også når tetanustoksoidet (figur 6) og meningokokkalt C polysakkarid (tabell 5) anvendes som eksponeringsantigener. I prøvene ble det anvendt 1 ug meningokokkalt C PS eller 1,5 ug tetanustoksoid eller 5ug influenza X-31 (SPAFAS laboratories). Tetanustoksoid fra Accurate Chemical (cat#sstettox) ble anvendt som eksponeringsantigen, mens det rensede toksoidet fra List Biologicals (cat#191) ble anvendt som mål antigen for ELIS A-analysen.

Influenza virus X-31 ble innkjøpt fra SPAFAS (Storrs, CT) og var inaktivert og bekreftet å være inaktivt [Payne et al., Vaccine 16; 92-98 (1998)] av leverandøren.

Menningokokkalt C polysakkarid (PS) ble levert av Pasteur Merrieur Connaught (Swiftwater PA). Metylert, humant albumin kan oppnås ifølge metodene beskrevet av Gheesling et al., J. ClinMicrobiol. 32; 1475-82(1994).

For fremstillingen av antigen/adjuvansmiddelblandingene ble frysetørkede testforbindelser rekonstituert til 2 mg/ml med fosfatbufret saltoppløsning (PBS; eat # P-3813; Sigma Chemical Co, St Louis MO) og ultralydbehandlet i et avkjølt vannbad i 2 minutter. Monofosforyllipid A, MPL, (Ribi Irnmunochemical) ble rekonstituert til 2 mg/ml med sterilt vann for injeksjon, inkubert ved 50 °C i 15 minutter og deretter ultralydbehandlet som ovenfor. "Imject" alun, innkjøpt fra Pierce Irnmunochemical, ble anvendt ifølge produsentens retningslinjer og omfattet omtrent 20-30 % av injeksjonsvolumet. Indikerte mengder av antigen, fortynnet i PBS, ble blandet med forbindelsene, MPL eller alun slik at den endelige konsentrasjon av forbindelsen eller MPL var 300 ug (med mindre annet er angitt) i det 200 ul injeksjonsvolum. Blandingene ble inkubert ved romtemperatur i 40 minutter med kontinuerlig risting før injeksjon.

Antigenspesifikke IgG-nivåer ble overvåket ved hjelp av direkte ELISA hvor antigen ble passivt påført 96-brønners Costar EIA/RIA-plater. Plater ble belagt med 50 ul/brønn av det indikerte antigen og inkubert over natten (ON) ved 4 °C og vasket 3x med PBS + 0,05 % "tween" 20 (PBS-t) i en automatisert platevasker. Plater ble så blokkert med 200 ul/brønn med 0,5 % gelatin i PBS i 1 time ved romtemperatur (RT) og vasket 3x med PBS-t. Musesera ble fortynnet i PBS-t pluss 0,3 % BSA og 100 (il av varierende fortynningsmidler ble tilsatt, i duplikat til de antigenbelagte brønner (eller BSA-belagte brønner som en kontroll) og inkubert ved RT i 1 time og på nytt vasket 3x med PBS-t. Biotinylert geit anti-muse IgG (Southern Biotechnology Associates Inc., Birmingham AL, eat # 1031-08) ble fortynnet 1:5 000 i PBS-t og 100 ul/brønn ble påført og inkubert ved RT i 1 time, vasket 3x med PBS-t og etterfulgt av tilsetting av 1:10 000 streptavidin-pepperrotperoksidasekonjugat (Southern Biotechnology Associates Inc.) i PBS-t i 30 minutter ved RT og på nytt vasket 3x med PBS-t. Brønner ble så inkubert i 100 (il TMB-substrat (Kirkegaard and Perry Labs) i 5 minutter. Fargeutvikling ble stanset med tilsetting av et like volum av 1 M fosforsyre og absorbens ble avlest ved 450 nm på en "Titertek Multiscan"-plateleser med Deltasoft programvare analysepakke.

For relativ kvantitering av antigenspesifikke IgG-nivåer ble kurver sammenliknet med hverandre ved å bestemme den fortynning som var nødvendig for å oppnå en bestemt mengde av antistoffgenerert farge. I noen tilfeller ble en total IgG-analyse ved bruk av et anti-FAb-spesifikt reagens for å innfange kjente mengder renset IgG (innkjøpt fra Southern Biotech.) som en IgG standardkurve gjennomført i konjunksjon med det direkte ELISA på BSA-P18-konjugatet. Anti-FAb-reagenset orienterer det rensede IgG på en måte liknende hvorledes et antistoff ville binde til et antigen gjennom FAb-regionen. Dette tillater påvisning av bundet antistoff ved hjelp av de samme reagenser som anvendes for å måle antigenspesifikk innfanging av antistoffer. De samme reagensoppløsninger anvendt for påvisning av antistoffene bundet til BSA-P18-konjugat, nemlig biotinylert anti-IgG (Fc-spesifikk) etterfulgt med HRP-streptavidin, ble samtidig anvendt til den anti-FAb totale IgG kvantitative analyse og den antispesifikke analyse. Følgelig er signalet fra bindingen av den rensede IgG kurve ekvivalent til signalet generert til like mengder av IgG bundet i anti-mål antigen analysen. Mengden av antistoff i serumet blir så interpolert fra den rensede IgG-standard ved bruk av en 4-parameterkurvetilpasning (DeltaSoft 3 programpakke).

Tabell 7 nedenfor inneholder forbindelsesnummeret som referert heri til det tilsvarende ER-nummer.

Claims (1)

1. I 1.

   Forbindelse med formel I

   hvori: RI er valgt fra gruppen bestående av (a) C(O); (b) C(0)-Ci.i4 alkyl-C(O), hvori C\. u alkyl eventuelt er substituert med hydroksy, C1.5 alkoksy, C1.5 alkenylendioksy, C1.5 alkylamino, eller C1.5 alkylaryl, hvori aryldelen av C1.5 alkylaryl eventuelt er substituert med C1.5 alkoksy, C1.5 alkylamino, C1.5 alkoksyamino, C1.5 alkylamino-Ci-5 alkoksy, -O-C1.5 alkylamino-Ci-5 alkoksy, -O-C1.5 alkylamino-C(0)-Ci.s alkyl C(0)OH, -O-C1.5 alkylamino-C(0)-Ci_5 alkyl-C(0)-Ci.5 alkyl; (c) C2til Ci5 rettkjedet eller forgrenet alkyl som eventuelt er substituert med hydroksy eller alkoksy; og (d) -C(0)-C6-i2 arylen-C(O)- hvori arylen eventuelt er substituert med hydroksy, halogen, nitro eller amino; a og b er uavhengig 0,1,2, 3 eller 4; d, d', d", e, e' og e" er uavhengig et helt tall fra 1 til 4; X<1>, X\ Y' og Y er uavhengig valgt fra gruppen bestående av null, oksygen, NH og N(C(0)CM alkyl), og N(CM alkyl)2; W1 og W<2> er uavhengig valgt fira gruppen bestående av karbonyl, metylen, sulfon og sulfoksid; \ R<2> og R<5> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av: (a) C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkyl som eventuelt er substituert med okso, hydroksy eller alkoksy; (b) C2 til C2o rettkjedet eller forgrenet alkenyl eller dialkenyl som eventuelt er substituert med okso, hydroksy eller alkoksy; (c) C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkoksy som eventuelt er substituert med okso, hydroksy eller alkoksy; (d) -NH-C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkyl, hvori alkylgruppen eventuelt er substituert med okso, hydroksy eller alkoksy; og (e) hvori Z er valgt fra gruppen bestående av O og NH, og M og N er uavhengig valgt fra gruppen bestående av C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkyl, alkenyl, alkoksy, acyloksy, alkylamino og acylamino; R<3> og R<6> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkyl eller alkenyl eller eventuelt substituert med okso eller fluor; R4 og R<7> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av C(0)C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkyl eller alkenyl; C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkyl; C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkoksy; C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkenyl; hvori alkyl-, alkenyl- eller alkoksygruppene uavhengig og eventuelt kan være substituert med hydroksy, fluor eller Ci til C5 alkoksy; G1, G2, G3 og G<4> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av oksygen, metylen,amino, tiol, -NHC(O)-, og -N(C(0)CM alkyl); eller G<2>R<4> eller G4R7 kan sammen være et hydrogenatom eller hydroksyl; eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav. 2.

   Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at R<1> er valgt fra gruppen bestående av C(O) og C(0)-Cm4 alkyl-C(O). 3.

   Forbindelse ifølge krav 2, karakterisert ved at R<1> er C(O)-Ci-M alkyl-C(O). 4.

   Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at a og ber 2. 5.

   Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at X1 og Y1 begge er NH. 6.

   Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved atdogeerl. 7.

   Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at G<2>R<4>og G4R7 begge er hydroksy. 8.

   Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at den er valgt fra gruppen bestående av ER803022, ER803058, ER803732, ER804053, ER804057, ER804058, ER804059, ER804442, ER804680 og ER804764: 9.

   Immunologisk adjuvanssammensetning, karakterisert ved at den omfatter en forbindelse ved formel I

   hvori: R<1> er valgt fra gruppen bestående av (a) C(O); (b) C(0)-Ci-i4 alkyl-C(O), hvori C1-14 alkyl eventuelt er substituert med hydroksy, C1.5 alkoksy, C1.5 alkenylendioksy, C1.5 alkylamino, eller C1-5 alkylaryl, hvori aryldelen av C1.5 alkylaryl eventuelt er substituert med C1.5 alkoksy, C1.5 alkylamino, C1.5 alkoksyamino, C1.5 alkylamino-Ci-5 alkoksy, -O-C1.5 alkylamino-Ci.5 alkoksy, -O-C1.5 alkylamino-C(0)-Ci-5 alkyl C(0)OH, -O-C1.5 alkylamino-CCO)^,^ alkyl-C(0)-Ci.5 alkyl; (c) C2til C15 rettkjedet eller forgrenet alkyl som eventuelt er substituert med hydroksy eller alkoksy; og (d) -C(0)-C6-i2 arylen-C(O)- hvori arylen eventuelt er substituert med hydroksy, halogen, nitro eller amino; a og b er uavhengig 0,1, 2, 3 eller 4; d, d', d", e, e' og e" er uavhengig et helt tall fra 1 til 4;X<1>, X2, Y<1> og Y<2> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av null, oksygen, NH og N(C(0)CM alkyl), ogN(CM alkyl)2; W<1> og W<2> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av karbonyl, metylen, sulfon og sulfoksid; R og R er uavhengig valgt fra gruppen bestående av: (a) C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkyl som eventuelt er substituert med okso, hydroksy eller alkoksy; (b) C2 til C2o rettkjedet eller forgrenet alkenyl eller dialkenyl som eventuelt er substituert med okso, hydroksy eller alkoksy; (c) C2 til C2o rettkjedet eller forgrenet alkoksy som eventuelt er substituert med okso, hydroksy eller alkoksy; (d) -NH-C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkyl, hvori alkylgruppen eventuelt er substituert med okso, hydroksy eller alkoksy; og (e)

   hvori Z er valgt fra gruppen bestående av O og NH, og M og N er uavhengig valgt fra gruppen bestående av C2 til C2o rettkjedet eller forgrenet alkyl, alkenyl, alkoksy, acyloksy, alkylamino og acylamino;

   R<3> og R<6> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkyl eller alkenyl eller eventuelt substituert med okso eller fluor;

   R4 og R7 er uavhengig valgt fra gruppen bestående av C(0)C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkyl eller alkenyl; C2 til C2o rettkjedet eller forgrenet alkyl; C2 til C2o rettkjedet eller forgrenet alkoksy; C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkenyl; hvori alkyl-, alkenyl- eller alkoksygruppene uavhengig og eventuelt kan være substituert med hydroksy, fluor eller Ci til C5 alkoksy;

   G<1>, G2, G3 og G<4> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av oksygen, metylen,amino, tiol, -NHC(O)-, og -N(C(0)CM alkyl);

   eller G<2>R<4> eller G4R7 kan sammen være et hydrogenatom eller hydroksyl;

   eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav. 10.

   Vaksinesammensetning, karakterisert ved at den omfatter et antigen og en adjuvansforbindelse med formel I

   hvori: R<1> er valgt fra gruppen bestående av (a) C(0); (b) C(0)-Ci-i4 alkyl-C(O), hvori C1-14 alkyl eventuelt er substituert med hydroksy, C1.5 alkoksy, Ci-5 alkenylendioksy, Ci.5 alkylamino, eller Ci-5 alkylaryl, hvori aryldelen av C 1.5 alkylaryl eventuelt er substituert med Ci.5 alkoksy, Ci-5 alkylamino, Ci.5 alkoksyamino, C1.5 alkylamino-Ci-5 alkoksy, -O-C1.5 alkylamino-Ci-5 alkoksy, -O-C1.5 alkylamino-C(0)-Ci-5 alkyl C(0)OH, -O-C1.5 alkylamino-C(0)-Ci.5 alkyl-C^-d.s alkyl; (c) C2 til C)5 rettkjedet eller forgrenet alkyl som eventuelt er substituert med hydroksy eller alkoksy; og (d) -C(0)-C6-i2arylen-C(0)- hvori arylen eventuelt er substituert med hydroksy, halogen, nitro eller amino; a og b er uavhengig 0,1, 2, 3 eller 4; d, d', d", e, e' og e" er uavhengig et helt tall fra 1 til 4; 19 1 9 X , X , Y og Y er uavhengig valgt fra gruppen bestående av null, oksygen, NH og N(C(0)CM alkyl), og N(CM alkyl)2; W 1 og W 9 er uavhengig valgt fra gruppen bestående av karbonyl, metylen, sulfon og sulfoksid; R<2> og R<5> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av: (a) C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkyl som eventuelt er substituert med okso, hydroksy eller alkoksy; (b) C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkenyl eller dialkenyl som eventuelt er substituert med okso, hydroksy eller alkoksy; (c) C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkoksy som eventuelt er substituert med okso, hydroksy eller alkoksy; (d) -NH-C2 til C2o rettkjedet eller forgrenet alkyl, hvori alkylgruppen eventuelt er substituert med okso, hydroksy eller alkoksy; og (e)

   hvori Z er valgt fra gruppen bestående av O og NH, og M og N er uavhengig valgt fra gruppen bestående av C2 til C2o rettkjedet eller forgrenet alkyl, alkenyl, alkoksy, acyloksy, alkylamino og acylamino;

   R<3> og R<6> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkyl eller alkenyl eller eventuelt substituert med okso eller fluor;

   R4 og R7 er uavhengig valgt fra gruppen bestående av C(0)C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkyl eller alkenyl; C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkyl; C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkoksy; C2 til C20 rettkjedet eller forgrenet alkenyl; hvori alkyl-, alkenyl- eller alkoksygruppene uavhengig og eventuelt kan være substituert med hydroksy, fluor eller Ci til C5 alkoksy;

   G1, G2, G3 og G<4> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av oksygen, metylen,amino, tiol, -NHC(O)-, og -N(C(0)C^ alkyl);

   eller G<2>R<4> eller G<4>R<7> kan sammen være et hydrogenatom eller hydroksyl;

   eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav. 11.

   Sammensetning ifølge krav 10, karakterisert ved at adjuvansmiddelet og antigenet er kovalent bundet gjennom en amino-, karbonyl-, hydroksyl-eller fosfatdel av adjuvansmiddelet. 12.

   Sammensetning ifølge krav 10, karakterisert ved at R<1> er C(O) eller C(0)-C3-i4 alkyl-C(O), og at adjuvansmiddelet og antigenet er kovalent bundet til en karbonyldel av nevnte Ci karbonyl i nevnte C(O) eller C(0)-C3-i4 alkyl-C(O). 13.

   Anvendelse av en effektiv mengde av et antigen og en effektiv mengde av en adjuvansforbindelse med formel I

   hvori: R<1> er valgt fra gruppen bestående av (a) C(O); (b) C(0)-Ci-i4 alkyl-C(O), hvori C1-14 alkyl eventuelt er substituert med hydroksy, C1.5 alkoksy, C1.5 alkenylendioksy, C1-5 alkylamino, eller C1.5 alkylaryl, hvori aryldelen av C1.5 alkylaryl eventuelt er substituert med C1.5 alkoksy, C1.5 alkylamino, C1.5 alkoksyamino, C1.5 alkylamino-Ci.5 alkoksy, -O-C1.5 alkylamino-Ci-5 alkoksy, -O-C1-5 alkylamino-C(0)-Ci-5 alkyl C(0)OH, -O-C1.5 alkylamino-C(0)-Ci.5 alkyl-C(0)-C,.5 alkyl; (c) C2 til Ci5 rettkjedet eller forgrenet alkyl som eventuelt er substituert med hydroksy eller alkoksy; og (d) -C(0)-C6-i2 arylen-C(O)- hvori arylen eventuelt er substituert med hydroksy, halogen, ni tro eller amino; a og b er uavhengig 0,1, 2, 3 eller 4; d, d', d", e, e' og e" er uavhengig et helt tall fra 1 til 4; X<1>, X<2>, Y<1> og Y<2> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av null, oksygen, NH og N(C(0)C,.4 alkyl), ogN(CM alkyl)2; W<1> og W<2> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av karbonyl, metylen, sulfon og sulfoksid; R og R er uavhengig valgt fra gruppen bestående av: (a) C2 til C2o rettkjedet eller forgrenet alkyl som eventuelt er substituert med okso, hydroksy eller alkoksy; (b) C2 til C2o rettkjedet eller forgrenet alkenyl eller dialkenyl som eventuelt er substituert med okso, hydroksy eller alkoksy; (c) C2 til C2o rettkjedet eller forgrenet alkoksy som eventuelt er substituert med okso, hydroksy eller alkoksy; (d) -NH-C2 til C2o rettkjedet eller forgrenet alkyl, hvori alkylgruppen eventuelt er substituert med okso, hydroksy eller alkoksy; og (e)

   hvori Z er valgt fra gruppen bestående av O og NH, og M og N er uavhengig valgt fra gruppen bestående av C2 til C2o rettkjedet eller forgrenet alkyl, alkenyl, alkoksy, acyloksy, alkylamino og acylamino;

   R<3> og R<6> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av C2 til C2o rettkjedet eller forgrenet alkyl eller alkenyl eller eventuelt substituert med okso eller fluor;

   R<4> og R<7> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av C(0)C2 til C2o rettkjedet eller forgrenet alkyl eller alkenyl; C2 til C2o rettkjedet eller forgrenet alkyl; C2til C2o rettkjedet eller forgrenet alkoksy; C2til C20 rettkjedet eller forgrenet alkenyl; hvori alkyl-, alkenyl- eller alkoksygruppene uavhengig og eventuelt kan være substituert med hydroksy, fluor eller Ci til C5 alkoksy;

   G<1>, G2, G<3> og G<4> er uavhengig valgt fra gruppen bestående av oksygen, metylen,amino, tiol, -NHC(O)-, og -N(C(0)CM alkyl);

   eller G<2>R<4> eller G4R7 kan sammen være et hydrogenatom eller hydroksyl;

   eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav,

   for fremstilling av et medikament for å stimulere en immunrespons mot nevnte antigen.