NO178504B - Fr.måte for fr.stilling av minaktivin,DNA-molekyl,gen,vert,prober,preparat som omfatter prober,reagens for lokalisering og defini. av grenser for tumor i histologiske pröver,samt anvendelse av DNA-molekyl,minaktivin og preparat - Google Patents

Description

Teknisk område

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av renset minaktivin, DNA-molekyl som koder for en aminosyresekvens hos minaktivin, rekombinant DNA-molekyl, sammensmeltet gen, samt en rekombinant vert. Den vedrører også reagens for lokalisering og definering av grensene for tumorer i histologiske prøver, syntetisk oligonucleotidprobe og preparater derav, samt anvendelse av det rekombinante DNA-molekyl, fremstilte minaktivinprodukter og preparatene-

Bakgrunnsteknikk

Minaktivin (PAI-2) er en naturlig forekommende inaktivator av urokinasetype plasminogenaktivatorer. Denne type plasminogenaktivator finnes i helt uvanlig høye nivåer i mange alvorlige humane carcinomer, særlig i lunge, tykktarm, bryst og prostata. Plasminogenaktivatorer er serin-proteaser som antas å formidle den proteolyttiske kaskade som følger med cellulær translokasjon, forflytning og inntrengning. Som sådanne synes de å være forbundet med vev-ødeleggelse og omdanning, og har vært implisert i tumorvekst og metastase. De kan også spille en rolle i betennelsesreaksjoner.

Plasminogenaktivatorer finnes generelt å være av to typer: 1) urokinasetype og 2) vevtype. Plasminogenaktivator av vevtype finnes hovedsakelig i blodet og blodkarveggene,

og hvor den er ansvarlig for aktivering av det fibrino-lyttiske forsvarssystem mot trombose. Plasminogenaktivatorer av urokinasetype synes ikke å spille noen rolle i normale, trombolyttiske prosesser, men har vært implisert i de pato-logiske hendelser som er forbundet med inntrengning og vev-ødeleggelse, særlig tumormetastaser og betennelsesreaksjoner.

Flere inhibitorer som er spesifikke for plasminogenaktivatorer, er blitt beskrevet og som omfatter én isolert fra morkake (Holmberg, L., Biochim. Biophys. Acta 544,

128-137 (1978)) og en annen (PAI-1) som fremstilles i dyr-kede, vaskulære endotélceller (Van Mourik, J.A.,

Lawrence, D.A., Loskutoff, D.J., J. Biol. Chem. 259, 14914-14921 (1984)). Minaktivin ble funnet å bli fremstilt av blodmonocytter og U937-celler, og synes å være immunologisk beslektet med morkakeinhibitoren. Slektsskapet mellom disse forskjellige inhibitorer er for tiden ukjent.

Som tilfellet er med de fleste andre sterkt biologisk aktive proteiner, fremstilles minaktivin i svært små mengder in vivo og er som sådan svært vanskelig å rense og karakterisere ved hjelp av vanlige biokjemiske fremgangsmåter. Ettersom derfor store mengder renset minaktivin er påkrevet for ytterligere bedømning av dens egenskaper og biologiske virkningsfullhet i kliniske anvendelser, er det ønskelig å produsere proteinet under anvendelse av rekombinante DNA-teknikker; dvs. ved kloning av minaktivingenet inn i en alternativ vert, slik som bakterie- eller dyreceller. For å klone minaktivin er det ønskelig å rense inntil homogenitet de små mengder som kan renses slik fra naturlig forekommende minaktivin for å fremstille antistoffer, aminosyresekvenser, peptidfragmenter og syntetiske oligo-nucleotider avledet fra den rensede minaktivin. Disse reagenser kan brukes i kloningsfremgangsmåter.

Forkortelser

HPLC : høytrykksvæskekromatografi

Mr : relativ molekylvekt

MW : molekylvekt

PMA : 4-forbol-12-myristat-13-acetat

SDS-PAGE: natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgel-elektroforese

TFA : trifluoreddiksyre

HPA : human plasminogenaktivator

bp : basepar

kb : kilobasepar

PU : Ploug

Beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling av renset minaktivin, kjennetegnet ved at:

a) en cellelinje som er i stand til å uttrykke minaktivin, dyrkes, b) den minaktivinholdige supernatant innhøstes og kultursupernatanten konsentreres ved å bruke en hulfiber-dialyse/oppkonsentreringsenhet utstyrt med en filtreringsinnsats med passende membran-porestørrelse, c) supernatanten fraksjoneres ved hydrofob kromatografi på en fenyl-"Sepharose"-kolonne og/eller ionebytterkromatografi, hvor elueringen ved ionebytterkromatografien er en trinnvis pH-eluering, d) preparatet som inneholder minaktivin, fraksjoneres ved gelfiltreringskromatografi, e) det minaktivinholdige eluat isoelektrofokuseres, isoelektrofokuseringsfraksjonene prbbes med antistoffer for å lokalisere minaktivinbåndet, og proteinene elueres fra gelen med 1 M glycin som inneholder 1 mM EDTA, pH 9,0, og/eller f) fraksjonen som inneholder minaktivinaktivitet, fraksjoneres ved HPLC-fordelingskromatografi.

Ved en foretrukket utførelsesform består kulturen av en makrofagcellelinjekultur. Foretrukne dyrkningsbeting-elser omfatter dyrking i fravær av serum og/eller i nærvær av en tilstrekkelig mengde av et stoff eller stoffer som vil inhibere urokinaseproduksjon eller indusere konstitutiv produksjon av minaktivin. Et egnet stoff for dette formål er dexamethason som fortrinnsvis brukes ved en konsentrasjon på 1 uM. Kulturen kan også dyrkes i nærvær av PMA. Et foretrukket konsentrasjonsområde for PMA i kultur er 1-300 ng/ml, helst 10-30 ng/ml.

Et foretrukket volum av innhøstet kultursupernatant er 4-5 liter. Det innledende oppkonsentreringstrinn er fortrinnsvis et 10-gangers oppkonsentreringstrinn. Et egnet apparat for denne oppkonsentrering er en "Amicon" DC2 hulfiberdialyse/oppkonsentrerings-enhet utstyrt med en patron med grensemolekylvekt på 30.000.

Dialysen ifølge trinn b) skjer fortrinnsvis med et slikt dialysat som 50 mM glycin, pH 7,8. Helst bør 50 mM glycindialysatet med pH 7,8 brukes ved et volum som er minst like stort som volumet av prøven som dialyseres mot dialysatet.

Kromatografien ifølge trinn c) utføres fortrinnsvis på en fenyl-Sepharose<®->kolonne. For den trinnvise pH-eluering bør ionestyrken til supernatanten helst reguleres til 2M, særlig kan dette skje ved tilsetning av fast NaCl, deretter bør pH reguleres til 5,5, fortrinnsvis med sitronsyre. Et foretrukket ekvilibreringsmiddel for fenyl-Sepharose<®->kolonnen er en oppløsning av 50 mM Na-citrat, pH 5,5, 2M NaCl og 1 mM EDTA. Kolonnen kan elueres først med ekvilibreringsbuffer, deretter med 50 mM Na-citrat, pH 5,5, inneholdende 0,5M NaCl og 1 mM EDTA, og til slutt med 50 mM glycin, pH 9,0.

Isoelektrofokuseringstrinnet utføres fortrinnsvis på en preparativ plangel av "Ultrodex" inneholdende "Ampholines" i pH-området 4,5-6,0. Helst elektrofokuseres gelen ved 10°C i 23 timer på et LKB "Multiphor" isoelektrofokuseringsapparat. Egnede antistoffer som anvendes ifølge trinn e), omfatter geit-anti-morkake-inhibitor-antistoffer.

Fordelingskromatografien ifølge trinn f) er fortrinnsvis HPLC, helst utført på en "Vydac" C-4 reversfase-kolonne under anvendelse av en Waters høytrykksvæskekromato-graf. Elueringsgradienten er fortrinnsvis acetonitril i 0,1%

TFA.

Fordøyelse av det rensede minaktivin skjer fortrinnsvis med endoproteinase LysC. Egnede fordøyelsesbetingelser omfatter 3-5 ug minaktivin med 0,1 ug endoproteinase LysC i 20 mM Tris-Cl, pH 8,5, 5M urea, ved et volum på 50 ul og 22°C i 8 timer. En egnet form for fordelingskromatografi er reversfase-HPLC, særlig under anvendelse av en "Synchropak" RP-P(C-8)-kolonne med en gradient av acetonitril i 0,1% TFA.

Videre tilveiebringer oppfinnelsen et DNA-molekyl som koder for en aminosyresekvens hos minaktivin, kjennetegnet ved at det omfatter DNA-sekvensen:

en variant av DNA-sekvensen som koder for aminosyresekvensen som DNA-sekvensen koder for, en DNA-sekvens som koder for en naturlig forekommende allelisk variant av aminosyresekvensen, eller en DNA-sekvens som omfatter en del av DNA-sekvensen, idet DNA-molekylet fortrinnsvis er i hovedsakelig ren form.

Slike DNA-sekvenser kan fremstilles f.eks. fra pattedyrceller ved å ekstrahere total DNA fra disse og isolere sekvensene ved hjelp av standardteknikker for fremstilling av rekombinante molekyler.

Også innenfor omfanget av oppfinnelsen er et rekombinant DNA-molekyl, kjennetegnet ved at det omfatter et DNA-molekyl ifølge krav 7 og vektor-DNA, hvor vektor-DNA-en fortrinnsvis omfatter et plasmid valgt blant pMSG-, pKC-, pLJ-, pBR322-, pUC- og pUR-systemer, pZIP Neo SV(X), pLK57 og pLK58; samt et sammensmeltet gen, kjennetegnet ved at det omfatter en flyttbar promoter, et sete for translasjonsstart og et DNA-molekyl ifølge krav 7.

Videre tilveiebringer oppfinnelsen en vert som er kjennetegnet ved at den er transformert med minst ett rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 8 eller krav 9, idet verten fortrinnsvis er valgt blant: bakterier, f.eks. E. coil, Pseudomonas-arter og Bacillus-arter; gjær; andre sopper; eukaryote, ikke-differensierende cellelinjer, f.eks. insekt-celler, og humane eller andre pattedyrceller.

Særlig foretrukket er den transformerte vert ATCC 53585.

Oppfinnelsen tilveiebringer også et reagens for lokalisering og definering av grensene for tumorer i histologiske prøver, hvor reagenset omfatter passende merket homogent minaktivin, særlig homogent minaktivin avledet fra rekombinant DNA, eller fragmenter av minaktivinet fremstilt i henhold til fremgangsmåten ifølge krav 5.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre syntetiske oligonucleotidprober som er kjennetegnet ved at de har en sekvens av et DNA-molekyl ifølge krav 7.

Oppfinnelsen tilveiebringer også preparater omfattende syntetiske oligonucleotidprober ifølge oppfinnelsen.

Fortrinnsvis er preparatene diagnostiske reagenser.

Endelig tilveiebringer oppfinnelsen anvendelse av et rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 8 eller 9 for fremstilling av et polypeptid som utviser aktivinets immunologiske eller biologiske aktivitet; av merket, homogent minaktivin fremstilt ifølge krav 1 for lokalisering og definering av grensene for tumorer i histologiske prøver; av merkede peptider av minaktivin fremstilt ifølge krav 5 for lokalisering og definering av grensene for tumorer i histologiske prøver; og av et preparat ifølge krav 15 i en analyse utformet for ln vitro-påvisning av DNA som koder for minaktivin. Mangel på evne hos vev til å produsere minaktivin kan skyldes sensibilitet overfor carcinomer og betennelsestilstander. Påviste mangler kan be-handles ved administrering av renset minaktivin til pasienten og kan også tjene som en markør for vev påvirket av carcinomer og betennelse.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 er en plotting av minaktivinaktivitet som viser effekten av PMA på minaktivins utskillelse. Figur 2 er en gelanalyse av et størrelsefraksjonert minaktivin-mRNA-preparat. Figur 3 er et autoradiografi av immunoutfellings-produktene som etterfølger in vitro translasjon av størr-elsef raks jonert mRNA med minaktivin-mRNA i fraksjonene

sentrert rundt 18S rRNA-standard.

Figur 4 er et autoradiografi av immunoutfelte translasjonsprodukter som oppviser spesifisiteten til kompleksdannelse med urokinase under anvendelse av anti-urokinase-antistoffer. Figur 5 er et autoradiografi av immunoutfelte trans-las jonsprodukter som oppviser spesifisiteten av kompleksdannelse med urokinase under anvendelse av anti-morkake-inhibitor-antistoffer. (Autoradiografi som viser identitet til resultatene under anvendelse av anti-morkake-inhibitor-antistoffer med resultater under anvendelse av anti-urokinase-antistoffer). Figur 6 er et autoradiografi som viser identifisering av minaktivin-translasjonsprodukter ved sammenligning av immunoutfelte produkter i nærvær og fravær av urokinase under reduserende betingelser. Figur 7 er en fremstilling av en gel som viser differensiering av urokinasearter under anvendelse av tek-nikken med fibrin-overlegging. Figur 8 er et Sephacryl<®> S-200 kromatogram som viser eluering av anriket minaktivinaktivitet i forhold til total proteineluering. Figur 9 er en plotting som viser differensiell eluering av minaktivinaktivitet fra fenyl-boronat-agarose under varierende elueringsbetingelser. Figur 10 er et kromatogram som viser eluering av minaktivinaktivitet i forhold til totalt protein eluert fra en kromofokuseringskolonne som en funksjon av eluerings-pH. Figur 11 er en overlegging som viser minaktivinaktivitet over en gel av proteinfraksjonene isolert fra en isoelektrofokuseringsgel for å vise proteininnhold i forhold til minaktivinaktivitet. Figur 12a er en elueringsprofil for en immunoaffini-tetskolonne som viser eluering av minaktivinaktivitet. Figur 12b er en fremstilling av en SDS-PAGE-gel av minaktivin eluert fra immunoaffinitetskolonnen og en Western blot av denne gel. 125 Figur 13 er et autoradiografi av I <125> -merket urokinase på SDS-PAGE som viser former med høy og lav molekylvekt, og dissosiasjon av form med høy molekylvekt under reduserende betingelser. Figur 14 viser elueringsprofilen for minaktivinaktivitet og protein fra trinn-pH-elueringen av fenyl-Sepharose<®->kolonnen.

A: eluering med 50 mM natriumcitrat, pH 5,5, 1 mM EDTA, 0,5M natriumklorid.

B: eluering med 50 mM glycin, pH 9,0.

Figur 15 er en overlegging av minaktivinaktivitet over en SDS-PAGE-gel av proteinfraksjonene isolert fra en isoelektrisk fokuseringsgel for å vise proteininnhold i forhold til minaktivinaktivitet. Figur 16 er en fremstilling av fraksjonene fra for-søket med isoelektrisk fokusering vist i figur 15 etter Western-overføring av proteinet på nitrocellulose og immunologisk påvisning av proteinene med anti-morkake-inhibitor-antistoffer. Figur 17 viser en elueringsprofil for det høyrensede minaktivinpreparat fra en "Vydac" C-4 reversfase høytrykks-væskekromatografering. Figur 18 er en fremstilling av en SDS-PAGE som viser homogen minaktivin erholdt fra topp 5 fra HPLC-en vist i figur 17. Figur 19 viser elueringsprofilen for peptider av minaktivin eluert fra en "Synchropak"RP-P (C-8)-kolonne høytrykksvæskekromatografering. Figur 20 viser endonucleaserestriksjonskartet og DNA-sekvenseringsfremgangsmåten for klonene som inneholder segmenter av minaktivingenet. Figur 21 viser hybrid-utvelgelsestranslasjon av minaktivin-mRNA. Figur 22 viser oppbygningen av plasmidet pBTA438 som inneholder det sammenhengende minaktivingen. Figur 23 viser den fullstendige cDNA for minaktivingenet og den utledede aminosyresekvens for minaktivinproteinet. De 5 peptidene erholdt fra aminosyresekvensanalysen, er understreket. Figur 24 viser oppbygningen av minaktivin-ekspresjons-vektorene pBTA4 44 og pBTA447. Figur 25 viser SDS-polyacrylamidgelelektroforesen,

35

Western-analysen og S radioaktivt merket proteinanalyse

av minaktivin uttrykt fra pBTA44 7.

Figur 2 6 viser oppbygningen av hybridprotein-ekspresjonsvektorene a) pBTA440 og b) pBTA586. Figur 27 viser SDS-polyacrylamidgelelektroforesen,

35

Western-analysen og S radioaktivt merket proteinanalyse

av hybridminaktivinproteinene uttrykt fra pBTA440 og PBTA5 86. Figur 2 8 viser oppbygningen av pattedyr-klonings-vektorene pBTA587, pBTA588 og pBTA590 som inneholder minaktivingenet. Figur 29 er et autoradiografi som viser ekspresjon av minaktivin i pattedyrceller etter immunoutfelling i nærvær dg fravær av urokinase.

Beste måte for utførelse av oppfinnelsen

Induksjon av U937- cellelinje for forøkt minaktivinsyntese

Minaktivin er funnet å bli fremstilt av induserte, humane monocytter, visse makrofager og transformerte celler av monocyttisk linje (se internasjonal patentsøknad W086/01212). Den transformerte cellelinje U937 (ATCC CRL 1593) ble funnet å produsere minaktivin i vesentlig mengde i nærvær av dexamethason. Minaktivinnivået utskilt ved hjelp av disse cellene under serumfrie betingelser ble funnet å være bare ca. 0,06% av det samlede protein utskilt ved hjelp av disse celler. Det ble funnet at dette nivå kunne økes med omtrent en størrelsesorden til 0,4% ved tilsetningen av 4-forbol-12-myristat-13-acetat (PMA). Virk-ningen av PMA på minaktivinutskillelse med tiden fulgte en bifase-kurs med en innledende forsinkelsesperiode på 6 timer, etterfulgt av en lineær økning i minaktivinaktivitet opptil 60 timer (figur 1). Ingen forskjeller ble iakttatt ved å øke PMA-konsentrasjonen fra 10 ng/ml til 30 ng/ml. Dessuten ble det bestemt at forbolestrene var nært knyttet til cellene, ettersom radioaktivt merket PMA bare kunne påvises i små mengder (mindre enn 10%) i kultursupernatantene selv etter 17 timer.

Eksemplene nedenunder illustrerer foretrukne utfør-elsesformer av oppfinnelsen. De bør ikke oppfattes som be-grensende for omfanget av oppfinnelsen. Med mindre annet er angitt, er alle deler og prosentdeler basert på vekt.

Eksempel 1

Cellekultur

Den humane makrofagcellelinje, U937, ble dyrket i RPMI 1640 inneholdende 10% kalvefosterserum og 1 uM dexamethason, enten i T175 dyrkningskolber eller i en 10 liters Braun-fermentor. Cellene ble holdt ved densiteter på

1-3 x 10 celler/ml. Selv om minaktivin ble utskilt av cellene under denne vekstfase, ble cellene overført til serumfritt medium for å oppnå supernatanter for minaktivin-rensing. Cellene ble pelletert, vasket en gang, resuspendert i RPMI 1640 inneholdende 1 uM dexamethason, og dyrket i et tidsrom på tre dager. Det utskilte minaktivinnivå fra disse cellene under serumfrie betingelser kunne økes med omtrent en størrelsesorden til 0,4% ved tilsetning av PMA.

Cellene ble deretter innhøstet og supernatantene brukt i rensefremgangsmåten nedenunder.

Eksempel 2

Rensing av homogen minaktivin

a) Oppkonsentrering av serumfrie minaktivinsupernatanter

Normalt ble 4-5 liter kultursupernatant oppkonsentrert 10 ganger ved å bruke en "Amicon" DC2 hulfiber-dialyse/oppkonsentrerings-enhet utstyrt med en innsats med avstengning ved molekylvekt 30.000. Konsentratet ble deretter dialysert mot minst et like stort volum 50 mM glycin, pH 7,8, for å fjerne alle spor av fargestoff.

b) Sentrifugering av minaktivinkonsentrat

Det dialyserte konsentrat ble sentrifugert i en

JA10 sentrifuge ved 8000 rpm i 30 minutter ved 4°C for å pelletere gjenværende cellerester og protein som eventuelt var blitt utfelt under dialysen. Den klarede supernatant ble så delt opp i aliquoter og nedfrosset ved -20°C inntil den trengtes til etterfølgende rensing.

c) Fenyl- Sepharose®- kromatografi ved å bruke en trinnvis pH- eluering

Minaktivin ble ytterligere renset fra ti ganger oppkonsentrert kultursupernatant erholdt fra celle dyrket i fravær av PMA ved hjelp av trinnvis pH-eluering under anvendelse av fenyl-Sepharose<®> på følgende måte.

Ionestyrken til supernatanten (200 ml, 12.000 enheter, spesifikk aktivitet 102 enheter/mg) ble regulert til 2M ved tilsetning av fast NaCl, og pH ble regulert til 5,5 med sitronsyre. Denne oppløsning ble tilført en fenyl-Sepharose<®->kolonne (4,4 cm x 5,0 cm) ekvilibrert i 50 mM Na-citrat, pH 5,5, 2M NaCl og 1 mM EDTA, og eluert med den samme buffer inntil grunnlinjeabsorbansen ved 280 nm (A280) vendte tilbake til grunnlinjen. Kolonnen ble deretter eluert med 50 mM natriumcitrat, pH 5,5, som inneholdt 0,5M NaCl og 1 mM EDTA, og på nytt ble A280 overvåket inntil absorbansen vendte tilbake til grunnlinjen. Minaktivinen ble deretter eluert fra kolonnen med 50 mM glycin, pH 9,0.

Figur 14 viser elueringsprofilen.

Utvinningen av minaktivin ved hjelp av denne fremgangsmåte var 9553 enheter som utgjør 80% av enhetene til-ført kolonnen. Materialet med høyest spesifikk aktivitet er slått sammen (6700 enheter, spesifikk aktivitet 1343 enheter/mg) og oppkonsentrert til 3 ml på en "Amicon" YM10 membran.

d) Sephacryl<®> S- 2Q0 gelpermeeringskromatografi

Den sammenslåtte, oppkonsentrerte minaktivin ble

tilført til en 2,2 cm x 78 cm kolonne av Sephacryl<®> S-200 ekvilibrert med 0,1 M natriumborat, pH 9,0. Fraksjoner med 5,0 ml ble samlet opp ved en strømninghastighet på

0,46 ml/min. Figur 8 viser at minaktivin ble eluert ved bakkanten av den største proteintoppen. Fraksjonene som

inneholdt minaktivinaktivitet, ble slått sammen (4480 enheter, spesifikk aktivitet 1355 enheter/mg) og oppkonsentrert til 3 ml ved å bruke en YMIO-membran. Kalibrering av denne kolonne med kjJ ente M r-standarder indikerte at minaktivin hadde en Mr på 45-48kd.

e) Isoelektrisk fokusering

Den oppkonsentrerte minaktivinoppløsning ble tilført

til en preparativ plangel av "Ultrodex" inneholdende amfoliner i pH-området 4,5-6,0, og elektrofokusert i 23 timer ved 10°C på et LKB "Multiphor" isoelektrisk fokuseringsapparat. Etter fullførelse av behandlingen, ble 30 soner langs gelens lengde skrapet ut og proteinet eluert fra hver med 10 ml IM glycin inneholdende 1 mM EDTA, pH 9,0. Aliquoter av hver fraksjon ble analysert med hensyn på minaktivinaktivitet og underkastet elektroforese på 15% SDS-polyacrylamidgeler for å lokalisere protein. Figur 15 viser at en betydelig mengde protein er blitt fjernet fra fraksjonene som inneholder minaktivinaktiviteten. Under disse betingelser fokuseres minaktivin mellom pH 5 og pH 5,2, og innenfor dette området av gelen ble 15% av den samlede aktivitet tilført gelen, utvunnet.

I virkeligheten var bare to proteinbånd synlige (figur 15) i området av den isoelektriske fokuseringsgel som inneholdt minaktivinaktivitet. For å bestemme hvilket av disse båndene som er minaktivin, ble proteinet på en ekvivalent polyacrylamidgel overført på nitrocellulose og probet med antistoffer laget i geit mot morkake-inhibitor. På grunn av like biologiske egenskaper ble det antatt som sannsynlig at de to proteinene ville være immunologisk beslektet.

Som vist i figur 16, kryssreagerer proteinbåndet M^ =

45-48 kd spesifikt med anti-morkake-inhibitor-antistoffene, noe som antyder at dette proteinbåndet er minaktivin.

Videre er denne observasjon i overensstemmelse med Mr på 45-48 kd bestemt for naturlig forekommende minaktivin på gelpermeeringskromatografi.

f) Høytrykksvæskekromatografi

Fraksjonene fra den isoelektriske fokusering ovenfor

som inneholdt minaktivinaktivitet, ble oppkonsentrert 10 ganger på en "Amicon" YM10 ultrafiltreringsmembran og ytterligere fraksjonert på en "Vydac" C-4 reversfase-kolonne ved å bruke en Waters høytrykksvæskekromatograf. Proteinene ble eluert fra reversfasekolonnen ved å bruke en gradient av acetonitril i 0,1% TFA som vist i figur 17.

Hver av absorbanstoppene ble undersøkt ved hjelp av SDS-PAGE, og topp 5 ble funnet å inneholde ren minaktivin (figur 18).

Eksempel 2A

(a) Gelfiltrering

Cellefrie supernatanter ble bearbeidet gjennom trinnene (a) og (b) som beskrevet i renseeksempel 2 i W086/01212, og deretter gjennom fenyl-Sepharose<®> ved å bruke en trinnvis pH-eluering som beskrevet i renseeksempel 1 i W086/01212. Fraksjonene som inneholdt minaktivinaktivitet, ble slått sammen, oppkonsentrert ved utfelling med 85% mettet ammoniumsulfat og tilført en 2,2 cm x 80 cm kolonne av Sephacryl<®> S-200 ekvilibrert i 0,1M natriumborat,

pH 9,0. 3,5 ml store fraksjoner ble samlet opp ved en strøm-ningshastighet på 0,46 ml/min. Figur 8 viser at minaktivin ble eluert i bakkant av den største proteintoppen og hadde en topp-spesifikk aktivitet på 2 206 enheter/mg, noe som utgjør en total økning i spesifikk aktivitet med 31 ganger. Under disse forhold oppfører minaktivinen seg som et molekyl med en lignende Stokes radius som ovalbumin, noe som antyder en molekylstørrelse pa 45-49x10 3 dalton.

(b) Fenylboronat- agarosekromatografi

Cellefrie supernatanter ble bearbeidet gjennom trinnene (a) og (b) som beskrevet i renseeksempel 2 i W086/01212. En ml av supernatanten ble gjort til 10 mM i MgCl2, og deretter ble pH regulert til pH 8,5 med natrium-hydroxyd. Denne oppløsningen ble tilført til en kolonne av fenylboronat-agarose -30 (PBA 30) (0,8 cm x 2,5 cm) ekvilibrert i 50 mM glycin, pH 8,5, inneholdende 10 mM MgC^ ved 4°C. Kolonnen ble deretter vasket med 9 ml av den ovenfor nevnte buffer og deretter i rekkefølge på følgende måte: a) 10 ml av 50 mM glycin, pH 8,5, som inneholdt 10 mM

EDTA

b) 10 ml av 50 mM glycin, pH 8,5, som inneholdt 100 mM sorbitol

c) 10 ml av 100 mM Tris-HCl, pH 8,5

d) 10 ml av 50 mM natriumacetat, pH 5,0

5 ml store fraksjoner ble samlet opp og dialysert

mot 50 mM glycin, pH 7,8, over natten ved 4°C før bestemmelser av minaktivinaktivitet og protein. Resultatene vist i figur 9, illustrerer at to forskjellige topper med aktivitet eluerer fra kolonnen under forskjellige betingelser. Den første toppen eluert med EDTA, inneholder 35% av den samlede aktivitet som er fylt på kolonnen med en økning i spesifikk aktivitet på 14 ganger. Den andre toppen utgjør 32% av den opprinnelige aktivitet med en 4,4 ganger økning i spesifikk aktivitet.

(c) Kromofokusering

Cellefrie supernatanter ble bearbeidet gjennom trinnene (a) og (b) som beskrevet i renseeksempel 2 i W086/01212. Fire ml av denne supernatanten ble dialysert

mot 25 mM imidazol-HCl-buffer, pH 7,4, og deretter tilført en PBE 94 kromofokuserings-kolonne (1 cm x 27 cm) ekvilibrert i den ovenfor nevnte buffer. En lineær pH-gradient ble deretter opprettet ved å tilføre 200 ml polybuffer, pH 4,0,

og 4 ml fraksjoner ble samlet opp i 4 ml aliquoter av IM Tris.HCl, pH 7,5. Hver 10 fraksjoner ble slått sammen, oppkonsentrert og vasket på en "Centricon" 30 og analysert med hensyn på konsentrasjon av minaktivinaktivitet og protein.

Figur 10 viser at hoveddelen av aktiviteten eluerte nær pH 5. Den samlede utvinning av aktivitet var 8 2%, og det var en 2 ganger økning i spesifikk aktivitet.

(d) Isoelektrisk fokusering

Cellefrie supernatanter ble bearbeidet gjennom trinnene (a) og (b) som beskrevet i renseeksempel 2 i W086/01212, og deretter gjennom fenyl-Sepharose<®> ved å bruke en trinnvis pH-eluering som beskrevet i renseeksempel 1 i W086/01212. Fraksjonene som inneholdt minaktivinaktivitet, ble slått sammen, oppkonsentrert ved utfelling med 85% mettet ammoniumsulfat og dialysert over natten mot 50 mM glycin, pH 9,0. Denne oppløsning ble tilført en preparativ plangel av "Ultrodex" inneholdende amfoliner i pH-området 4,5-6,0, og elektrofokusert i 23 timer ved 10°C på et LKB "Multiphor" isoelektrisk fokuseringsapparat. Etter full-førelse av bearbeidingen, ble 30 soner langs lengden av gelen skrapet ut og proteinet eluert fra hver med 10 ml IM glycin inneholdende 1 mM EDTA, pH 9,0. Aliquoter av hver fraksjon ble analysert med hensyn på minaktivinaktivitet og elektroforesebehandlet med 15% SDS-polyacrylamidgeler for å lokalisere protein. Figur 11 illustrerer at en betydelig mengde protein er blitt fjernet fra fraksjonene som inneholder minaktivinaktiviteten. Under disse betingelser fokuserer minaktivin mellom pH 5 og pH 5,2, og innenfor dette området av gelen ble 39% av den samlede aktivitet som ble tilført gelen, utvunnet.

(e) Immunoaffinitetskromatografi

Cellefrie supernatanter ble bearbeidet som gjennom renseeksempel 1. En 4,6 ml aliquot av dette minaktivinpreparat (2300 enheter, 2,25 mg, spesifikk aktivitet 1020E/mg) ble gjort 0,05M i natriumfosfat, 0,5 i NaCl,

0,01% i Triton<®>X-100, 0,1% i natriumazid, 1 mM i EDTA og pH regulert til 7,5. Denne oppløsning ble fortynnet til 15 ml med den ovenfor nevnte buffer og tilsatt til 15 ml Sepharose<®> 4B hvortil 10 mg anti-morkake-inhibitor-antistoff var blitt koblet kjemisk. Oppslemmingen ble rystet over natten ved 4°C og deretter helt over i 2,5 cm x 3,1 cm kolonne. Ubundet protein ble drenert fra kolonnen og kolonnen vasket med buffer inntil absorbansen ved 2 80 nm vendte tilbake til grunnlinjen. Kolonnen ble deretter eluert med 3M KSCN inneholdende 10 mM Tris.HCl, pH 8,0. Elueringsprofilen er vist i figur 12. Fraksjonene eluert ved hjelp av KSCN, ble oppkonsentrert 8,5 ganger på en

"Centricon" 10, vasket med 40 mM glycin, pH 7,8, og analysert med hensyn på minaktivinaktivitet og ved hjelp av SDS-PAGE. Hoveddelen av minaktivinaktiviteten ble ikke bundet til antistoffkolonnen. En liten mengde minaktivinaktivitet (8,5 enheter) bindes imidlertid spesifikt og elueres med 3M KSCN. Dette indikerer at under disse betingelser er antistoffkolonnen blitt overlesset med minaktivin. Videre taper minaktivin over 90% av sin aktivitet i nærvær av KSCN i løpet av et sammenlignbart tidsrom, hvilket tyder på at den lave utvinning av minaktivinaktivitet kan skyldes inaktivering av molekylene i KSCN. SDS-PAGE-resultatene viser at den aller største del av proteinet eluerer ufor-sinket fra kolonnen. KSCN-eluatet inneholder imidlertid et hoved-proteinbånd med molekylvekt ca. 45.000, svarende til molekylstørrelsen til minaktivin ifølge gelfiltrering (se eksempel 2A(a)) (figur 12a). Western-analyse av dette minaktivinpreparat viste en eneste forflytning av immunologisk kryssreaktive arter, identisk med proteinbåndet iakttatt etter SDS-PAGE (figur 12b).

Under visse betingelser er minaktivin blitt observert å ha en molekylstørrelse på omtrent 60-70.000 (som nærmere omtalt i PCT191-85). Denne uoverensstemmelse kan skyldes endret mobilitet på grunn av glycosyleringsgraden til minaktivin.

Eksempel 3

Isolering av og sekvens i peptidfragmenter fra minaktivin

Minaktivin ble renset fra PMA-induserte U937-celler som beskrevet i eksempel 2 ovenfor. Minaktivinen (3-5 ug) ble deretter oppløst med endoproteinase Lys C (0,1 ug) i 20 mM Tris-HCl, pH 8,5, inneholdende 5M urea i et slutt-volum på 50 pl i 8 timer ved 22°C. De resulterende peptider ble separert ved hjelp av reversfase høytrykksvæske-kromatograf i på en "Synchropak" RP-P (C-8)-kolonne under anvendelse av en gradient av acetonitril i 0,1% TFA

(figur 19). Peptidene avmerket ved hjelp av stjernene, ble sekvensbestemt på et gassfase-sekvensbestemmelsesapparat av type "Applied Biosystems" 470A, og sekvensene er som følger:

Pepti d 13: AQILELPY-GDV-MFLLLP-E...

Peptid 11: GRANFSGMSE-NDLF...

Peptid 10: MAE-EVEVYIPQFKLEE-Y...

Peptid 6: LNIGYIEDLK

Peptid 9: IPNLLPEG-V

Eksempel 4

Molekylær kloning av minaktivin

a) Isolering av mRNA

Fra figur 1 kan den optimale transkripsjonstid for

PMA-induserte U937-celler beregnes til å være mellom 15 og 25 timer. En fire-liters, serumfri kultur av U937-celler ved en celletetthet på 1,2 x 10 celler/ml ble derfor inkubert i 19 timer i nærvær av PMA, cellene ble innhøstet og nedfryst hurtig i flytende nitrogen inntil videre bruk. Ikke-PMA-stimulerte U937-celler fra tre-dagers serumfrie kulturer ble også beholdt for mRNA-isolering. Humane blodmonocytter fremstilt som beskrevet i internasjonal patent-søknad W086/01212 og dyrket i 3 dager in vitro, ble også brukt som en mRNA-kilde.

Samlet RNA fra hver av de ovenfor nevnte kilder ble ekstrahert ved hjelp av en modifikasjon av Guanidin-HCL-metoden. Cellepelleten ble homogenisert i 20 volumer (pr. g vekt) buffer inneholdende 4M guanidin-isothiocyanat, 50 mM Tris HC1, pH 7,5, 10 mM EDTA, 0,5% Sarkosyl<®>, 0,1 M 2-mercaptoethanol i et blandeapparat med lav hastighet i

3 minutter ved 4°C. Suspensjonen ble deretter sentrifugert i 10 minutter for å fjerne rester. Nucleinsyrer ble utfelt fra supernatanten ved tilsetning av eddiksyre til 25 mM og 0,75 volumer kald ethanol, og det ble inkubert over natten ved -20°C. Suspensjonen ble sentrifugert på nytt i 30 minutter ved -10°C og pelleten oppløst i buffer inneholdende 7,5M guanidin-HCl, 20 mM natriumacetat, pH 5,0, 1 mM dithiothreitol ved 20% av det opprinnelige volum. Etter sentrifugering for å fjerne eventuelt uoppløst materiale, ble RNA på nytt utfelt med 0,55 volumdeler kald ethanol ved

-20°C i 1-3 timer. RNA ble utvunnet ved sentrifugering,

på nytt oppløst i guanidin-HCl-bufferen og på nytt utfelt. Det siste trinn ble gjentatt 3 ganger. Etter den siste utfelling ble pelleten oppløst i 20 mM EDTA, pH 7,0, og ekstrahert med et like stort volum kloroform:butanol (4:1). RNA ble så utfelt fra vannfasen ved tilsetning av natriumacetat, pH 5,0, til 0,3M og to volumdeler kald ethanol ved -20°C over natten. RNA ble utvunnet ved sentrifugering og behandlet med 100 mg/ml proteinase K i 20 mM HEPES, pH 7,4, 0,5% natriumdodecylsulfat i 4 timer ved 50°C for å fjerne eventuelt restprotein. RNA ble så utvunnet ved utfelling i nærvær av 0,2M natriumacetat, pH 5,0, og to volumdeler ethanol ved -20°C. Etter utvinning ved sentrifugering ble eventuell rest-DNA fjernet ved utfelling av RNA i nærvær av 3M natriumacetat, pH 6,0, over natten ved 4°C. RNA ble utvunnet ved sentrifugering og utfelt i nærvær av 0,25N natriumklorid og to volumdeler ethanol. RNA ble på nytt utvunnet ved sentrifugering. Poly A<+>mRNA ble så isolert ved hjelp av to omganger med adsorpsjon og eluering fra oligo (dT)-cellulose.

Poly A<+>mRNA ble anriket 10-20 ganger med hensyn på minaktivin-mRNA ved hjelp av sentrifugering med sucrose-densitetsgradient. Prøven ble lagt oppå en 15-34% (vekt/vekt) sucrosegradient og sentrifugert i en Beckman SW41-sentrifuge ved 33.000 rpm i 16 timer ved 4°C. Figur 2 viser en gelanalyse under denatureringsbetingelser for det størr-elsesfraksjonerte mRNA-preparat. Minaktivin-mRNA ble påvist i de fraksjonene (fraksjoner 16 og 17) som var sentrert rundt den 18S ribosomale RNA-standard bestemt ved hjelp av in vitro translasjon og immunoutfelling (fremgangsmåte beskrevet nedenunder) som vist i figur 3. b) Identifikasjon av minaktivin- translasjonsproduktet

Minaktivin-mRNA ble identifisert ved hjelp av

in vitro translasjon i et cellefritt reticulocyttlysat-system etterfulgt av immunoutfelling av minaktivin-translasjonsproduktet under anvendelse av dets naturlige substrat, urokinase.

Kanin-reticulocyttlysat kommersielt tilgjengelig fra Amersham, ble brukt først i henhold til produsentens instruksjoner med tilsetning av kalvelever-tRNA (Boehringer Mannheim) ved en konsentrasjon på 100 ng/ml. <35>S-methionin (Amersham) ble tilsatt ved en konsentrasjon på 2 mCi/ml

for å muliggjøre påvisning av translasjonsproduktene ved autoradiografi. Poly A<+>mRNA fremstilt som beskrevet ovenfor, ble translatert ved en konsentrasjon på 50 mg/ml i 90 minutter ved 30°C. 25 mikroliter av translasjonsbland-ingen ble brukt for hver immunoutfelling. Etter inkubasjon og fjerning av en vasket suspensjon av hele Staphylococcus aureus-celler for å minimalisere ikke-spesifikk binding, ble prøven inkubert ved 50 mPU urokinase i 90 minutter ved værelsetemperatur. Dette trinnet muliggjør kompleksdannelse mellom minaktivintranslasjonsproduktet og urokinasen. Komplekset ble fjernet fra oppløsningen ved tilsetning av 1-2 ul anti-urokinase-antiserum, eller antistoffer mot morkakeinhibitor og inkubert ved værelsetemperatur i 30 minutter og over natten ved 4°C, og deretter utfelt ved tilsetning av 25 ul vasket Pansorbin<®>. Etter sentrifugering ble minaktivin-urokinase-antistoff-Pansorbin<®->pelleten vasket, oppløst ved koking i nærvær av 2% SDS og 2-mercaptoethanol, og produktene ble analysert ved hjelp av gelelektroforese etterfulgt av autoradiografi.

35

Immunoutfelling av de S-merkede translasjonsprodukter med antistoffer mot urokinase ga urokinase-spesifikke translasjonsprodukter med Mrs på 6 9.000 og 7 9.000. Disse proteinbåndene representerer spesifikke komplekser av minaktivin med urokinase ettersom: 1) de ikke er til stede i fravær av urokinase eller mRNA,

2) de ikke utfelles i fravær av antistoff, og

3) de konkurrerer med umerket, renset minaktivin og preparater av morkakeinhibitor når det gjelder urokinasebinding (figur 4).

Immunoutfellingsproduktet ble funnet å utgjøre 0,05% av det totale protein syntetisert fra mRNA erholdt fra PMA-induserte U937-celler. Ingen produkter av immunoutfelling kunne påvises fra mRNA erholdt fra ikke-induserte U937-celler, sannsynligvis på grunn av de reduserte nivåer av minaktivin-mRNA i dette preparat.

Immunoutfelling av urokinase-minaktivin-translasjonsproduktene under anvendelse av antistoffer mot morkake-inhibitor ga identiske resultater. Flere anti-morkake-inhibitor-antistoff-preparater utfelte de særegne urokinase-minaktivin-translas jonsproduktkompleksene med molekylvekt 69.000 og 7 9.000 (figur 5).

En sammenligning av de immunoutfelte produkter erholdt i nærvær og fravær av urokinase, muligjør direkte identifikasjon av minaktivin-translasjonsproduktet som vist i figur 6. Det er til stede som et karakteristisk bånd ved en M 'på 43.000. Denne molekylvekten synes å være noe mindre enn den som iakttas for det naturlig forekommende protein, muligens på grunn av glycosylering. I nærvær av urokinase forsvinner dette båndet, og det karakteristiske urokinase-minaktivin-translasjonsproduktet påvises ved Mr 69.000. Tilleggsproteinbåndet ved 79-80.000 Mr som tidligere ble iakttatt, synes å representere en ikke-redusert form av komplekset ettersom prøvene ble analysert under del-vis reduserte betingelser.

Videre ble det funnet at kompleksdannelse med minaktivin-translasjonsproduktet var avhengig av tilstedeværelsen av urokinaseformen med lav molekylvekt (HPA 33). Rene preparater av HPA 52 og HPA 33 ble erholdt og bekreftet å være i overveiende grad den ene art eller den andre ved hjelp av fibrin-overlegging (figur 7). I tillegg ble plasminogen/plasmin tilsatt til HPA 3 3 for å omdanne even-tuelle restspor av HPA 52 i preparatet til formen med lav molekylvekt. Det særegne urokinase-minaktivin-translasjons-produktkompleks med molekylvekt 69.000 kom bare til syne når urokinasepreparatene som ble brukt, inneholdt HPA 33. Forklaringen på dette resultatet er ukjent. Tilsetning

av trasylol til lysatblandingen for å inhibere eventuell proteolyse hadde ingen virkning på dette resultatet.

In vitro translasjon av mRNA fra U937-celler gir altså klart et biologisk aktivt minaktivin-translasjonsprodukt med Mr omtrent 43.000 som lett kan identifiseres ved dannelsen av komplekset med urokinase som gir en karakteristisk Mr på 6 9.000.

c) Konstruksjon av samlinger med komplementær DNA cDNA-samlinger ble konstruert fra total poly A<+>mRNA

eller mRNA fraksjonert ved hjelp av sucrose-densitets-gradient under anvendelse av flere forskjellige etablerte metoder. Som et eksempel ble den første kjede av komplementær DNA generelt syntetisert fra mRNA under anvendelse av primer-initiert revers transkriptase. Den andre kjeden ble deretter syntetisert, f.eks. ved (1) konvensjonell "hårnålsløyfe"-primet DNA-syntese under anvendelse av DNA-polymerase eller revers transkriptase, (2) RNase H-DNA polymerase I - mediert annenkjedet syntese eller (3) 5'-"tailed" priming-metode. Etter behandling med Sl-nuclease (om påkrevet) ble DNA methylert, og butte ender ble generert ved å bruke standardmetoder for igjenfylling, f.eks. DNA-polymerase, Klenow-fragmentet eller T4-polymerase. Deretter kan cDNA-ene klones ved å knytte dem til egnet plasmid (f.eks. pBR322-, pUC- eller pUR-systemer) eller bakteriofag-vektorer (f.eks. lambda gt 11) gjennom komplementære homo-polymer-haler eller cohesive ender dannet med syntetiske koblersegmenter som inneholder passende restriksjonsseter, under anvendelse av fremgangsmåter, og deretter transformere en egnet vert.

Eksempel 5

En foretrukket fremgangsmåte for oppbygning av cDNA-samlingene er som følger. cDNA ble syntetisert fra 6 ug total poly A<+>mRNA under anvendelse av Moloney murin leukemi virus-revers transkriptase (BRL, 200E/ug mRNA) i nærvær av 50 mM Tris HC1, 75 mM KC1, 10 mM DTT, 3 mM MgCl,

1 mM hver av dATP, dCTP, dGTP og dTTP, 10 ug/ml oligo(dT)12_lg og 100 ug/ml BSA. Et 200 ul reaksjonsvolum ble inkubert ved 37°C i 40 minutter. Den andre kjede ble syntetisert ved hjelp av "hårnålsløyfe"-primet syntese under anvendelse av Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I. Reaksjonsblandingen ble varmet opp ved 70°C i 10 minutter

for å separere DNA/RNA-duplekser, fortynnet til to ganger volumet og Klenow tilsatt inntil 325E/ml i nærvær av 10 uCi dATP (1800 Ci/mmol). Reaksjonsblandingen fikk inkubere i 1 time ved 15°C. Etter ekstraksjon med fenol:kloroform (1:1) og ethanolutfelling, ble DNA-en opp-løst og "hårnålsløyfen" fjernet ved behandling med 80 enheter Sl nuclease i nærvær av 0,2M NaCl, 50 mM natriumacetat, pH 4,5, 1 mM ZnSO^ og 0,5% glycerol, og utfelt som beskrevet tidligere.

Den dobbeltkjedede cDNA ble deretter methylert ved

å bruke 20 enheter EcoRl-methylase i nærvær av 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA og 8 uM S-adenosyl-methionin. DNA-en ble reparert ved tilsetning av 2,5E T4 DNA-polymerase i nærvær av 33 mM Tris-acetat, pH 8,0, 66 mM kaliumacetat, 10 mM magnesiumacetat, 0,5 mM dithiothreitol, 0,1 mg/ml BSA og 0,5 mM hver av dATP, dCTP, dGTP og dTTP i 1 time ved 37°C, etterfulgt av tilsetning av T4 polynucleotidkinase (20E) og 0,1 mM ATP. Etter ekstraksjon med fenol:kloroform (1:1) og ethanolutfelling ble EcoRl-koblere tilsatt til den på nytt oppløste DNA (2 ug koblere/1 ug cDNA) under anvendelse av T4 DNA-ligase (IBI; l,2E/ug, DNA). Reaksjonen ble utført på en konsentrert cDNA-oppløsning (167 ug/ml) ved 26°C i 4 timer. Etter behandling med EcoRl ble de frie koblere separert fra cDNA-en ved kromatografering på "Biogel" A150M. Fraksjoner som inneholdt cDNA med gjennom-snittlig lengde større enn 1.000 b.p., ble slått sammen og cDNA-en oppkonsentrert og utfelt ved tilsetning av to volumdeler ethanol. Utbyttet av cDNA var 2,5 ug.

cDNA-samlinger ble fremstilt både i lambda gt 11 og gt 10. cDNA (100 ng) ble ligert til EcoRl-spaltet, fosfatasebehandlet lambda gt 11 (1 ug), ved en DNA-konsentrasjon på 220 ug/ml ved 4°C i 16 timer. DNA-en ble emballert ved å bruke ferdigfremstilte emballeringspreparater. Fager ble forsterket ved adsorpsjon til E. coli stamme Y1088 og

underkastet screening i Y1090. Samlingen med lambda gt 11 inneholdt omtrent 8x10 rekombinanter pr. ug cDNA (94% av den samlede mengde fager). Andelen av rekombinanter som inneholdt cDNA-molekyler, ble bestemt ved screening av samlingen med cDNA syntetisert i nærvær av cc[ 32P]-dATP. Rundt 90% av hvite plakker hybridiserte med denne proben.

For samlingen fremstilt i lambda gt 10, ble cDNA (200 ng) ligert til EcoRI-spaltet, fosfatasebehandlet lambda gt 10 (1 ug) ved en DNA-konsentrasjon på 240 ug/ml ved 25°C i 4 timer. DNA-en ble emballert som ovenfor ved å bruke E. coli stamme C600 hfl.

Samlingen fra lambda gt 10 inneholdt omtrent 7,5x10<g >rekombinanter pr. ug cDNA. Andelen av rekombinanter som inneholdt cDNA-molekyler, ble bestemt ved screening av samlingen med radioaktivt merket cDNA. Mer enn 90% av plakkene hybridiserte med denne probe.

Eksempel 6

Identifikasjon av kloner som inneholder minaktivingenet

Klonen eller klonene som inneholder genet som koder for minaktivin, kan identifiseres med probene beskrevet i eksemplene nedenunder under anvendelse av etablerte teknikker.

Eksempel 6a

Hybrid/ utvelgelse- translasjon

cDNA-kloner som inneholder sekvenser som er komplementære til minaktivin-mRNA, kan identifiseres ved hybridiseringsutvelgelse. Den klonede DNA denatureres, immobiliseres til en fast matriks, slik som nitrocellulose, og hybridiseres til preparater av total mRNA. RNA/DNA-dupleksen varmes opp for å frigjøre mRNA som deretter translateres i det in vitro kanin-reticulocytt-lysat-cellefrie system som beskrevet ovenfor. Translasjonsproduktet kan deretter identifiseres som beskrevet i eksempel 4b.

Eksempel 6b

DNA- prober som er komplementære til minaktivin- gensekvensen

Ved å bruke aminosyresekvensen erholdt for peptider av minaktivin som beskrevet i eksempel 3, kan deretter oligo-nucleotidsekvenser som ville kode for aminosyresekvensen, forutsies og oligonucleotidprober syntetiseres ved å bruke konvensjonell, etablert teknikk. Ved å bruke disse sekvens-data ble en rekke oligonucleotidprober syntetisert ved å bruke et "Applied Biosystems"380A DNA-synteseapparat. Sekvensene til disse oligonucleotidene er:

Den spesifikke oligonucleotidprobe kan merkes radioaktivt og deretter brukes til screening av cDNA-samlinger ved in situ hybridisering av bakteriekolonier eller bakteriofag-plakker under anvendelse av standardteknikker for å identifisere kloner som inneholder hele eller en del av minaktivingenet.

Eksempel 6c

Immunologisk screening

Klonene kan screenes ved å bruke standardfremgangs-måter med antistoffer som kryssreagerer med det naturlige minaktivinprotein.

Antistoffer til minaktivin fremstilles ved hjelp av standardmetoder, f.eks. immuniseres hver kanin med 10-100 ug renset minaktivin i nærvær av et passende adjuvans, slik som Freunds fullstendige eller montanid. Etter en forsterkning med en ekvivalent mengde omtrent fire uker senere kan kaninserum erholdes som kan analyseres med hensyn på antistoffer mot minaktivin.

Eksempel 6d

Screening med hensyn på biologisk aktivitet

Kloner som inneholder minaktivingenet, kan testes eller screenes med hensyn på minaktivinaktivitet ved å bruke enten radioaktivt merket urokinase eller urokinase og antistoffer mot urokinase. Dette vil kunne gjøres ved å bruke standardteknikker for immunologisk screening. Urokinase og antistoffer mot urokinase kan erholdes kommersielt. Radioaktivt merket urokinase kan fremstilles som beskrevet nedenunder.

Kommersielt tilgjengelig urokinase ble affinitets-renset ved kromatografering på p-aminobenzamidin-Sepharose<® >ifølge de publiserte fremgangsmåter [Holmberg, L.,

Bladh, B., Astedt, B, Biochim. Biophys. Acta 445, 215-222

(1976) og Goldfarb, R.H., Quigley, J.P., Biochemistry 19, 5463-5471 (1980)]. Syttifem Ploug-enheter av den rensede urokinase ble jodert ved konjugasjon med N-succinimidyl-3-

(4-hydroxy, 5-[I 125] jodfenyl)propionat ifølge Bolton-Hunter-fremgangsmåten. Den I 125-merkede urokinase ble separert fra den frie markør ved kromatografering på Sephadex<®> G-25M ekvilibrert i 0,1M natriumfosfat, pH 7,0, 0,4M natriumklorid, 0,1% Triton<®> X100 og 1% bærer-bovin-serumalbumin.

125

Analyse av det I -merkede urokinasepreparat ved SDS-polyacrylamidgel-elektroforese under ikke-reduserende betingelser viste tilstedeværelse av de karakteristiske urokinaseformer med høy (M^ 55.000) og lav (Mr 33.000) molekylvekt (figur 14). Under reduserende betingelser ble formen med høy molekylvekt dissosiert i sine karakteristiske underenheter med M 33.000 og 22.000. Jodering av urokinasepreparatet resulterte i et tap på 10-15% plasminogen-aktivatoraktivitet målt ved hjelp av analysen til Coleman og Green [Ann. N.Y. Acad. Sei. 370, 617 (1981)], men hadde ingen virkning på minaktivininhibering av enzymet.

"Dot blot"-analyser hvor forskjellige fortynninger av minaktivin ble avsatt på nitrocellulosepapir, inkubert

over natten med radioaktivt merket urokinase, vasket,

tørket og autoradiografert, viste at den radioaktivt merkede urokinase kunne påvise minaktivin bundet til en fast fase ved en følsomhet på 10 mE eller omtrent 0,1 ng minaktivin.

Eksempel 7

Idenfikasjon av minaktivingenet

Den foretrukne fremgangsmåte for identifisering av minaktivingenet er som følger. Etter syntese ble oligonucleotidprobene 7-10 beskrevet i eksempel 6b, renset ved polyacrylamidgel-elektroforese og merket med polynucleotid-32

kinase (IBI, lE/mol DNA) og gamma- P-ATP, og renset ved ionebytterkromatografi under anvendelse av standardfrem-gangsmåter.

Samlingen fra lambda gt 10 som beskrevet i eksempel 5, ble screenet ved hjelp av in situ hybridisering ifølge standard forsøksfremgangsmåter. Hybridiseringsbetingelser ble regulert for å muliggjøre spesifikk binding med minal bakgrunnsstråling og ble bestemt til å være som følger: Prober 7 og 8: 3 timer ved 50°C i 6xSSC, 5xDenhardts, 0,1% SDS; 20 ug/ml tRNA etter forhybridisering i 1 time ved 42°C i 6xSSC, 5xDenhardts 0,5% SDS, 0,2 mg/ml DNA fra oppkuttet kalvethymus.

Prober 9 og 10: 16 timer ved 3 7°C i lOxDenhardts, 5xSSC, 0,05% natriumpyrofosfat.

32

P-merkede oligonucleotidprober med spesifikk aktivitet som er større enn 10 p cpm/ug, ble brukt ved omtrent 0,5 pmol/ml. Filtrene ble vasket i 0,5X eller 2xSSC inneholdende 0,1% SDS ved økende temperaturer for å øke strengheten for seleksjon av positive kloner.

Plakker som ga positive signaler, ble plukket ut, screenet på nytt og fag-DNA renset ved å bruke standard fremgangsmåter (se f.eks. Maniatis et al., Molecular Cloning 1982).

To rekombinante bakteriofag-kloner MIN1D og MIN611, inneholdende sekvenser som krysshybridiserte til hverandre med EcoRI-bundne cDNA-innskudd på hhv. 2100 og 1060 basepar, ble erholdt. Disse innskuddene ble subklonet i plasmid pUC18, hvorved plasmidene hhv. pBTA440 og pBTA441 ble dannet, og disse ble kartlagt ved hjelp av restriksjonsenzymanalyse som vist i figur 20. Southern blot-analyse av klon MIN1D lokaliserte bindingsområdet i oligonucleotidprobene 7 og 8 innenfor et Xbal-NcoI-restriksjonsfragmentområde med 320 basepar som vist i figur 20.

At disse klonene inneholdt gener som koder for minaktivin, ble verifisert ved hybrid-utvelgelse-translasjon og DNA-sekvensanalyse.

Hybrid/ utvelgelse- translasjon

Renset pBTA440 ble immobilisert på nitrocellulose-fibre ved en konsentrasjon på 20 ug pr. 3 mm x 3 mm filter ifølge fremgangsmåten beskrevet av Maniatis et al.

(Molecular Cloning 1982). Etter vasking ble hvert filter inkubert med 50 ug total mRNA og hybridisert i 3 timer ved 50°C. Etter grundig vasking ble den spesifikt hybridiserte mRNA eluert ved koking og deretter translatert in vitro ved

å bruke et kommersielt kaninreticulocytt-lysatpreparat.

Som illustrert i figur 21, ble den hybridiserte mRNA vist å kode spesifikt for et translasjonsprodukt med Mr 43.000 ved gelelektroforese, karakteristisk for minaktivintranslasjonsproduktet beskrevet i eksempel 4b. I nærvær av urokinase forsvant videre dette båndet, og det karakteristiske urokinase-minaktivin-kompleks ble påvist ved M 69.000.

r

DNA- sekvensanalyse

Restriksjonsfragmenter av pBTA440 ble subklonet inn i de enkeltkjedede fagvektorer Ml3mp9, Ml3mpl8 og M13mpl9, og DNA-sekvensen til det 2.100 bp store innskudd ble bestemt ved å bruke Sanger-kjedetermineringsmetoden. Undersøkelse av DNA-sekvensen indikerte at det 2100 bp store innskudd ikke inneholdt hele den kodende sekvens i minaktivinet.

Primer- forlengeIse

For å oppnå det gjenværende av DNA-sekvensen som koder for det N-terminale område i minaktivin, ble en andre cDNA-samling bygd opp ved å bruke primer-forlengelse. Samlingen ble fremstilt ved priming av 5 mikrogram polyA<+>mRNA med oligonucleotiden 5' TTC CAG TAA ATA ATT CCC TGT GGA TGC ATT 3' som er komplementær til de tidligere sekvensbestemte nucleotider 391-420. EcoRI-bundne cDNA-innskudd ble deretter klonet i lambda gtlO ved å bruke standardtekikker.

3 4

Omtrent 5,3 x 10 av de 7,2 x 10 kloner erholdt, ble screenet med en andre oligonucleotid 5' GCC TGC AAA ATC GCA TCA GGA TAA CTA CC 3' (komplementær til nucleotidene 310-335). Av de 100 positive kloner erholdt, ble 15 renset, og klonen (klon 13) med det største cDNA-innskudd (430 bp) ble subklonet inn i plasmid pUC18, hvorved plasmid pBTA442 ble dannet. DNA-sekvensen til pBTA442 ble bestemt som beskrevet ovenfor (se også figur 20).

Den kodende sekvens i minaktivingenet, inneholdt i pBTA440 og pBTA443, et plasmid som inneholder den 430 bp store 5'-minaktivinsekvens i pUCl8 i motsatt orientering til pBTA442, ble gjort sammenhengende ved rekombinering av visse DNA-restriksjonsfragmenter for dannelse av pBTA438, som vist i figur 22. E. coli K-12, stamme JM109 inneholdende pBTA438, er blitt deponert ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland

20852, U.S.A., 11. februar 1987 under deponeringsbetegnelsen ATCC 53585.

Den fullstendige cDNA-sekvens i minaktivingenet og den utledede aminosyresekvens i minaktivinproteinet er gjengitt i figur 23. Det fullstendige translasjonsprodukt består av 415 aminosyrer (Mr46.543). Genet koder for de 5 peptidene som fås ved aminosyresekvensanalysen av naturlig forekommende minaktivin, slik som vist i figur 23.

DNA-sekvensanalysen avslører at minaktivin er et medlem av serinproteaseinhibitor-overfamilien (kjent som serpiner) selv om den er spesifikk for plasminogenaktivatorer av urokinasetype.

Eksempel 8

Ekspresjon av biologisk aktiv minaktivin

Ekspresjon på høyt nivå av det biologisk aktive molekyl fås f.eks. ved integrering av den cDNA i full lengde som er til stede i pBTA438 i forskjellige vektorer som kan styre syntesen av proteinet i en rekke verter, slik som bakterier eller eukaryotiske celler (slik som pattedyrceller transfisert eller transformert med vektoren). Vektoren inneholder fortrinnsvis en nucleotidsekvens som er i stand til å regulere ekspresjon av nucleotidsekvensen som koder for minaktivin. Denne andre nucleotidsekvens kan omfatte, som et eksempel, en promotersekvens, polyadenylerings-sekvenser eller nucleotidsekvenser som gjør det mulig for proteinet å bli uttrykt som et hybridmolekyl smeltet sammen med et annet protein.

Eksempel 9

Bakterieekspresjon av minaktivin

Den generelle fremgangsmåte er fremstillingen av en ekspresjonsvektor eller et kloningshjelpemiddel som lar seg replikere i E. coli, som inneholder en DNA-sekvens som koder

for ekspresjon av minaktivin.

Minaktivin kan uttrykkes i sin naturlig forekommende form eller som et hybridmolekyl som er smeltet sammen med et annet protein. Disse konstruksjonene er vist i figurene 24 og 26.

En serie plasmidkonstruksjoner brukte lambda P - ekspresjonsvektorene pLK57 og pLK58 (Botterman et al.,

Gene 37_; 229-239, 1985) for å uttrykke naturlig forekommende eller tilnærmet naturlig forekommende (N-terminal aminosyre-modifisert) minaktivin.

Som vist i figur 24, ble plasmidet pBTA438 oppløst med EcoRI og Pral, og et 1610 bp EcoRI- Dral-restriksjonsfragment ble isolert fra en agarosegel. Dette fragmentet ble ligert med T4-ligase til vektor pLK57 som var blitt oppløst med EcoRI og EcoRV. Derivatplasmidet pBTA444 inneholder lambda P -promoteren som regulerer ekspresjonen av naturlig forekommende minaktivin.

Ekspresjonsvektoren pBTA444 ble brukt til å transformere E. coli K-12 stamme N4830 (Joyce et al. PNAS 80, 1830-1834, 1983) som inneholder den varmelabile cl-repressor fra lambda. Celler transformert med pBTA444, ble dyrket over natten i MEB-medium (Mott et al. PNAS 82, 88-92, 1985)) med 100 ug/ml ampicillin ved 28°C. Celler ble fortynnet i MEB-medium, dyrket ved 28°C til en OD^q<q> på 1,0, hvoretter forvarmet (65°C) MEB-medium ble tilsatt i like stort volum for å ekvilibrere temperaturen til 42°C. Etter 4 timer med dyrking ved 42°C ble cellene innhøstet, og membran- og oppløselige proteinfraksjoner ble fremstilt ved å resuspen-dere vaskede celler (etter -70°C nedfrysing og opptining) i 200 u 20% sucrose 30 mM Tris-HCl, pH 8,1, og 1 mg/ml lysozymoppløsning, etterfulgt av tilsetning av 3 ml 3M EDTA, pH 7,3. Celleekstraktet ble klaret ved kortvarig lydbølge-behandling, og membran- og uoppløselige proteiner pelletert ved sentrifugering (27.000xg), 60 minutter. De oppløselige proteiner ble utfelt ved tilsetning av trikloreddiksyre

(10% vekt/volum) til supernatanten og pelleten oppløst i vann. De pelleterte membraner ble også oppløst i vann.

Prøver av disse fraksjonene for både ikke-induserte (28°C) og induserte (42°C) celler ble analysert ved SDS-polyacrylamidgel-elektroforese og immunologisk påvisning av minaktivin ved hjelp av western-overføring under anvendelse av antiserum mot human morkakeinhibitor. Som vist i figur 25 a,

er et minaktivinproteinbånd (M r40-50K), visualisert ved hjelp av western-overføring under anvendelse av antistoffer mot human morkakeinhibitor og kanin-anti-geit-IgG koblet til alkalisk fosfatase, til stede i både den induserte (42°C), oppløselige fraksjon og membranfraksjonen.

En alternativ fremgangsmåte for fremstilling av naturlig minaktivin er også vist i figur 24. Plasmidet pBTA442 ble oppløst med XhoII og et 243 bp XhoII restriksjonsfragment ble renset fra en agarosegel. Dette fragment ble ligert med T4-ligase til vektor pLK58 oppløst med Bglll. Derivatplasmidet pBTA445 ble oppløst med PvuII og Smal, og

et 2800 bp stort fragment renset og ligert med T4-ligase til et renset 1320 bp PvuII- Dral restriksjonsfragment fra pBTA438. Derivatplasmidet pBTA446 ble gjort lineært med Bglll og ligert til et syntetisk, dobbeltkjedet 26-mer oligonucleotid inneholdende et bakterielt ribosombindende sete og de opprinnelige nucleotider i det naturlige minaktivingen, hvilket ga plasmid pBTA447. Når pBTA447 transformeres inn i en passende vert, slik som N4830, indusert og analysert som beskrevet ovenfor, produseres minaktivin igjen som vist i figur 25. I begge tilfellene, ved pBTA444- og pBTA447-holdige celler, var minaktivin til stede både i de induserte (42°C), oppløselige fraksjoner og membran fraksjonene.

For å fastlegge den biologiske aktivitet av minaktivin produsert i E. coli N4830, ble oppløselige fraksjoner og membranfraksjoner inkubert i 90 minutter med urokinaseformer med høy og lav molekylvekt som beskrevet i eksempel 4. Prøver ble deretter utfelt med aceton, på nytt oppslemmet i vann og undersøkt på en reduserende SDS-polyacrylamidgel. Minaktivin og minaktivin-urokinase-komplekser ble visualisert ved hjelp av western-overføring som beskrevet ovenfor. Som vist i figur 25, er minaktivin i den oppløselige fraksjon fra indusert E. coli N4830 som inneholder pBTA447-komplekser med urokinase under standard analysebetingelser• Dette indikerer at minaktivin produsert fra disse bakteriecellene, beholder biologisk aktivitet.

To eksempler på en fremgangsmåte for fremstilling av et protein som er sammensmeltingen av hele eller en del av en proteinkodende sekvens, og hele eller en del av den minaktivinkodende sekvens, følger nedenunder. Som vist i figur 26, ble plasmidet pBTA440 oppløst med Sspl og Pral, og et 1110 bp stort fragment ble isolert fra en agarosegel. Pette fragmentet ble ligert til vektoren pBTA4 4 9 oppløst med EcoRV, hvilket dannet pBTA450. pBTA450 ble deretter oppløst med Aval og et renset 2800 bp fragment ligert til plasmidet pLK57 oppløst med Aval, hvorved plasmidet pBTA586 ble dannet. Dette plasserer en del av den minaktivinkodende sekvens under kontroll av lambda P -promoteren, og sammensmeltet med den kodende sekvens for de første 80 aminosyrene i traT-genet, hvorav de første 20 utgjør en signalsekvens som resulterer i sammensmeltingen som kommer til syne i den ytre membran hos E. coli. Denne signalsekvensen spaltes fra under transport til den ytre membran som er den normale lokalisering til traT-proteinet.

Når plasmid pBTA586 transformeres i en passende vert, slik som N4830, og induseres med temperatur-endring som ovenfor, kommer traT-minaktivin-fusjonsproteinet til syne i den ytre membran, som vist i figur 27.

Et andre eksempel på en fremgangsmåte for fremstilling av en sammensmelting, er vist i figur 26. I plasmid pBTA440 er den minaktivinkodende sekvens sammensmeltet i ramme med en del av (3-galactosidasegenet som er til stede på plasmid pUC18.

Når plasmid pBTA440 transformeres inn i en passende vert, slik som JM101, eller hvilken som helst E. coli-stamme som inneholder lacl^-genet, og induseres ved tilsetning av isopropyl-thio-(3-D-galactopyranosid (sluttkonsentrasjon 1 mM) , kan minaktivinproduksjon påvises som beskrevet ovenfor

(figur 27) .

Eksempel 10

Ekspresjon av rekombinant minaktivin i eukaryotiske celler

Et fragment av pBTA43 8 inneholdende hele det kodende område for minaktivin, ble innført i en serie vektorer som er i stand til å gi stabil integrering og ekspresjon av eukaryote gener i pattedyrceller. Disse omfattet 1) pKC3 (avledet fra pKO-neo, Van Doren, Hanahan, D., Gluzman, Y.,

J. Virol. 50, 606-614 (1984) ) , hvor minaktivin-cDNA-sekvensen er plassert under kontroll av den første SV40-promoter; 2) pZipNeoSV (X) 1 (Cepko, CL. , Roberts, B.E., Mulligan, R.C., Cell 37, 1053-1062 (1984)), et Molony murin leukemivirus-avledet retroviralt "ferge"-system hvor minaktivingenet er plassert nedstrøms fra den retrovirale LTR-promoter, og utvelgelse er basert på neo-genet som gir kanamycin-resistens i prokaryoter, og G418-resistens i eukaryoter; og 3) pMSG (kommersielt tilgjengelig) hvor regulert ekspresjon av minaktivin oppnås ved utnyttelse av en dexamethason-induserbar promoter som finnes i muse-brysttumorviruset (MMTV) 5' - LTR.

Konstruksjonen av disse tre vektorene er vist i

figur 28, og detaljene er som følger. Det kodende område i minaktivingenet ble isolert fra pBTA438 som et 1610 bp EcoRI- Pral-fragment og innført i følgende vektorer som beskrevet nedenunder.

Pet 1610 bp EcoRI- Pral-fragment ble ligert inn i pKC3 som var blitt oppløst med EcoRI og Smal, og deretter transformert inn i E. coli C6OO7. Pet resulterende plasmid ble betegnet pBTA58 7.

Pen andre konstruksjonen, det 1610 bp store EcoRI-Dral-fragment, ble gjort jevn i endene ved å bruke Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I, ligert inn i Smal-setet til pMSG og transformert inn i en egnet E. coli K-12 vert. Kolonier som inneholdt minaktivingenet i pMSG, ble påvist

32

ved kolonihybridisering under anvendelse av det P-merkede oligonucleotid (29-mer) som tidligere er beskrevet i eksempel 7 (komplementær til nucleotidene 310-335). Det resulterende plasmid ble betegnet pBTA588.

I den tredje konstruksjon ble EcoRI/ Pral-fragmentet med jevne ender beskrevet ovenfor, ligert inn i pUC7 som var blitt oppløst med HincII, hvilket ga konstruksjonen betegnet PBTA589. Ettersom HincII-setet i pUC7 er flankert av BamHI-seter, gjorde dette det mulig for minaktivingenet å bli isolert etter BamHI-oppløsning og ligert inn i BamHI-setet i pZIPNeo SV(X)1. Etter transformasjon inn i en egnet E. coli K-12 vert, ble kolonier inneholdende minaktivingenet påvist ved hjelp av kolonihybridisering som beskrevet ovenfor. Det resulterende plasmid ble betegnet pBTA5 90.

Transfeksjon av eukaryote celler

Alle plasmider ble transfisert inn i eukaryote

celler ved hjelp av calciumfosfat-metoden. Omtrent 1-2 x IO<5 >celler ble sådd i en T25-kolbe i 5 ml Dulbecco modifisert Eagle-medium supplert med 10% (volum/volum) kalvefosterserum, 3,6 mM glutamin, 200 mM, 45IE/ml penicillin og 45 mg/ml streptomycin (fullstendig medium). Omtrent 1 til 5 ug CsCl-gradient-renset DNA ble utfelt med calciumfosfat og tilsatt til cellene. Etter 4 timer ble cellene behandlet med et glycerolsjokk og dyrket i fullstendig medium i 3 dager. Kultursupernatanten ble deretter fjernet for måling av transient ekspresjon. Cellene ble så trypsinert og oppdelt 1/3 i T75-kolber med fullstendig medium inneholdende den passende antibiotikumutvelgelse (se nedenunder). Cellene ble vasket hver 6. - 7. dag med det samme medium og transfektanter plukket ut etter 14-2 8 dager og dyrket individuelt inntil sammenløpende vekst ble oppnådd.

Betingelsene for transfeksjon for hver av pBTA587, pBTA5 8 8 og pBTA5 90 var som følger: pBTA58 7. Ettersom pKC3 ikke inneholder en selekter-bar markør, ble pBTA587 cotransfisert med pZIPNeo SV(X)1

ved et molart forhold på 7,5:1, pBTA587: pZIPNeo SV(X)I. Transfektanter ble selektert med fullstendig medium inneholdende 0,4 mg/ml G418. Transfeksjoner ble utført i COS-celler.

pBTA588. Ettersom pMSG inneholder E. coli xanthin-guanin-fosforibosyltransferase (gpt)-genet uttrykt fra den første SV40-promoter, ble stabilt transfiserte celler selektert i HAT-medium inneholdende hypoxanthin, aminopterin og

mycofenolsyre. Transfeksjoner ble utført ved å bruke NIH3T3-celler.

pBTA590. Transfektanter ble selektert ved å bruke fullstendig medium inneholdende 0,4 mg/ml G418. Transfeksjoner ble utført i NIH3T3-celler.

Analyse av ekspresjon av rekombinant minaktivin i eukaryote celler

Etter transfeksjon påvises transient ekspresjon av rekombinant minaktivin ved å dyrke cellene i nærvær av <35>S-methionin og spesifikk immunoutfelling av den rekombinant, radioaktivt merkede minaktivin ved å bruke antistoffer mot morkakeinhibitor i det vesentlige ifølge fremgangsmåten beskrevet i eksempel 4b. 48 timer etter transfeksjon av pBTA587 i COS-celler ble f.eks. supernatanten fjernet og cellene dyrket i nærvær av 1 ml methionin-fri EMEM, supplert med S-methionm. Etter immunologisk utfelling med 50 ug geit-anti-morkakeinhibitor-antistoffer og 200 ul vasket Pansorbin<®>, ble kompleksene analysert ved hjelp av SDS-polyacrylamidgel-elektroforese (reduserende betingelser) og visualisert ved autoradiografi som vist i figur 29. Rekombinant minaktivin ble påvist som et bånd med Mr 45-48.000 som ikke iakttas i den tilsvarende kontrolltransfeksjon inneholdende vektoren (pKC3) alene. Når urokinase (15 Plough-enheter) tilsettes til supernatanten før immunoutfelling, forsvinner dette båndet som er karakteristisk for biologisk aktiv minaktivin. Det iakttas et bånd ved Mr 6 9.000 som er en indikasjon på minaktivin-urokinasekomplekset, men som er noe utydelig på grunn av et ikke-spesifikt proteinbånd i den samme posisjon. Noe av den rekombinante minaktivin synes også å være blitt proteolyttisk avkuttet etter tilsetningen av urokinasepreparatet, noe som også viser seg ved det påviste bånd for M 35-37.000.

r

At den rekombinante minaktivin fremstilt var biologisk aktiv, ble fastslått ved å dyrke cellene i fravær av serum i 4 timer og kvantifisere inhiberingen av urokinase-aktivitet med hjelp av den kolorimetriske analyse i det vesentlige som beskrevet i eksempel 1. Det ble påvist et inhiberingsnivå som svarer til omtrent 1 enhet/ml minaktivinaktivitet over bakgrunnsstrålingen.

Transfektanter som inneholder minaktivingenet, kan også analyseres med hensyn på minaktivinaktivitet ved å bruke radioaktivt merket urokinase fremstilt som beskrevet i eksempel 6, eller ifølge fremgangsmåten til Baker. Kultur-supernatanter inkuberes med den radioaktivt merkede urokinase for å muliggjøre kompleksdannelse mellom den rekombinante minaktivin og urokinase. Komplekset fjernes så fra oppløs-ningen ved tilsetning av kanin-antistoffer fremstilt mot urokinase, og utfelles ved hjelp av tilsetning av vasket Pansorbin<®> eller anti-kanin-antistoffer covalent bundet til immunokuler. Etter sentrifugering vaskes minaktivin-urokinase-antistoff-pelleten, brytes opp ved koking med 2% SDS, og produktene analyseres ved hjelp av gelelektroforese etterfulgt av autoradiografi. Tilstedeværelsen av biologisk aktiv rekombinant minaktivin fremstilt av de transfiserte celler, vises gjennom forandringen i molekylvekt for urokinase fra Mr 55.000 (eller 33.000) til en høyere Mr (69 til 92.000) (se eksempel 4b) som er karakteristisk for dannelsen av minaktivin-urokinase-komplekset.

Eksempel 11

Rensing og utvinning av biologisk aktivt protein

Etter etableringen av betingelser for ekspresjon av minaktivin i E. coli ved høye nivåer, innhøstes cellene som inneholder plasmidet som utkoder minaktivingenet ved sen log-fase. En volumdel sammenpakkede celler ble oppslemmet i to volumdeler lysebuffer (0,1M natriumfosfat, pH 7,0, inneholdende 1 mM EDTA og 1 mM fenylsulfonylfluorid) og lyset ved hjelp av tre sendinger gjennom en fransk presse ved 1.054,5 kg/cm 2. Suspensjonen ble sentrifugert ved 23.000xg i 20 minutter og pelleten resuspendert i to volumdeler lysebuffer inneholdende 5% Triton<®> X-100. Suspensjonen ble på nytt sentrifugert ved 23.000xg i 20 minutter og pelleten oppslemmet i 3 volumdeler 0,1M Tris-Cl, pH 8,0, inneholdende 8M urea og 0,1M DTT. Oppløsningen ble gjennomboblet med nitrogen og inkubert i et forseglet rør ved 37°C i 2 timer. Etter inku-beringen ble pH i oppløsningen senket til omtrent pH 3,5 ved tilsetning av 50 ul iseddik for hver ml oppløsning. Suspensjonen ble klaret ved sentrifugering som ovenfor, og supernatanten tilført en Sephadex<®> G-75-kolonne (3,2 cm x 90 cm) ekvilibrert i 0,1M eddiksyre. Fraksjonene som inneholdt minaktivinen, ble lokalisert ved hjelp av SDS-PAGE. Fraksjonene som inneholdt minaktivinen, ble slått sammen og dialysert mot 10 mM Tris-Cl, pH 8,0, inneholdende 8M urea og 0,1 mM DTT ved værelsetemperatur i 16 timer. Den analyserte oppløsning ble så tilført en DEAE-Sephadex<®->kolonne (2,2 cm x 25 cm) ekvilibrert i den ovenfor nevnte buffer, og kolonnen ble vasket for å eluere ubundet materiale. Minaktivinen ble så eluert fra kolonnen ved å bruke en lineær gradient av natriumklorid fra 0 til 0,5M i den samme buffer. Fraksjonene som inneholdt minaktivinen, ble identifisert ved hjelp av SDS-PAGE og dialysert grundig mot destillert vann. Proteinet som ble utfelt under denne fremgangsmåte, ble utvunnet ved lyofilisering. Det lyofiliserte protein ble på nytt oppløst i 0,1% trifluoreddiksyre og tilført en "Vydac" C-4 revers-fasekolonne knyttet til en Waters høytrykksvæskekromatograf. Den rene minaktivin ble eluert fra kolonnen ved å bruke en lineær gradient av acetonitril fra 0 til 80% i 0,1% trifluoreddiksyre. A22q-toppen svarende til minaktivin, ble identifisert ved SDS-PAGE, fraksjonene slått sammen og lyofilisert.

Den lyofiliserte, rensede minaktivin ble oppløst i 0,1M Tris-Cl, pH 8,0, inneholdende 8M urea ved en konsentrasjon på 10 mg/ml og fortynnet til 10 ug/ml i 0,1M Tris-Cl,

pH 8,0, inneholdende 1 mM redusert glutathion og 0,1 mM oxydert glutathion. Refoldingsreaksjonen fikk fortsette ved værelsetemperatur i 24 timer, og deretter ble oppløsningen oppkonsentrert og diafiltrert mot 0,1M natriumfosfat, pH 7,0, på en "Amicon" omrørt celle ved å bruke en YMlO-membran.

Den resulterende oppløsning inneholdende aktiv minaktivin, ble analysert ved å bruke analysen beskrevet ovenfor (eksempel 1) .

Utvinningen av biologisk aktiv minaktivin utskilt ved høye nivåer fra pattedyrceller, utføres ved bruk av de samme fremgangsmåter som beskrevet i eksempel 2 for rensingen av den naturlige minaktivin fra U937-celler. Dette omfatter først en 10 ganger oppkonsentrering av den cellefrie supernatant ved å bruke en "Amicon" CD-2 hulfiber-konsentrator utstyrt med en innsats med sperre ved 30.000 dalton. Konsentratet dialyseres så mot minst ett like stort volum 50 mM glycin, pH 7,8, for å fjerne alle spor av fargestoff. Det dialyserte konsentrat sentrifugeres i en JAlO-sentrifuge ved 8000 rpm i 30 minutter ved 4°C for å pelletere gjenværende cellerester og protein som kan være blitt utfelt under dialysen. Den klarede supernatant deles så opp i aliquoter og nedfryses ved -20°C inntil den skal brukes til etterfølgende rensing.

Minaktivin renses ytterligere fra 10-ganger oppkonsentrert kultursupernatant ved trinnvis pH-eluering under anvendelse av fenyl-Sepharose<®> på følgende måte.

Ionestyrken til supernatanten reguleres til 2M ved tilsetning av fast NaCl, og pH reguleres til 5,5 med sitronsyre. Denne oppløsning tilføres en fenyl-Sepharose<®->kolonne (4,4 cm x 5,0 cm) ekvilibrert i 50 mM Na-citrat,

pH 5,5, 2M NaCl og 1 mM EDTA og elueres med den samme buffer inntil grunnlinjeabsorbansen ved 280 nm (A280) vender tilbake til grunnlinjen. Minaktivinen elueres så fra kolonnen med 50 mM glycin, pH 9,0. Fraksjoner inneholdende minaktivinen med høyeste spesifikke aktivitet, slås sammen og oppkonsentreres på en "Amicon" YMIO-membran.

Den sammenslåtte, oppkonsentrerte minaktivin tilføres så en 2,2 cm x 78 cm kolonne av Sephacryl<®> S-200 ekvilibrert med 0,1M natriumborat, pH 9,0. Fraksjoner av 5,0 ml samles opp ved en strømningshastighet på 0,46 ml/min. Fraksjonene som inneholder minaktivinaktivitet, ble slått sammen og oppkonsentrert til 3 ml ved å bruke en YMIO-membran. Kalibrering av denne kolonne med kjente Mr~standarder indikerer at minaktivin har en M på 45-48 kd.

Den oppkonsentrerte minaktivinoppløsning tilføres en preparativ plangel av "Ultrodex" inneholdende amfoliner i pH-området 4,5-6,0, og elektrofokuseres i 23 timer ved 10°C på et LKB "Multiphor" isoelektrisk-fokuserende apparat.

Etter fullførelse av elektrofokuseringen ble 30 soner over gelens lengde skrapet ut og proteinet eluert fra hver med 10 ml IM glycin inneholdende 1 mM EDTA, pH 9,0. Aliquoter av hver fraksjon ble analysert med hensyn på minaktivinaktivitet og elektroforesebehandlet på 15% SDS-polyacrylamidgeler for å lokalisere protein. Under disse betingelser fokuseres minaktivin mellom pH 5 og pH 5,2 og er høyrenset. Dette materiale oppkonsentreres igjen på en "Amicon" YMIO-membran og lagres ved -20°C i 50 mM glycin, pH 9,0, inneholdende 1 mM EDTA og 50% glycerol.

Industriell anvendelse

Som en spesifikk inaktivator for urokinase-type plasminogenaktivatorer, har minaktivin en rekke potensielle industrielle anvendelser som et klinisk reagens for diagnose og eventuell behandling av forskjellige humane carcinomer og betennelsestilstander.

Undersøkelser av celletransformasjon in vitro ved hjelp av tumorvirus (Ossowski,let al., J. Exp. Med. 13 7, 112, 1973) og ved hjelp av kjemiske carcinogener (Sisskin, et al., Int. J. Cancer, _26, 331, 1980) viser begge at plasminogen-aktivatorutskillelse er den mest pålitelige, tidlige biokjemiske hendelse som er forbundet med transformasjon. Videre er cellelinjers evne til å danne metastaser in vivo funnet å korrelere med deres evne til å uttrykke plasminogenaktivator (Wang et al., Cancer Research 40, 288, 1980). Det er også alminnelig antatt at tumorceller i flere av de mest alminne-lige humane kreftformer, dvs. carcinomer i lunge, bryst, prostata og tykktarm, gir høye nivåer av urokinasetype plasminogenaktivator (Duffy, M.J., 0'Grady, P. Eur. J. Clin. Oncol. 20(5)577-582, 1984).

Våre tidligere undersøkelser (Stephens, R.S. et al., Blood 6j5 , 333-337, 1985) vedrørende ondartethet i tykktarm-slimhinne og tilstander som disponerer for ondartethet, dvs. adenom-polypper, polyposis coli og betennelsestilstander i tykktarmen, slik som Crohns sykdom og ulcerøs colitt, har vist at humane tykktarmkreftformer gir betydelig større mengder urokinasetype plasminogenaktivator enn det som oppstår i tilgrensende ikke-involvert vev. Minaktivin ble funnet å være i stand til å binde seg til og inhibere denne tumor-assosierte plasminogenaktivator (Stephens et al., Blood 6_6, 333-337, 1985). Følgelig har minaktivin industriell anvendelse som et reagens for identifisering og bestemm-else av tumorer både in vivo og i histologiske prøver. For å synliggjøre tumorer in vivo, kan minaktivin merkes med en passende isotop, slik som technetium-99m (Richardson, V.J., Brit. J. Cancer 40, 35, 1979) eller jod-131 (Begent, R.H.J. Lancet, 2. okt. 1982). Etter administrering av minaktivin-preparatet kan lokaliseringen til og grensene for tumoren bestemmes ved hjelp av kjente radioisotopmetoder, slik som gamma-kamera-bildedannelse. Minaktivin gir således en følsom metode for å muliggjøre identifikasjonen av små metastatiske kreftformer, særlig de som oppstår etter kirurgisk inngrep. Ved analysen av histokjemiske prøver kan minaktivin

131

eller dens antistoff merkes med en isotop slik som I , eller konjugeres til et passende enzym eller et annet kjemisk reagens. Etter kontakt med en histologisk prøve, slik som et biopsi-utsnitt, vil minaktivin bindes til tumortype-plasminogenaktivatoren ved dens sekresjonssted, og derved identifisere tumorgrensene og eventuelt den metastatiske tilstand til tumoren. I tillegg til dens diagnostiske anvendelser kan minaktivin også brukes i direkte behandling av tumorer. Som en bestemt inhibitor for enzymet som er implisert i prosessen hvorved tumorer invaderer omgivende vev (Dano, K. et al., Adv. in Cancer Res. _44, 138, 1985),

kan det oppnås regulering og særlig inhibering av tumorvekst og metastaser. Videre kan minaktivin brukes som et lege-middel-avgivelsessystem for å avlevere lectiner eller toksiner direkte til voksende tumorer. Det vil forstås at dette systemet kan by på mange fordeler når det gjelder spesifisitet og svært sterkt tumoricide egenskaper.

Andre biologiske fremgangsmåter hvor urokinasetype-plasminogenaktivatorer har vært implisert, omfatter de fysiologiske hendelser som er forbundet med invasjon og vev-ødeleggelse, slik som kroniske betennelsestilstander inkludert reumatoid artritt. Ettersom minaktivin er en del av den naturlige vertrespons på vevnedbrytning, vil den vise seg å være en nyttig markør for overvåkning av sykdomstil-standen, særlig under foreskrevne behandlingsforløp. Merkede antistoffer eller DNA-prober avledet fra minaktivin, har industriell anvendelse som diagnostiske reagenser for overvåkning av minaktivinnivåer i blodplasma, i makrofager fra vevbiopsier og i synovialvæske for korrelasjoner med syk-domstilstander. Likeledes er minaktivin selv også angitt å ha en terapeutisk virkning når den administreres in vivo ved å bedre slike tilstander.

Claims (19)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av renset minaktivin, karakterisert ved at: a) en cellelinje som er i stand til å uttrykke minaktivin, dyrkes, b) den minaktivinholdige supernatant innhøstes og kultursupernatanten konsentreres ved å bruke en hulfiber-dialyse/oppkonsentreringsenhet utstyrt med en filtreringsinnsats med passende membran-porestørrelse, c) supernatanten fraksjoneres ved hydrofob kromatografi på en fenyl-"Sepharose"-kolonne og/eller ionebytterkromatografi, hvor elueringen ved ionebytterkromatografien er en trinnvis pH-eluering, d) preparatet som inneholder minaktivin, fraksjoneres ved gelfiltreringskromatografi, e) det minaktivinholdige eluat isoelektrofokuseres, isoelektrofokuseringsfraksjonene probes med antistoffer for å lokalisere minaktivinbåndet, og proteinene elueres fra gelen med 1 M glycin som inneholder 1 mM EDTA, pH 9,0, og/eller f) fraksjonen som inneholder minaktivinaktivitet, fraksjoneres ved HPLC-fordelingskromatografi.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at kulturen er en makro-f agcellelinj ekultur.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller krav 2, karakterisert ved at kulturen dyrkes i fravær av serum og/eller i nærvær av en tilstrekkelig mengde av et stoff eller stoffer som vil inhibere urokinaseproduksjon eller indusere konstitutiv produksjon av minaktivin, hvor stoffet fortrinnsvis er dexamethason.

4. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-3, karakterisert ved at kulturen dyrkes i nærvær av PMA.

5. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-4, karakterisert ved at det rensede minaktivin fordøyes med endoproteinase LysC.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at de resulterende peptider separeres ved hjelp av HPLC.

7- DNA-molekyl som koder for en aminosyresekvens hos minaktivin, karakterisert ved at det omfatter DNA-sekvensen: en variant av DNA-sekvensen som koder for aminosyresekvensen som DNA-sekvensen koder for, en DNA-sekvens som koder for en naturlig forekommende allelisk variant av aminosyresekvensen, eller en DNA-sekvens som omfatter en del av DNA-sekvensen, idet DNA-molekylet fortrinnsvis er i hovedsakelig ren form.

8. Rekombinant DNA-molekyl, karakterisert ved at det omfatter et DNA-molekyl ifølge krav 7 og vektor-DNA, hvor vektor-DNA-en fortrinnsvis omfatter et plasmid valgt blant pMSG-, pKC-, pLJ-, pBR322-, pUC- og pUR-systemer, pZIP Neo SV(X), pLK57 og pLK58.

9. Rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 8, karakterisert ved at en ekspresjonskontroll-sekvens er operativt bundet til DNA-sekvensen, og fortrinnsvis er ekspresjonskontrollsekvensen valgt fra (3-galactosidasegenet til E. coil, trp-operonet, den venstre promoter i bakteriofag X, den lange endegjentagelse i Moloney leukemivirus, muse-brysttumorvirus eller SV40 tidligpromoter.

10. Sammensmeltet gen, karakterisert ved at det omfatter en flyttbar promoter, et sete for translasjonsstart og et DNA-molekyl ifølge krav 7.

11. Vert, karakterisert ved at den er transformert med minst ett rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 8 eller krav 9, idet verten fortrinnsvis er valgt blant: bakterier, f.eks. E. coil, Pseudomonas-arter og Bacillus-arter; gjær; andre sopper; eukaryote, ikke-differensierende cellelinjer, f.eks. insekt-celler, og humane eller andre pattedyrceller.

12. Vert ifølge krav 11, karakterisert ved at den er den transformerte vert ATCC 53585.

13. Reagens for lokalisering og definering av grensene for tumorer i histologiske prøver, karakterisert ved at det omfatter passende merket homogent minaktivin, særlig homogent minaktivin avledet fra rekombinant DNA, eller fragmenter av minaktivinet fremstilt i henhold til fremgangsmåten ifølge krav 5.

14. Syntetisk oligonucleotidprobe, karakterisert ved at den har en sekvens av et DNA-molekyl ifølge krav 7.

15. Preparater, karakterisert ved at de omfatter syntetiske oligonucleotidprober ifølge krav 14.

16. Anvendelse av et rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 8 eller 9 for fremstilling av et polypeptid som utviser aktivinets immunologiske eller biologiske aktivitet.

17. Anvendelse av merket, homogent minaktivin fremstilt ifølge krav 1 for lokalisering og definering av grensene for tumorer i histologiske prøver.

18. Anvendelse av merkede peptider av minaktivin fremstilt ifølge krav 5 for lokalisering og definering av grensene for tumorer i histologiske prøver.

19. Anvendelse av et preparat ifølge krav 15 i en analyse utformet for in vitro-påvisning av DNA som koder for minaktivin.