NO178007B

NO178007B - Reagens for påvisning av droger

Info

Publication number: NO178007B
Application number: NO901122A
Authority: NO
Inventors: Salvatore Joseph Salamone; Stephen Vitone
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1989-03-10
Filing date: 1990-03-09
Publication date: 1995-09-25
Also published as: ATE154135T1; DE69030829T2; DE69030829D1; EP0386644B1; AU5123190A; JPH03200763A; AU624686B2; NZ232854A; EP0386644A3; US5618926A; ES2104566T3; NO178007C; DK0386644T3; CA2011722C; NO901122D0; JP3009170B2; CA2011722A1; NO901122L; ZA901808B; EP0386644A2

Description

Foreliggende oppfinnelse angår et reagens til bruk ved immunoassaytesting av kroppsvæsker. Mer spesielt angår oppfinnelsen leting etter reagenser som vil gi sensitiv, spesifikk og reproduserbar virkning i sammenheng med mikro-partikkelbaserte immonuassayformater. Det er et stort behov for forbedringer i slike assay for påvisning både av mis-bruk av droger og terapeutiske midler.

I immunoassaymetoder for påvisning av droger har forskjellige utgangsdroger, drogemetabolitter, såvel som syntetiske drogederivater blitt undersøkt som hapteniske utgangspunk-ter for utvikling av en eller flere reagenser i forskjellige assaysystemer. Eksempelvis har slik påvisning blitt beskrevet i EP 279.308, 296.883 og 73.611 samt i US patent 4.621.691 og US 4.262.089. Imidlertid beskriver ingen av disse påvisning ved et konjugat av en poly(aminosyre) eller en polymer med et medikamentderivat hvor forholdet mellom aktivert medikamentderivat og poly(aminosyren) er mindre enn 1, slik som i foreliggende oppfinnelse. De forskjellige forbindelser ifølge tidligere teknikk har vist sine forde-ler og ulemper når de ble anvendt som haptener i seg selv eller når de blir brukt i, eller modifiseres ytterligere for bruk i spesifikke immunoassayformater.

Bruken av slike forbindelser som haptene ligander i mikro-partikkelbaserte immunoassays, dvs. tilknyttet til et mikropartikkelsubstrat i et antall systemer, har også blitt undersøkt. Vanligvis har disse systemer som mål å øke hastigheten, spesifisiteten, og viktigst, påvisningen av den endelige interaksjon eller konkurranse av den mikropar-tikkelbundne ligand med antistoffet eller drogen som er tilstede i en prøve.

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye reagenser for bruk i immunoassays, spesielt ved påvisning av drogebruk ved antistoffmediert diagnostisk undersøkelse av en prøve av kroppsvæsker. Reagensene ifølge foreliggende oppfinnelse er særpreget ved at de har formelen:

hvor:

D er et drogederivat som er antigenisk selektivt for bestemmelse av nærvær av måldroge eller måldrogemetabolitt, A er en aktiverende linker-spacergruppe valgt fra gruppen omfattende grupper av formlene

hvor X er en valgfri avstandsgruppe som forbinder A til D og som omfatter en benzengruppe, en amidgruppe, en tioureagruppe, en ureagruppe, en rett eller forgrenet C-j^q alifatisk gruppe eller en kombinasjon av disse grupper,

P er en poly(aminosyre) eller polymer som er i stand til kovalent binding med A, og

n er mindre enn 1.

Mikropartikkelreagenser fremstilt fra de ovenstående konjugater er videre nye aspekter i foreliggende oppfinnelse.

Figur 1 representerer en kurve av reaksjonsfølsomheten mot det støkiometriske forhold av A-D- og P-reaktanter som brukes ved fremstillingen av P-[A-D]n~konjugater ifølge foreliggende oppfinnelse som benyttet i et latex mikropar-tikkelreagensbasert agglutineringsassay. Reaktiviteten nedtegnes som graden av agglutinering på en relativ skala fra 0 til 4. Kurven viser resultatene av forskjellige mengder av PCP (fencyklidin)-aktivert derivat N-[l-(4-isotiocyanofenyl)etyl]-4-[1-(1-piperidinyl-l-cykloheksyl]-benzamid og benzoylecgoninderivatet [lR-(exo,exo,anti) ]-8-metyl-3-[[4-[[[[[[[(2,5-dioksopyrolidin-l-yl)oksy]karbo-nyl] fenyl]amino]-(tioksometyl)]-amino]metyl]benzoyl]oksy]-bicyklo-[3,2,l]oktan-2-karboksylsyre, begge som det bovine serum albumin latex-partikkelreagens.

Foreliggende oppfinnelse gir nye og nyttige reagenser for påvisning av drogebruk i antistoffmediert undersøkelse av kroppsvæsker. Reagensenene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter en poly(aminosyre) eller et polymerkonjugat som i sin tur er anvendelig som et intermediærreagens for binding til mikropartikulære matriser, for derved å gi et spesielt raskt virkende, følsomt og nøyaktig reagens for mikro-partikkelbasert undersøkelse, såsom latex-agglutinering.

Av spesiell interesse for bruken av foreliggende reagenser er konjugeringen til en aminogruppe som er en del av en poly(aminosyre)-struktur. Med poly(aminosyre) menes både polypeptider og proteiner, som enten er naturlige eller syntetiske. Konjugering av den aktiverte ester til poly-(aminosyre) eller til polymerer inneholdende aminogrupper utføres ved å kombinere de passende mengder av den aktiverte ester med poly(aminosyre) eller aminopolymeren under milde betingelser, normalt en organisk/bufret vandig opp-løsning med et pH-område på ca. 6-9. En typisk anvendelig poly(aminosyre) for fremstilling av reagenser ifølge foreliggende oppfinnelse, er bovint serum albumin (BSA).

Forholdet mellom aktivert drogederivat A-D og poly(amino-syre) eller polymer er et essensielt aspekt ved reagensene ifølge foreliggende oppfinnelse, og deres høye følsomhet og pålitelighet for påvisning av droger i den resulterende diagnostiske test. På grunn av deres utmerkede antigene aktivitet har det blitt funnet at for de aktiverte drogederivater ifølge oppfinnelsen må forholdet n av A-D til P være mindre enn 1, og typisk under 0,5. Således bør, under hensyn til det normalt mindre enn 100 % utbytte som kan forventes fra konjugeringsreaksjonen av A-D med P (da utbytter for de aktiverte drogederivater ifølge foreliggende oppfinnelse med f.eks. bovint serum albumin er mest typisk i området 50-75 %), det opprinnelige støkiometriske forhold av A-D til P for reaksjonen velges tilsvarende.

Det optimale forhold n for et gitt aktivert drogederivat i henhold til foreliggende oppfinnelse kan lett bestemmes ved å nedtegne reaksjonsfølsomheten i et ønsket assayformat mot det støkiometriske forhold hos reaktantene, dvs. A-D/P. Figur 1 viser et typisk resultat av en slik nedtegning for PCP (fencyklidin)- og kokain (benzoylecgonin)- reagenser i tilfeller med et latex agglutinerings-assayformat. I henhold til standard praksis blir disse assay foretatt mot minimum klinisk effektive cuttoff-konsentrasjoner, dvs. som spesifisert av The National Institute on Drug Abuse (De-partment of Health and Human Services), som f.eks. for fencyklidin er 25 ng/ml og for kokain 300 ng/ml.

Den aktiverende linker-spacer-gruppe A kan være en gruppe av formel

hvor X er en valgfri avstandsgruppe som binder A til D og omfåttene en benzengruppe, amidgruppe, tioureagruppe eller ureagruppe eller en rett eller forgrenet alifatisk kjede på <c>l-10' eller en kombinasjon av disse.

Drogederivatet D kan være en måldroge i seg selv, dets metabolitt eller ethvert annet derivat som er tilstrekkelig antigenisk selektivt til å indikere tilstedeværelse av måldrogen eller drogemetabolitten i en undersøkt prøve av

kroppsvæske, f.eks. urin.

Aktiveringsgruppen A er kovalent bundet til den valgte drogen, drogemetabolitten eller drogederivatet på et ste-risk og reaktivt passende sted, som i tilfelle med droger som misbrukes fortrinnsvis er som følger: For amfetamin og metamfetamin: ved orto-, meta-eller para-karbonet i benzenringen, fortrinnsvis para.

For THC: ved 9-karbonet av A<8>THC-derivatene.

For barbiturat: ved 5-karbonet av 5-substituerte barbitursyrederivater.

For fencyklidin: ved orto-, meta- eller para-karbonet av benzenringen, fortrinnsvis para.

For morfin: ved 3-hydroksylgruppen.

For benzoyl ecgonin: ved meta- eller para-karbonet

av benzenringen, fortrinnsvis para.

For 1,4-benzodiazepiner: ved 1-nitrogenet.

De reaktive aminogrupper av P binder til A via amid (i tilfelle N-hydroksysuccinimidester)-binding eller urea eller tiourea (i tilfelle med isotiocyanater)-binding.

Det påfølgende rensede proteinkonjugat bindes enten kovalent eller hydrofobt, vanligvis kovalent, til en mikropar-tikkel som vil bli brukt som det antigene reagens i en spesifikk diagnostisk test for påvisning av droger.

Passende mikropartikler for den kovalente binding av aktiverte drogederivat-proteinkonjugater vil være karboksylerte styrenbutadiener, karboksylerte polystyrener, akrylsyre-polymerer og lignende. Egnede mikropartikler for hydrofob tilknytning av proteinkonjugat vil være polystyren, poly-vinyltoluen, polydivinylbenzen, polyvinylklorid, poly-tertiært butylstyren og lignende. Egnede mikropartikler for direkte kovalent binding av det aktiverte ester vil være aminopolystyren, aminopolyvinyltoluen og lignende. Egnede magnetiske partikler for tilknytning av proteinkonjugater vil være den respektive polymer impregnert med et magnetisk metall, såsom jern(II)- eller jem(III)-oksyder.

Mikropartiklenes størrelse vil typisk strekke seg fra omkring 0,01 til omkring 1,0 jim. Magnetiske mikropartiklers størrelse vil strekke seg fra omkring 0,1 til omkring 20 (im.

Når det spesielle mikropartikkelkoblede produkt er dannet, kan det anvendes i spesifikke diagnostiske tester for påvising av droger i biologiske væsker. Det kan bli brukt i enhver passende konsentrasjon, avhengig av den spesielle test, avlesnigsmetoden for resultatene og angjeldende prøvetype. I et urin-latex-assay gjort synlig for det blotte øye vil vektkonsentrasjonen av latexpartikler være fra ca. 0,1 til ca. 5,0%. I et urin-latex-assay som bruker et instrument for å bestemme graden av turbiditet i området 340 til 72 0 nm, vil vektkonsentrasjonen av latexpartikler være fra ca. 0,001 til ca. 1,0 %. En typisk visuell latex-test er beskrevet i US patent nr. 4.101.549.

For barbiturater er et foretrukket aktivert drogederivat N-hydroksysuccinimidester-derivatet med formel

Ovennevnte derivat, sammen med andre anvendelige derivater i henhold til foreliggende oppfinnelse, kan fremstilles ved å omsette det passende barbitursyrederivat, såsom beskrevet i US patent nr. 4.101.549, med N-hydroksysuccinimid i nærvær av et karbodiimid. Det foretrukne konjugatreagens kan i sin tur dannes ved å binde det aktiverte drogederivat til en poly(aminosyre) eller polymer, generelt via en amidbinding.

For morfin er de foretrukne aktiverte drogederivater iso-tiocyanatderivatene av formel:

hvor R<1> er hydrogen, metyl eller acetyl, fortrinnsvis hydrogen; a er 2 til 8, fortrinnsvis 3; og isotiocyanat-enheten er i meta- eller para-posisjon.

Disse isotiocyanater kan fremstilles ved å omsette den passende beskyttede aminobenzosyre med det ønskede alkyl-aminoopiatderiat, som beskrevet i US patent nr. 3.888.864. Aminogruppen blir så deblokkert og derivatisert til isotiocyanatet ved å bruke tiofosgen under milde betingelser. De konjugerte reagenser blir i sin tur dannet ved å binde det aktiverte drogederivat til en poly(aminosyre) eller polymer, generelt via en tioureabinding.

For amfetamin og metamfetamin<1> er et foretrukket aktivert drogederivat N-hydroksysuccinimidester-derivatet av formel

35 -'■Med mindre annet er angitt, skal referanser heri til droger eller drogederivater med kjente optiske isomere former forstås slik at de også refererer til de optiske antipoder eller racemat.

hvor R<2> er hydrogen i tilfelle med amfetamin og metyl i tilfelle med metamfetamin, b er 1 til 9, fortrinnsvis 3, og alkylkjeden er meta eller para, fortrinnsvis para.

Den aktiverte ester fremstilles ved å omsette d-amfetamin (eller metamfetamin) med trifluoreddiksyre-anhydrid. Det resulterende N-beskyttede amfetamin omsettes med ravsyreanhydrid i nærvær av aluminiumklorid for å gi et i hovedsak beskyttet amfetamin som inneholder en syre og keton. Keto-net reduseres med palladium på kull i en hydrogenatmosfære, og syren blir så omdannet til en aktivert ester med N-hydroksysuccinimid i nærvær av et karbodiimid.

Den beskyttende gruppe, i dette tilfelle trifluoracetyl, fjernes før bruk i et antistoffmediert assay, som f.eks. etter fremstilling av et mikropartikkel(f.eks. latex)reagens .

For tetrahydrocannabinoid er et foretrukket aktivert drogederivat N-hydroksysuccinimidesterderivatet av formel

Slike derivater kan fremstilles ved, som beskrevet i J. Org. Chem, (1986), 51, s. 5463-5465, å omsette det passende cannabinoidderiat med et hydroksysuccinimid i nærvær av et karbodiimid.

For fenylcyklidin (PCP) er de foretrukne drogederivater iso-tiocyanatene av formel

såvel som N-hydroksuccinimidesterderivatet av formel

PCP-isotiocyanatderivatet kan fremstilles ved å omsette PCP-syren som beskrevet i US patent nr. 4.196.185, med tionyl-klorid, etterfulgt av reaksjon med R-(+)p-nitro-oc-metyl-benzylamin-hydroklorid. Nitrogruppen reduseres med Raney-nikkel (H2, etanol), og den resulterende aminogruppe omdannes til et isotiocyanat på samme måte som beskrevet i eksempel 1 nedenfor.

PCP-N-hydroksysuccinimidesterderivatet kan fremstilles

ved å omsette PCP-syren, som beskrevet i US patent nr. 4.296.185, på samme måte som beskrevet i eksempel 7 nedenfor.

nedenfor.

For benzoylecgonin er det foretrukne aktiverte drogederivat N-hydroksysuccinimidesterderivatet av formel

hvor R<3> er hydrogen eller metyl, fortrinnsvis hydrogen.

Disse esterderivater kan fremstilles ved å omsette metyl-ecgonin med syrekloridet av para-cyanobenzosyre. Nitrilet reduseres med Raney nikkel (55 psi H2, metanol), og metyl-esteren blir så fjernet i kokende vann. Aminogruppen omsettes så med isotiocyanatet av para-aminobenzosyre og den aktiverte ester fremstilles på samme måte som beskrevet i eksempel 7 nedenfor.

For benzodiazepiner er et foretrukket drogederivat isotiocyanatderivatet av formel

Isotiocyanatet kan fremstilles ved å omsette 1-(2-aminoetyl)-7-klor-l,3-dihydro-5-(2-fluorfenyl)-2H-l,4-benzodiazepin-2-on som beskrevet i Med. Chem.

(1986), 11, s. 774-777 på samme måte som beskrevet i eksempel 1 nedenfor, hvor aminogruppen omsettes med beskyttet para-aminobenzosyre og videreføres til iso-tiocyanatet.

Av de foregående aktiverte drogederivater er de følgende forbindelser mest foretrukket: For morfin: N-[3-[7,8-didehydro-4,5-epoksy-6-hydroksy-17-metylmorfinan-3-yl)oksy]propoksy]-4-isotiocyanat-benzamid.

For barbiturat: 5-[3-[2,5-diokso-l-pyrrolidinyl)oksy]-1-metyl-3-okso-propyl]-5-(2-propenyl)2,4,6(1H,3H,5H)pyri-midintrion.

For amfetamin: (S)-N[2-[4-[4-[(2,5-diokso-l-pyrrolidinyl)-oksy]-4-okso-butyl]fenyl]-1-metyl-etyl]-2-trifluoracetamid.

For metamfetamin: (S)-N-metyl-N[2-[4-[4-[(2,5-diokso-l-pyrrolidinyl) -oksy]-4-okso-butyl]fenyl]-1-metyl-etyl]-2-trifluoracetamid.

For tetrahydrocannabinoider: l-[[(6a,7,10,10a-tetrahydro-l-hydroksy-6,6-dimetyl-3-pentyl-6H-dibenzo)oksy][b,d]pyran-1-yl-karbonyl]oksy]-2,5-pyrrolidindion.

For fencyklidin: N-[l-(4-isotiocyanofenyl)etyl]-4-[l-(1-piperidinyl)-1-cykloheksyl]benzamid.

For benzodiazepiner: N-[2-[7-klor-5-(2-fluorfenyl)-2,3-dihydro-2-okso-lH-l,4-benzodiazepin-l-yl]etyl]-4-isotiocyanatbenzamid.

For benzoylecgonin: [lR-(exo,exo,anti)]-8-metyl-3-[[4-

[[[[[[[(2f5-dioksopyrolidin-l-yl)oksy]karbonyl]fenyl]-amino]-tioksometyl)]amino]metyl]benz oyl]oksy]bicyklo-[3,2,1]-oktan-2-karboksylsyre.

Foretrukne poly(aminosyre)-konjugater av de ovenfor nevnte drogederivater er BSA (bovine serum albumin)-konjugater og den foretrukne mikropartikkelreagens-utførelsesform innbe-fatter disse konjugater ved kovalent amidbinding til overflaten av karboksylerte latex mikropartikler.

Oppfinnelsen vil bli ytterligere forklart og illustrert i de følgende eksempler. Alle temperaturer er i °Celcius.

Eksempel 1

Fremstilling av opiatreagens

Fremstilling av N-[3-[7,8-didehydro-4,5-epoksy-6-hydroksy-17-metylmorfinan-3-yl)oksy]propoksy]-4-N-(butylcarbamoyl)-benzamid: En omrørt oppløsning av 0,5 g (1,46 mmol) 3-0-amino-propyl-morfin og 0,5 g (2,1 mmol) p-(1-t-butoksy-formamido)benzo-syre (dannet ved å behandle p-aminobenzosyre med di-t-butyl-dikarbonat i nærvær av 1 N NaOH) i 20 ml metylenklorid og 5 ml tørr dimetylformamid) ble behandlet med 0,5 g (2,6 mmol) 1-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimid-hydroklorid og omrørt ved romtemperatur over natten. Reaksjonsblandingen ble vasket med vann (3 x 25 ml), tørket over vannfri natriumsulfat og konsentrert under vakuum. Residuet ble kromatografert på 100 g kiselgel ved å bruke 15% metanolkloroform som elueringsmiddel, som ga 0,77 g (1,37 mmol) N-[3-[7,8-didehydro-4,5-epoksy-6-hydroksy-17-metylmorfinan-3-yl)oksy]propoksy]-4-(N-t-butyl-carbamoyl)-benzamid. NMR (CDC13) 5 1,64 (s,9H,t-butyl), 2,56(2,3H,N-CH3), 4,98(d,J=6Hz, 1H, ArOCH), 7,52(d,J=9H2, 2Hz, Ar), 7,88(d,J=9HZ, 2H, Ar).

Fremstilling av N-[3-[7,8-didehydro-4,5-epoksy-6-hydroksy-17-metylmorfinan-3-yl)oksy]propoksy]-4-aminobenz amid: En omrørt oppløsning av 0,7 g (1,24 mmol) N-[3-[7,8-dide-hydro-4,5-epoksy-6-hydroksy-l7-metylmorfinan-3-yl)oksy]-propoksy]-4-N-(butylkarbamoyl)benzamid i 25 ml metylenklorid ble behandlet med 5 ml trifluoreddiksyre og omrørt ved romtemperatur i 30 min. Oppløsningsmidlet ble fjernet under vakuum og residuet ble oppløst i metylenklorid, vasket med mettet vandig natriumbikarbonat, tørket over vannfri natriumsulfat og konsentrert under vakuum, hvilket ga 0,5 g N-[3-[7,8-didehydro-4,5-epoksy-6-hydroksy-17-metylmorfinan-3-yl)oksy]propoksy]-4-aminobenzamid.

NMR(CDC13) & 2,53(s,3H,N-CH3), 4,85 (d,J=6HZ, 1H, ArOCH), 5,22 (d,J=10Hz, 1H, vinyl), 5,69 (d,J=10Hz, 1H, vinyl), 6,45 - 6,66 (m, 4H, Ar), 7,61 (d,J=8Hz, 2H, Ar).

Fremstilling av N-[3-[7,8-didehydro-4,5-epoksy-6-hydroksy-17-metylmorf inan-3-yl)oksy]propoksy]-4-isotiocyanatbenzamid: En omrørt oppløsning av 0,5 g (1,1 mmol) N-[3-[7,8-dide-hydro-4,5-epoksy-6-hydroksy-l7-metylmorfinan-3-yl)oksy]-propoksy]-4-aminobenzamid i 10 ml metylenklorid ble behandlet med 0,5 g fast vannfri natriumbikarbonat, fulgt av 150 Hl (1,9 mmol) tiofosgen og omrørt ved romtemperatur i 30 min. Oppløsningsmidlet ble fjernet under vakuum og residuet ble kromatografert på 150 g kiselgel ved å bruke 15% metanolkloroform, hvilket ga 230 mg N-[3-[7,8-didehydro-4,5-epoksy-6-hydroksy-17-metylmorfinan-3-yl)oksy]propoksy]-4-isotiocyanatbenzamid som et amorft fast stoff.

IR(CHC13) 3435(NH), 2100(NCS), 1652 (amido), NMR(CDC13-DMS0-d6) 6 l,92(s,l,CH av CH2), 2,07(t,J=6Hz, 2H,CH2), 3,08(d,J=19Hz,l,CH av CHc2), 3,53(bs,1,OH), 4,88 (d,J=6Hz, 1H,ArOCH), 5,28(d,J=10Hz,lH, vinyl), 5,72(d,J=10Hz, 1H, vinyl), 6,57(d,J=6Hz, 2H, Ar), 6,69 (d,J=6Hz, 2H, Ar), 7,28(d,J=9HZ, 2H, Ar), 7,91(d,J=9Hz, 2H, Ar), 7,55(bs, 1H, NH). MS,(+FAB) m/e 504(M+H).

Konjugering av N-[3-[7,8-didehydro-4,5-epoksy-6-hydroksy-17-metylmorfinan-3-yl)oksy]propoksy]-4-isotiocyanatbenzamid (opiat) til bovin serum albumin (BSA)

Til en oppløsning (175 ml) inneholdende natriumbikarbonat (0,5 M), 10% dimetylsulfoksyd (DMSO) og BSA (5,0 g) ved pH 8,0 ved 25° ble isotiocyanatet (0,004 g i 14 ml DMSO) tilsatt dråpevis. Reaksjonen ble omrørt ved 4° i 15 t, ved hvilket punkt den ble overført til dialysepose og dialysert først i en vandig natriumbikarbonat DMSO (10%)-oppløsning (0,05M, pH8, 4 x 10 volumer), og så i en natriumbikarbonat-buffer (0,05M, pH 8, 7 x 10 volumer). Etter dialyse ble proteinkonsentrasjonen målt og justert til 0,005 g pr. ml.

Eksempel 2

Fremstilling av sensitivert latex inneholdende opiat-BSA-konjugatet - generell fremgangsmåte

Til en omrørt latex (Seradyn karboksymodifisert polystyren-(0,888 nm)-suspensjon (180 ml, 10% faststoff), ble det tilsatt N-hydroksybenzotriazol (NHB) (0,6 g i 24 ml vandig dimetylformamid) og l-cykloheksyl-3-(2-morfolinoetyl)-karbodiimid meto p-toluensulfonat (CMC) (2,0 g i 32 ml vann). Suspensjonen ble omrørt i 3 t ved 4°, deretter fortynnet til 2% latex og grundig vasket med vann ved tangentiell strømningsfiltrering. Til den vaskede 2% latex ble det tilsatt 900 ml opiat-BSA-oppløsning fra eksempel 1. Reaksjonsblandingen ble omrørt over natten ved 4°, og ble igjen vasket grundig med vann ved tangentiell strømnings-filtrering. Den vaskede latex ble så justert til en 3% latex faststoffkonsentrasjon (pr. vekt).

Eksempel 3

Opiattest

Fremstilling av reaksjonsbuffer for forsøk:

Dette fortynningsmiddel består av den følgende vandige oppløsning ved pH 7,5:

1. Pipes [0,20M, 1,4-piperazin bis(etansulfonsyre)]

2. PVP [0,50% polyvinylpolypyrrolidon]

3. PEG 8000 [1,50% poly(etylenglykol)]

4. Natriumklorid [10%]

5. Natriumazid [0,1%]

Fremstilling av antiserumbuffer for test:

Renset muse monoklonalt antistoff mot opiater for-

tynnes i et passende buffersystem. Dette fortynningsmiddel består av det følgende i vandig oppløsning i pH 7,0:

1. Pipes (0,05M)

2. BSA (0,25%)

3. Natriumklorid (0,15%)

4. Natriumazid (0,15%)

Forsøksmetode:

10 pl opiatfri urin plasseres i en blandebrønn i en kapillær agglutinografiplate, fulgt av 50 mikroliter hver av antiserumbuffer, reaksjonsbuffer og latex (eksempel 2). De tilsatte væsker omrøres i 3 sek og oppløsningen beveges for å få den i kontakt med kapillæret. Væsken vil bevege seg gjennom kapillæret og fylle overvåkningsområdet ved enden av kapillæret etter 3 til 6 min. Væsken i overvåkningsområdet vil fremtre som fine fnokker (agglutinert) eller melkeaktig. For negative prøver bør agglutinering være meget sterk med meget lite uklarhet.

Fortynningen av et spesielt antiserum som er valgt ved forsøket, er den som har den høyeste fortynning som fremde-les vil gi sterk agglutinering i betraktningsområdet. Når forskjellige mengder opiater oppløses i opiatfri urin i forsøkssystemene, inntreffer ingen agglutinering. Mengden av opiat som er nødvendig for å hemme agglutineringen, vil variere fra 100 ng pr. ml eller mer, avhengig av konsentrasjonen av antiserum som er brukt og styrken av det dannede antiserum. Således er, for systemet beskrevet ovenfor, urin inneholdende 300 ng opiat pr. ml tilstrekkelig for delvis å hemme agglutinering og urin inneholdende 600 ng opiat pr. ml er tilstrekkelig til fullstendig å hemme agglutinering.

Den følgende tabell viser typen av kryssreaktivitet som observeres i systemet beskrevet ovenfor:

Den følgende tabell viser typen spesifisitet og nøyaktighet som observeres med det ovenfor beskrevne assay når det brukes med prøver som er positive for opiater:

Eksempel 4

Fremstilling av barbituratreagens

Fremstilling av 5-[3-[2,5-diokso-l-pyrrolidinyl)oksy]-1-metyl-3-oksopropyl]-5-(2-propenyl)2,4, 6 (1H, 3H,5H)pyrimi-dintrion: Til en oppløsning av 5-allyl-5-(1-karboksyisopropyl)barbi-tursyre (5g, 19,6 mmol) i metylenklorid (150 ml) og dimetylformamid (25 ml) ble N-hydroksysuccinimid (2,5 g, 21,7 mmol) og 1-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimid-hydroklorid (4,5 g, 23,4 mmol) tilsatt. Reaksjonen ble omrørt over natten ved romtemperatur og ble så konsentrert i vakuum. Residuet ble oppløst i metylenklorid og vasket tre ganger med saltsyre (0,2N, 200 ml), en gang med vann og en gang med natriumbikarbonat. I løpet av vasketrinnene dannet det seg et presipitat som ble filtrert, og som ga 2,4 g produkt. Den vandige fase ble ekstrahert med etylacetat og alle organiske lag ble slått sammen, tørket (Na2S04), filtrert og oppiøsningsmidlene inndampet for å gi ytterligere 1,0 g produkt.

IR(KBr), 3245(bred NH), 1810-1685(C=0) cm"<1>,

<X>H NMR(DMSO-dg), 6 0,97(d,J=6Hz, 3H, CH3),

2,55-2,78(m, 4H, CH2), 2,82 (s, 4H, CH2), 5,11 (t, 2H,CH2, vinyl), 5,52(m, 1H, CH, vinyl), ll,68(bs, 2H, NH) MS, (+)FAB, m/e 352(M+H)

Beregnet for C 51,28, H 4,87, N 11,96.

Funnet C 51,06, H 4,91, N 11,94.

Konjugering av 5-[3-[(2,5-diokso-l-pyrrolidinyl)oksy]-1-metyl-3-oksopropyl]-5-(2-propenyl)-2,4,6(1H,3H,5H)pyrimi-din-trion (barbiturat) til BSA (bovin serum albumin).

Til en oppløsning (400 ml) inneholdende natriumbikarbonat

(0,05 M), 10% dimetylsulfoksyd (DMSO) og BSA (6,0 g) ved pH 8,5 og 25° ble N-hydroksy-succinimidesteren (0,008 g i 6,6, ml DMSO) tilsatt dråpevis. Reaksjonen ble omrørt i 15 t ved 4°, og ble så overført til dialysepose og dialysert, først i en vandig natriumbikarbonat-DMSO (10%)-oppløsning (0,05M, pH 8, 4 x 10 volumdeler) og derpå i en natriumfosfatbuffer (0,05M. pH 7, 7 x 10 volumdeler). Etter dialyse ble proteinkonsentrasjonen målt og justert til 0,005 g pr. ml.

Eksempel 5

Fremstilling av sensitivisert latex inneholdende barbiturat-BSA-konjugatet, generell fremgangsmåte

Til en omrørt latex (Seradyn karboksymodifisert polystyren 0,888 nm)-suspensjon (180 ml, 10% faststoff) ble N-hydroksybenzotriazol (NHB) (0,6 g i 24 ml vandig dimetylformamid) og l-cykloheksyl-3-(2-morfolinoetyl)karbodiimid meto p-toluensulfonat (CMC) (2,0 g i 32 ml vann) tilsatt. Suspensjonen ble omrørt i 3 t ved 4°, deretter fortynnet til 2% latex og vasket grundig med vann ved tangentiell strømningsfiltrering. Til den vaskede 2% latex ble det tilsatt 900 ml barbiturat-BSA-oppløsning fra eksempel 4. Reaksjonen ble omrørt over natten ved 4" og ble igjen vasket grundig med vann ved tangentiell strømningsfiltrer-ing. Den vaskede latex ble så justert til en 3% latex faststoff(pr. vekt)-konsentrasjon.

Eksempel 6

Barb iturattest

Fremstilling av reaksjonsbuffer for test:

Dette fortynningsmiddel består av det følgende i vandig

oppløsning ved pH 7,5:

1. Hepes [0,2OM, 4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazinetansulfon-syre]

2. PVP [0,50%, polyvinylpolypyrrolidinon]

3. PEG 8000 [1,00%, poly(etylenglykol)]

4. Natriumklorid [1,5%]

5. Natriumazid [0,1%]

Fremstilling av antiserum for test:

Kanin antiserum mot barbiturater fortynnes i et passende buffersystem. Dette fortynningsmiddel består av det føl-gende i vandig oppløsning ved pH 8,0:

1. Hepes (0,05M)

2. BSA (0,25%)

3. Natriumklorid (0,15%)

4. Natriumazid (0,15%)

Forsøksmetode:

10 ni barbituratfri urin plasseres i en blandebrønn i en

kapillær agglutinografiplate, fulgt av 50 ni hver av antiserumbuffer, reaksjonsbuffer og latex (eksempel 5). De tilsatte væsker omrøres i 3 sek og oppløsningen beveges for å få den i kontakt med kapillæret. Væsken vil bevege seg gjennom kapillæret og fylle overvåkningsområdet ved enden av kapillæret etter 3 til 6 min. Væsken i overvåkningsområdet vil fremtre som fine fnokker (agglutinert) eller melkeaktig. For negative prøver bør agglutineringen være meget sterk med meget lite uklarhet.

Fortynningen av et spesielt antiserum som er valgt for forsøket er den som har den høyeste fortynning som fremde-les vil gi sterk agglutinering i observasjonsområdet. Når forskjellige mengder barbiturater oppløses i barbituratfri urin i forsøkssystemet, inntreffer ingen agglutinering. Mengden av barbiturat som er nødvendig for å hemme agglutineringen, vil variere fra 100 ng pr. ml eller mer, avhengig av konsentrasjonen av antiserum som er brukt og styrken av det dannede antiserum. Således er for systemet beskrevet ovenfor urin inneholdende 200 ng barbiturat pr. ml tilstrekkelig for delvis å hemme agglutinering, og urin inneholdende 400 ng barbiturat pr. ml er tilstrekkelig til fullstendig å hemme agglutinering.

Den følgende tabell viser typen spesifisitet og nøyaktighet som observeres med det ovenfor beskrevne assay når det brukes med prøver som er positive for barbiturater:

Eksempel 7

Fremstilling av amfetaminreaaens

Fremstilling av (S)-N-(l-metyl-2-fenyletyl)fluor-

acetamid (l):

Til en blanding av d-amfetaminsulfat (20,0 g, 0,108 mol) i trietylamin (75 ml) som var mettet med argon og avkjølt på et isbad, ble trifluoreddiksyreanhydrid (31 ml) tilsatt dråpevis i løpet av 15 min. Reaksjonen ble omrørt ved romtemperatur over natten. Oppløsningsmidlene ble så inndampet i vakuum og residuet ble oppløst i metylenklorid (200 ml), vasket med 5% vandig vinsyre (3 x 250 ml), tørket (Na2S04), filtrert og konsentrert under vakuum, og ga en gul olje. Materialet ble krystallisert i en heksan/eter-blanding og ga 14 g av produktet.

^■H NMR (CDC13) <&> 1,17 (d, J=6Hz, 3H, CH-j) , 2,78 (7, J=5Hz, 2H, CH2), 4,22 (m, J=6Hz, 1H, CH), 6,00 (bs, 1H, NH), 7,06 (d, J=6Hz, 2H, Ar), 7,22 (m, 3H, Ar).

Fremstilling av (S)-4-(2-metyl-2-[(trifluoracetyl)amino]-etyl]-p-okso-benzenbutansyre (2): Til en omrørt oppløsning av (1) (12,Og) 0,05 mol) in metylenklorid (210 ml) under argon ble ravsyreanhydrid (8,0 g, 0,08 mol) tilsatt. Reaksjonen ble avkjølt i et isbad og deretter behandlet med aluminiumklorid (28,0 g, 0,21 mol) porsjonsvis i løpet av 5 min. Reaksjonen ble omrørt ved 0-5° i 2 t og deretter ved romtemperatur over natten. Saltsyre (3N, 120 ml) ble så tilsatt langsomt, og deretter ble oppløsningen omrørt i ytterligere 1 t. Metylenkloridet ble fjernet i vakuum og det vandige lag ble ekstrahert med etylacetat. Det organiske lag ble tørket (Na2S04), filtrert og oppløsningsmidlene inndampet for å gi et brunt residuum, som ved triturering med eter ga 10,5 g produkt.

IR(CHC13) 3300(NH), 1700 (syre + amid), 1555 (amid) cm"<1>, <X>HNMR(CDC13 + DMSO-d6) & 1,21 (d,J=7Hz, 3H, CH3), 2,73

(t, J=6Hz, 2H, CH2), 2,82 (m, 1H, H av CH2), 2,95 (m, 1H, H av CH2), 3,27 (t, J=6HZ, 2H, CH2), 4,25 (1H, CH), 7,27 (d, J=8Hz, 2H, Ar), 7,92 (d,J=8Hz, 2H, Ar), 7,57 (bs, 1H, NH). Ms, m/e 331 (M+).

Fremstilling av (S)-4-[2-metyl-2-[trifluoracetyl]-amino]-etyl]benzenbutansyre (3): En blanding av 2 (9,2 g, 0,027 mol) og 10% palladium på kull (4,0 g) i eddiksyre (400 ml) ble hydrogenert ved 50 psi i 24 t. Katalysatoren ble filtrert fra, filtratet ble konsentrert under vakuum og residuet ble triturert med eter for å gi 7,0 g av et hvitt produkt.

IR(CHC13) 3425(NH), 1718(syre), 1532(amid), 1170(CF3) cm"<1>, <3->H NMR(CDC13) 6 1,16 (d, J=7Hz, 3H, CH3), l,92(m, 2H, CH2), 2,34 (bs, 2H, AR-CH2), 2,63 (m, 2H, CH2), 2,79 (m, 2H, CH2) , 4,28 (m, 1H, CH) , 5,94 (bs, 1H, NH) , 6,97 (d,J=8Hz, 2H, AR), 7,03 (d, J=8Hz, 2H, AR). MS, m/e 299 (M-H20).

Fremstilling av (S)-N-[2-[4-[4-[(2,5-diokso-l-pyrrolidi-nyl )-oksy]-4-okso=butyl]fenyl]-1-metyl-etyl]-2-trifluoracetamid (4)

Til en omrørt oppløsning av 3. (5,4 g, 0,019 mol) i metylenklorid (150 ml), tetrahydrofuran (150 ml) og dimetylformamid (50 ml) bie N-hydroksysuccinimid (2,7 g, 0,023 mol) og 1-(3-dimetylaminopropyl)-3-etyl-karbodiimid-hydroklorid (6,0 g, 0,031 mol) tilsatt. Reaksjonen ble omrørt ved romtemperatur over natten og ble så konsentrert i vakuum.

Det resulterene residuum ble oppløst i metylenklorid, filtrert og renset ved kromatografi på kiselgel (7% eter/- metylenklorid som elueringsmiddel) og ga en gul olje som krystalliserte i eter, og ga 3,7 g av et hvitt produkt. IR(CHC13), 3425(NH), 1812-1741(imid), 1725(amid), 1170(CF3) cm-<1>. ^-H NMR(CDC13) 6 1,21 (d, J=7Hz, 3H, CH3), 2,07 (m, 2H, CH2), 2,60 (t, J=7Hz, 2H, CH2), 2,72 (t, J=7Hz, 2H, CH2), 2,80-2,90 (m, 6H, CH2), 4,27 (m, 1H, CH), 6,10 (bs, 1H, NH), 7,09 (d, J=8Hz, 2H, Ar), 7,15 (d, J=8Hz, 2H, Ar) .

MS, (+)FAB, m/e 415(M+H), m/e 437(M+Na).

Beregnet for C 55,07; H 5,11; N 6,76

Funnet for C 54,94; H 5,22; N 6,76

Konjugering av (S)-N-[2-[4-[4-[(2,5-diokso-l-pyrrolidinyl)-oksy]-4-oksobutyl]fenyl]-1-metyl-etyl]-2-trifluoroacetamid (amfetamin) til bovin serum albumin (BSA): Til en oppløsning (400 ml) inneholdende natriumbikarbonat

(0,05 M), 10% dimetylsulfoksyd (DMSO) og BSA (6,0 g) ved pH 8,5 og 25° ble N-hydroksy-succinimidesteren (4) (0,035 g i 32,6 ml DMSO) tilsatt dråpevis. Reaksjonen ble omrørt i 15 t ved 4° og dialysert som i eksempel 4. Etter dialyse ble proteinkonsentrasjonen målt og justert til 0,0005 g pr. ml.

Eksempel 8

Fremstilling av sensitivisert latex inneholdende amfetamin-BSA-konjugatet - generell fremgangsmåte

Til en omrørt latex (Seradyn karboksymodifisert polystyren 0,888 -suspensjon (180 ml, 10% faststoff) ble N-hydroksybenzotriazol (NHB) (0,6 g i 24 ml vandig dimetylformamid) og l-cykloheksyl-3-(2-morfolinoetyl)karbodiimid meto p-toluensulfonat (CMC) (2,0 g i 32 ml vann) tilsatt. Suspensjonen ble omrørt i 3 t ved 4°, deretter fortynnet til 2% latex og vasket grundig med vann ved tangentiell strøm-ningsf iltrering. Til den vaskede 2% latex ble det tilsatt 900 ml amfetamin-BSA-oppløsning fra eksempel 7. Reaksjonen ble omrørt over natten ved 4° og ble igjen vasket grundig med vann ved tangentiell strømningsfiltrering. Den vaskede latex ble tatt av filtreringsapparaturen og pelletert ved sentrifugering. Pelletene ble resuspendert i 3000 ml natriumkarbonat (pH 11,4, 0,10M) og ble omrørt ved romtemperatur i 24 t. Blandingen ble igjen pelletert ved sentrifugering, resuspendert i 2000 ml fosfatbuffer (pH6, 0. 05.), satt tilbake på det tangentielle strømningsfiltre-ringssystem og vasket grundig med vann. Den vaskede latex ble så justert til 3,0 % latex faststoff(pr. vekt)-konsentrasjon.

Eksempel 9

Amfetamintest:

Fremstilling av reaksjonsbuffer for test:

Dette fortynningsmiddel består av det følgende i vandig oppløsning ved pH 7,5:

1. Pipes [0,20M, 1,4-piperazin bis(etansulfonsyre)]

2. PVP [0,80% polyvinylpolypyrrolidon]

3. PEG 8000 [1,50% poly(etylenglykol)]

4. Natriumklorid [20%]

5. Natriumazid [0,1%]

Fremstilling av antiserumbuffer for test:

Saue-antiserum mot amfetaminer fortynnes i et passende buffersystem. Dette fortynningsmiddel består av det følgen-de i vandig oppløsning i pH 7,2: 1. Hepes [(0,05M) 4-(2-hydroksyety1)-piperaz in-etansulfonsyre] 2. BSA (0,25%)

3. Natriumklorid (0,15%)

4. Natriumazid (0,15%)

Forsøksmetode:

10 ul amfetaminfri urin plasseres i en blandebrønn i en kapillær agglutinografiplate, fulgt av 50 \ il hver av anti-serumbuf f er, reaksjonsbuffer og latex (eksempel 8). De tilsatte væsker omrøres i 3 sek og oppløsningen beveges for å få den i kontakt med kapillæret. Væsken vil bevege seg gjennom kapillæret og fylle observasjonsområdet ved enden av kapillæret etter 3 til 6 min. Væsken i observasjonsområdet vil fremtre som fine fnokker (agglutinert) eller melkeaktig. For negative prøver bør agglutineringen være meget sterk med meget lite uklarhet.

Fortynningen av et spesielt antiserum som er valgt for forsøket er den som har den høyeste fortynning som fremde-les vil gi sterk agglutinering i observasjonsområdet. Når forskjellige mengder amfetamin oppløses i amfetaminfri urin i forsøkssystemet, inntreffer ingen agglutinering. Mengden av amfetamin som er nødvendig for å hemme agglutineringen, vil variere fra 250 ng pr. ml eller mer, avhengig av konsentrasjonen av antiserum som er brukt og styrken av det dannede antiserum. Således er for systemet beskrevet ovenfor, urin inneholdende 1000 ng amfetamin pr. ml tilstrekkelig for delvis å hemme agglutinering og urin inneholdende 1500 ng amfetamin pr. ml er tilstrekkelig til fullstendig å hemme agglutinering.

Den følgende tabell viser typen spesifisitet og nøyaktighet som observeres med det ovenfor beskrevne assay når det brukes med prøver som er positive for amfetamin:

Eksempel 10

Fremstillin<g> av tetrahydrocannabinoidreaoens

Fremstilling av 1-[[(6a,7,10,10a-tetrahydro-l-hydroksy-6,6-dimetyl-3-pentyl-6H-dibenzo)oksy[b,d]pyran-l-yl(karbonyl]-oksy]-2,5-pyrrolidindion: Til en oppløsning av 1,26 g (3,67 mmol) av 11-nor- <8->THC-9-karboksylsyre<1> i 50 ml 1:1 etylacetat/metylenklorid ble det tilsatt 1,68 (14,7 mmol) N-hydroksy-succinimid og 2,10 g (11,0 mmol) 1-(3-dimetyl-aminopropyl)-3-etylkarbodiimid hydroklorid. Reaksjonen ble omrørt i 16 t ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble vasket med IN saltsyre (3 x 100 ml) vann (3 x 100 ml) og mettet saltvann (100 ml). Den organiske fase ble tørket over Na2S04, konsentrert under redusert trykk og kromatografert over silikagel. Eluering med 40% etylacetat i heksan ga 1,41 g (87%) av den ønskede N-hydrosysuccinimidester. Tilfredsstillende NMR, IR og MS ble oppnådd.

IR(KBr) 3415(0H), 1802, 1760, 1738 (c=0) cm""<1>, ^ NMR (CDC13) 6 0,88 (t, J=6HZ, 3H, CH3), 1,13 (s, 3H, CH3), 1,40 (S, 3H, CH3), 2,86 (bs, 4H, CH2), 6,11 (s, 1H, Ar), 6,27 (s, 1H, Ar), 7,32 (d, J=4Hz, 1H, vinyl). MS, m/e 441(M+)

Konjugering av l-[[(6a,7,10,lOa-tetrahydro-l-hydroksy-6,6-dimetyl-3-pentyl-6H-dibenzo)oksy[b,d]pyran-l-yl(karbonyl]-oksy]-2,5-pyrrolidindion (cannabinoid) til bovin serum albumin (BSA): Til en oppløsning (300 ml) inneholdende natriumbikarbonat (0,05 M), 10% dimetylsulfoksyd (DMSO) og BSA (4,5 g) ved pH 8,5 og 25° ble N-hydroksy-succinimidesteren (0,006 g i 6,2 ml DMSO) tilsatt dråpevis. Reaksjonen ble omrørt i 15 t ved 4° og dialysert som i eksempel 4. Etter dialyse ble proteinkonsentrasjonen målt og justert til 0,005 g pr. ml.

Eksempel 11

Fremstilling av sensitivisert latex inneholdende cannabinoid-BSA-konjugatet - generell fremgangsmåte

Til en omrørt latex (Seradyn karboksymodifisert polystyren 0,888 nm)-suspensjon (180 ml, 10% faststoff) ble N-hydroksybenzotriazol (NHB) (0,6 g i 24 ml vandig dimetylformamid) og l-cykloheksyl-3-(2-morfolinoetyl)karbodiimid meto p-toluensulfonat (CMC) (2,0 g i 32 ml vann) tilsatt. Suspensjonen ble omrørt i 3 t ved 4°, deretter fortynnet til 2% latex og vasket grundig med vann ved tangentiell strømningsfiltrering. Til den vaskede 2% latex ble det tilsatt 900 ml opiat-BSA-oppløsningen fra eksempel 10. Reaksjonen ble omrørt over natten ved 4° og ble igjen vasket grundig med vann ved tangentiell strømningsfiltrering. Den vaskede latex ble så justert til en 2,2% latex faststoff (pr. vekt)-konsentrasjon.

Eksempel 12

THG- test

Fremstilling av reaksjonsbuffer for test:

Dette fortynningsmiddel består av den følgende vandige

oppløsning ved pH 6,5:

1. Hepes [0,05M 4-(2-hydroksyetyl)-piperazin-etansulfonsyre]

2. PVP [0,50%, polyvinylpolypyrrolidinon]

3. PEG 8000 [1,00%, poly(etylenglykol)]

4. Natriumklorid [0,5%]

5. Natriumazid [0,1%]

Fremstilling av antiserumbuffer for test:

Renset muse monoklonalt antistoff mot cannabinoider fortynnes i et passende buffersystem. Dette fortynningsmiddel består av det følgende i vandig oppløsning i pH 7,0:

1. Hepes (0,05M)

2. BSA (0,25%)

3. Natriumklorid (0,15%)

4. Natriumazid (0,15%)

Forsøksmetode:

10 \ il cannabinoidfri urin plasseres i en blandebrønn i en kapillær agglutinografiplate, fulgt av 50 jaI hver av antiserumbuffer, reaksjonsbuffer og latexreagens (eksempel 11). De tilsatte væsker omrøres i 3 sek og oppløsningen beveges for å få den i kontakt med kapillæret. Væsken vil bevege seg gjennom kapillæret og fylle observasjonsområdet ved enden av kapillæret etter 3 til 6 min. Væsken i observasjonsområdet vil fremtre som fine fnokker (agglutinert) eller melkeaktig. For negative prøver bør agglutineringen være meget sterk med meget lite uklarhet.

Fortynningen av et spesielt antiserum som er valgt for forsøket er den som har den høyeste fortynning som fremde-les vil gi sterk agglutinering i observasjonsområdet. Når forskjellige mengder cannabinoider oppløses i cannabinoidfri urin i forsøkssystemet, inntreffer ingen agglutinering. Mengden av cannabinoid som er nødvendig for å hemme agglutineringen, vil variere fra 50 ng pr. ml eller mer, avhengig av konsentrasjonen av antiserum som er brukt og styrken av det dannede antiserum. Således er for systemet beskrevet ovenfor urin inneholdende 100 ng cannabinoid pr. ml tilstrekkelig for delvis å hemme agglutinering og urin inneholdende 600 ng cannabonoid pr. ml er tilstrekkelig til fullstendig å hemme agglutinering.

Den følgende tabell viser typen spesifisitet og nøyaktighet som observeres med det ovenfor beskrevne assay når det brukes med prøver som er positive for cannabinoider:

Claims

1. Reagens for bruk i immunoassays, karakterisert ved formelen P-(A-D)n hvor D er et drogederivat som er antigenisk selektivt for bestemmelse av tilstedeværelse av måldroge eller måldrogemetabolitt, A er en aktiverende linker-spacergruppe valgt fra gruppen omfattende grupper av formlene hvor X er en valgfri avstandsgruppe som forbinder A til D og som omfatter en benzen-gruppe, en amid-gruppe, en tiourea-gruppe, en urea-gruppe, en rett eller forgrenet C^^q alifatisk gruppe eller en kombinasjon av disse grupper, P er en poly(aminosyre) eller en polymer som er i stand til kovalent å binde til A, og n er mindre enn 1.

2. Reagens ifølge krav 1, karakterisert ved at A-D er et aktivert drogederivat, valgt fra gruppen omfattende et A<8>THC-derivat med A som en substituent ved 9-karbonet derav, et 5-substituert barbitursyrederivat med A som en andre substituent ved 5-karbonet derav, et fencyklidinderi-vat med A som en substituent på benzenet derav, et morfin-der ivat med A som en substituent på 3-hydroksylgruppen derav, et benzoyl-ecgoninderivat med A som en substituent på benzenet derav, et 1,4-benzodiazepinderivat med A som en substituent på 1 nitrogenet derav og et amfetaminderivat med A som en substituent på benzenet derav.

3. Reagens ifølge krav 2, karakterisert ved at A-D er en forbin-delse av formel hvor R1 er hydrogen, metyl eller etyl, a er 2 til 8, og isotiocyanatet er meta eller para.

4. Reagens ifølge krav 2, karakterisert ved at A-D er en forbin-delse av formel: hvor R<2> er hydrogen eller metyl, b er 1 til 9, og alkyl-gruppen er bundet til benzenringen i meta- eller para-stilling.

5. Reagens ifølge krav 2, karakterisert ved at A-D er forbindelsen N-[3-[7,8-didehydro-4,5-epoksy-6-hydroksy-17-metylmorfinan-3-yl)oksy]propoksy-4-isotiocyanat-benzamid.

6. Reagens ifølge krav 2, karakterisert ved at A-D er forbindelsen 5-[3-[2,5-diokso-l-pyrrolidinyl)oksy]-l-metyl-3-oksopro-pyl]-5-(2-propenyl)2,4,6(1H,3H,5H)pyrimidintrion.

7. Reagens ifølge krav 2, karakterisert ved at A-D er forbindelsen (S)-N[2-[4-[4-[(2,5-diokso-1-pyrrolidiny1)-oksy]-4-oksobu-tyl]fenyl]-1-metyl-etyl]-2-trifluoracetamid.

8. Reagens ifølge krav 2, karakterisert ved at A-D er forbindelsen N-[1-(4-isotiocyanofenyl)etyl]-4-[1-(l-piperidiny1)-1-cykloheksyl]benzamid.

9. Reagens ifølge krav 2, karakterisert ved at A-D er forbindelsen [lR-(exo,exo,anti)]-8-metyl-3-[[4-[[[[[[[(2,5-dioksopyroli-din-l-yl)oksy]karbonyl]fenyl]amino](tioksometyl)]amino]metyl]-benzoyl]oksy]bicyklo[3,2,1]-oktan-2-karboksylsyre.

10. Reagens ifølge krav 2, karakterisert ved at A-D er forbindelsen 1-[[/6a,7,10,10a-tetrahydro-l-hydroksy-6,6-dimetyl-3-pen-tyl-6H-dibenzo)oksy][b,d]pyran-l-yl(karbonyl]oksy]-2,5-pyrrolidinon.

11. Mikropartikulært immunoassayreagens, karakterisert ved at det omfatter reagenset ifølge krav l, 2 eller 5-10, bundet til mikropartikler ved hydrofobisk eller kovalent binding av poly-(aminonosyren) eller polymeren, P, til overflaten av mikro-partiklene.

12. Mikropartikulært reagens ifølge krav 11, karakterisert ved atPer kovalent bundet til latex-mikropartikler.

13. Reagens fiølge krav 12, karakterisert ved at Per bovinserum-albumin.