NO177426B - Kitin- eller kitosanoligomer og fremgangsmåte til fremstilling derav - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en kitin-eller kitosanoligomer og en fremgangsmåte til fremstilling derav.

I de senere år er matvaretilbudet blitt rikelig, og krabber og reker er blitt importert fra utlandet, og av kitinmaterialet i skallene deres er kitin og kitosan blitt fremstilt i store mengder. Kitin og kitosan er i seg selv nå under utvikling som jordbrukskjemikalier, kunstig hud, livbeslektede substanser etc, og kitinoligosakkarid eller kitosanoligosakkarid som har enda høyere verdi tiltrekker seg nå oppmerksomhet.

Det har vært kjent at kitinoligosakkarid eller kitosanoligosakkarid kan fremstilles ved dekomponering av kitin med kitinase eller av kitosan med kitosanase.

Det er også kjent at kitin og kitosan kan hydrolyseres delvis med saltsyre for å fremstille N-acetylkito-pentaose eller kitopentaose fra N-acetylglukosamin eller glukosamin.

Det er også kjent en fremgangsmåte, Van Slyke's metode, hvorved nitrogen i aminoform kvantiseres, hvor kitosan depolimeriseres ved tilsetning av salpetersyrling til kitosan ved en temperatur på fra 20 til 50°C (US-patent 3.922.260).

Men ved den ovennevnte dekomponeringsmetode med et enzym er det vanskelig å regulere molekylvekten, hvorved det oppnås en oligosakkaridblanding som har forskjellige molekyler, og konsentrasjonen er så lav som 0,001% og må derfor konsentreres. For å oppnå et oligosakkarid med en passende molekylvekt må det følgelig utføres fraksjonering, noe som er et meget besværlig arbeid, og på grunn av at det dannes et oligosakkarid med en ende med følgende struktur:

kan det ved oppvarming under konsentreringsoperasjonen eller steriliseringsoperasjonen forekomme Maylard-reaksjon som bevirker farging. Selv om denne kan reduseres ytterligere med et reduksjonsmiddel foreligger også det problem at det kan forekomme ringåpning og omdanning til en sukkeralkohol. Som følge av at konsentrasjonen ved denne reaksjon er lav er det dessuten nødvendig med et stort ut-styr for produksjon i stor skala.

På grunn av at den ovennevnte fremgangsmåte med delvis hydrolysering med saltsyre gir det samme produkt som med enzym kan de ovennevnte problemer med farging og ringåpning ikke løses.

Ved den sistnevnte.fremgangsmåte med depolymeri-sering av kitosan med salpetersyrling er mengden salpetersyrling som anvendes, delvis på grunn av at det anvendes kitosan med en meget høy molekylvekt, så høy som 3-5 mol per mol aminogrupper i kitosanet, hvorved dette kan bli dekomponert til glukosamin, som er et monosakkarid. På grunn av at dekomponeringsreaksjonen utføres ved en rela-tivt høy temperatur på 20-25°C, kan det opptre sidereak-sjoner, såsom overføringsreaksjoner, før dekomponering til monosakkarider, og disse reaksjonsprodukter kan rekombi-neres og derved danne andre produkter enn kitosaloligo-sakkarider.

Følgelig kan produktet som oppnås ved denne fremgangsmåte inneholde glukosidforbindelser som kan være toksiske, hvilke er andre enn det ovennevnte glukosamin, og også uomsatt salpetersyrling foreligger i produktet, hvorved det er problemer ved anvendelse som næringsmiddel-tilsetningsmidler eller farmasøytika.

Kitin- eller kitosanoligomeren ifølge oppfinnelsen kjennetegnes ved at den har en 2,5-anhydromannitolendegruppe, og at oligomeren har formelen

hvor R1 er CH2OH og R2, R<3> og R<4> hver er NHCOCH3 eller NH2, m+n er 0-500 og m er 50% eller mindre av n, under den forutsetning at når R<2> er NHCOCH3 er R3 NHC<OC>H3 og når R er NH2 og når R<2> er NH2 er R3 N<H>2 og R4 er NHCOCH3. Dette betyr at kitinoligomerene ifølge den foreliggende oppfinnelse er kitinoligomerer som har en 2,5-anhydromannitolendegruppe med strukturformelen i den ene ende og en gruppe med strukturformelen i den annen ende, hvorved disse ender er bundet direkte til hverandre eller via en kjede med 0-100 enheter med strukturformelen idet kjeden eventuelt inneholder som en del av den enheter med strukturformelen

På den annen side er kitosanoligomeren ifølge oppfinnelsen en kitosanoligomer som har en 2,5-anhydromannitolendegruppe med strukturformelen:

i den ene ende og en gruppe med strukturformelen i den annen ende hvorved disse to ender er bundet til hverandre eller via en kjede med 0-500 enheter med strukturformelen hvorved kjeden eventuelt inneholder som en del av den enheter med strukturformelen

Fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen kjennetegnes ved

a) omsetning av kitin eller kitosan med salpetersyrling ved en temperatur på 10°C eller lavere i en vandig

løsning med pH på 1-6,

b) nøytralisering av reaksjonsløsningen etter full-føring av reaksjonen ved tilsetning av ammoniakk, et alkylamin eller en anionbytterharpiks, til dannelse av en kitin- eller kitosanoligomer som har en 2,5-anhydromannoseendegruppe, og c) reduksjon av oligomeren med et reduksjonsmiddel, og eventuelt etter reduksjonen, utfelling av kitinoligomeren eller kitosanoligomeren som har 2,5-anhydromannitol-endegruppen og som er løst i et vandig medium ved blanding med et medium som er forenlig med det vandige medium og hvori kitinoligomeren eller kitosanoligomeren er dårlig løselig. Oligomeren som har en 2,5-anhydromannitolgruppe med strukturen

som har lav reaktivitet, høy stabilitet og derfor vanskelig farges, kan anvendes som utgangsmateriale eller som mellomprodukt for matvaretilsetningsstoffer eller farma-søytika etc.

(I) Kitin-kitosanoligomer.

(1) Kitinoligomer.

Kitinoligomeren ifølge oppfinnelsen har en 2,5-anhydromannitolendegruppe med strukturformelen

i den ene ende og en gruppe med strukturformelen i den annen ende, hvorved disse to ender er bundet direkte til hverandre eller via en kjede med 0-1.000, fortrinnsvis 0-500, spesielt 40-250, enheter med strukturformelen hvor kjeden eventuelt inneholder enheter med den nedenfor angitte strukturformel i en mengde på 50% eller mindre, fortrinnsvis 45% eller mindre: Idet oligomerer som inneholder aminogrupper som er delvis acetylert, vanligvis foreligger i det naturlig forekommende kitin kan det alternativt ved å anvende kunstig deacetylert kitin også fremstilles en kitinoligomer eller kitosanoligomer hvor en del av kjeden i strukturformelen ovenfor er blitt omdannet til en kjede med formelen:

Derfor er det vanskelig å skjelne mellom den deacetylerte kitinoligomer og kitosanoligomer.

Men generelt har en kitinoligomer en molekylvekt fra 570 til 200.000 og en deacetyleringsgrad på fra 0 til 50%, mens en kitosanoligomer generelt har en molekylvekt på fra 480 til 100.000 og en deacetyleringsgrad på fra 50 til

100%.

Oligomeren har etter nøytralisering en 2,5-anhydromannoseendegruppe med strukturformelen:

som har derfor høy reaktivitet og som kan omsettes med forskjellige forbindelser. På grunn av at den har høy reaktivitet er den ustabil mot varme og har følgelig den ulempe at den lett farges, og derfor kan den reduseres med et reduksjonsmiddel, hvorved strukturformelen

i enden omdannes til 2,5-anhydromannitol, hvorved det dannes en termisk stabil kitinoligomer med lavere reaktivitet .

Selv om den ovenfor angitte 2,5-anhydromannosegruppe kan reduseres til 2,5-anhydromannitolgruppen, vil som følge av at strukturformelen i den annen ende og strukturformelen til mellomproduktets kjede blir værende uforandret, de primære egenskaper for anvendelse som farma-søytika, matvaretilsetningsstoffer ikke forandres, hvorved det ikke er noen vesentlig forandring i anvendelighet.

(2) Kitosanoligomer

Når det gjelder kitosanoligomeren ifølge oppfinnelsen har den en 2,5-anhydromannitolgruppe i den ene ende, med strukturformelen

og en gruppe med strukturformelen i den annen ende, hvorvéd disse to ender er bundet direkte til hverandre eller gjennom en kjede med 0-500, fortrinnsvis 0-300, spesielt 0-30 enheter for en med lav molekylvekt eller 40-280 enheter for en med høy molekylvekt og med strukturformelen som eventuelt som del av kjeden inneholder vanligvis 50% eller mindre, fortrinnsvis 45% eller mindre, av enheter med strukturformelen og en som har 2,5-anhydromannosegruppe i en ende, om-fattende 2,5-anhydromannosegruppe med strukturformelen og en gruppe med strukturformelen i den annen ende, hvorved disse to ender er bundet direkte til hverandre eller gjennom en kjede med 0-500, fortrinnsvis 0-300, spesielt 0-30 enheter for en med lav molekylvekt eller 40-280 enheter for en med høy molekylvekt og med strukturformelen inneholdende eventuelt som del av kjeden vanligvis 50% eller mindre, fortrinnsvis 45%, av enheter med strukturformelen Den ovennevnte kitosanoligomer har en 2,5-anhydromannitolgruppe med strukturformelen eller en 2,5-anhydromannosegruppe med formelen i den ene ende og en gruppe med strukturformelen i den annen ende, hvorved disse to er bundet direkte til hverandre eller gjennom en kjede med 0-500 enheter med strukturformelen men idet de som inneholder aminogrupper som er delvis acetylert vanligvis foreligger i det naturlig forekommende kitosan, kan det alternativt ved å anvende syntetisk deacetylert kitosan også dannes en kitosanoligomer med følgende strukturformel Men mens den har høy reaktivitet er den på den annen side ustabil mot varme og har følgelig den ulempe at den lett farges, og derfor kan den reduseres med et reduksjonsmiddel, hvorved endegruppen med strukturformelen

omdannes til 2,5-anhydromannitol, hvorved det dannes en termisk stabil kitosanoligomer med lavere reaktivitet.

Selv om 2,5-anhydromannosegruppen ovenfor kan reduseres til en 2,5-anhydromannitolgruppe vil som følge av at strukturformelen i den annen ende og strukturformelen av den mellomliggende kjede blir værende uforandret de primære egenskaper ved anvendelse som farmasøytika, matvaretilsetningsstoffer ikke forandres, hvorved der er stort sett ingen forandring i anvendelighet.

(II) Fremgangsmåte til fremstilling av kitin-kitosanoligomer

(1) Utgangsmaterialer (a) Kitin-kitosan

Kitin og kitosan som skal anvendes til fremstilling av kitin-kitosanoligomer ifølge oppfinnelsen er det kitin som oppnås ved å behandle kitinmaterialer som bestanddel i krepsdyr, såsom reker, krabber etc, insekter, såsom biller, siriss etc, shiitake (sopp), cellevegger hos mugg med saltsyre for å fjerne kalsiumkarbonat og deretter behandle det med en alkaliløsning i et kort tidsrom for å fjerne proteiner etc, eller kitosanet som oppnås ved oppvarming av dette med et konsentrert alkali for å bevirke deacetylering.

Vanligvis har disse naturlig forekommene kitiner en midlere molekylvekt på fra 100.000 til ca. 1.000.000, mens kitosans midlere molekylvekt er så høy som fra 20.000 til 200.000 og derfor er naturlig forholdet kitin eller kitosan dersom det anvendes som sådanne som utgangsmaterialer så viskøse at det ikke kan utføres tilstrekkelig reaksjon med salpetersyrling dersom den ikke utføres under strenge betingelser.

Derfor er kitin-kitosanoligomeren som oppnås ved reaksjonen under slike strenge betingelser bare en blanding som inneholder forskjellige molekylvekter hvor høye molekylvekter og lave molekylvekter foreligger i blanding på grunn av at reaksjonen er utsatt for å foregå fra overflaten av utgangsmaterialemolkeylene.

For å oppnå en kitin-kitosanoligomer med en jevn molekylvekt foretrekkes det derfor å anvende en med lav viskositet som har en midlere molekylvekt på 50.000 eller lavere, fortrinnsvis 20.000-50.000, spesielt 30.000-40.000, for kitinet eller kitosanet som skal anvendes som utgangsmateriale.

I fremgangsmåten til fremstilling av kitinet eller kitosanet ifølge foreliggende oppfinnelse er det på grunn av at reaksjonen foregår ved alkoholisering av aminogruppene i kitinet med salpetersyrling vanlig å anvende ett som inneholder aminogrupper i kitinet.

Imidlertid utføres reaksjonen på grunn av at 3-10% enheter som har aminogrupper vanligvis foreligger i naturlig forekommende kitiner ifølge den foreliggende oppfinnelse ved anvendelse av dem, men alternativt kan kitiner eller kitosaner som oppnås ved delvis eller total deacetylering av dem anvendes.

Disse kitiner eller kitosaner bør fortrinnsvis gjøres løselige for at reaksjonen skal forløpe jevnt. Derfor foretrekkes det å anvende dem i finpulverisert form, særlig i flak som passerer 15-30 mesh, fortrinnsvis 30 mesh.

(b) Salpetersyrling

Som salpetersyrling for anvendelse ifølge oppfinnelsen kan det anvendes salpetersyrling som sådan, men med det formål at reaksjonen skal foregå langsomt foretrekkes det å anvende et nitritt som kan gi salpetersyrling in situ.

Eksempler på slikt nitritt kan omfatte natriumnitritt, kaliumnitritt, sinknitritt, ammoniumnitritt, kalsiumnitritt, bariumnitritt, magnesiumnitritt etc, og blant disse foretrekkes det å anvende et alkalimetall-nitritt, særlig natriumnitritt eller kaliumnitritt.

Disse nitritter anvendes for å alkoholisere aminogruppene i kitinet eller kitosanet ved deaminering, og de anvendes derfor vanligvis i mengder i området fra 0,01 til 1 molekvivalent, fortrinnsvis fra 0,1 til 0,6 molekvivalent i forhold til aminogruppene, og molekylvekten til kitinoligomeren eller kitosanoligomeren som dannes kan styres avhengig av mengden. Dersom den anvendte mengde er mindre 0,01 molekvivalent vil reaksjonen vanskelig foregå, mens dersom mengden er over 1 molekvivalent kan det dannes monosakkarider, såsom N-acetylglukosamin eller glukosamin, i store mengder, hvorved utbyttet av kitinoligomeren eller kitosanoligomeren vil bli nedsatt.

(2) Reaksjon (a) Løselighetsgjøring

Ved fremstilling av kitinoligomeren eller kitosanoligomeren ifølge oppfinnelsen foretrekkes det for å gjøre det lettere å utføre reaksjonen til kitinet og kitosanet som er utgangsmaterialene å løse kitinet eller kitosanet i en vandig løsning ved iblanding av et løsgjørende middel i det vandige reaksjonsmedium for kitin og kitosan. Som middel for å løse kitinet og kitosanet kan det tilsettes organiske syrer som har 1-10 karbonatomer, fortrinnsvis 2-7 karbonatomer, såsom maursyre, eddiksyre, smørsyre, oksalsyre, vinsyre, ravsyre, melkesyre, askorbinsyre, propionsyre, adipinsyre, benzosyre etc, og mineralsyrer, såsom saltsyre, hydrobromsyre, salpetersyrling etc. Blant disse foretrekkes eddiksyre, oksalsyre, vinsyre og melkesyre, og det er spesielt foretrukket å anvende eddiksyre.

Disse løseliggjørende midler kan anvendes enten enkeltvis eller som en blanding, men anvendes vanligvis som en blanding med vann, som er reaksjonsløsningsmiddel.

Disse løseliggjørende midler kan anvendes i mengder på 0,5 mol% eller mer, fortrinnsvis ekvimolar % eller mer i forhold til kitinet eller kitosanet, men som følge av at større mengder er mulig anvendes de vanligvis i mengder på høyst 20 volum% av vann, fortrinnsvis fra 0,1 til 20 volum%, spesielt fra 5 til 10 volum% av vann, som er reak-sjonsløsningsmidlet.

Ved å regulere typen og mengden av løseliggjørende middel styres hydrogenionekonsentrasjonen i reaksjonsblandingen som beskrevet ovenfor i et spesifikt område.

(b) Reaksjon

Ved fremstilling av kitinoligomeren eller kitosanoligomeren ifølge oppfinnelsen er det et viktig punkt at kitinet eller kitosanet tillates å reagere i en blanding med salpetersyrling ved en temperatur på fra 10°C eller lavere, fortrinnsvis fra -5 til 10°C, mer foretrukket fra 0 til 8°C, spesielt fra 2 til 6°C, i en vandig løsning med en hydrogenionekonsentrasjon (pH) på fra 1 til 6, fortrinnsvis fra 2 til 4.

Ved å blande under slike betingelser går reaksjonen langsomt, og derfor hydrolyseres kitinet eller kitosanet ikke i den glukosidbundne del hvor glukosaminoglukanen-heten er bundet, men aminogruppen i kitinet eller kitosanet alkoholiseres ved deaminering med salpetersyrling, og alkoholgruppen utgjør en pseudoglukol nærmere oksygenet 1 den glukosidbundne del av glukosaminglukanenheten, hvorved det antas at pinakolomleiringsreaksjonen som er vist nedenfor sannsynligvis har foregått.

Dersom reaksjonstemperaturen under reaksjonsbeting-elsene ovenfor overskrider 10°C vil det inntreffe hydroly-sereaksjon, og ytterligere overføringsreaksjon og rekombineringsreaksjon foregår, hvorved der er en fare for at toksiske glukosidenheter kan dannes. Når på den annen side hydrogenionekonsentrasjonen er under 1 har hydrolysereak-sjonen som bevirker spalting av glukosidbindingen tendens til å foregå, noe som kan bevirke overføringsreaksjon og rekombineringsreaksjon. Dersom hydrogenionekonsentrasjonen overskrider 6 vil salpetersyrling dekomponeres og miste virkningen, eller molekylvekten kan ikke styres.

Reaksjonen ovenfor utføres i en vandig løsning under betingelsene med den ovenfor angitte temperatur og hydro-genionekonsentras jon, men andre organiske løsningsmidler og buffere kan også blandes inn i den vandige løsning.

Reaksjonen utføres vanligvis i fra atskillige minutter til 10 timer,, fortrinnsvis i fra 0,5 til 3 timer.

(c) Nøytralisering

Blandingen av kitinoligomeren eller kitosanoligomeren som har en 2,5-anhydromannoseendegruppe inneholdende salpetersyrling eller et nitritt oppnådd ved reaksjonen ovenfor inneholder en stor mengde ureagert salpetersyrling eller nitrat og er derfor meget sur, og på grunn av at forskjellige problemer vil opptre dersom det i det etter-følgende trinn forsøkes å utføre reaksjonen mens salpetersyrlingen eller nitrittet holdes i en slik tilstand er det viktig å nøytralisere blandingen.

Slik nøytralisering kan utføres til en hydrogen-ionekonsentras jon (pH) på 7 eller høyere, fortrinnsvis fra 7 til 8, ved tilsetning av et nøytraliserende middel.

Nøytraliseringen kan gjøre det lettere å utføre den etterfølgende reaksjon og også å felle ut den dannede kitinoligomer eller kitosanoligomer.

Som det nøytraliserende middel kan det anvendes forskjellige alkalier, såsom kaustisk soda, men det er ønske-lig å anvende ammoniakk, et alkylamin eller anionbytteharpiks, og spesifikke eksempler på midlet vil bli angitt nedenfor.

Ammoniakk

Som det ovennevnte ammoniakk kan det anvendes konsentrert ammoniakkvann, som er et ammoniakkvann hvori ammoniakkgass er løst i vann, vanligvis i en konsentrasjon på 20-30 vekt%, fortrinnsvis 26-30 vekt%.

Mengden tilsatt nøytraliserende middel kan være opptil det nivå hvori hydrogenionekonsentrasjonen i ovennevnte vandige medium er i det område som angitt ovenfor, nærmere bestemt en mengde på fra 40-70 ml ammoniakkvann per liter reaksjonsblanding..

Alkvlaminer

Som alkylaminene som er nevnt ovenfor kan det anvendes aminer med alkylgrupper som har 1-20 karbonatomer, såsom metylamin, etylamin, dietylamin, trietylamin, n-propylamin, isopropylamin, n-butylamin og lignende.

Mengden alkylamin kan være opptil det nivå hvor hydrogenionekonsentrasjonen i det vandige medium kommer i det ovenfor angitte område, men nærmere bestemt en mengde på fra 50-200 g per liter reaksjonsblanding.

Anionb<y>tteharpiks

Som den ovennevnte anionbytteharpiks kan det anvendes harpikser som har en basisitet, såsom en amino-gruppe (-NH2, -NHR, -NR2), kvaternær ammoniumgruppe ^_+NR3) etc. innført i grunnmassen av syntetiske harpikser .

Det tilsettes en slik mengde anionbytteharpiks at salpetersyrlingen nøytraliseres, nærmere bestemt en mengde som vanligvis er 200 g/l eller mer, fortrinnsvis fra 300 g til 1 kg/l eller mer, regnet av reaksjonsblandingen.

(3) Reduksjonsreaksjon

Den nøytraliserte blanding som er beskrevet ovenfor inneholder kitin- eller kitosanoligomer som inneholder 2,5-anhydromannosegrupper, og oligomeren har en aldehyd-endegruppe med høy reaktivitet og med strukturformelen: og har derfor høy reaktivitet og derved den ulempe at den lett farges eller kombineres og kan reduseres til en alkohol, hvorved det oppnås en 2,5-anhydromannitolendegruppe med stukturformelen hvorved det dannes en stabil kitin- eller kitosanoligomer med liten reaktivitet.

For denne reduksjonsreaksjon kan ethvert av de reduksjonsmidler som er kjent på området og som kan redusere aldehydgrupper mildt velges. Spesielt kan det tilsettes nikkelkatalysatorer for hydrogeneringsreduksjon, såsom Raney-nikkel, Ni-karbon etc, palladiumkatalysatorer for hydrogeneringsreduksjon, såsom Pd-karbon, metallhydrider, såsom aluminiumdiisobutylhydrid, organiske tinnhydrider, hydrosilan og lignende; metallhydrogenkompleksforbind-elser, såsom litiumaluminiumhydrid, natriumborhydrid, kaliumborhydrid, litiumborhydrid, kalsiumborhydrid, sink-borhydrid og lignende; diboran, alkylboran og lignende.

Blant disse reduksjonsmidler foretrekkes spesielt metallhydrider, såsom aluminiumdiisobutylhydrid, organiske tinnhydrider, hydrosilan etc, metallhydrogenkompleksfor-bindelser, såsom litiumaluminiumhydrid, natriumborhydrid, kaliumborhydrid, litiumborhydrid, kalsiumborhydrid, sink-borhydrid og lignende, diboran, alkylboran etc. Blant dem er det mest hensiktsmessig å anvende metallhydrogen-kompleksforbindelser, særlig borhydridforbindelser, såsom natriumborhydrid, kaliumborhydrid og lignende.

Denne reduksjonsreaksjon utføres ved tilsetning av reduksjonsmidlet ovenfor til den nøytraliserte blanding som er beskrevet ovenfor som sådan eller etter fjerning av forurensningene i den nøytraliserte blanding på enkel måte ved filtrering etc.

Reduksjonsmidlet kan tilsettes i et forhold på vanligvis 1 mol eller mer, fortrinnsvis 1,5-3 mol, per mol 2,5-anhydromannosegruppe i kitinoligomeren eller kitosanoligomeren for å redusere 2,5-anhydromannosegruppen i kitinoligomeren eller kitosanoligomeren til 2,5-anhydromannitolgruppen.

Reduksjonsreaksjonen kan utføres ved en temperatur på generelt 100°C eller lavere, fortrinnsvis romtemperatur eller lavere, vanligvis under normalt trykk i atskillige timer.

Reduksjonsreaksjonen utføres inntil det stort sett ikke foreligger noen 2,5-anhydromannosegruppe.

(4) Fraksjonering

Til et vandig medium hvori kitinoligomerer eller

kitosanoligomerer med forskjellige molekylvekter og med en 2,5-anhydromannitolendegruppe, som beskrevet ovenfor, tilsettes det for utfelling et løsningsmiddel som er forenlig med det vandige medium og som kan løse de ovenfor beskrevne kitinoligomerer eller kitosanoligomerer med vanskelighet, gradvis eller trinnvis, hvorved kitin-kitosanoligomerene utfelles fraksjonert fra det ovennevnte vandige medium suksessivt fra en som har høyere molekylvekt. Ved denne fraksjonering kan det oppnås fraksjoner med snevrere molekylvektfordeling.

(a) Tilsetning av utfellingsmedium

Etter at nøytralisering er utført ved anvendelse av ammoniakkvann, et alkylamin eller en anionbytteharpiks som nøytraliserende middel slik som beskrevet ovenfor er kitinoligomeren eller kitosanoligomeren som inneholder 2,5-anhydromannose dannet fra det vandige medium egnet for utfelling, og er derfor ved tilsetning av et ytterligere medium for utfelling, som er forenlig med det vandige medium og som kan løse kitinoligomeren eller kitosanoligomeren med vanskelighet gradvis eller trinnvis, utfelles kitinoligomerene eller kitosanoligomerene fra det vandige medium suksessivt fra en som har høyere molkeylvekt.

(b) Utfellingsmedium

Som mediet som er forenlig med det vandige medium og som kan løse de ovennevnte kitinoligomerer eller kitosanoligomerer med vanskelighet kan det f.eks. tilsettes alkoholer, ketoner, etere, estere, hydrokarboner og andre.

Nærmere bestemt er det alkoholer med 1-5, fortrinnsvis 1-4 karbonatomer, såsom metanol, etanol, propanol, butanol, etylenglykol og lignende, ketoner med 1-5, fortrinnsvis 1-4, karbonatomer, såsom aceton, metyletylketon og lignende, etere som har 2-6, fortrinnsvis 2-4, karbonatomer, såsom etyleter og lignende; estere som har 2-10, fortrinnsvis 2-5, karbonatomer, såsom etylacetat og lignende, samt hydrokarboner med 1-10, fortrinnsvis 1-6, karbonatomer, såsom n-heksan, petroleumeter etc.

(c) Tilsetningsmengde

Mengden av disse utfellende medier som tilsettes kan være en mengde som kan utfelle kitinoligomerer eller kitosanoligomerer med høyere molekylvekter fra det ovenfor beskrevne vandige medium, og mengden kan nærmere bestemt være fra 0,4 til 1,4 liter, fortrinnsvis 0,5 til 1 liter per liter av det vandige medium.

Ved fraksjonering av kitinoligomerene eller kitosanoligomerene som er utfelt slik suksessivt kan kitinoligo-sakkaridene eller kitosanoligosakkaridene fraksjoneres for respektive forskjellige polysakkarider med forskjellige høyere molekylvekter.

(5) Produkt

Ved å isolere kitinoligosakkaridet eller kitosan-oligosakkaridet ved en konstant molekylvekt, oppnådd ved fraksjonering av respektive forskjellige polysakkarider, inneholder hver fraksjon et kitinoligosakkarid eller kitosanoligosakkarid med en molekylvekt av høy virknings-fullhet, hvorved enda høyere effekt kan utøves.

På den annen side har kitinoligomerene eller kitosanoligomerene som har en 2,5-anhydromannitolgruppe i den reduserte ende lavere reaktivitet, høy termisk stabilitet og vil derfor vanskelig kunne farges og vil være anvende-lig som sådant som matvaretilsetningsmiddel eller farma-søytikum, eller som mellomprodukt for disse.

Med kitinoligomeren eller kitosanoligomeren ifølge oppfinnelsen som oppnås slik under den betingelse hvor 2,5-anhydromannosegruppen reduseres til 2,5-anhydromannitolgruppen, som også er termisk stabil, nøytraliseres salpetersyrling tilstrekkelig i en blanding, og et utfellingsmedium som er et dårlig løsningsmiddel for kitinoligomeren eller kitosanoligomeren under den betingelse hvor salpetersyrlingen løses i vann tilsettes gradvis for å utfelle og utvinne bare den kitinoligomer eller kitosanoligomer som løses i blandingen. Følgelig foreligger i kitinoligomeren eller kitosanoligomeren salpetersyrling eller et nitrat bare i en mengde som vanligvis er ca. 20 ppm eller mindre, fortrinnsvis 2 ppm eller mindre, spesielt 0-0,7 ppm, som er lavere enn det nivå på 25 ppm som er definert i næringsmiddelsloven, og den vil derfor ikke bli begrenset ved utvikling av anvendelser til fremstilling av matvaretilsetningsmidler og farmsøytika.

Eksempel 1

I en glasskolbe med 5 liter volum, utstyrt med en rører ble det anbrakt 100 g kitosan i flak som passerte 500 mesh, og 2 liter 10 prosentig, vandig eddiksyre ble tilsatt litt etter litt for å løse kitosanen, etterfulgt av tilstrekkelig avkjøling av løsningen i et is-bad til 4°C.

Deretter ble 300 ml 1 prosentig vandig natriumnitritt (salpetersyrling/glukosaminrest = molart forhold 0,1) tilsatt for å regulere hydrogenionekonsentrasjonen (pH) til 3, og reaksjonen ble utført under omrøring ved 4°C i 1,5 timer for utfelling av en kitosanoligomer som hadde en 2,5-anhydromannosegruppe.

Etter fullføring av reaksjonen ble blandingen nøytralisert med 393 ml konsentrert ammoniakkvann, og ytterligere ved tilsetning av 3,2 g natriumborhydrid (dobbelt antall mol i forhold til natriumnitritt), og reduksjonsreaksjonen ble utført under omrøring i et is-vannbad i 5 timer for utfelling av en kitosanoligomer som inneholdt 2,5-anhydromannitol.

Etter fullføring av reduksjonsreaksjonen ble for å gjøre produktet lett utfellbart konsentrert ammoniakkvann tilsatt for regulering av blandingen til pH 8, etterfulgt av 2,5 liter aceton for utfelling av produktet.

Bunnfallene ble filtrert, vasket grundig med aceton, tørket i en vakuumovn og deretter analysert ved høy-ytelses-væskekromatografi og elementær analyse.

Analysebetingelsene ved høyytelses-væskekromato-grafien var følgende:

Kolonne: "Asahipack GS-220".

Strømningshastighet: 0,5 ml/min.

Temperatur: 50°C.

Mobil fase: 0,5 M acetatbuffer.

pH: 4,0.

Resultatene er vist i fig. 1. Produktet inneholdt 1,0% monosakkarider, 6,0% disakkarider og 80,6% 8-29 sakkarider, og utbyttet av produktet var 59,7 g, som ble funnet å være 60% av det teoretiske utbytte på 99,4 g.

Eksempel 2

Ved anvendelse av samme glasskolbe utstyrt med en rører ble 100 g kitosan tilsatt og løst ved tilsetning av 1 liter 10 prosentig, vandig eddiksyre litt etter litt og deretter tilstrekkelig avkjøling med is-vann.

Deretter ble det til løsningen tilsatt 88 ml 10 prosentig vandig natriumnitritt

(salpetersyrling/glukosaminrest = molart forhold 0,3) for regulering av hydrogenionekonsentrasjonen (pH) til 3, og reaksjonen ble utført i et is-vannbad i 4 timer.

Etter fullføring av reaksjonen ble blandingen nøytralisert med 210 ml konsentrert ammoniakkvann, og dessuten ble 9,6 g natriumborhydrid (dobbelt antall mol i forhold til natriumnitritt) tilsatt for å utføre reduksjonsreaksjonen under omrøring i et is-vannbad i 4 timer.

Etter fullføring av reduksjonsreaksjonen ble for å gjøre produktet lett utfellbart konsentrert ammoniakkvann tilsatt for regulering av blandingen til pH 8-9, etterfulgt av konsentrering til halve volumet (ca. 500 ml).

Deretter ble det til konsentratet tilsatt 3,5 liter metanol, og bunnfallet som dannet seg ble filtrert og analysert ved høyytelse-væskekromatografi, hvorved de i fig. 2 viste resultater ble oppnådd. Bunnfallet viste seg å inneholde 0,2% monosakkarider, 5,3% disakkarider og 69,3% 10-25 sakkarider.

Filtratet ble konsentrert videre, og en blanding av metanol-aceton = 1:1 ble tilsatt til konsentratet for å bevirke utfelling igjen, og bunnfallet ble analysert igjen ved høyytelse-væskekromatografi, hvorved de i fig. 3 viste resultater ble oppnådd. Bunnfallet viste seg å inneholde 3,7% monosakkarider, 4,1% disakkarider, 0,2% trisakkarider, 0,1% tetrasakkarider, 10,4% pentasakkarider og 67,5% 6-23 sakkarider.

Som resultat var utbyttet 74,3 g som tilsvarer 7 6% av det teoretiske utbytte på 98,2 g.

Eksempel 3

Ved å anvende samme glasskolbe utstyrt med en rører ble 100 g kitosan tilsatt og ytterligere løst ved tilsetning av 1 liter 10 prosentig, vandig eddiksyre litt etter litt og deretter avkjølt tilstrekkelig med is-vann.

Deretter ble det til løsningen tilsatt 146 ml 10 prosentig vandig natriumnitritt (salpetersyrling/glukosaminrest = molart forhold 0,5) for å regulere hydrogen-ionekonsentras jonen (pH) til 3, og reaksjonen ble utført i et is-vannbad i 4 timer.

Etter fullføring av reaksjonen ble blandingen nøy-tralisert med 200 ml konsentrert ammoniakkvann, og ytterligere 16 g natriumborhydrid (dobbelt antall mol i forhold til natriumnitritt) ble tilsatt for å utføre reduksjonsreaksjonen under omrøring i is-vannbad i 4 timer.

Etter fullføring av reduksjonsreaksjonen ble for å gjøre produktet lett utfellbart konsentrert ammoniakkvann tilsatt for å regulere blandingen til pH 8-9, etterfulgt av konsentrering til halve volumet (ca. 500 ml) .

Deretter ble det til konsentratet tilsatt 1,5 liter metanol, og bunnfallet som dannet seg ble filtrert og vasket med aceton.

Det oppnådde bunnfall ble analysert ved høyytelse-væskekromatograf i, hvorved de i fig. 4 viste resultater ble oppnådd. Bunnfallet viste seg å inneholde 2,1% monosakkarider, 9,8% disakkarider, 1,1% trisakkarider, 3,1% tetrasakkarider, 0,8% pentasakkarider, 0,4% heksasakka-rider og.79,3% 7-25 sakkarider. Utbyttet av det oppnådde bunnfall var 26,6 g som tilsvarer 27% av det teoretiske utbytte.

Til filtratet ovenfor ble det ytterligere tilsatt 4 liter metanol for å bevirke utfelling igjen. Bunnfallet ble filtrert og vasket med aceton. Det oppnådde bunnfall ble analysert ved høyytelse-væskekromatografi, hvorved de i fig. 5 viste resultater ble oppnådd. Bunnfallet viste seg å inneholde 0,1% monosakkarider, 2,1% disakkarider, 0,7% tetrasakkarider, 0,6% pentasakkarider, 0,3% heksa-sakkarider og 79,1% 7-25 sakkarider. Utbyttet av produktet var 11,2 g, som tilsvarer 12% av det teoretiske utbytte.

Filtratet etter gjenutfellingen som er beskrevet ovenfor ble konsentrert til 200 ml, og til konsentratet ble det tilsatt en blanding av 300 ml metanol og 500 ml aceton for å oppnå bunnfall. Bunnfallet ble filtrert og vasket med aceton. Bunnfallet ble analysert ved høyytelse-væskekromatograf i, hvorved de i fig. 6 viste resultater ble oppnådd. Bunnfallet inneholdt 2,3% monosakkarider, 4,4% disakkarider, 0,6% trisakkarider, 0,3% tetrasakkarider, 0,2% pentasakkarider og 88,7% 6-23 sakkarider.

Utbyttet av det oppnåde bunnfall var 11,2 g, som tilsvarer 12% av den teoretiske mengde.

Av den grunn var det totale utbytte 52,9 g som tilsvarer 54% av det teoretiske utbytte 97,2 g.

Eksempel 4

I en glasskolbe med 5 liter volum utstyrt med en rører ble det anbrakt 50 g kitosan i flak som passerte 30 mesh, og 480 ml 10 prosentig, vandig eddiksyre ble tilsatt litt etter litt under omrøring for å løse kitosanen, etterfulgt av avkjøling av løsningen i et is-vannbad.

Deretter ble 136 ml 10 prosentig, vandig natriumnitritt (salpetersyrling/glukosaminrest = molart forhold 0,7) tilsatt for å regulere hydrogenionekonsentrasjonen (pH) til 3, og reaksjonen ble utført ved 0°C under om-røring i 16 timer, hvoretter blandingen ble hensatt over natten ved romtemperatur for fullføring av reaksjonen.

Etter fullføring av reaksjonen ble blandingen nøytralisert med konsentrert ammoniakkvann og konsentrert under senket trykk. Dessuten ble det til konsentratet gradvis tilsatt aceton for å bevirke acetonfraksjonering ved utfelling av produktene fra ett med høyere molekylvekt, hvorved de i tabell 1 fraksjoneringsresultater ble oppnådd.

Eksempel 5

Forsøket ble utført ved samme fremgangsmåte som i eksempel 3 med unntagelse av at det ble anvendt et naturlig kitin istedenfor kitosan og at det molare forhold salpetersyrling/ glukosaminrest ble forandret til 0,5 for fremstilling av en kitinoligomer som inneholdt 2,5-anhydromannosegruppe, etterfulgt av reduksjonsreaksjonen til fremstilling av en kitinoligomer med en 2,5-anhydromannitolgruppe.

Som resultat av analyse av produktet ved høyytelse-væskekromatograf i og IR-analyse ble de i fig. 10 viste resultater oppnådd. Som følge av at det viste en absorp-sjonstopp ved 1.600-1.700 cm<-1>, ble denne bekreftet til å være en kitinoligomer med en 2,5-anhydromannitolgruppe. Dessuten ble produktet fra fig. 7 bekreftet til å være en kitinoligomer som hadde en 2,5-anhydromannitolgruppe som er en blanding av 40-250 sakkarider.

Eksempel 6

I et glassbeger med 500 ml innvendig volum, utstyrt med en rører, ble det anbrakt 10 g kitosan i flak som passerte 300 mesh (molekylvekt 40.000), og til dette ble det tilsatt litt etter litt 100 ml vandig eddiksyre (løs-gjørende middel/vann: 10 volum%), etterfulgt av tilstrekkelig avkjøling av løsningen i et is-vannbad til 3°C.

Deretter ble 14,5 ml 10 prosentig vandig natriumnitritt (salpetersyrling/glukosaminrest i kitosan (molart forhold): 0,5) tilsatt for regulering av hydrogenionekonsentrasjonen (pH) til 3, og reaksjonen ble utført i den vandige løsning ved 3°C under omrøring i 2 timer til fremstilling av en kitosanoligomer som hadde en 2,5-anhydromannosegruppe .

Etter fullføring av reaksjonen ble blandingen nøy-tralisert med 15 ml ammoniakkvann, og ytterligere ved tilsetning av 1,6 g natriumborhydrid (dobbelt antall mol i forhold til natriumnitritt) og reduksjonsreaksjonen ble utført ved omrøring av blandingen ved romtemperatur over natten til fremstilling av en kitosanoligomer som inneholdt 2,5-anhydromannitol.

Etter fullføring av reduksjonsreaksjonen ble reaksjonsblandingen filtrert for fjerning av uløselige stoffer fra den, og filtratet ble konsentrert til 100 ml. Deretter ble produktet utfelt ved tilsetning av metanol. Under denne operasjon ble mengden metanol som ble anvendt forandret uttrykt som konsentrat:metanolforhold fra 1:3 (første fraksjon) til 1:5 (andre fraksjon) og 1:10 (tredje fraksjon) for å bevirke fraksjonering.

Dessuten ble det foretatt konsentrering til tørr tilstand, og produktet ble utfelt ved tilsetning av metanol og aceton. Ved den operasjon ble fraksjonering utført med metanol:aceton = 1:2 (fjerde fraksjon). Disse bunnfall ble vasket grundig med aceton og eter og tørket i en vakuumeksikator.

Bunnfallet ble analysert ved IR-analyse, hvorved de i fig. 9 viste resultater ble oppnådd. Bunnfallet viste seg ved IR-analyse å være en kitosanoligomer med en 2,5-anhydromannitolgruppe.

Faststoffene i den første til den fjerde fraksjon som ble oppnådd ved fraksjoneringen ble analysert ved høyytelse-væskekromatografi og elementæranalyse.

Analysebetingelsene under høyytelse-væskekromato-graf ianalysen var følgende: Kolonne: "Asahipack GFA-30F".

Strømningshastighet: 0,3 ml/min.

Temperatur: 50°C.

Mobil fase: 0,5% acetatbuffer.

pH: 4,0.

Resultatene er vist i fig. 8 (a)-(d).

Produktene i de respektive fraksjoner viste seg å være som følger:

Første fraksjon [Fig. 8(a)]

Utbytte: 7,2 vekt%.

Topp a-1: Kitosanutgangsmateriale.

Topp a-2: Kitosanoligomer 88,5 mol%.

Molekylvekt: 40.000-1.300 (246 sakkarider-7 sakkarider).

Topp a-3: Natriumacetat.

Andre fraksjon [Fig. 8(b)]

Utbytte: 15,2 vekt%.

Topp b-1: Kitosanutgangsmateriale.

Topp b-2: Kitosanoligomer 99,7 mol%.

Molekylvekt: 45.000-1.300 (277 sakkarider-7 sakkarider).

Topp b-3: Natriumacetat.

Tredje fraksjon [Fig. 8(c)]

Utbytte: 8,4 vekt%.

Topp c-1: Kitosanoligomer 100 mol%.

Molekylvekt: 25.000-1.000 (154 sakkarider-5 sakakrider).

Topp c-2: Natriumacetat.

Fjerde fraksjon [Fig. 8(d)]

Utbytte: 42,2 vekt%.

Topp d-1: Kitosanoligomer 97,4 mol%.

Molekylvekt: 25.000-1.300 (154 sakkarider-7 sakkarider).

Topp d-2: Kitosanoligomer 2,6 mol%.

Molekylvekt: 1.300-900 (7 sakkarider-5 sakkarider). Topp d-3 - 7: Forskjellige salter.

4. Kort beskrivelse av tegningene:

Fig. 1-6 er diagrammer av høyytelse-væskekromato-grafianalyse av kitosanoligomerene som ble fremstilt i eksemplene i oppfinnelsen. Fig. 7 er et diagram av høy-ytelse-væskekromatograf ianalyse av kitinoligomeren som ble fremstilt i eksemplet. Fig. 8(a)-(d) er diagrammer av høy-ytelse-væskekromatograf ianalyse av de respektive bestand-deler i kitosanoligomeren oppsamlet ved fraksjonering i eksemplene. Fig. 9 viser et diagram av IR-analyse av kitosanoligomeren som ble oppnådd i eksemplet. Fig. 10 viser et diagram av IR-analyse av kitinoligomeren oppnådd i eksemplet.

1: Monosakkarid, 2: disakkarid, 3: trisakkarid,

4: tetrasakkarid, 5: pentasakkarid, 6: heksasakkarid, 6-23: 6-23 sakkarider, 7-25: 7-25 sakkarider: 8-29: 8-29 sakkarider, 10-25: 10-25 sakkarider, 40-250: 40-250 sakkarider.

Claims (3)

1. Kitin- eller kitosanoligomer, karakterisert ved at den har en 2,5-anhydromannitolendegruppe, og at oligomeren har formelen hvor R<1> er CH2OH og R<2>, R<3> og R<4> hver er NHCOCH3 eller NH2, m+n er 0-500 og m er 50% eller mindre av n, under den forutsetning at når R<2> er NHCOCH3 er R<3> NHCOCH3 og når R4 er NH2 og når R2 er NH2 er R3 NH2 og R4 er NHCOCH3.

2. Fremgangsmåte til fremstilling av kitin- eller kitosanoligomeren ifølge krav 1, karakteriser t ved a) omsetning av kitin eller kitosan med salpetersyrling ved en temperatur på 10°C eller lavere i en vandig løsning med pH på 1-6, b) nøytralisering av reaksjonsløsningen etter fullføring av reaksjonen ved tilsetning av ammoniakk, et alkylamin eller en anionbytterharpiks, til dannelse av en kitin- eller kitosanoligomer som har en 2,5-anhydromannoseendegruppe, og c) reduksjon av oligomeren med et reduksjonsmiddel, og eventuelt etter reduksjonen, utfelling av kitinoligomeren eller kitosanoligomeren som har 2,5-anhydromannitol-endegruppen og som er løst i et vandig medium ved blanding med et medium som er forenlig med det vandige medium og hvori kitinoligomeren eller kitosanoligomeren er dårlig løselig.

3. Fremgangsmåte i samsvar med krav 2, karakterisert ved at reduksjonsmidlet er en borhydridforbindelse.