NO176924B - Antistoffpreparat til ikke-terapeutisk anvendelse - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår antistoffpreparater til ikke-terapeutisk anvendelse, omfattende humane, monoklonale antistoffer som er i stand til å reagere med forskjellige bakterieslekter.

Grampositive og gramnegative bakterier kan forårsake livstruende sykdom hos infiserte pasienter. Disse bakterie-infeksjoner forårsaker ofte betydelig morbiditet og mortali-tet. Det er en øket forekomst av slike infeksjoner hos for tidlig fødte barn, eldre pasienter og pasienter med alvorlige grunnleggende medisinske tilstander slik som forbrenninger, kirurgisk trauma, langsomt-legende sår eller ondartede lidelser. Disse infeksjoner er typisk av nosocomiell opprin-nelse (dvs. sykehuservervede) og opptrer særlig hos pasienter som har vært underkastet langvarig sykehusinnleggelse i forbindelse med kirurgiske inngrep, intravaskulær insult eller langtidsterapi med immunundertrykkende midler eller antibiotika. Dessuten er nyfødte som har et umodent immunsystem, tilsynelatende akutt mottakelige for neonatal sepsis og meningitis forårsaket av spesielle gramnegative og grampositive bakterier.

Blant de hyppigst forekommende organismer ved syk-dommer fremkalt av gramnegative og grampositive bakterier, er Escherichia coli ( E. coil), Klebslella pneumoniae ( K. pneumoniae), Serratla marcescens (S. marcescens), Enterobacter aerogenes og cloacae (E. aerogenes/ cloacae), Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), Nelsserla menlngitidis ( N. meningi-tidls), gruppe B Streptococcus og Staphylococcus aureus (S. aureus) (Sonnenwirth, A. C, "The Enteric Bacilli and Similar Gram-Negative Bacteria," side 753-790, i Microbiology, 2. utgave, Davis, B. D., Dulbecco, R., Eisen, H. N. Ginserberg, H. S., Wood, W. B., og McCarty, M., Eds., Harper og Row, (1973); McCabe, W.R.., "Gram-Negative Bacteremia," Adv. Intern. Med., 19:135-138 (1974); Kreger, et al., "Gram-Negative Bacteremia III. Reassessment and Etiology, Epidemiology, and Ecology in 612 Patients," Am. J. Med. 68:332-343 (1980); Robbins, J. B. , et al., "Escherichia coli Kl Capsular Polysaccharide Associated With Neonatal Meningitis," New Engl. J. Med., 290:1216-1220 (1974); og Hughs, J. M., et al., "Nosocomial Infection Surveillance, 1980-1982, "Morb. Mort. Weekly Report, 32:1SS-16SS (1983)). Av disse infeksjoner forårsaker vanligvis atskillige, men ikke alle serotyper av visse gramnegative bakterier f.eks. E. Coli, K. pneumoniae, E. aerogenes/ cloacae, P. aemginosa og S. marcescens, bakteriemi blant den voksne befolkning. I motsetning til voksne er de immunologisk umodne nyfødte særlig mottakelige for septicæmia og meningitis forårsaket av de innkapslede stammer av E. coli, N. meningitidis gruppe B, Hemophilus influenzae type B og de fem stammetyper av gruppe B Streptococcus. Selv om andre bakterier også kan forårsake disse infeksjoner, er de ovenfor siterte bakterier de som hovedsakelig isoleres fra de tidligere nevnte blod-infeksjoner.

Antibiotika har lenge vært det primære terapeutiske verktøy til bekjempelse og utryddelse av grampositive og gram-negative infeksjoner. Den fortsatte forekomst og alvorlighet av infeksjonene, den stadige forekomst av antibiotikaresi-stente bakteriestammer og den iboende toksisitet av visse antibiotika poengterer antibiotikaterapiens begrensninger. Disse iakttagelser har inspirert til søkning etter alternative profylaktiske og terapeutiske metoder.

Det er en utbredt oppfatning at antistoffer som er reaktive med tilgjengelige strukturer (eksternt frilagte) på levende bakterier kan lette bakteriedestruksjon ved en hvilken som helst av flere mekanismer. Blant disse mekanismer er: (1) direkte lyse av bakterien i nærvær av serumkomplement, (2) bakteriostase ved blokkering av næringsmiddelutdrivnings-reseptorer, (3) opsonisering og etterfølgende fagocytose av bakteriene i nærvær eller fravær av serumkomplement eller (4) forebyggelse av bakteriens tilknytning til vertsvev (Mims, C.A., "Recovery from Infection", i The Pathogenesis of Infectious Disease, side 198-222, Mims, C.A., Ed., Academic Press (1982)). For bakterier som har overflate carbohydratmolekyler slik som lipopolysaccharid (LPS) og/eller kapsler, synes antistoff å være det mest effektive via opsoniserings-mekanismer (Kaijser, B., et al., "The Protective Effeet Against E. coli of 0 and K Antibodies of Different Immunglobulin Classes", Scand. J. Immunol., 1:276 (1972)). Antistoffer rettet mot de tilgjengelige carbohydratstrukturer kan derfor tilveiebringe et effektivt middel til bakterieeliminer-ing.

I alminnelighet produserer pattedyr som utsettes for sykdomsproduserende bakterier, antistoffer som er spesifikke overfor LPS eller kapsel. Disse antigener er kjemisk forskjellige strukturer oppbygget av hyppig gjentatte oligosaccharid-molekyler, og hvis tilstedeværelse bestemmer bakteriestammenes serotype. Da de ofte er de immundominerende bakterieantigener, har serotypespesifikke antistoffer (anti-LPS eller kapsel) vært de mest undersøkte av mulige terapeutiske antistoffer. På grunn av disse antistoffers begrensede kryssreaktivitet og den tilsynelatende sterkt forskjellige natur av carbohydratanti-gener på patogene grampositive og gramnegative bakterier, vil det imidlertid være ytterst vanskelig og kostbart å fremstille en terapeutisk formulering som kun inneholder serotypespesifikke antistoffer (se f.eks. Kaijser, B. og Ahlstedt, S., "Protective Capacity of Antibodies Against Escherichia coli 0 and K Antigens", Infect. Immun., 17:286-292 (1977); og Morrison, D.C. og Ryan, J.L., "Bacterial Endotoxins and Host Immune Response", Adv. Immunol., 28:293-450 (1979)). Til tross for dette har forskjellige rapporter stimulert visjoner om at det ville kunne finnes immunterapeutiske metoder til behandling av gramnegativ bakteriesykdom.

Fraksjonert, humant plasma anriket med hensyn til immunglobuliner inneholdende spesifikke og beskyttende antistoffer mot de infiserende organismer, har vært noe effektive overfor P. aeruginosa-infeksjoner. (Collins, M.S. og Robey, R.E., "Protective Activity of an Intravenous Immune Globulin (Human) Enriched in Antibody Against Lipopolysaccharide Antigens of Pseudomonas aeruginosa", Amer. J. Med., 3:168-174

(1984)). Kommersielle produkter er imidlertid ikke lett tilgjengelige på grunn av visse iboende begrensninger som har hindret utstrakt bruk av disse til behandling av livstruende bakteriefremkalt sykdom.

En slik begrensning i forbindelse med immunglobulin-preparater er at de samles fra store puljer av plasmaprøver som på forhånd er blitt utvalgt på grunn av tilstedeværelsen av et begrenset antall spesielle antistoffer. Disse forråd består typisk av prøver fra et tusentall donorer som kan ha lave titerverdier for visse patogene bakterier. I beste fall er det således bare en beskjeden økning av den resulterende titerverdi for ønskede antistoffer.

En annen slik begrensning er at den på forhånd valgte prosess i seg selv krever meget kostbar kontinuerlig screening av donorpopulasjonen for å sikre produktensartethet. Til tross for betydelige anstrengelser kan produktpartier stadig variere fra porsjon til porsjon og fra det ene geografiske område til det andre.

Enda en slik begrensning som ligger i selve immun-globulinpreparatene, er at deres anvendelse resulterer i sam-tidig administrering av store mengder fremmede proteinsubstan-ser (f.eks. vira) som er i stand til å fremkalle ugunstige biologiske virkninger. Kombinasjonen av lave titerverdier av ønskede antistoffer og høyt innhold av uvedkommende stoffer begrenser ofte mengden av spesifikke og dermed gunstige immunglobuliner som kan administreres til pasienten til sub-optimale nivåer.

I 1975 rapporterte Kohler og Milstein at visse muse-cellelinjer kunne fusjoneres med musemiltceller under dannelse av hybridomer som ville utskille rene "monoklonale" antistoffer (Kohler, G. og Milstein, C, "Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity", Nature, 256:495-497 (1975)). Med denne teknologis fremkomst ble det mulig å produsere murinantistoffer mot en eller flere spesielle determinanter på antigener.

Ved anvendelse av denne teknologi er det blitt ut-ledet monoklonale museantistoffer fra mus immunisert med polysaccharid fra Neisseria meningltidis gruppe B. Disse murine IgM monoklonale antistoffer ble iakttatt å binde og opsonisere atskillige Kl-positive E. coli-stammer uansett deres LPS serotype (Cross, supra, Soderstrom, supra, og Cross, A.S., et al., "The Importance of the Kl Capsule in Invasive Infections Cause by Escherichia coli", J. Inf. Dis., 149:184-193 (1984)). Dessuten var de monoklonale antistoffer beskyttende i mus overfor letal smitte med E. coli Kl og gruppe B meningococcale organismer (Cross, supra og Soderstrom, supra). I et annet eksempel er monoklonale museantistoffer som var spesifikke mot type III gruppe B Streptococcus, rapportert å være beskyttende ved en eksperimentell museinfeksjonsmodell (Egan, M.L., et al., "Protection of Mice from Experimental Infection with Type III Group B Streptococcus Using Monoclonal Antibodies", J. Exp. Med., 1:1006-1011 (1983)).

Selv om et monoklonalt museantistoff er verdifulle ved behandling av mus, er det betydelige ulemper ved å bruke det til mennesker. Det humane immunsystem er i stand til å gjenkjenne et hvilket som helst monoklonalt museantistoff som et fremmed protein. Dette kan resultere i akselerert clearance av antistoffet og dermed opphevelse av dets farmakologiske virkning (Levy, R. og Miller, R.A., "Tumor Therapy with Monoclonal Antibodies", Fed. Proe, 42:2650-2656 (1983)). Hva som er mer alvorlig, er at det kunne tenkes å føre til sjokk og til og med død på grunn av allergiske reaksjoner som er analoge med "serumsyke". Kliniske forsøk har vist at antimuse-immunglobulinreaksjoner har begrenset anvendeligheten av disse antistoffer hos ca. halvparten av de pasienter som mottar monoklonale museantistoffer til behandling av forskjellige tumorer (Sears, H.F., et al., "Phase I Clinical Trial of Monoclonal Antibody in Treatment of Gastrointestinal Tumor", Lancet, 1:762-764 (1982); og Miller, R.A., et al., "Monoclonal Antibody Therapeutic Trials in Seven Patients with T-Cell Lymphoma", Blood, 62:988-995 (1983)).

Det er følgelig et behov for humane, monoklonale antistoffer som er reaktive overfor gramnegative og grampositive bakterier. Den forskjelligartede antigenisitet av grampositive og gramnegative sykdomsfremkallende bakterier gir imidlertid sterk formodning om at det vil være praktisk talt umulig å produsere serotypespesifikke humane monoklonale antistoffer mot hvert av de mange betydelige bakteriepato-gener.

Den forskjelligartede antigenisitet av gramnegative bakterier tilskrives de forskjellige områder av lipopoly-saccharidet (LPS), et molekyl som er knyttet til gramnegative organismers ytre membran. LPS-molekylet anses generelt å være oppbygget av tre strukturelle områder. Området nærmest den ytre membran er det såkalte lipid A avsnitt av LPS. Dette strukturelt bevarte område har den endotoksiske aktivitet som er knyttet til gramnegativ sykdom. Det andre strukturelle område, betegnet kjerne, er kjedet til et lipid A ofte via en 2-keto-3-deoxy-D-mannooctonatrest (KDO) og er i likhet med lipid A-området vanligvis ikke tilgjengelig for antistoff når det tredje ytterste område av LPS er til stede. Selv om dette område er bevart delvis i enkelte gramnegative bakteriearter, er det funnet mange avvik i komplett kjerne blant medlemmer av familien Enterobacteriaceae. Det ytterste område av et LPS-molekyl er oppbygget av gjentatte oligosaccharidenheter og er kjent som den O-spesifikke sidekjede. Sukkerne i disse oligosaccharidenheter omfatter molekylære entiteter som utviser serotypespesifikk strukturell antigenisk uensartethet. Selve sukkerne, deres sekvens og deres bindinger, bestemmer således O-sidekjedeantigenisiteten via deres tertiære struktur. Antistoffer mot disse O-grupper har generelt vist seg å være sero-typespesif ikke. Serotyper defineres typisk ved deres reaktivitet med monospesifikke antisera som utviser bindingsaktivitet for bare en spesiell antigenisk determinant. Se generelt Mayer et al., Meths. Microbiology, 18:157-201 (1985).

Antisera mot LPS kjerne og lipid A-områder er blitt fremstilt som ledd i bestrebelser på å vise beskyttelse mot gramnegativ infeksjon, Sakulramrung og Domingue, J. Inf. Dis., 151:995-1104 (1985); McCabe,et al., J. Infect. Dis., 1365:516

(1977); og Mullan, et al., Infect. Immun., 10:1195-1201

(1974). I den senere tid er det blitt fremstilt muse og humane monoklonale antistoffer som reagerer med de bevarte områder. Selv om disse antistoffer av og til har vist partiell ln vlvo effektivitet ved skreddersydde modellsystemer (Teng, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82:1790 (1985); og Bogard og Kung, patentsøknad nr. W085/01659), har andre laboratorier ikke vært i stand til å påvise lignende virkninger. Se Elkins og Metcalf, Infect. Immun. 48:597 (1985); og Gigliotti og Shenap, J. Inf. Dis. 151:1005-1011 (1985). Enn videre reagerer disse antistoffer i alminnelighet ikke med (binder ikke til) intakte levedyktige gramnegative bakterier eller rensede LPS-molekyler. Disse resultater antyder at det er tvilsomt om kjerne eller lipid A avsnitt av LPS vil være tilgjengelig på bakterier i deres naturlige og infeksiøse tilstand vil være tilgjengelige for antistoff. Det er også alminnelig akseptert at antikjerne eller antilipid A antistoffer ikke vil reagere med grampositive bakterier da sistnevnte ikke har LPS. I be-traktning av disse resultater er det usannsynlig at monoklonale antistoffer mot de bevarte kjerne eller lipid A områder av LPS vil være virkningsfulle til behandling av human gramnegativ eller for den saks skyld grampositiv bakteriell sykdom.

Det er således fortsatt et betydelig behov for humane monoklonale antistoffer som er bredt (intergenus) kryssreaktive overfor grampositive og gramnegative bakterier.

Ved foreliggende oppfinnelse tilveiebringes således et antistoffpreparat til ikke-terapeutisk anvendelse, kjenne-tegnet ved at det omfatter humane monoklonale antistoffer, og er reaktivt med minst to bakteriearter av minst to slekter, idet minst ett av antistoffene eller bindingsfragment derav er i stand til spesifikt å reagere med en ikke-kjerne carbohydratepitop som er felles for serotyper av minst to forskjellige arter. Det tilveiebringes også hittil ukjente cellelinjer som utskiller humane monoklonale antistoffer eller bindingsfragmenter derav, som spesifikt er kryssreaktive med en epitop omfattende en tilgjengelig ikke-kjerne carbohydratdel som forefinnes på minst to serotyper av to forskjellige arter av forskjellige bakterieslekter. Det tilveiebringes således også et sett eller utstyr, inneholdende et antistoffpreparat ifølge foreliggende oppfinnelse, til bruk ved påvisning av tilstedeværelse av minst to medlemmer av arter av forskjellige bakterieslekter.

I overensstemmelse med oppfinnelsen tilveiebringes det hittil ukjente cellelinjer som er i stand til å produsere humane monoklonale antistoffer, og preparater omfattende slike antistoffer, hvilke preparater er i stand til selektivt å reagere med flere bakterieslekter som er ansvarlige for nosocomiale, neonatale eller andre infeksjoner, hvor individuelle antistoffer typisk reagerer med ikke-kjernecarbohydratepitoper som forefinnes på multiple bakterieslekter. De omhandlede celler har identifiserbare kromosomer hvori kimlinje DNA'et fra disse eller en forløpercelle er blitt omleiret til å kode for et antistoff eller et bindingsfragment derav med et bind-ingssted for en antigenisk determinant (epitop) som er felles for carbohydratmolekyler som finnes på minst visse serotyper av to eller flere bakterieslekter. Disse humane monoklonale antistoffer kan anvendes på flere forskjellige ikke-terapeutiske måter, herunder til diagnose av bakteriell sykdom, og påvisning av forskjellige bakteriearter og slekter.

Cellene ifølge oppfinnelsen vil typisk være celler som er i stand til stabil fremstilling av et humant antistoff i kultur, i særdeleshet udødeliggjorte humane lymfocytter som produserer beskyttende humane monoklonale antistoffer mot ikke-kjernecarbohydratdeterminanter på tilgjengelige molekyler som er felles for minst to bakteriearter. Med "tilgjengelig" menes at ikke-kjernecarbohydratdeterminantene er fysisk tilgjengelige i det anvendte miljø for direkte interaksjon med de monoklonale antistoffer. Enn videre er de ikke-kjerne-carbohydratmolekyler som frigjøres til det omgivende miljø, også frie for direkte interaksjon med antistoffmolekylene, og til å bli utskilt via det retikuloendoteliale system.

Preparatene ifølge oppfinnelsen inneholdende de monoklonale antistoffer, vil typisk kunne anvendes til påvisning av nosocomiale, neonatale og andre infeksjoner. Da nosocomiale infeksjoner typisk forårsakes av infeksjoner av følgende bakterier: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes/ cloacae, Serratia marcescens og Streptococcus agalactiae gruppe B, vil antistoff prepara ter som er reaktive overfor to, tre, fire eller flere slike bakterier, bli foretrukket. Tilsvarende for neonatale infeksjoner, slik som ved neonatal sepsis og meningitis, er antistoffene fortrinnsvis spesifikke overfor to eller flere av følgende bakterieorganismer: Escherichia coli Kl, Neisseria meningitidis gruppe B, Streptococcus agalactiae gruppe B og Hemophilus influenzae type B. Blant andre alminnelig infeksi-øse bakterier er: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Bacteroides fragilis, Pseudomonas cepacia, Myco-Jbacterium tuberculosis, Providencia morganii, Salmonella typhi, Pneumocystis carinii, Acinetobacter herellea, Pastu-rella multocida, Klebsiella oxytoca. For ytterligere relevante patogene bakterier som er velkjente for fagmannen, henvises det til Hughs, J.M., et al., "Nosocomial Infection Surveillance, 1980-1982", Morb. Mort. Weekly Report, 32:1SS-16SS

(1983) og generelt Microbiology, 3. utgave, Davis, B.D., Dulbecco, R., Eisen, H.N., Ginserberg, H.S., Wood, W.B. og McCarty M., Eds., Harper og Row (1980). De monoklonale antistoffer vil reagere med individuelle medlemmer eller alle medlemmer av en spesiell bakterieart hvor medlemmene kan skjelnes fra hverandre ved deres overflateepitoper, i særdeleshet LPS eller kapselsteder, f.eks. serotyper. Den uventede iakttagelse av monoklonalt antistoff-kryssreaktivet på tvers av forskjellige bakteriearter, her under de ovenfor angitte klinisk viktige arter, tilveiebringer hittil ukjente midler for ikke-terapeutisk anvendelse. Ved anvendelse av på forhånd valgte kryssreaktive antistoffer i kombinasjon kan en blanding av enkelte få antistoffer fremstilles for påvisning av et antall forskjellige arter av infeksiøse bakterier. Som eksempel vil en blanding av to monoklonale antistoffer, det ene kryssreaktivt med minst to bakteriearter av klinisk betydning og det andre kryssreaktivt med minst to eller tre forskjellige arter, kunne anvendes til påvisning av fire, fem, seks eller flere forskjellige arter. Tilføyelse av et tredje eller fjerde monoklonalt antistoff som hvert især er kryssreaktivt med minst to klinisk betydningsfulle arter, vil, selv hvis en eller flere av artene er den samme som den som gjenkjennes av det første og/eller andre antistoff, øke anvendeligheten for påvisning av fem til ti eller flere arter. Naturligvis kan det være nødvendig også å tilføye ett eller flere monoklonale antistoffer som hvert især er spesifikt for nettopp en enkelt på forhånd valgt bakterieart, f.eks. når monoklonale antistoffer som er kryssreaktive med denne art, ikke er tilgjengelige. Fremstilling av monoklonale antistoffer kan utføres ved udødeliggjørelse av ekspresjonen av nukleinsyresekvenser som koder for antistoffer eller bindingsfragmenter derav, som er spesifikke for en ikke-kjerne-carbohydratepitop som forefinnes på multiple bakteriearter. De monoklonale antistoffer fremstilles typisk ved celledrevet Epstein-Barr-virus (EBV) transformasjon av lymfocytter oppnådd fra humane donorer som utsettes for, eller har vært utsatt for, de respektive gram-negative bakterier. De således fremstilte antistoffutskillende cellelinjer karakteriseres som kontinuerlig voksende lymfo-plastoid-celler som har en diploid karyotype, er Epstein-Barr-kjerneantigen (EBNA) positive og utskiller monoklonalt antistoff av enten IgG, IgM, IgA eller IgD isotype. Selve den celledrevne transformasjonsprosess utgjør en oppfinnelse som er overdratt til Genetic Systems Corporation og beskrevet i detalj i US patentskrift 4 464 465. De monoklonale antistoffer kan anvendes intakte eller som fragmenter, slik som Fv, Fab og F(ab')2, men anvendes vanligvis intakte. Cellelinjer som produserer antistoffene, vil alternativt kunne fremstilles ved cellefusjon mellom passende medikamentmerkede humane myelom-, musemyelom- eller humane lymfoblastoidceller og humane B-lymfocytter, under dannelse av hybridcellelinj er. Cellelinjene ifølge oppfinnelsen kan anvendes til annet enn til direkte fremstilling av de humane monoklonale antistoffer. Cellelinjene kan fusjoneres med andre celler (slik som passende medikamentmerkede humane myelom-, musemyelom- eller humane lymfoblastoidceller) under dannelse av hybridomer, og således sørge for overføring av de gener som koder for de humane monoklonale antistoffer. Cellelinjene kan også anvendes som kilde for det DNA som koder for immunoglobu-linene som kan isoleres og overføres til celler ved andre teknikker enn fusjon. Dessuten kan genene som koder for de monoklonale antistoffer, isoleres og anvendes i henhold til rekombinante DNA-teknikker til fremstilling av det spesifikke immunglobulin i forskjellige verter. Spesielt kan ved fremstilling av cDNA-biblioteker ut fra budbringer RNA, et enkelt cDNA-klon som koder for immunglobulinet og som er fritt for introner, isoleres og anbringes i passende prokaryotiske eller eukaryotiske ekspresjonsvektorer og deretter transformeres til en vert for endelig masseproduksjon. Lymfoblastoid- eller hybridcellelinjene kan klones og screenes i henhold til konvensjonelle teknikker med de antistoffer som er i stand til å bindes til epitopene av forskjellige bakterieslekter påvist i cellesupernatantene. Av særlig interesse er monoklonale antistoffpreparater som reagerer med minst ca. tre, fortrinnsvis minst ca. fem og opptil og innbefattende alle følgende alminnelige nosocomiale infeksjonsforårsakende bakterier: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes/ cloacae, Serratia marcescens og Streptococcus agalactiae gruppe B. Til påvisning av neonatale infeksjoner vil preparatene fortrinnsvis reagere med minst to, vanligvis minst tre og mer alminnelig minst fire og opptil og innbefattende alle følgende infeksjonsforårsakende bakterieslekter: Escherichia coli Kl, Neisseria meningitidis gruppe B, Streptococcus agalactiae gruppe B, Hemophilus influenzae type B, Staphylococcus aureus og Staphylococcus epidermidis. Hvert av preparatene vil innbefatte minst to, vanligvis minst tre til fem, og mer vanlig seks til ti humane monoklonale antistoffer hvor minst ett antistoff reagerer med ikke-kjerne-carbohydratepitoper (f.eks. av LPS-molekylene), som er felles for to eller flere bakterieslekter, og som tilveiebringer beskyttelse. Typisk vil antistoffet ikke binde til alle serotyper av hver bakterie, men kan binde til to, tre eller flere serotyper. Det er ønskelig at det er minst ett monoklonalt antistoff som bindes til en tilgjengelig ikke-kjerne-carbohydratdel av minst to slekter av gramnegative bakterier, og minst ett monoklonalt antistoff som bindes til en tilgjengelig carbohydratdel av en gramnegativ bakterie og en grampositiv bakterie. Det innbyrdes molforhold mellom de forskjellige monoklonale antistoffkomponenter vil vanligvis ikke avvike med mér enn en faktor 10, vanligvis ikke med mer enn en faktor 5, og komponenter vil vanligvis forefinnes i et molforhold på ca. 1:1-2 i forhold til hver av de andre antistoffkomponenter. De humane monoklonale antistoffer kan også finne anvendelse hver for seg, i særdeleshet når patogenet er blitt identifisert eller er begrenset til et snevert område av patogener innenfor det angjeldende antistoffs bindings-spektrum. De monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen kan lyofiliseres for oppbevaring og rekonstitueres i en passende bærer før bruk. Denne teknikk er blitt vist å være effektiv i forbindelse med konvensjonelle immunglobuliner, og i og for seg kjente lyofiliserings- og rekonstitueringsteknikker kan anvendes. Fagmannen vil kunne forstå at lyofilisering og rekonstituering kan føre til varierende grader av antistoff-aktivitetstap (f.eks. er med konvensjonelle immunglobuliner IgM antistoffer tilbøyelige til å gjennomgå større aktivitets-tap eller IgG antistoffer), og at det kan være behov for å justere anvendelsesnivåene for å kompensere for dette. Monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen kan ytterligere finne et bredt spektrum av anvendelser in vitro. Eksempelvis kan de monoklonale antistoffer anvendes til bakterietypebestemmelse og til isolering av spesifikke bakteriestammer eller fragmenter derav. For diagnostiske formål kan de monoklonale antistoffer enten være merket eller umerket. Diagnostiske analyser medfører typisk påvisning av dannelse av et kompleks via binding av det monoklonale antistoff til organismens LPS. I umerket form finner antistoffene anvendelse ved agglutiner-ingsahalyser. Dessuten kan umerkede antistoffer anvendes i kombinasjon med andre merkede antistoffer (andre eller sekundære antistoffer) som er reaktive med det monoklonale antistoff, slik som antistoffer som er spesifikke for humant immunglobulin. Alternativt kan de monoklonale antistoffer merkes direkte. Vidt forskjellige markører kan anvendes, slik som radionukleider, fluorescensfrembringende midler, enzymer, enzymsubstrater, enzymcofaktorer, enzyminhibitorer, ligander (i særdeleshet haptener) etc. Tallrike typer av immunanalyser er tilgjengelige, og enkelte av analysene beskrives eksempelvis i US patentskrifter nr. 3 817 827, 3 850 752, 3 901 654, 3 935 074, 3 984 533, 3 996 345, 4 034 074 og 4 098 876. Vanligvis anvendes de monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen ved enzymimmunanalyser hvor de angjeldende antistoffer eller sekundære antistoffer fra en annen art konju-geres til et enzym. Når en prøve slik som humant blod eller et lysat derav inneholdende en eller flere bakterier av en viss slekt eller serotype kombineres med de angjeldende antistoffer, inntreffer det binding mellom antistoffene og de molekyler som utviser de utvalgte epitoper. Slike celler kan deretter atskilles fra de ubundne reagenser, og et sekundært antistoff (merket med et enzym) tilsettes. Deretter påvises tilstedeværelse av antistoff-enzymkonjugatet som er spesifikt bundet til cellene. Andre konvensjonelle teknikker som er velkjente for fagmannen, kan også anvendes. Det kan også leveres sett eller utstyr til bruk med de angjeldende antistoffer ved påvisning av bakterieinfeksjon eller av tilstedeværelse av et valgt antigen. Foreliggende monoklonale antistoffpreparat kan således leveres, vanligvis i lyofilisert form, i en beholder, enten alene eller i forbindelse med ytterligere antistoffer som er spesifikke overfor andre gramnegative bakterier. Antistoffene som kan være konjugert til en markør eller ukonjugerte, inkluderes i settene eller utstyrene med puffere slik som tris, fosfat, carbonat, etc, stabiliseringsmidler, biocider, inerte proteiner, f.eks. okseserumalbumin eller lignende. Vanligvis vil disse materi-aler være til stede i en mengde på mindre enn ca. 5 vekt%, basert på mengden av aktivt antistoff, og vanligvis til stede i en samlet mengde på minst 0,001 vekt%, igjen basert på antistoff konsentrasjonen. Det vil ofte være ønskelig å inkludere et inert fordrøyningsmiddel eller eksipient for å fortynne de aktive bestanddeler hvor eksipienten kan være til stede i en mengde på fra 1 til 99 vekt% av det samlede preparat. Når et annet eller sekundært antistoff som er i stand til å bindes til det monoklonale antistoff anvendes, vil dette vanligvis forefinnes i en separat beholder. Det andre antistoff konju-geres typisk til en markør og formuleres på analog måte med de ovenfor beskrevne antistoff-formuleringer. Oppfinnelsen beskrives nærmere i de etterfølgende eksempler.

Eksempel 1

Dette eksempel viser fremgangsmåter for fremstilling av et humant monoklonalt antistoff som har intergenus kryssreaktivitet overfor medlemmer av slektene Escherichia coli ( E. coli), Serratia marcescens ( S. marcescens), Klebsiella pneumoniae ( K. pneumoniae) og Enterobacter aerogenes (E. aerogenes).

A. Oppnåelse av egnede humane celler

Egnede humane B-celler (lymfocytter) ble oppnådd fra perifert blod fra et individ som ble vist å ha vært angrepet av sykdommen cystisk fibrose. Enkeltkjernede celler ble fra-skilt fra det perifere blod ved standardsentrifugeringsteknik-ker på "Ficoll-Paque" (Boyum, A., "Isolation of Mononuclear Cells and Granulocytes from Human Blood", Scand. J. Clin. Lab. Invest., 21. Suppl. 97:77-89 (1968)) og ble vasket to ganger i calciummagnesiumfritt fosfatpufret saltvann (PBS) før suspen-dering i 1 ml 90 % kalvefosterserum (FBS) og 10 % dimethyl-sulfoxyd og nedfrysning til -196 °C i flytende nitrogen.

Når de enkeltkjernede celler skulle transformeres, ble en ampulle inneholdende 5 x IO<7> celler hurtig opptint ved 37 °C. Cellesuspensjonen ble tilsatt til 10 ml Iscoves medium inneholdende 15 % FBS og ble sentrifugert ved romtemperatur i 10 minutter ved 250 x g. De enkeltkjernede celler ble befridd for T-celler (lymfocytter) ved anvendelse av en modifisert E-rosettprosedyre. I korte trekk ble cellene resuspendert til en konsentrasjon på 1 x IO<7> celler/ml i PBS inneholdende 20 % FBS ved 4 °C. 1 ml av denne suspensjon ble deretter anbragt i et 17 x 100 mm rundbunnet polystyrenrør hvortil det ble tilsatt 1 x 10<9> 2-aminoethyl-isothiouroniumbromid (AET)behandlede røde saueblodlegemer fra en 10 vol/vol% oppløsning i Iscoves medium (Madsen, M. og Johnson, H.E., "A Methodological Study Rosette Formation Using AET Treated Sheep Red Blood Cells", J. Immun. Methods, 27:61-74, (1979)). Suspensjonen ble blandet kraftig i 5-10 minutter ved 4 °C, og Erosett-cellene ble fjernet ved sentrifugering gjennom "FicollPaque" i 8 minutter ved 2500 x g og 4 °C. E-rosett-negative, enkeltkjernede celler fra perifert blod (E PMBC) som dannet bånd ved grenseflaten, ble vasket en gang i Iscoves medium og ble resuspendert i samme inneholdende 15 vekt/vol% FBS (g/ml), L-glutamin (2 mM/1), natriumpyruvat (1 mM/1), penicillin (100 IU/ml), streptomycin (100 ug/ml), hypoxanthin(1 x 10"<4> M) og thymidin (1,6 x 10"s M). Dette medium omtales i det etterfølgende som HAT-medium.

B. Celledrevet transformasjon av enkeltkjernede celler fra perifert blod

Celledrevet transformasjon av E"PBMC ble oppnådd ved co-dyrkning av E"PBMC med en transformerende cellelinje. Den transformerende cellelinje var en EBNA-positiv human lymfoblastoid cellelinje som stammet fra ethylmethansulfonat-mutagenese av GM 1500 lymfoblastoid-cellelinjen. Utvelgelse i nærvær av 30 ug/ml 6-thioguanin gjorde cellene hypoxant-hinguanin-fosforibosyl-transferase-manglende og dermed HAT-følsomme. Cellelinjen betegnes som lA2-cellelinjen og ble deponert ved American Type Culture Collection (ATCC) den 29. mars, 1982 under ATCC nr. CRL 8119. lA2-celler i logaritmisk vekstfase ble suspendert i HAT-medium og kombinert med E"PBMC i et forhold på 30 lA2-celler pr. E"PBMC. Celleblandingen ble plettert i 10 rundbunnede 96-brønns mikrotiterplater i en konsentrasjon på 62.000 celler/brønn i et volum på 200 ul/brønn, og kulturen ble inkubert ved 37 °C i en fuktet atmosfære inneholdende 6 % C02. Kulturer ble matet 5 dager etter transformasjon ved utskiftning av halvparten av supernatanten med friskt HAT-medium. Brønnene ble iakttatt hver annen dag i et omvendt mikroskop for tegn på celledeling. 10 dager etter plettering av celleblandingen og etter at lA2-cellene var døde på grunn av HAT-utvelgelse, ble mating av brønnene gjennomført med en ny mediumformulering som var identisk med HAT-mediet bortsett fra at den manglet aminopterinkomponenten. 15 dager etter plettering ble det iakttatt at 100 % av brønnene inneholdt formerende celler, og at cellene i de fleste av brønnene var av tilstrekkelig densitet til fjerning og testing av supernatantene med hensyn til anti-B. coli- eller anti-S. marcescens-antistoff.

C. Påvisning av celler utskillende spesifikt antistoff

Supernatanter ble screenet for tilstedeværelse av anti-E. coli- eller anti-S. marcescens-antistoffer ved anvendelse av en enzymkjedet immunsorbent analyseteknikk (ELISA)

(Engvall, E. , "Quantitative Enzyme Immunoassay (ELISA) in Microbiology", Med. Biol., 55:193-200, (1977)). Antigenplatene besto av en rekke flatbunnede 96-brønns "Immunolon 2"-mikrotiterplater hvis brønner inneholdt en blanding av enten levedyktige E. coli eller S. marcescens serotyper fiksert til brønnoverflåtene med poly-L-lysin (PLL). I korte trekk ble 50 pl PLL (1 ug/ml) i PBS tilsatt til hver brønn i 30 minutter ved romtemperatur (ST). Platene ble vasket tre ganger med PBS, og enten PBS eller 50 pl av en blandet bakteriesuspensjon med O.D.660 = 0, 2 ble tilsatt til hver brønn. Platene ble inkubert ved 37 °C i 60 minutter og ble vasket tre ganger med saltvann/0,02 % Tween<®> 20 (saltvann/T) for å fjerne ikke-festede bakterier. Blant forskjellige antigenplater som ble screenet, var: 1) en blanding av E. coli serotype 01 (ATCC nr. 23499) og 04 (ATCC nr. 12791), 2) en blanding av S. marcescens serotype 07, 015, 016 og 018 (alle referansetypestammer ble oppnådd fra Communicable Disease Center (CDC), Atlanta, GA) og 3) en mikrotiterplate uten bakterier.

Til ELISA-prosedyren ble analysebrønner først blokkert med 200 pl av en blanding inneholdende 5 vekt/vol% fett-fri tørrmelk, 0,0001 % "Foam A" og 0,01 vekt/vol% "Thimerosal" i 500 ml PBS for å forebygge ikke-spesifikk proteinbinding. Etter inkubering i 1 time ved ST ble platene vasket 3 ganger med 200 pl/brønn/vasking med saltvann/T. Til hver brønn ble tilsatt 50 pl av en blanding inneholdende 0,1 % Tween<®> 20 og 0,2 % kvegserumalbumin i PBS (PTB). Supernatanter fra brønner i kulturplaten ble replikaplettert i tilsvarende brønner i antigen- og kontrollplatene (50 pl/brønn), og platene ble inkubert ved ST i 30 minutter. Supernatantene ble deretter fjernet, platene ble vasket fem ganger med saltvann/T, og 50 pl biotinylert geiteanti-humant immunblobulin (lg) (TAGE nr. 9303040 fortynnet 1:250 i PTB) ble tilsatt til hver brønn. Etter 30 minutters inkubering ved ST ble det biotinylerte reagens fjernet, brønnene ble vasket fem ganger med saltvann/T og 50 pl av et på forhånd dannet avidin:biotinylert pepperrot-peroxydasekompleks ("Vectastain ABC Kit", Vector Laboratories) ble tilsatt til hver brønn. Etter 30 minutter ved ST ble "Vectastain ABC" reagenset fjernet, brønnene ble vasket fem ganger med saltvann/T og 100 pl substrat (0,8 mg/ml ortho-fenylendiamin-dihydroklorid i 100 mM citratpuffer, pH 5,0 pluss 0,03 % H202 i avionisert H20 blandet i like store volumer umiddelbart før plettering) ble tilsatt til hver brønn. Etter 30 minutters inkubering i mørke ble 50 pl 3N H2S04 tilsatt til hver brønn for å avslutte reaksjonen. Kultursupernatanter som inneholdt antistoff som reagerte med de bakteriebelagte plater, ble påvist ved å måle absorbansen ved 490 nm på en Dynatech<®>MR 580 mikroELISA leser.

Kultursupernatanter fra seks transformasjoner ble analysert ved hjelp av den ovenfor angitte metode, hvilket resulterte i identifikasjon av en brønn (7D7) som hadde aktivitet på E. coli og S. marcescens serotypeplatene, men ikke på kontrollplatene. Det ble påvist ved etterfølgende ELISA med individuelle E. coli-serotyper at denne brønn inneholdt antistoff som var reaktivt med i det minste E. coli-serotypene: 0,8, (A.T.C.C. nr. 23504) og 075 (A.T.C.C. nr. 12798), men ikke 0,4, 06:K2, 08:K8, 09:K9 eller 022:K13 (hhv. A.T.C.C. nr. 12791, 19138, 23501, 23505 og 23517). Denne brønn inneholdt dessuten antistoff som var reaktivt med S. marcescens-serotypene 012, 013 og 015, men ikke noen andre av de tyve kjente S. marcescens LPS serotyper.

D. Kloning av spesifikt antistoffproduserende celler

Cellene i brønn 7D7 ble underkastet atskillige kloningsrunder (fire) inntil alle klonale supernatanter analysert ved den ovenfor angitte ELISA-prosedyre, ga en positiv reaksjon på E. coli-serotypene 08 og 075 og på S. marcescens serotypene 012, 013 og 015. Det var aldri noe eksempel hvor noen klonal supernatant viste segregering i sitt reaktivitetsmønster, hvilket gir formodning om at kultursupernatant fra brønn 7D7 hadde sann intergenus kryssreaktivitet med de angitte E. coli og S. marcescens serotyper og i'-... inneholdt mer enn en cellelinje (som hver viser individuell serotypereaktivitet). Celler ble klonet ved grensefortynning i rundbunnede 96-brønnsplater i fravær av mateceller. Medier besto av Iscoves medium inneholdende 15 vol/vol% FBS, L-glutamin (2 mM/1), natriumpyruvat (1 mM/1), penicillin (100 IU/ml) og streptomycin (100 ug/ml). Kulturer ble matet hver tredje dag ved utskiftning av halvparten av supernatanten med friskt medium. Vanligvis hadde brønnene tilstrekkelig lymfoblastoid celledensitet mellom 2 og 3 uker etter plettering, til analyse av anti-E. coli og S. marcescens serotype-spesifisitet.

Ved dette forsøk ble det således oppnådd en klonet transformert human cellelinje som er kontinuerlig (udødelig) og utskiller et humant monoklonalt antistoff til en determinant på overflaten av de angitte E. coli og S. marcescens serotyper.

Før innlevering av foreliggende patentsøknad ble den kontinuerlig transformerte humane cellelinje betegnet som 7D7 deponert ved American Type Culture Collection, Rockville, MD. som A.T.C.C. nr. CRL 9009.

E. Ytterligere karakterisering av interqenus kryssreaktivitet

Antistoff fra den klonede 7D7 cellelinje ble analysert med hensyn til ytterligere intergenus kryssreaktivitet ved en modifikasjon av standard immunavtrykksteknikken. Nærmere bestemt ble kryssreaktivitet overfor bakteriene K. pneumoniae, E. aerogenes og E. cloacae undersøkt ved anbringelse av bakterier som pletter på en nitrocellulosepapirskive med gitter, den bakterieholdige skive ble omsatt med antistoffet, og antistoffreaksjonene ble fremkalt med alkalisk fosfatase/nitrobluetetrazolium-enzymsystem. I korte trekk ble 1,0 ul bakterier (O.E.660 = 0,4) anbragt som pletter pr. gitterseksjon av en nitrocellulosepapirsive ("Schleicher and

'i Schuell", 37 mm nitrocelluloseskive med gitter, 0,45 um). Hver skive kan lett romme 60 forskjellige bakterieprøver. De plet-tede skiver ble lufttørket, fiksert i 25 vol/vol% isopropanol i 30 minutter og ble blokkert i 10 minutter i det fettfrie tørrmelkreagens som beskrevet for ELISA-metoden. De blokkerte

skiver ble vasket tre ganger i 5 minutter i PBS/Tween<®> 20 og ble overført til lokkene fra 35 x 10 mm vevskulturskåler. Den antistoffholdige supernatant (1,0 ml) ble tilsatt til lokket og inkubert ved ST i 60 minutter. Etter tre 5 minutters vask-inger i PBS/Tween<®> 20 ble det tilsatt 1-2 ml 1:1000 fortynnet (PBS) alkalisk fosfatase-konjugert geite-anti-humant immunglobulin (TAGO, Burlingame, CA) i 60 minutter ved ST. Skivene ble vasket som ovenfor angitt og ble nedsenket i 1-2 ml friskt substrat fremstilt som følger: 16,5 ml brom-klorindolylfosfat og 8,5 mg nitrobluetetrazolium ble oppløst i 50 ml alkalisk fosfatasepuffer (0,1 M Tris-HCl, pH 9,5 med 0,1 M NaCl og 5 mM MgCl2), løsningen ble oppbevart i mørke og ble filtrert umiddelbart før bruk. Etter passende farvefremkallelse (10-15 minutter) ble reaksjonen stanset ved at skiven ble skyllet i atskillige porsjoner destillert vann. De fremkalte skiver kan oppbevares etter tørking.

Skivene inneholdt 50 K. pneumoniae kapseltype.de referansestammer levert fra dr. George Kenney, University of Washington, Department of Pathobiology, Seattle, WA og American Type Culture Collection, 4 E. aerogenes kliniske blodisolater og 6 E. cloacae kliniske blodisolater (blodisolater levert fra Harborview Hospital, Seattle, WA). Entero-bacterisolatene ble typet (artsbestemt) under anvendelse av API 20E-systemet av 23 standardiserte, biokjemiske tester (API Analytab Products, Plainview, NY). Denne metode identifiserer gramnegative bakteriers slekt og art, men ikke serotypen. Derfor identifiseres Enterobacterne ikke som E. coli, S. marcescens og K. pneumoniae med hensyn til serotype, men kun med hensyn til slekt og art.

Ut fra disse forsøk ble 7D7-antistoffet iakttatt å ha ytterligere intergenus kryssreaktivitet. Dette antistoff reagerte med følgende serotyper:

Det humane monoklonale antistoff 7D7 ble således iakttatt å ha intergenus kryssreaktivitet overfor bakterier tilhørende artene E. coli, S. marcescens, K. pneumoniae, E. aerogenes, men ikke E. cloacae.

F. Karakterisering av monoklonale antistoffer

Den iakttagelse at det monoklonale antistoff kryss-reagerte med flere forskjellige bakterieslekter, ga formodning om at antistoffet var rettet mot et felles protein eller carbohydrat. Disse to molekylarter er blitt vist å svare for intragenus kryssreaksjoner (Mutharia, L. og Hancock, R.E.W., "Characterization of Two Surface-Localized Antigenic Sites on Porin Protein F of Pseudomonas aeruginosa", Canadian J. of Microbiol., 31:381-386 (1985) og Orskov, F. og Orskov, I., "Serotyping of Escherichia Coli", i Methods in Microbiology, vol. 14, Bergan, T.,red. Academic Press, Orlando, FL, 43-112

(1984)).

Biokjemisk karakterisering av de molekyltyper som gjenkjennes av 7D7-antistoffet, ble utført ved immunavtrykksanalyse. I korte trekk ble vaskede bakterier fra en 20 ml sub-stratkultur som hadde stått natten over (for E. coli, S. marcescens og E. aerogenes serotyper) eller fra plater dyrket natten over ( K. pneumoniae), ekstrahert i 1,0 ml av en oppløs-ning inneholdende 64 ml 50 mM Tris pH 7,6, 30 ml glycerol, 0,3 g deoxycholat (natriumsalt), 0,14 ml beta-mercaptoethanol og 6 ml avionisert vann (Schechter, I. og Block, K., "Solubilization and Purification of trans-Formesyl Pyro-phasphateSqualene Synthetase", J. Biol. Chem.,246:7690-7696,

(1971)). Etter 18 timers inkubering ved 4 °C ble suspensjonen sentrifugert ved 10.000 x g i 10 minutter. Supernatanten ble fjernet, og proteinet ble bestemt kvantativt ved anvendelse av "BioRad" proteinanalyse (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Mellom 100 og 1000 ng protein (varierer for hver bakterie-ekstrakt) fra hver bakterie ble underkastet natriumdodecyl sulfat (SDS) - polyacrylamidgelelektroforese (Kusecek, B., et al., "Lipopolysaccharide, Capsule, and fimbriae as Virulence Factors Among 01, 07, 016, 018 or 075 and Kl, K5 or K100 Escherichia coli", Infection and Immunity, 43:368-379 (1984)). Separerte molekyltyper ble overført fra gelen til en nitro-cellulosemembran (NCM) som beskrevet i (Towbin, H., et al., "Electrophoretic Transfer of Proteins From Polyacrylamide Gels to Nitrocellulose Sheets: Procedure and Some Applications", Proe. Nati. Acad. Sei., 76:4350-4354 (1979)), og NCM-avtrykket ble blokkert i 1 time i PBS-Tween<®> (Batteiger, B, et al., "The Use of Tween 20 as a Blocking Agent in the Immunological Detection of Proteins transferred to Nitrocellulose Membranes", J. Immunol. Meth. 55:297-307 (1982)). Avtrykket ble inkubert ved ST i 1 time i 10 ml brukt kultursupernatant fra 7D7-linjen. Etter fire 5 minutters skyllinger i PBS-Tween<® >ble avtrykket inkubert i geite-anti-humant lg konjugert til alkalisk fosfatase og ble fremkalt som tidligere beskrevet for bakterienitrocelluloseskiveanalysen. Positive reaksjoner ble observert i alle spor som inneholdt deoxycholatekstrakter av de her beskrevne bakterier. I disse spor viste 7D7-antistoffet seg å gjenkjenne en rekke molekylentiteter i regelmessig avstand som ga et stigelignende mønster på immunavtrykket. Denne profil stemte fullstendig overens med den som ses ved polyacrylamidgelelektroforetisk analyse av LPS i nærvær av SDS, hvor det er blitt påvist at den heterogene størrelsesprofil som utvises av båndene, skyldes en populasjon av LPS-molekyler som avviker i vektsprang svarende til antall av O-antigeniske oligosaccharid-sidekjedeenheter som er til stede pr. molekyl (Pavla, E.T. og Makela, P.H., "Lipopolysaccharide Hetero-geneity in Salmonella typhimurium Analysed by Sodium Dodecyl Sulfate/Polyacrylamide Gel Electrophoresis", Eur. J. Biochem., 107:137-143 (1980) og Goldman, R.C. og Leive, L., "Hetero-geneity of Antigenic-Side-Chain Length in Lipopolysaccharide from Escherichia coli 0111 and Salmonella typhimurium LT2, Eur. J. Biochem., 107:143-154 (1980)). Disse data indikerer at det monoklonale antistoff 7D7 er rettet mot en antigenisk determinant som er felles for de LPS-molekyler som finnes på enkelte serotyper av E. coli, S. marcescens, K. pneumoniae og E. aerogenes.

For ytterligere å definere den molekylære natur av antigenet ble deoxycholatekstratene før elektroforese behandlet med det proteolytiske enzym Proteinase K (Eberling W.,

et al., "Proteinase K from Tritirachium album Limber", Eur.

J. Biochem. 47:91-97 (1974)). For å fremstille denne prøve ble 10 pg Proteinase K tilsatt til 50 ug prøveprotein, og bland-ingen ble oppvarmet til 65 °C i 60 minutter. Prøvene ble underkastet elektroforese og immunavtrykk som her beskrevet. Immunavtrykksmønsterne som ble iakttatt etter Proteinase K-behandling, var identiske med de mønstre som ble iakttatt uten behandling, hvilket gir formodning om at antigenet, som er reaktivt med 7D7-antistoffet, ikke har proteinnatur.

For spesifikt å få rede på om 7D7 reagerte med en carbohydratepitop, ble den elektrooverførte deoxycholatprøve underkastet mild perjodatoxydasjon fOr nitrocellulosepapiret ble omsatt med antistoff. Denne reaksjon ble vist å ødelegge carbohydratdeterminanter og dermed deres etterfølgende reaktivitet med antistoff uten å forandre protein- eller lipid-epitoper (Woodward, M.P., et al., "Detection of Monoclonal Antiboides Specific for Carbohydrate Epitopes Using Periodate Oxidation", J. of Immunol. Methods, 78:143-153 (1985)). I korte trekk ble det elektroavtrykte nitrocellulosepapir som inneholdt den elektroforesebehandlede prøve, blokkert med PBS-Tween<®> som her beskrevet, hvoretter papir ble skyllet med 50 mM eddiksyre-natriumacetatpuffer, pH 4,5. Nitrocellulosepapiret ble inkubert i 60 minutter i mørke ved ST i 50 mM per-jodsyre oppløst i eddiksyrepufferen. Det behandlede papir ble skyllet tre ganger i PBS-Tween<®> og ble omsatt med antistoffet som her beskrevet. Elektroavtrykte deoxycholatekstrakter som var behandlet på denne måte, var ikke lenger reaktive med det monoklonale antistoff 7D7. Disse data indikerer sterkt at epitopen som gjenkjennes med dette antistoff, er et carbohydrat som forefinnes på LPS-molekylet hos de her beskrevne bakterier.

Isotypen av det monoklonale antistoff 7D7 ble bestemt ved en ELISA-prosedyre lik de spesifisitetstester som er beskrevet ovenfor, bortsett fra at det ble anvendt biotinylert geite-anti-humant IgG (gammakjedespesifikt, TAGO) eller biotinylert geite-anti-humant IgM (my-kjedespesifikt, TAGO) som reagens i det andre trinn istedenfor det mer bredt reaktive biotinylerte geite-anti-humant lg. Begge reagenser ble anvendt i en 1:500 fortynning, og antigenplaten inneholdt an-samlinger av PLL-immobiliserte E. coli 08 og 075 stammer. Positiv reaksjon av det monoklonale antistoff 7D7 med E. coli-stammene ble iakttatt bare med anti-IgM-reagenset, hvilket viser en IgM isotype for det monoklonale antistoff. Som fagmannen ville kunne forstå, ville man, hvis ovenstående frem-gangsmåte ble gjentatt flere ganger, og isotypene av de således oppnådde intergenus kryssreaktive monoklonale antistoffer ble bestemt, finne ytterligere, f.eks. IgM og IgG isotyper (Frosch, M., et al., "NZB Mouse System for Production of Monoclonal Antibodies to Weak Bacterial Antigens: Isolation of an IgG Antibody to the Polysaccharide Capsules of Escherichia coli Kl and Grop Meningocci", Proe. Nati. Acad. Sei., 82:1194-1198 (1985)).

G. In vitro- aktivitet

Funksjonell aktivitet in vitro av det monoklonale antistoff 7D7 ble undersøkt ved en in vitro opsonofagocytose-analyse som sammenlignet antistoffets baktericide aktivitet i nærvær og fravær av både humane neutrofiler og humant komplement.

Bakterier ble fremstilt enten ved inokulering av

10 ml tryptisk soyasubstrat (TSB) med 50 ul av en substrat-kultur (for E. coli, S. marcescens og E. aerogenes) som hadde stått over natten, eller for K. pneumoniae, ved strykning av en petriskål inneholdende "Worfel-Ferguson Agar". Til sub-stratkulturer ble rørene inkubert ved 37 "C på et risteanlegg i 3 timer, på hvilket tidspunkt 1,5 ml av kulturen ble sentrifugert i 1 minutt ved 10.000 x g, de brukte kulturmedier ble kassert, og pelleten ble suspendert i 3,5 ml Hanks avbalan-serte saltløsning inneholdende 0,1% gelatin og 5 mM HEPES (HBSS/gel). For de agarplatedyrkede bakteriers vedkommende ble koloniene skrapet av platen og overført til steril HBSS/gel. Bakterie konsentrasjonene ble justert for bakterier dyrket under begge betingelser til -3 x 103 bakterier/ml ved måling av 0.D. 660 og fremstilling av passende fortynninger (ca. 1:50.000). Humane neutrofiler ble isolert i henhold til van Furth og Van Zwet ("In Vitro Determination of Phagocytosis and Introcellular Killing by Polymorphonuclear and Mononuclear

Phagocytes", i Handbook of Experimental Immunology, vol. 2, D.M. Weir,red., 2. utgave, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 36.1-36.24 (1973)) med flere modifikasjoner. Gulbrune lag fra 10 ml heparinisert blod ble underlagt med "Ficoll-Pague" og ble sentrifugert. Pelleten av røde blodlegemer (RBC) ble vasket en gang med RPMI 1640 medium og ble resuspendert i like stort volum av 37 °C PBS. 3 ml av denne suspensjon ble tilsatt til 6 ml 2 % dextran (i 37 °C PBS), og innholdet ble blandet forsiktig, men grundig ved å snu beholderen opp og ned. Etter 20 minutters inkubering ved 37 °C for å gi RBC anledning til å sedimentere, ble supernatanten fjernet (inneholdende neutrofiler), ble vasket to ganger i PBS ved 4 °C, en gang i HBSS/gel og ble suspendert i det samme til 5 x IO<7 >neutrofiler/ml. For komplementkildens vedkommende som ble anvendt i forbindelse med E. coli og S. marcescens, ble humant serum adsorbert to ganger med levende bakterieansamlinger (Bjornson, A.B. og Michael, J.G., "Factors in Human Serum Promoting Phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa I. Interaction of Opsonins with the Bacterium", J. of Inf. Dis., 130-Suppl:S119-S126 (1974)), svarende til de organismer som ble anvendt ved analysen. Dette serum ble ytterligere adsorbert med kokt "Zymosan" (Bjornson, supra) for å fjerne serumkompo-nenten properidin, et molekyl som er nødvendig for aktivering av den alternative komplementbane. Til opsonofagocyttiske analyser under anvendelse av K. pneumoniae og E. aerogenes var komplementkilden uadsorbert normalt humant serum anvendt i en sluttkonsentrasjon på 1 %.

Plater anvendt til kvantitativ bestemmelse av antallet av overlevende/ødelagte bakterier ble fremstilt idet 24 brønnsplater først ble oppvarmet til 37 °C i 3-5 timer. En 0,4 % oppløsning av agarose i TSB ble fremstilt ved å auto-klavere bland ingen i 5 minutter og la den avkjøle til 50 °C i et vannbad. Ca. 15 minutter før avslutning av den endelige inkuberingsperiode ved opsonofagocytoseanalysen ble en 24 brønnsplate fjernet fra inkubatoren på 37 °C, ble anbragt på en 42 °C varm plate, og 0,4 ml TSB/agarose ble tilsatt til hver brønn. Platen ble straks satt tilbake i inkubatoren på 37 °C slik at agarosen aldri ble avkjølt under 37 °C.

Til analysen ble tilsatt 25 pl 7D7 kultursupernatant og 25 pl av en passende bakteriestamme til 96 brønns rundbunnede mikrotiterplater som ble dobbeltbestemt og inkubert ved ST i 30 minutter. Dette ble etterfulgt av tilsetning av 15 pl humant komplement, 15 pl humane neutrofiler (5 x 10<6>/ml) og 70 pl HBSS/gel. Hele platens overflate ble avtørket med en steril bomullstampong, en klebende formstoffplatelukkeanord-ning ble anbragt slik at den sikkert dekket hele platen og områdene mellom brønnene og platen ble rotert ved 37 °C i 1 time. Etter inkubering ble platen sentrifugert ved 100 x g i

5 minutter, platelukkeanordningen ble fjernet forsiktig, og plateoverflaten ble tørket med en steril bomullstampong dyppet i 70 % ethanol. 50 mikroliter ble fjernet fra hver mikrotiter-brønn og ble tilsatt til individuelle brønner i 24 brønns-platene for kvantitativ bestemmelse, som allerede inneholdt 0,4 m/brønn smeltet (38 °-40 °C) 0,4 % TSB/agarose. Disse plater ble anbragt på en risteanordning med horisontal stil-ling i 1 minutt ved 150 opm, og agarosen fikk størkne ved ST i 15 minutter. Til slutt ble det tilsatt et 0,4 ml TSB/agarose-overlag til hver brønn etterfulgt av en størkningsperiode på 15 minutter ved 4 °C før platene ble inkubert over natten ved 37 °C. Etter 18 timer ble antallet av kolonier tellet, og de registrerte data ble rapportert som kolonidannende enheter (CFU) for hvert sett av betingelser.

De her anvendte bakterieserotyper ble, bortsett fra K. pneumoniae, bare inaktivert i nærvær av monoklonalt antistoff 7D7, en aktiv komplementkilde og humane neutrofiler (tabell 1). Når dette forsøk ble gjentatt med flere ikke-7D7 reaktive bakterieserotyper, ble det ikke iakttatt noen bakteriedestruksjon (data ikke vist), hvilket viser det monoklonale antistoff 7D7's funksjonelle spesifisitet og dets kapasitet til å opsonisere bakterier og fremme deres fagocytose. Da de kombinerte virkninger av opsoniner (spesifikke antistoffer) og polymorfonukleære leukocytter (neutrofiler) viste seg å være den primære mekanisme for immunitet overfor disse bakteriestammer, ga disse data formodning om at antistoff 7D7 etter passende administrering ville gi beskyttelse overfor letal smitte med de her beskrevne bakterieserotyper.

Eksempel II

Dette eksempel viser fremgangsmåter for fremstilling og utvelgelse av et humant monoklonalt antistoff som er i besittelse av intergenus kryssreaktivitet overfor medlemmer av artene Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae og Enterobacter aerogenes. Dette eksempel viser dessuten antistoffets opsoniske aktivitet in vitro overfor homologe S. marcescens, K. pneumoniae og E. aerogenes serotyper. Fremgangsmåten ifølge eksempel I (i det vesentlige som beskrevet i del A til G) ble gjentatt for fremstilling av et humant monoklonalt antistoff som var kryssreaktive overfor de her beskrevne bakteriearter, bortsett fra at det var nødvendig å foreta spesifikke modifikasjoner for å karakterisere og analysere det i foreliggende eksempel beskrevne antistoff. Det etterfølgende er endringer i analyseprosedyrer og de med det her beskrevne monoklonale antistoff oppnådde resultater. 1. Kultursupernatanter fra seks transformasjoner ble analysert ved hjelp av ovenstående metode, hvilket resulterte i identifisering av en brønn (4F10) som hadde aktivitet på S. marcescens serotypeplaten, men ikke på E. coli eller kontrollplaten. Det ble ved etterfølgende ELISA med individuelle S. marcescens serotyper bestemt at denne brønn inneholdt antistoff som var reaktivt med S. marcescens serotypene 015 og 018, men ikke noen annen av de tyve kjente S. marcescens LPS serotyper.

Før innlevering av foreliggende søknad ble den kontinuerlig transformerte humane cellelinje som er identifisert som 4F10, deponert ved American Type Culture Collection, Rockville. MD. som A.T.C.C. nr. CRL 9007. 2. Antistoff fra den klonede 4F10 cellelinje ble analysert for ytterligere intergenus kryssreaktivitet ved en modifikasjon av standard immunavtrykksteknikken. Spesielt ble kryssreaktiviteten overfor bakteriene K. pneumoniae, E. aerogenes og E. cloacae undersøkt ved anbringelse av bakterier som pletter på en nitrocellulosepapirskive med gitter, omsetning av den bakterieholdige skive med antistoffet og fremkallelse av antistoffreaksjonene med et alkalisk fosfatase/nitro-bluetetrazoliumenzymsystem.

Ut fra disse forsøk ble 4F10-antistoffet observert å ha ytterligere intergenus kryssreaktivitet. Dette antistoff reagerte med følgende serotyper:

Det humane monoklonale antistoff 4F10 hadde således intergenus kryssreaktivitet overfor bakterier tilhørende artene S. marcescens, K. pneumoniae, E. aerogenes. 3. Ved anvendelse av immunavtrykksteknikken ble positive reaksjoner observert i alle spor som inneholdt deoxycholatekstrakter av de her beskrevne bakterier. I disse spor viste 4F10-antistoffet seg å gjenkjenne enten et bredt bånd av komponenter eller en rekke molekylære entiteter i regelmessig avstand, som ga anledning til et stigelignende mønster. Denne profil stemte helt overens med den som iakttas ved polyacryl-amidgelelektroforetiske analyser av carbohydratdeler som enten viser omfattende molekylvektsheterogenitet på grunn av en ofte gjentatt spesifikk sukkersekvens, eller på grunn av LPS-molekyler som avviker ved vektsprang som svarer til antallet av 0-antigeniske oligosaccharid-sidekjedeenheter pr. molekyl (Vimr. E.R., et al., "Use of Procaryotic-Derived Probes to Identify Poly (Sialic Acid) in Neonatal Neuronal Membranes", Proe. Nati. Acad. Sei., (1983) 81:1971-1975; og Holden, K.G., et al., "Gel Electrophoresis of Mucous Glycoproteins, I. Effeet of Gel Porosity", Biochemistry (1971) 10:3105-3109). Disse data indikerer at det monoklonale antistoff 4F10 er rettet mot en antigenisk determinant som er felles for carbohydratmolekyler som finnes på enkelte serotyper av S. marcescens, K. pneumoniae og E. aerogenes.

Iakttatte immunavtrykksmønstre etter behandling med Proteinase K var identiske med de mønstre som ble iakttatt uten behandling, og gir således formodning om at antigenet, som er reaktivt med 4F10-antistoffet, ikke er av proteinnatur.

For spesifikt å få rede på om 4F10 reagerte med carbohydratepitop ble den elektrooverførte deoxycholatprøve underkastet mild perjodatoxydasjon før omsetning av nitrocellulosepapir med antistoff. Elektroavtrykte deoxycholatekstrakter behandlet på denne måte, var ikke lenger reaktive med det monoklonale antistoff 4F10. Disse data indikerer sterkt at den epitop som gjenkjennes av dette antistoff, er en carbohydratdel som forefinnes på molekyler som de her beskrevne bakterier er i besittelse av.

4. Isotypen av det monoklonale antistoff 4F10 ble bestemt

ved en ELISA-prosedyre med de i eksempel I beskrevne spesifisitet stester, bortsett fra at antigenplaten inneholdt en ansamling av PLL-immobiliserte S. marcescens 015 og 018 serotyper. Positiv reaksjon av det 4F10 monoklonale antistoff med 5. marcescens serotypene ble bare iakttatt med anti-IgM-reagenset, hvilket viser en IgM isotype for det monoklonale antistoff. Fagmannen vil kunne forstå at hvis fremgangsmåten ifølge dette eksempel ble gjentatt flere ganger, og isotypene av således oppnådde intergenus kryssreaktive monoklonale antistoffer ble bestemt, ville man finne ytterligere isotyper, f.eks. IgM og IgG isotyper.

5. In vitro funksjonell aktivitet av det monoklonale

antistoff 4F10 ble undersøkt ved en opsonofagocyttisk analyse som sammenlignet antistoffets baktericide aktivitet i nærvær og fravær av både humane neutrofiler og humant komplement.

De her anvendte bakterieserotyper ble inaktivert bare i nærvær av monoklonalt antistoff 4F10, en aktiv komplementkilde og humane neutrofiler (tabell 3). Når dette forsøk ble gjentatt med flere ikke-4F10 reaktive bakterieserotyper, ble det ikke observert noen bakteriedestruksjon (data ikke vist), hvilket viser den funksjonelle spesifisitet av monoklonalt antistoff 4F10 og dets kapasitet til å opsonisere bakterier og fremme deres fagocytose.

Eksempel III

Dette eksempel viser fremgangsmåter for fremstilling av et humant monoklonalt antistoff som er reaktivt med både

Escherichia coli kapseltype Kl og Neisseria meningitidis ( N. meningitidis) gruppe B polysaccharid. Fremgangsmåten i eksempel I (hovedsakelig beskrevet i del A til G) ble gjentatt for fremstilling av et humant monoklonalt antistoff som var kryssreaktive overfor de her beskrevne bakterier, bortsett fra at det var nødvendig å foreta spesifikke modifikasjoner for å karakterisere og analysere det antistoff som er beskrevet i dette eksempel. Det etterfølgende er endringer i analyseprosedyrer og resultater oppnådd med det her beskrevne monoklonale antistoff. 1. Kultursupernatanter fra fem transformasjoner ble analysert ved hjelp av ovenstående metode, hvilket resulterte i identifikasjon av fire brønner (5D4, 2C10, 9B10 og 8A8) som inneholdt anti-E. coli-spesifisitet på E. coli serotypeplaten, men ikke på S. marcescens eller kontrollplatene. Det ble bestemt ved etterfølgende ELISA utført som anført på individuelle E. coli serotyper, at disse brønner inneholdt antistoff som var reaktivt med minst E. coli serotypene: 01 (ATCC 23499), 07:K1 (ATCC 12792), 016:K1 (ATCC 23511) og 050 (CDC 1113-83), men ikke 04 (ATCC 12792), 06:K2 (ATCC 19138), 08:K8 (ATCC 23501), 09:K9 (ATCC 23505) eller 022:K13 (ATCC 23517). På grunn av deres bedre egenskaper under kloningsprosedyren og øket antistoffproduksjon ble det monoklonale antistoff 9B10 utvalgt for ytterligere analyse.

Før innlevering av foreliggende søknad ble en kontinuerlig transformert human cellelinje, som her identifisert som 9B10, deponert ved American Type Culture Collection, Rockville, MD, som A.T.C.C. nr. CRL 9006. 2. Det resultat at de monoklonale antistoffer fra hver av klonene reagerte med den identiske gruppe av E. coli 0-anti-genserotyper, indikerte at disse antistoffer var rettet mot en bakterieoverflatestruktur som er felles for disse serotyper. Adskillige metoder ble anvendt for å definere den overflate-struktur som er felles for disse E. coli serotyper. Som angitt, hadde to (07:Kl og 016:Kl) av de fire E. coli serotyper som ble identifisert med 9B10-antistoffet, Kl kapselserotype, mens de to andre (01 og 050) ikke var blitt typebestemt etter deres K-antigenserotype. Man forfulgte derfor den mulighet at 9B10-antistoffet inneholdt reaktivitet overfor Kl-antigenet, og at de E. coli-stammer som hadde O-antigenserotypene 01 og 050, også hadde Kl-kapselserotypen.

Andre har gjort bruk av Kl-kapselens termolabilitet til å fastslå dens tilstedeværelse. Oppvarming av Kl positive E. coli serotyper i et kokende vannbad på 100 °C i 60 minutter fjerner disse stammers etterfølgende evne til å reagere med anti-Kl sera og forsterker deres evne til å reagere med anti-0 antigensera (Orskov, F. og Orskov, I., "Serotyping of Escherichia coli", i Methods in Microbiology, vol. 14, T. Bergan, red., Academic Press, London (1984), side 44-105). De resiproke virkninger av kokning skyldes sannsynligvis fjerning av kapselen og den økede tilgjengelighet av antistoff for lipopolysaccharid (LPS) molekyler. De E. coli Kl positive serotyper (07 og 016) og de ikke-Kl typebestemte serotyper (01 og 050) ble oppvarmet som angitt og omsatt med 9B10 antistoffet og LPS serotypespesifikke heterologe sera (Difco Bacto-A. coli typebestemmelsesreagenser) ved ELISA-prosedyren. Varmebehandlede organismer mistet all reaktivitet overfor 9B10 antistoffet, og deres reaktivitet med deres homologe LPS sero-typespesif ikke sera ble forøket, mens ikke-behandlede

(kontroll) organismer forble sterkt reaktive med 9B10 kultursupernatanter og dårlig reaktive med deres respektive LPS serotypespesifikke antisera.

Polysaccharidet (carbohydrat) fra Neisseria meningitidis gruppe B bakterier (en homopolymer av sialsyre, alfa 2, 8-bundet-poly-N-acetylneuraminsyre) er blitt vist å være kjemisk og antigenisk homogent med E. coli Kl polysaccharidet (Grados, 0. og Ewing, W.H., "Antigenic Relationship between Escherichia coli og Neisseria meningitidis", J. Immunol.

(1973) 110:262-268). Disse data gir formodning om at hvis det monoklonale 9B10 antistoff inneholder spesifisitet for E. coli Kl kapsel, skulle antistoffet også inneholde spesifisitet for N. meningitidis gruppe B polysaccharid, og ytterligere at monoklonale antistoffer som inneholder spesifisitet for gruppe B polysaccharidet av N. meningitidis, også skulle vise reaktivitet overfor E. coli-stammer med Kl-kapselen. To forsøks-prosedyrer ble anvendt som test for (1) 9B10 antistoffets evne til å reagere med N. meningitidis og (2) evnen hos et antistoff overfor N. meningitidis gruppe B polysaccharid til å reagere med de fire E. coli 9B10 reaktive serotyper. Sterkt renset gruppe B polysaccharid (Connaught Laboratories, Toronto, Canada) og levedyktige N. meningitidis gruppe B bakterier ble omsatt med 9B10 antistoffet ved en ELISA som ovenfor angitt. Det monoklonale 9B10 antistoff reagerte sterkt med begge antigenpreparater. For å vise den motsatte spesifisitet ble det anvendt et i handelen tilgjengelig N. meningitidis gruppe B meningitistestsett ( "Directagen" Direct Antigen Detection System, Hynson, Westcott, and Dunning, Baltimore, MD), som anvender latexkuler overtrukket med et monoklonalt murinantistoff mot gruppe B polysaccharidet. Ved agglutineringsanalyser under anvendelse av de 9B10 positive E. coli serotyper viste alle fire serotyper sterk reaktivitet med de antistoffbelagte kuler. E. coli serotyper som ble vist å være Kl antigennegative, var også negative i dette testsystem. Tilsammen indikerer disse data at det monoklonale 9B10 antistoff er reaktivt med E. coli Kl-kapselen og det typespesifikke carbohydrat på N. meningitidis gruppe B. Da mange av disse analyser ble utført med intakte, levedyktige bakterier, kan det ytterligere utledes at monoklonalt antistoff 9B10 er spesifikt for en del av et utvendig eksponert område av polysialsyremolekylet. 3. Isotypen av det monoklonale 9B10 antistoff ble bestemt ved en ELISA-prosedyre i likhet med de i eksempel I beskrevne spesifisitetstester, bortsett fra at antigenplaten inneholdt en ansamling av PLL immobiliserte E. coli Kl positive serotyper. Positiv reaksjon av det monoklonale 9B10 antistoff med de Kl positive E. coli serotyper ble bare iakttatt med anti-IgM-reagenset, hvilket viser en IgM isotype for det monoklonale antistoff. Fagmannen vil kunne forstå at hvis fremgangsmåten i dette eksempel ble gjentatt flere ganger, og isotypene av således oppnådde Kl spesifikke monoklonale antistoffer ble bestemt, ville man finne ytterligere isotyper,

f.eks. IgM og IgG isotyper.

4. In vitro funksjonell aktivitet av det monoklonale 9B10 antistoff ble undersøkt ved en opsonofagocyttisk analyse som sammenlignet antistoffets baktericide aktivitet i nærvær og fravær av både humane neutrofiler og humant komplement.

Kl positive E. coli serotyper ble inaktivert bare i nærvær av monoklonalt antistoff 9B10, en aktiv komplementkilde og humane neutrofiler (tabell 4). Når dette forsøk ble gjentatt med flere Kl negative E. coli serotyper, ble det ikke iakttatt noen bakteriedestruksjon (data ikke vist), hvilket viser det monoklonale antistoff 9B10's Kl spesifisitet og dets kapasitet til å opsonisere bakterier og fremme deres fagocytose. Da den kombinerte virkning av opsoniner (spesifikke antistoffer) og polymorfonukleære leukocytter (neutrofiler) viste seg å være den primære mekanisme for immunitet for Kl positive E. coli serotyper, ga disse data formodning om at antistoff 9B10 etter passende administrering vil gi beskyttelse mot en letal smitte med eventuelle E. coli Kl innkapslede serotyper, uansett O-antigenserotypen.

Eksempel IV

Dette eksempel viser fremgangsmåter for fremstilling av et humant monoklonalt antistoff som har intergenus kryssreaktivitet overfor medlemmer av artene Escherichia coli ( E. coli ), EnteroJbacter cloacae (E. cloacae) og gruppe B Streptococcus. Dette eksempel viser dessuten en antistoff kryssreaktivitet med arter tilhørende de to hovedbakterie-grupper gramnegative (E. coli og E. cloacae) og grampositive (gruppe B Streptococcus). Fremgangsmåten i eksempel I (i det vesentlige beskrevet i del A til G) ble gjentatt for fremstilling av et humant monoklonalt antistoff som var kryssreaktive overfor de her beskrevne bakterier, bortsett fra at det var nødvendig å foreta spesifikke modifikasjoner for å karakterisere og analysere det antistoff som er beskrevet i dette eksempel. Det etterfølgende er endringer i analyseprosedyrer og resultater erholdt med det her beskrevne monoklonale antistoff. 1. Supernatanter ble screenet med hensyn til tilstedeværelse av anti-gruppe B Streptococcus antistoffer ved anvendelse av en enzymkjedet immunosorbentanalyseteknikk (ELISA) som beskrevet i eksempel I. Antigenplatene besto av en rekke flatbunnede 96 brønns "Immunolon 2" mikrotiterplater hvis brønner inneholdt blandinger av gruppe B Streptococci kapseltyper fiksert til brønnenes overflater med poly-L-lysin (PLL). Blant forskjellige antigenplater anvendt ved screeningen, var: (1) en blanding av gruppe B Streptococcus typer Ia (A.T.C.C. nr.

12400), Ib (A.T.C.C. nr. 12401), Ic (A.T.C.C. nr. 27591); (2) en blanding av II (A.T.C.C. nr. 12973), og III (klinisk isolat erholdt fra dr. C. Wilson, Children's Orthopedic Hospital, Dept. Infectious Disease, Seattle, WA); og (3) en mikrotiterplate uten bakterier.

Kultursupernatanter fra to transformasjoner ble analysert ved hjelp av den ovenfor angitte metode, hvilket resulterte i identifikasjon av en brønn (4B9) som hadde aktivitet på begge gruppe B Streptococcus typebestemmelses-plater, men ikke kontrollplatene. Ved etterfølgende ELISA med individuelle gruppe B Streptococcus-typer, ble det bestemt at denne brønn inneholdt antistoff som var reaktivt med alle fem referansetypebestemmelsesstammer.

Ved dette forsøk ble det således oppnådd en klonet transformert human cellelinje som er kontinuerlig (udødelig) og utskiller et humant monoklonalt antistoff til en determinant på overflaten av de anførte gruppe B Streptococcus-typer.

Den som 4B9 indentifiserte, kontinuerlig transformerte humane cellelinje ble før innlevering av foreliggende søknad deponert ved American Type Culture Collection, Rockville, MD, som A.T.C.C. nr. CRL 9008. 2. Antistoff fra den klonede 4B9 cellelinje ble analysert med hensyn til kryssreaktivitet overfor gramnegative og grampositive bakterier ved en modifikasjon av standardimmuno-avtrykksteknikken. Spesielt ble kryssreaktivitet overfor bakteriene E. coli, K. pneumoniae, S. marcescens, E. aerogenes, E. cloacae, Hemophilus influenzae og Staphylococcus aureus undersøkt ved anbringelse av bakterier som pletter på en nitrocellulosepapirskive med gitter, omsetning av den bakterieholdige skive med antistoffet, og fremkallelse av antistoff reaksjonene med et alkalisk fosfatase/nitrobluetetra-zoliumenzymsystem (som beskrevet i eksempel I).

Ut fra disse forsøk ble 4B9-antistoffet iakttatt å ha kryssreaktivitet med spesielle gramnegative bakteriearter. Dette antistoff reagerte med E. coli LPS serotypene 04, 07, 018 og 025 og de kliniske E. cloacae isolater. Det humane monoklonale antistoff 4B9 har således intergenus kryssreaktivitet mellom de gramnegative og grampositive bakterier som tilhører artene E. coli, E. cloacae og gruppe B. Streptococcus. 3. Det resultat at det monoklonale antistoff kryss-reagerte med flere forskjellige bakterieslekter tilhørende både gramnegative og grampositive bakteriegrupper, ga en indikasjon på at antistoffet var rettet mot et felles protein eller carbohydrat. Den biokjemiske karakterisering av de molekyl typer som ble gjenkjent med 4B9-antistoffet, ble utført ved immunavtrykksanalyse. For analyse av de gramnegative slekter ble vaskede bakterier ekstrahert i deoxycholat som beskrevet i eksempel I. For de grampositive bakteriers vedkommende ble 1,0 1 bakterier dyrket i 6 timer i modifisert "Todd-Hewitt" substrat (Difco, "Todd-Hewitt" substrat inneholdende 2,8 g/l vannfritt natriumfosfat, pH 7,8) ved 37 °C, høstet ved sentrifugering og vasket tre ganger i PBS. Bakteriene ble resuspendert i 85 ml protoplastmedium (40 vekt/vol% saccharose i 0,03 M kaliumfosfatpuffer, pH 6,8, inneholdende 10 mM MgCl2), og suspensjonen ble oppvarmet til 37 °C i 10 minutter. Ca. 3000 enheter av mutanolysinet (SIGMA) ble tilsatt, og bland-ingen ble rystet ved 37 °C i 90 minutter eller inntil suspen-sjons 0D660 var redusert med over 90 %. Det nedbrutte materiale ble sentrifugert ved 2000 x g i 15 minutter ved ST, og supernatanten ble dialysert overfor PBS i 48 timer (Young, M.K. og Mattingly, S.J., "Biosynthesis of Cell Wall Peptidoglycan and Polysaccharide Antigens by Protoplasts of Type III Group B Streptococcus", J. Bact., (1983) 154:211-220). Dialysatet ble konsentrert til den tidoble konsentrasjon ved positiv trykk-dialyse gjennom et "PM-10" filter (Amicon Corp., Danvers, MA).

Carbohydrater som bindes til hvetekimagglutinin, ble renset ved affinitetskromatografi på en hvetekimlectin Sepharose<®> 6MB søyle (SIGMA). Det bundne nedbrytningsprodukt som her beskrevet, ble eluert fra søylen med 10 ml 0,1 M Nacetylglucosamin, og eluatet ble dialysert overfor destillert vann ved 4 °C. Det affinitetsrensede eluat ble tørket ved lyofilisering, og den tørre vekt av det resulterende materiale ble oppnådd (Gray, B.M., et al., "Interaction of Group B Streptococcal Type-Specific Polysaccharides with Wheat Germ Agglutinin and Other Lectins", J. or Immunol. Meth., (1984)

72:269-277). Positive reaksjoner ble observert i alle spor som inneholdt deoxycholatekstrakter av de her beskrevne bakterier. I de spor som inneholdt ekstrakter for gramnegative bakterier, viste 4B9-antistoffet seg å gjenkjenne en rekke molekylentiteter i regelmessig avstand, som ga anledning til etstige-lignende mønster på immunavtrykket. Denne profil stemte helt overens med den som ses ved polyacrylamidgelelektroforetisk analyse av LPS i nærvær av SDS, hvor det er blitt påvist at den heterogene størrelsesprofil som utvises av båndene, skyldes en populasjon av LPS molekyler som avviker fra hverandre ved vektsprang som svarer til antallet av O-antigeniske oligosaccharid-sidekjedeenheter som forefinnes pr. molekyl (Pavla, E.T. og Makela, P.H., supra og Goldman, R.D. og Leive, L., supra). I de spor som inneholder ekstrakter fra gruppe B Streptococcus-typene, viste 4B9-antistoffet seg å gjenkjenne komponenter som forefinnes på et bredt bånd. Denne profil stemte overens med den som ses ved polyacrylamidgelelektroforetisk analyse av carbohydratgrupper som viser omfattende molekylvektsheterogenitet med en hyppig gjentatt spesifikk sukkersekvens (Vmir, E.R. et al., supra og Holden, K.G., supra). Disse data indikerer at det monoklonale antistoff 4B9 er rettet mot en antigenisk determinant som er felles for molekyler som finnes på enkelte serotyper av E. coli, E. cloacae og gruppe B Streptococcus.

For ytterligere å definere den molekylære natur av antigenet ble deoxycholatekstraktene behandlet med proteolyt-isk enzym Proteinase K før elektroforese av disse (Eberling, W., supra). Immunavtrykksmønstrene iakttatt etter Proteinase K-behandling, var identisk med de mønstre som ble iakttatt uten behandling, og gir således en indikasjon på at antigenet, som er reaktivt med 4B9-antistoffet, ikke er av proteinnatur.

For spesifikt å klarlegge om 4B9 reagerte med en carbohydratepitop, ble elektrooverførte deoxycholat og hvetekimagglutineringsaffinitetsrensede prøver underkastet mild perjodatoxydasjon før nitrocellulosepapirets omsetning med antistoff (se eksempel I). Elektroavtrykte deoxycholatekstrakter som var behandlet på denne måte, var ikke lenger reaktive med det monoklonale 4B9 antistoff. Disse data indikerer sterkt at den epitop som gjenkjennes med dette antistoff, er en carbohydratgruppe som forefinnes i molekyler som både gramnegative og grampositive bakterier, som her beskrevet, er i besittelse av. 4. Det monoklonale 4B9 antistoffs isotype ble bestemt ved en ELISA-prosedyre i likhet med de spesifisitetstester som er beskrevet ovenfor, bortsett fra at antigenplaten inneholdt en ansamling av PLL immobiliserte gruppe B Streptococcus typer II og III. Positiv reaksjon av det monoklonale 4B9 antistoff med gruppe B Streptococcus-stammer ble iakttatt bare med anti-IgM-reagenset, hvilket viser en IgM isotype for det monoklonale antistoff. 5. Det monoklonale 4B9 antistoffs funksjonelle aktivitet in vitro ble undersøkt ved en opsonofagocyttisk analyse som sammenlignet antistoffets baktericide aktivitet i nærvær og fravær av både humane neutrofiler og humant komplement.

De her anvendte bakteriestammer ble inaktivert bare i nærvær av monoklonalt antistoff 4B9, en aktiv komplementkilde og humane neutrofiler (tabell 6). Når dette forsøk ble gjentatt med flere ikke-4B9 reaktive bakterieserotyper, ble det ikke iakttatt noen bakteriedestruksjon (data ikke vist), hvilket viser den funksjonelle spesifisitet av monoklonalt antistoff 4B9 og dets kapasitet til å opsonisere bakterier og fremme deres fagocytose.

Eksempel V

Dette eksempel viser fremgangsmåter for fremstilling og utvelgelse av et humant monoklonalt antistoff som utviser intergenus kryssreaktivitet overfor medlemmer av slektene Serratia marcescens, Klebslella pneumoniae og Enterobacter aerogenes. Dette eksempel viser dessuten den opsoniske aktivitet av antistoffet in vitro overfor homologe S. marcescens,

K. pneumoniae og E. aerogenes serotyper. Fremgangsmåten ifølge eksempel I (i det vesentlige som beskrevet i avsnitt A til G) ble gjentatt, bortsett fra at det var nødvendig å foreta spesifikke modifikasjoner for å karakterisere og analysere antistoffet beskrevet i dette eksempel. Det etterfølgende er endringer i analyseprosedyrer og resultater oppnådd med det her beskrevne monoklonale antistoff. 1. Kultursupernatanter fra fire transformasjoner ble analysert ved hjelp av ovenstående metode, hvilket resulterte i identifikasjon av en brønn (7E10) som var i besittelse av bindingsaktivitet på minst en av fire K. pneumoniae serotypeplater inneholdende kapselserotypene: 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 19, 20, 21, 24, 27, 31, 43, 44 og 55, men ikke på kontrollplaten (ingen bakterier). Antistoff fra 7E10 cellelinjen ble analysert for ytterligere intergenus kryssreaktivitet ved en modifikasjon av standard immunavtrykksteknikken. Spesielt ble kryssreaktivitet med bakteriene K. pneumoniae, E. aerogenes, S. marcescens, E. coli og P. aeruginosa undersøkt ved å an-bringe bakterier som pletter på en med gitter forsynt nitrocellulosepapirskive, omsette den bakterieholdige skive med antistoffet og fremkalle antistoffreaksjonene med et alkalisk fosfatase/nitrobluetetrazoliumenzymsystem.

Ut fra disse forsøk ble 7E10-antistoffet iakttatt å være i besittelse av ytterligere intergenus kryssreaktivitet. Dette antistoff reagerte med følgende arter og serotyper:.

Det humane monoklonale antistoff 7E10 var således i besittelse av intergenus kryssreaktivitet med bakterier til-hørende slektene K. pneumoniae, S. marcescens og E. aerogenes.

2. Isotypen av det monoklonale antistoff 7E10 ble bestemt ved en ELISA-prosedyre i likhet med de i eksempel I beskrevne spesifisitetstester, bortsett fra at antigenplaten inneholdt en ansamling av PLL (poly-L-lysin) immobiliserte K. pneumoniae K8 og Kil serotyper. Positiv reaksjon av det monoklonale antistoff 7E10 med K. pneumoniae serotypene ble bare iakttatt med anti-IgM-reagenset, hvilket viser en IgM isotype for det monoklonale antistoff. Fagmannen vil kunne forstå at hvis fremgangsmåten i dette eksempel ble gjentatt flere ganger, og isotypene av således erholdte intergenus kryssreaktive monoklonale antistoffer ble bestemt, ville man finne ytterligere isotyper, f.eks. IgM og .IgG isotyper. 3. Funksjonell aktivitet in vitro av det monoklonale antistoff 7E10 ble undersøkt ved en opsonofagocyttisk analyse, ved hvilken antistoffets baktericide aktivitet i nærvær og fravær av både humane neutrofiler og humant komplement ble sammenlignet. De her anvendte bakterieserotyper ble inaktivert bare i nærvær av monoklonalt antistoff 7E10, en aktiv komplementkilde og humane neutrofiler (tabell 8). Når dette forsøk ble gjentatt med serotyper som ikke er reaktive med antistoff 7E10, ble det ikke iakttatt noen bakteriedestruksjon (data ikke vist). Disse forsøk viste den funksjonelle spesifisitet av monoklonalt antistoff 7E10 samt dets kapasitet til å opsonisere bakterier og fremme deres fagocytose.

Eksempel VI

Dette eksempel viser fremgangsmåter for fremstilling og utvelgelse av et humant monoklonalt antistoff som er i besittelse av intergenus kryssreaktivitet overfor medlemmer av slektene Serratla marcescens og Klebsiella pneumoniae. Dette eksempel viser dessuten den opsoniske aktivitet av antistoffet in vitro overfor homologe S. marcescens og K. pneumoniae serotyper. Fremgangsmåten beskrevet i eksempel I (i det vesentlige som beskrevet i avsnitt A til G) ble gjentatt, bortsett fra at det var nødvendig å foreta spesifikke modifikasjoner for å karakterisere og analysere det antistoff som er beskrevet i dette eksempel. Det etterfølgende er endringer i analyseprosedyrer og resultater oppnådd med det her beskrevne monoklonale antistoff.

1. Kultursupernatanter fra fire transformasjoner ble analysert ved hjelp av ovenstående metode, hvilket resulterte i identifikasjon av en brønn (8C9) som utviste bindingsaktivitet på minst en av fire K. pneumoniae serotypeplater inneholdende kapselserotypene: 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 19, 20, 21, 24, 27, 31, 43, 44 og 55, men ikke på kontrollplaten (ingen bakterier). Antistoff fra 8C9 cellelinjen ble analysert med hensyn til ytterligere intergenus kryssreaktivitet ved en modifikasjon av standard immunavtrykksteknikken. Spesielt ble kryssreaktivitet overfor bakteriene K. pneumoniae, E. aerogenes, S. marcescens, E. coli og P. aeruginosa undersøkt ved anbringelse av bakterier som pletter på en med gitter forsynt nitrocellulosepapirskive, omsette den bakterieholdige skive med antistoffet og fremkalle antistoffreaksjonene med alkalisk fosfatase/nitrobluetetrazoliumenzymsystem.

Ut fra disse forsøk ble 8C9-antistoffet iakttatt å være i besittelse av ytterligere intergenus kryssreaktivitet. Dette antistoff reagerte med følgende arter og serotyper:

Det humane monoklonale antistoff 8C9 var således i besittelse av intergenus kryssreaktivitet med bakterier til-hørende slektene K. pneumoniae og S. marcescens. 2. Isotypen av det monoklonale antistoff 8C9 ble bestemt ved en ELISA-prosedyre i likhet med de i eksempel I beskrevne spesifisitetstester, bortsett fra at antigenplaten inneholdt en ansamling av PLL immobiliserte K. pneumoniae K14 og K27 serotyper. Positiv reaksjon av det monoklonale antistoff 8C9 med K. pneumoniae serotypene ble bare iakttatt med anti-IgM-reagenser, hvilket viser en IgM isotype for det monoklonale antistoff. Fagmannen vil kunne forstå at hvis fremgangsmåten i dette eksempel ble gjentatt flere ganger, og isotypene av de således erholdte intergenus kryssreaktive monoklonale antistoffer ble bestemt, ville man finne ytterligere isotyper, f.eks. IgM og IgG isotyper. 3. Funksjonell aktivitet av det monoklonale antistoff 8C9 in vitro ble undersøkt ved en opsonofagocyttisk analyse, hvor-ved den baktericide aktivitet av antistoffet i nærvær og fravær av både humane neutrofiler og humant komplement ble sammenlignet. De her anvendte bakterieserotyper ble inaktivert bare i nærvær av monoklonalt antistoff 8C9, en aktiv komplementkilde og humane neutrofiler (tabell 9). Når dette forsøk ble gjentatt med serotyper som ikke var reaktive med antistoff 8C9, ble det ikke iakttatt noen bakteriedestruksjon (data ikke vist). Disse forsøk viste den funksjonelle spesifisitet av monoklonalt antistoff 8C9 samt dets evne til å opsonisere bakterier og fremme deres fagocytose.

Eksempel VII

Dette eksempel viser fremgangsmåter for fremstilling og utvelgelse av et humant monoklonalt antistoff som er i besittelse av intergenus kryssreaktivitet overfor medlemmer av slektene Serratia marcescens og Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes og Enterobacter cloacae. Dette eksempel viser dessuten den opsoniske aktivitet av antistoffet in vitro overfor homologe S. marcescens og K. pneumoniae, E. aerogenes og E. cloacae serotyper. Fremgangsmåten ifølge eksempel I (i det vesentlige som beskrevet i avsnitt A til G) ble gjentatt, bortsett fra at det var nødvendig å foreta spesifikke modifikasjoner for å karakterisere og analysere antistoffet beskrevet i dette eksempel. Det etterfølgende er endringer i analyseprosedyrer og resultater oppnådd med det her beskrevne monoklonale antistoff. 1. Kultursupernatanter fra fire transformasjoner ble analysert ved hjelp av ovenstående metode, hvilket resulterte i identifikasjon av en brønn (1E4) som var i besittelse av bindingsaktivitet på minst en av fire K. pneumoniae serotypeplater inneholdende kapselserotypene: 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 19, 20, 21, 24, 27, 31, 43, 44 og 55, men ikke på kontrollplaten (ingen bakterier). Antistoff fra 1E4 cellelinjen ble analysert med hensyn til ytterligere intergenus kryssreaktivitet ved en modifikasjon av standard immunavtrykksteknikken. Spesielt ble kryssreaktivitet overfor bakteriene K. pneumoniae, E. aerogenes, S. marcescens, E. coli, E. cloacae og P. aeruginosa undersøkt ved anbringelse av bakterier som pletter på en med gitter forsynt nitrocellulosepapirskive, omsetning av den bakterieholdige skive med antistoffet og fremkallelse av antistoffreaksjonene med et alkalisk fosfatase/nitrobluetetra-zoliumenzymsystem.

Ut fra disse forsøk ble lE4-antistoffet iakttatt å være i besittelse av ytterligere intergenus kryssreaktivitet. Dette antistoff reagerte med følgende arter og serotyper:

Det humane monoklonale antistoff 1E4 var således i besittelse av intergenus kryssreaktivitet med bakterier til-hørende artene K. pneumoniae , S. marcescens, E. cloacae og E. aerogenes. 2. Isotypen av det monoklonale antistoff 1E4 ble bestemt ved en ELISA-prosedyre i likhet med de i eksempel 1 beskrevne spesifisitetstester, bortsett fra at antigenplaten inneholdt en ansamling av PLL immobiliserte K. pneumoniae K3 og K8 serotyper. Positiv reaksjon av det monoklonale antistoff 1E4 med K. pneumoniae serotypene ble bare iakttatt med anti-IgM-reagenset, hvilket viser en IgM isotype for det monoklonale antistoff. Fagmannen vil kunne forstå at hvis fremgangsmåten i dette eksempel ble gjentatt flere ganger, og isotypene av således erholdte intergenus kryssreaktive monoklonale antistoffer ble bestemt, ville man finne ytterligere isotyper, f.eks. IgM og IgG isotyper. 3. Funksjonell aktivitet av det monoklonale antistoff 1E4 in vitro ble undersøkt ved en opsonofagocyttisk analyse, ved hvilken den baktericide aktivitet av antistoffet i nærvær og fravær av både humane neutrofiler og humant komplement ble sammenlignet. De her anvendte bakterieserotyper ble inaktivert bare i nærvær av monoklonalt antistoff 1E4, en aktiv komplementkilde og humane neutrofiler (tabell 10). Når dette forsøk ble gjentatt med serotyper som ikke var reaktive med antistoff 1E4, ble det ikke iakttatt noen bakteriedestruksjon (data ikke vist). Disse forsøk viste den funksjonelle spesifisitet av monoklonalt antistoff 1E4 samt dets evne til å opsonisere bakterier og fremme deres fagocytose.

Eksempel VIII

Dette eksempel viser fremgangsmåter for fremstilling og utvelgelse av et humant monoklonalt antistoff som er i besittelse av intergenus kryssreaktivitet overfor medlemmer av slektene Serratia marcescens, Klebslella pneumoniae, Enterobacter aerogenes og Pseudomonas aeruginosa. Dessuten viser dette eksempel den opsoniske aktivitet av antistoffet in vitro overfor homologe S. marcescens, K. pneumoniae, E. aerogenes og P. aeruginosa serotyper. Fremgangsmåten beskrevet i eksempel I (i det vesentlige som beskrevet i avsnitt A til G) ble gjentatt, bortsett fra at det var nødvendig å foreta spesifikke modifikasjoner for å karakterisere og analysere antistoffet beskrevet i dette eksempel. Det etterfølgende er endringer i analyseprosedyrer og resultater oppnådd med det her beskrevne monoklonale antistoff. 1. Kultursupernatanter fra fire transformasjoner ble analysert ved hjelp av ovenstående metode, hvilket resulterte i identifikasjon av en brønn (9D1) som var i besittelse av bindingsaktivitet på minst en av fire K. pneumoniae serotypeplater inneholdende kapselserotypene: 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 19, 20, 24, 27, 31, 43, 44 og 55, men ikke på kontrollplaten (ingen bakterier). Antistoff fra 9D1 cellelinjen ble analysert med hensyn til ytterligere intergenus kryssreaktivitet ved en modifikasjon av standard immunavtrykksteknikken. Spesielt ble kryssreaktivitet overfor bakteriene K. pneumoniae, E. aerogenes, S. marcescens, E. coli og P. aeruginosa undersøkt ved anbringelse av bakterier som pletter på en med gitter forsynt nitrocellulosepapirskive, omsetning av den bakterieholdige skive med antistoffet og fremkallelse av antistoffreaksjonene med et alkalisk fosfatase/nitrobluetetrazoliumenzymsystem.

Ut fra disse forsøk ble 9Dl-antistoffet iakttatt å være i besittelse av ytterligere intergenus kryssreaktivitet. Dette antistoff reagerte med følgende arter og serotyper:

Det humane monoklonale antistoff 9D1 var således i besittelse av intergenus kryssreaktivitet med bakterier til-hørende slektene K. pneumoniae, S. marcescens, E. aerogenes og P. aeruginosa. 2. Isotypen av det monoklonale antistoff 9D1 ble bestemt ved en ELISA-prosedyre i likhet med de i eksempel I beskrevne spesifisitetstester, bortsett fra at antigenplaten inneholdt en ansamling av PLL immobilisert K. pneumoniae K13 serotype. Positiv reaksjon av det monoklonale antistoff 9D1 med K. pneumoniae serotyper ble bare iakttatt med anti-IgM-reagenset, hvilket viser en IgM isotype for det monoklonale antistoff. Fagmannen vil kunne forstå at hvis fremgangsmåten i dette eksempel ble gjentatt flere ganger, og isotypene av således erholdte intergenus kryssreaktive monoklonale antistoffer ble bestemt, ville man finne ytterligere isotyper, f.eks. IgM og IgG isotyper. 3. Funksjonell aktivitet av det monoklonale antistoff 9D1 in vitro ble undersøkt ved en opsonofagocyttisk analyse, ved hvilken den baktericide aktivitet av antistoffet i nærvær og fravær av både humane neutrofiler og humant komplement ble bestemt. De her anvendte bakterieserotyper ble inaktivert bare i nærvær av monoklonalt antistoff 9D1, en aktiv komplementkilde og humane neutrofiler (tabell 11). Når dette forsøk ble gjentatt med serotyper som ikke var reaktive med antistoff 9D1, ble det ikke iakttatt noen bakteriedestruksjon (data ikke vist). Disse forsøk viste den funksjonelle spesifisitet av monoklonalt antistoff 9D1 samt dets evne til å opsonisere bakterier og fremme deres fagocytose.

Eksempel IX

Dette eksempel viser fremgangsmåter for fremstilling av et humant monoklonalt antistoff som er i besittelse av intergenus kryssreaktivitet overfor medlemmer av artene Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), Escherichia coli ( E. coli) og Serratia marcescens (S. marcescens). Fremgangsmåten i eksempel I (i det vesentlige som beskrevet i avsnitt A til G) ble gjentatt for fremstilling av et humant monoklonalt antistoff som var kryssreaktivt overfor de bakterier hvortil det bindes. Spesifikke modifikasjoner av fremgangsmåten i eksempel I for å karakterisere og analysere antistoffet beskrives i dette eksempel. Endringene i analyseprosedyrer og resultater oppnådd med det monoklonale antistoff, var som følger. 1. Supernatanter ble screenet med hensyn til tilstedeværelse av anti-P. aeruginosa antistoffer ved anvendelse av en ELISA-teknikk som beskrevet i eksempel I. Antigenplaten besto av en flatbunnet 96 brønns "Immunolon 2" mikrotiterplate (Dynatech, Alexandria, VA), hvis brønner inneholdt en blanding av poly-L-lysin (PLL) immobiliserte bakterier tilhørende de 7 P. aeruginosa Fisher-referansestammer (Fisher, M.W., et al., J. of Bacteriology (1969) 98:835-836, A.T.C.C. nr. 27312-27318).

Kultursupernatanter fra en transformasjon ble analysert ved hjelp av ovenstående metode og resulterte i identifikasjon av en brønn som var i besittelse av aktivitet på P. aeruginosa platen, men ikke på PLL-kontrollplaten. Ved etter-følgende ELISA med de 17 individuelle P. aeruginosa serotyper som hører til det såkalte International Antigenic Typing Scheme (IATS, A.T.C.C. nr. 33348-33364), ble det bestemt at en masterbrønn 9C3 inneholdt antistoffer som bindes til IATS serotype type 1 tLiu, P.V. Int. J. Syst. Bacteriol. (1983) 33:256-264).

Ut fra dette forsøk ble det således erholdt en klonet transformert human cellelinje som er kontinuerlig (udødelig) og utskiller et enkelt humant monoklonalt antistoff som bindes til en determinant på overflaten av P. aeruginosa IATS type 1.

Før innlevering av foreliggende søknad ble den kontinuerlig transformerte humane cellelinje som er identifisert som 9C3, deponert ved American Type Culture Colleetion, Rockville, MD, under A.T.C.C. nr. CRL 9239.

2. Antistoff fra den klonede 9C3 cellelinje ble analysert også med hensyn til kryssreaktivitet overfor gramnegative og grampositive bakterier ved en modifikasjon av standard immunavtrykksteknikken. Spesielt ble kryssreaktivitet overfor bakteriene E. coli, K. pneumoniae, S. marcescens, E. aerogenes, E. cloacae, Haemophilus influenzae og Staphylococcus aureus undersøkt ved anbringelse av bakterier som pletter på en med gitter forsynt nitrocellulosepapirskive, omsetning av den bakterieholdige skive med 9C3 antistoff og visualisering av antistoffreaksjonene med et alkalisk fosfatase/nitrobluetetrazoliumenzymsystem (som beskrevet i eksempel

I).

Ut fra disse forsøk ble antistoff 9C3 iakttatt å binde til E. coli serotype 06 og S. marcescens serotypene 012 og 014. Det humane monoklonale antistoff 9C3 er således i besittelse av intergenus kryssreaktivitet blant de gram-negative bakterier tilhørende spesifikke serotyper av artene E. coli, S. marcescens og P. aeruginosa.

3. Det resultat at det monoklonale antistoff kryss-reagerer med flere forskjellige bakterieslekter, gir en indikasjon på at antistoffet kan binde til en felles antigenisk determinant. Den biokjemiske karakterisering av de molekyl typer som gjenkjentes av 9C3-antistoffet, ble utført ved en immunavtrykksanalyse som beskrevet i eksempel I. Reaksjoner ble iakttatt i deoxycholatekstrakter av reaktive serotyper fra P. aeruginosa og E. coli, men ikke S. marcescens. Selv om det ikke er klart hvorfor antistoff 9C3 ikke reagerte med S. marcescens-preparatet, er det mulig at antistoffet gjenkjenner en konformasjonsmessig epitop som ble ødelagt ved behandling-ene. For E. coli og P. aeruginosa bakterieekstraktenes vedkommende viste 9C3-antistoffet seg å gjenkjenne en rekke molekylentiteter i regelmessig avstand som ga anledning til et stigelignende mønster på immunavtrykket. Denne profil stemmer helt overens med den som iakttas ved polyacrylamidgelelektroforetisk analyse av LPS i nærvær av SDS hvor det er blitt påvist at den heterogene størrelsesprofil som utvises av båndene, skyldes en populasjon av LPS-molekyler som avviker fra hverandre ved vektsprang som svarer til antallet av O-antigeniske oligosaccharid-sidekjedeenheter som forefinnes pr. molekyl (Pavla, E.T., og Makela, P.H., supra og Goldman, R.D. og Leive, L., supra).

For ytterligere å definere den molekylære struktur av antigenet ble deoxycholatekstraktene behandlet med proteolyt-isk enzym, Proteinase K, før elektroforese (Eberling, W., supra). Immunavtrykksmønstrene iakttatt etter Proteinase K-behandling, var identiske med de mønstre som ble iakttatt uten behandling, og gir således en indikasjon på at det antigen som var reaktivt med 9C3-antistoffet, ikke var av proteinnatur. 4. Isotypen av det monoklonale antistoff 9C3 ble bestemt ved en ELISA-prosedyre i likhet med de ovenfor beskrevne spesifisitetstester, bortsett fra at antigenplaten inneholdt PLL immobiliserte P. aeruginosa Fisher-serotype 4 bakterier. Positiv reaksjon av det monoklonale antistoff 9C3 med P. aeruginosa-stammen ble bare iakttatt med anti-IgM-reagenset, hvilket viser en IgM isotype for det monoklonale antistoff. 5. Funksjonell aktivitet av det monoklonale antistoff 9C3 in vitro ble undersøkt ved en opsonofagocyttisk analyse ved hvilken den baktericide aktivitet av antistoffet i nærvær og fravær av både humane neutrofiler og humant komplement ble sammenlignet.

De her anvendte bakteriestammer ble drept bare i nærvær av monoklonalt antistoff 9C3, en aktiv komplementkilde og humane neutrofiler (tabell 12). Når dette forsøk ble gjentatt med flere ikke-9C3 reaktive bakterieserotyper, ble det ikke iakttatt noen bakteriedestruksjon, hvilket viser den funksjonelle spesifisitet av det monoklonale antistoff 9C3 og dets evne til å opsonisere bakterier og fremme deres fagocytose.

Fra det foregående fremgår det at cellelinjene ifølge oppfinnelsen tilveiebringer preparater av humane monoklonale antistoffer og fragmenter derav som er kryssreaktive med forskjellige bakteriearter, både gramnegative og grampositive. Dessuten tilveiebringer cellelinjene antistoffer som finner anvendelse ved immunanalyser og andre velkjente prosedyrer.

Claims (15)

1. Antistoffpreparat til ikke-terapeutisk anvendelse, karakterisert ved at det omfatter humane monoklonale antistoffer, og er reaktivt med minst to bakteriearter av minst to slekter, idet minst ett av antistoffene eller bindingsfragment derav er i stand til spesifikt å reagere med en ikke-kjerne carbohydratepitop som er felles for serotyper av minst to forskjellige arter.

2. Antistoffpreparat ifølge krav 1, karakterisert ved at minst ett av antistoffene eller bindingsfragment derav reagerer med serotyper av arter av minst tre bakteriearter og slekter.

3. Antistoffpreparat ifølge krav 1, karakterisert ved at minst én av bakterieartene er grampositive og en annen er gramnegative.

4. Antistoffpreparat ifølge krav 1, karakterisert ved at hvert av minst to av antistoffene er beskyttende mot infeksjon forårsaket av bakterier tilhørende minst to forskjellige slekter.

5. Antistoffpreparat til ikke-terapeutisk anvendelse, karakterisert ved at det omfatter minst to humane monoklonale antistoffer eller bindingsfragment derav, hvor hvert av antistoffene spesifikt reagerer med en ikke-kjerne carbohydratepitop som er felles for serotyper av to eller flere bakteriearter av forskjellige slekter, og flere serotyper av minst én art, hvor artene omfatter Escherichia coli, Neisseria meningtidis, Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa og Streptococcus agalactiae gruppe B.

6. Antistoffpreparat ifølge ett eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at det omfatter minst ett humant monoklonalt antistoff som reagerer med minst én av følgende bakterieartkombinasjoner: (a) E. coli, S. marcescens og E. aerogenes; (b) E. coli og N. meningitidis; (c) E. coli, E. cloacae og Streptococcus agalactiae gruppe B; (d) K. pneumoniae, S. marcescens og E. aerogenes; (e) K. pneumoniae og S. marcescens; (f) K. pneumoniae, S. marcescens, E. aerogenes og E. cloacae; (g) K. pneumoniae, S. marcescens, E. aerogenes og P. aeruginosa eller (h) E. coli, S. marcescens og P. aeruginosa.

7. Antistoffpreparat til ikke-terapeutisk anvendelse, karakterisert ved at det omfatter minst to humane monoklonale antistoffer eller bindingsfragmenter derav, hvor hvert av antistoffene spesifikt reagerer med en ikke-kjerne carbohydratepitop som er felles for serotyper av to eller flere bakteriearter av forskjellige slekter, hvori artene omfatter Escherichia coli Kl, Neisseria meningitidis gruppe B, Haemophilus influenzae type B og Streptococcus agalactiae gruppe B.

8. Antistoffpreparat ifølge krav 5 til ikke-terapeutisk anvendelse, karakterisert ved at det omfatter to eller flere humane monoklonale antistoffer eller bindingsfragmenter derav, hvilke antistoffer er i stand til å reagere med i alt minst fire bakteriearter, samt en forenlig bærer.

9. Antistoffpreparat ifølge krav 1 til ikke-terapeutisk anvendelse, karakterisert ved at det omfatter et beskyt tende humant monoklonalt antistoff eller bindingsfragment derav, som bindes til gruppe B streptokokki's gruppe B karbo-hydrat, og til minst én annen bakterieart.

10. Antistoffpreparat ifølge krav 1 til ikke-terapeutisk anvendelse, karakterisert ved at det omfatter et beskyttende humant monoklonalt antistoff eller bindingsfragment derav, som bindes til en kapselkarbohydratdel som forefinnes på E. coli Kl, og til minst én annen bakterieart.

11. Antistoffpreparat ifølge krav 10, karakterisert ved at det humane monoklonale antistoff også bindes til N. meningitidis gruppe B.

12. Udødelig cellelinje, karakterisert ved at den utskiller et humant monoklonalt antistoff eller bindingsfragment derav, som spesifikt er kryssreaktivt med en epitop omfattende en tilgjengelig ikke-kjerne carbohydratdel som forefinnes på minst to serotyper av to forskjellige arter av forskjellige bakterieslekter, hvor bakterieartene er minst to av artene Escherichia coli, Serratia marcescens, Neisseria meningitidis, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Pseudomonas aeruginosa og Streptococcus agalactiae gruppe B.

13. Cellelinje ifølge krav 12, karakterisert ved at den er som deponert ved American Type Culture Collection under nr. CRL 9006, CRL 9007, CRL 9008, CRL 9009 eller CRL 9239.

14. Humant monoklonalt antistoff eller bindingsfragment derav til ikke-terapeutisk anvendelse, karakterisert ved at det er i stand til å binde til en carbonhydratepitop som er reaktiv med et monoklonalt antistoff produsert av en cellelinje ifølge krav 12 eller 13.

15. Sett eller utstyr til bruk ved påvisning av tilstedeværelse av minst to medlemmer av arter av forskjellige bakterieslekter, karakterisert véd at det omfatter et monoklonalt antistoffpreparat som inneholder minst ett monoklonalt antistoff, hvori antistoffet reagerer med en ikke-kjerne carbohydratdeterminant som er felles for minst to medlemmer av forskjellige bakteriearter, og en markør som tilveiebringer et påviselig signal og er kovalent bundet til antistoffet, eller bundet til et annet antistoff som er reaktivt med det monoklonale antistoff.