NO175102B - Analogifremgangsmåte for syntese av tetrapeptidet Ser-Asp-Lys-Pro-OH - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for syntese av tetrapeptidet Ser-Asp-Lys-Pro-OH og dettes NAC-Ser-Asp-Lys-Pro-OH-substitusjonsderivat samt deres farmasøytisk godtagbare salter.

Anvendelsen av medikamenter ved behandling av kreft er begrenset på grunn av den toksiske virkning på det friske vev og spesielt på det bloddannende vev. Gjentatt anvendelse av disse medikamenter medfører i et stort antall tilfeller enten en medulær letal aplasi, en sekundær leukemi eller litt mindre alvorlige hematologiske problemer.

Da de fleste antikreftmidler ikke virker annet enn på prolifereringscellene har man nu tenkt at det skulle være mulig å forebygge hematologiske skader ved å benytte de pluripotente cellestammer med prolifereringsinhibitorer.

Forsøk gjennomført av foreliggende søkere og tidligere publisert (se spesielt E. Frindel og M. Guigon, "Exp. Hemat", 5 (1977), 74-76, M. Guigon og E. Frindel, "Bull. Cancer" 68( 2), 1981), 150-153, J. Wdzieczak-Bakala, M. Lenfant og M. Guigon, "IRCS Med. Sei.", 12 (1984), 868-869, J. Wdzieczak-Bakala, M. Guigon, M. Lenfant og E. Frindel, "Biomed. Pharm", 37, (1983), 467-471, og M. Guigon, J. Wdzieczak-Bakala, J.Y. Mary og M. Lenfant, "Cell Tissue Kinet" 17 (1984), 49-55) på signifikant måte er mulig, ved å administrere en spesifikk inhibitor for cellestammene, å redusere den observerte letalitet hos dyr under behandling med cytosin arabionsid, Ara-C, et medikament som hyppig benyttes ved kreft-kjemoterapi, der anvendelsen er begrenset på grunn av den skadelige virkning på benmargen. Denne spesifikke inhibitor som er en ekstrakt av visse biologiske stoffer, spesielt benmarg eller kalvefetallever, beskytter cellestammene som er opprinnelsen for alle blodlinjene.

Således har biologiske studier effektivt vist at økningen av overlevelse som observeres, kan skyldes en beskyttelse av de hemopoietiske cellestammer, CFU-S (Colony Forming Units in the Spleen: enheter som danner kolonier i milten), det vil si pluripotente cellestammer som er i stand til å gi opphavet til kloner i milten hos mus bestrålet med letal dose, idet denne beskyttelse skyldes opprettholdelse av cellene utenfor den cellulære cyklus ved hjelp av inhibitoren.

Disse publiserte dokumenter beskriver teknikker som tillater å oppnå mer eller mindre rensede ekstrakter inneholdende den spesifikke inhibitor, men i alle disse tilfeller er det oppnådde sluttprodukt ikke homogent og utbyttene er lite tilfredsstillende. Det har således til i dag ikke vært mulig å isolere den aktive bestanddel og å fastslå dennes struktur.

Man har funnet en ny ekstraheringsprosess som tillater å oppnå en homogen, aktiv fraksjon fra et biologisk materiale, spesielt fra kalvefoster.

Denne prosess er beskrevet i NO-utl. 880186 som angår en fremgangsmåte for ekstrahering av tetrapeptidet: Ser-Asp-Lys-Pro-OH fra biologisk materiale og spesielt fra lever eller benmarg av kalvefoster, en fremgangsmåte som karakteriseres ved at den omfatter følgende trinn: å male opp utgangsstoffer med delipidering hvis nødvendig, - å bringe det oppnådde produkt i suspensjon i en buljong ved en pH-verdi nær 7 i nærvær av et svovelholdig reduk-sjonsmiddel spesielt ditioerytritol eller fortrinnsvis merkaptoetanol til en sluttkonsentrasjon på 10~<2>M,

å sentrifugere homogenatet ved ca. 15.000 x g i minst en i time,

å underkaste supernatanten en ultrafiltrering på et

membran med sperregrense nær 10.000 Da,

å underkaste det oppnådde ultrafiltrat kromotografi på en molekylsikt av polyakrylamidgeltypen med eluering med en ; 10~^M eddiksyreoppløsning,

å underkaste den aktive fraksjon som utvinnes fraksjo-nering på' en inversfasebærer av silisium, podet med

alifatiske rester og spesielt C-^g, og eluering med H2O, H20:CE30H (50:50) og CH3OH, og fortrinnsvis å gjenta dette

trinn minst en gang, og

å underkaste den nye aktive fraksjon som gjenvinnes en høytrykks-væskekromatografi på en iversfasekolonne av silisiumdioksyd, podet med alifatiske rester og spesielt C^g, for å oppnå en aktiv homogen fraksjon, med eluering med en blanding av EtøO, CF3COOH og MeOE eller en blanding av H2O, CF3COOH og CH3CN, og detektering av fraksjonene ved måling av absorbsjonen ved 215 nm.

Peptidet Ser-Asp-Lys-Pro-OH kan som nevnt innledningsvis, også oppnås ved syntese.

I henhold til dette angår foreliggende oppfinnelse en analogifremgangsmåte for syntese av det terapeutisk aktive tetrapeptidet Ser-Asp-Lys-Pro-OH og dettes NAC-Ser-Asp-Lys-Pro-OH-substitusjonsderivat, samt deres farmasøytisk godtagbare salter, og fremgangsmåten karakteriseres ved at den omfatter, suksessivt, i væskefase, ut fra C-terminal-enden, å føye til egnede aminosyregrupper, hensiktsmessig substituert eller beskyttet på de reaktive grupper og, etter behov, å fjerne beskyttende grupper, i henhold til følgende skj ema:

der Boe er tert.butoksykarbonyl;

Z er benzyloksykarbonyl;

Bzl er benzyl; og

Tfa er trifluoreddiksyre.

Inhibitoren som oppnås ifølge oppfinnelsen synes ikke å oppvise den artsspesifisitet (i de prøver som her beskrives er den ekstrahert fra kalvefostermarg og aktive mot mus); det er således tilrådelig å benytte den samt substitusjonsderivater på samme måte som de farmasøytisk akseptable salter i tallrike medisinske og biologiske anvendelsesområder på mennesker og dyr.

Disse forbindelser kan benyttes for beskyttelse av benmarg under antikreftbehandling med kjemoterapi.

I dette tilfellet er det fordelaktig å formulere preparatet som et pulver og administrere det i nærvær av hjelpestoffer og/eller vanlige drøyemidler på intravenøs eller subkutan måte under kjemoterapibehandlingen. Administreringsfrekven-sen og mengde produkt som administreres avhenger i det vesentlige av kinetikken til cellestammen som kan variere alt efter det terapeutiske middel, posologien og anvendelses-protokollen.

Andre "administrerings" måter kan benyttes, for eksempel den som består av å produsere inhibitoren i pasientens organisme ved å ty til genetiske konstruksjonsteknikker, for eksempel ved hjelp av bakterier. Tetrapeptidet og dettes substitu-sjonsderivat kan videre benyttes for å oppnå spesifikke antistoffer for dosering av inhibitormengden som sirkulerer hos pasienten og bestemmelse av denne rolle ved visse stoffer i det bloddannende system, samt ved margpoding.

Anvendelsen av disse antistoffer ved hyperproduksjon av inhibitor forbundet med patologi kan likeledes være en mulighet.

EKSEMPEL

I. Syntese i væskefase av NAc- Ser- Asp- Lys- Pro- OH,

vanligvis forkortet til AcSDKP.

a) Syntese av Boc- K( Z)- P- OH ( I) :

Til en oppløsning av Boc-K(Z)-0Su(4,19 mmol) i Dmf settes en

vandig oppløsning av P (8,38 mmol) hvortil det er satt 1,15 ml trietylamin (8,38 mmol). Blandingen omrøres over natten ved omgivelsestemperatur.

Efter fordamping av oppløsningsmidlet blir resten oppløst i etylacetat. Oppløsningen vaskes suksessivt med en 5#-ig sitronsyreoppløsning, med en 5#-ig natriumkarbonatoppløsning og med vann, og tørkes så over MgS04. Efter fordamping av oppløsningsmidlet blir det således oppnådde produkt karakterisert som følger: gulaktig olje: 3,98 mmol tilsvarende et utbytte på 95$;

- [a]D = 38°' (01,0; MeOH)

Rf: 0,5 (MeOH:CHCl3 : 1:9); 0,24 (EtOAc:MeOH: 8:1)

Rf-verdien bestemmes ved kromatografi på tynnsjiktskromato-grafi på silisiumdioksyd.

NMR gjennomføres i en CDCl3-oppløsning og ble bekreftet.

Bemerk:

Boe = tert-butyloksykarbonyl;

Z = benzyloksykarbonyl;

Su = sulfonamid;

Dmf = dimetylformamid.

b) Syntese av Boc- D( OBzl)- K( Z)- P- OH ( II ) :

Til en oppløsning av Boc-D(OBzl)-OSu (3,31 mmol) i Dmf settes

en oppløsning av Tfa.K(Z)-P-OH (3,15 mmol) i Dmf inneholdende

915 }jl trietylamin tilsvarende 6,62 mmol. Oppløsningen av Tfa.K(Z)-P-OH oppnås ved behandling av produkter (I) ved en oppløsning av 10 ekvivalenter Tfa og 1 ekvivalent anisol i 1 time ved 0°C. Den vaskes i heksan og derefter eter før den benyttes for det efterfølgende trinn. Blandingen som er samm sammen på denne måten, omrøres 1 natt ved omgivelsestemperatur. Efter fordamping av oppløsningsmidlet blir resten oppløseliggjort i etylacetat og vasket som under a) før karakterisering.

olje: 2,17 mmol; utbytte: 70$;

- [a]D = 20° (C=l,2; MeOH)

Rf: 0,23 (MeOH:CHCl3: 1:9);

NMR gjennomført i CDCl3-oppløsning: bekreftet.

Bemerk:

Tfa = trifluoreddiksyre og

Bzl = benzyl.

c) Syntese av Boc- S( Bzl)- D( 0Bzl)- K( Z)- P- 0H ( III) :

I henhold til den samme sekvens som under b) blir 1,47 mmol

Boc-S-(Bzl)-0su satt til 1,47 mmol Tfa.D(0Bzl)-K(Z)-P-0H).

Det oppnådde produkt oppviser følgende egenskaper:

olje: 1,31 mmol; utbytte: 89$

- [a]D = -270 (C=1,0; MeOH)

RF : 0,29 (MeOH:CHCl3 : 1:9); - NMR gjennomført i CDCl3-oppløsning tilsatt en liten mengde MeOD for å forbedre oppløseligheten, og oppløsningen av spektrene: bekreftet.

d) Syntese av AcS( Bzl)- D( OBzl)- K( Z)- P- OH ( IV) :

Efter eliminering av Boe N-terminalen til produkt (III) ble

den nye blokkerende gruppering føyet til i en enkelt etappe. Sluttproduktet oppviste efter vaskinger følgende karakter-istika når man benyttes 1 mmol Tfa.S(Bzl)D(OBzl)K(Z)P-OH:

- olje: 0,77 mmol; utbytte: 77$

- [a]D = 22° (C=1,0; MeOH)

RF : 0,12 (CHCL3:MeOH: 9:1); 0,54 (EtOAc:MeOH:CH3COOH; 16:3:1) - NMR gjennomført i CDCls-oppløsning med tilsatt MeOD: bekreftet.

e) Fremstilling av Ac- S- D- K- P- OH ( V) :

Produkt (IV) i metanoloppløsning underkastes efter tilsetning av karbon-palladium en hydrogenolyse. Efter at reaksjonen er ferdig, blir metanolen fordampet og resten karakterisert. Et sluttprodukt som efter lyofilisering viser seg som et fast hvitt stoff, karakteriseres ved de samme fysikokjemiske teknikker som et naturlig peptid, nemlig ved: - aminosyreanalyse; - høytrykksvæske-kromatografi;

- NMR i D20-oppløsning; og

- massespektrometri FAB og FAB (MS-MS).

Ved alle disse analyseteknikker fastslår man en god overens-stemmelse av de oppnådde resultater for det syntetisk produserte produkt V med de som oppnås for det naturlige produkt.

Spesielt kan proton-NMR-spektrene til det naturlige peptider og de syntetiske legges over hverandre på samme måte som massespektrene.

Analysen av dette syntetiske tetrapeptid ved hjelp av HPLC i inversfase på en analytisk ODS Hypersil C 18 kolonne under isokratiske betingelser med blandingen CH3CN/H2O, TFA 0,1$

[4,5:95,5], med en deteksjon ved 215 mm, tillater å fastslå at toppen ved 18 minutter og 25"C viser en antydning til skulder som bedre synes i den første del av toppen ved 24 minutter og 15°C. Denne topp kan ved 24 minutter og 15°C halveres til en topp med liten intensitet ved 22 minutter, tilsvarende den tidligere skulder, og til en topp etter 24 minutter. Det tilsvarende produkt ved denne topp har de biologiske egenskaper til det naturlige peptid.

Det ble underkastet prøver som beskrevet i forbindelse med det naturlige inhibitorekstrakt ifølge NO-søknad 880186.

Prosentandelen av CFU-S i syntesefasen av ADN som oppnås, er samlet i tabell II nedenfor.

Prøvene 1, 2 og 3 gjennomføres med tetrapeptidet som ble oppnådd ved en første syntese mens prøvene 4, 5, 6, 7 og 8 oppnås med tetrapeptidet som ble oppnådd ved en andre syntese. De oppnådde resultater skal sammenlignes med de som oppnås med de naturlige produkt og som figurerer i tabell I på den ene side og i tabell III på den annen side. Disse siste resultater oppnås med det naturlige produkt som ekstraheres fra to forskjellige mengder A og B av benmarg.

En sammenlignende undersøkelse av tabellene I og III på den ene side og II på den annen tillater å fastslå at det syntetiske peptid oppviser en aktivitet som helt og holdent tilsvarer den som oppnås med det naturlige peptid. De oppnådde resultater er skjematisk representert i den vedlagte figur.

II. Bestemmelse av den prinsippielle aktive struktur:

1. Analyse av aminosyrene:

Efter sur hydrolyse tillater en analyse ved EPLC av derivat-ene dannet ved omsetning med ortoftaldialdehyd å fastslå nærværet av lycin, aspartinsyre og serin. Analyse av produktet ved hjelp av en aminosyreanalysator tillater efter sur hydrolyse og oksydasjon med natriumhypoklorit å fastslå nærværet av prolin og å bekrefte nærværet av aspartinsyre, serin og lysin.

2. NMR- spektroskopi:

NMR-spektroskopi med H20 og D2O viser nærværet av fire aminosyrer, nemlig prolin, lysin, aspartinsyre og serin, og en acetylgruppe. NE2 i den laterale kjeden i lysin og OH i serinet er frie, NEtø i aminosyredelen til serin, lysin og aspartinsyre er substituert en gang. Den sannsynlige struktur er den til et peptid som er acetylert på NItø-terminalen.

3. Massespektroskopi:

Massespektroskopiteknikkene med FAB (Fast Atom Bombardment) viser at peptidet har en molekylmasse (M + 1) på 488.

Et studium av aminosyresekvensen ved en variant av massespek-troskopien, nemlig den teknikk som kalles MS-MS, har tillatt å fastslå at den totale primaerstruktur for peptidet er:

Ser(N-Ac)-Asp-Lys-Pro-OH

III. Beskrivelse av de biologiske prøver:

Den biologiske aktivitet av fraksjonen måles ved en analyse in vivo av inhiberingen av inntredenen i cyklen til CFTJ-S som induseres ved en injeksjon av Ara-C.

CFU-S hos mus som vanligvis er beroliget, trer inn i cyklen efter en injeksjon av Ara-C. Søkerne har vist at når inhibitoren injiseres 6 t før medikamentet forhindres inntrengen av CFU-S i ADN syntesens fase S.

Antallet CFU-S bestemmes i henhold til J.E. Till og E.A. McCulloch, "Radiat. Res,", 14, (1961), 213-222, der prinsippet er basert på evnen til CFU-S til å danne makroskopiske kolonier i milten. Disse kolonier er klonene som stammer fra et CFU-S.

Andelen CFU-S i fase S bestemmes i henhold til A.J. Becker "Blood", 2b, (1965), 296-308, basert på prinsippet om cellulaeravlivning. Inkuberingen av cellene med en oppløsning av tritiert tymidin (forløper til ADN) fører til selektiv død av celler i syntesefasen av ADN ved integrering av en letal dose av radioaktivitet (tritium) i ADN molekylet.

Prøvene gjennomføres på SPF (Spcific Pathogen Free) mus av stammen Balb/C eller CBA med en alder på 2 til 3 måneder.

Sammenligningsgruppene mottok intraperitonealt en behandling som følger:

For hver av gruppene ble benmarg fra dyrene samlet og bragt i suspensjon i 2 ml medium 199. Efter nummerering og fortynn-ing ble to mengder av 5 x 10^ nukleerte celler inkubert ved 37°C i 20 minutter eller med 1 ml medium 199 (Prøve A), eller med 1 ml tritiert tymidin (200 jiCi) (Prøve B). En cellulær suspensjon på 0,2 ml inneholdende 8 x IO<4> til 1,2 x IO<5 >nukleerte celler injiseres på intravenøs måte til sinus-retro-orbitalen til de strålingsmottagende dyr (9 Gy, 8 mus/forsøkspunkt).' 9 dager senere ble de mottagende mus avlivet og deres milt fjernet og fiksert i Bouinvæske (720 g 1% picrinsyre; 240 g formol; 4 g eddiksyyre/1 væske). Efter noen fikseringstimer ble de synlige noduler tellet makro-skopisk.

Hvis N og N' er det midlere antall noduler som oppnås for miltene av mottagerne som mottok cellene fra prøvene A henholdsvis B er andelen CFU-S ved syntesefasen av ADN beregnet ved formelen:

Resultater:

1. Inhibering av inntrengning i cyklen for CFU- S.

Under hvert rensetrinn isoleres en fraksjon som er aktiv vis a vis denne prøve. Ikke desto mindre blir en spesielt interessant aktivitet observert med en fraksjon som er homogen, oppnådd ifølge oppfinnelsen slik følgende tabell viser: Inhibering av inntrengning i cyklen av CFU-S ved injisering av 100 ng pr. mus av den homogene fraksjon som er oppnådd ifølge oppfinnelsen i henhold til protokoll II. 2. Aktivitet på virkning av overlevelsen av dyr behandlet med letale doser Ara- C.

Dyrene mottok de fraksjonerte Ara-C doser (4 x 925 mg/kg) på tidspunktene 0, 7, 24 og 30 timer. Den prøvede fraksjon administreres en gang 26 timer før den første Ara-C injeksjon. Dyrenes overlevelse bedømmes 15 - 30 dager efter behandlingen. I den protokoll som omfatter repeterte injeksjoner, letal Ara-C, er det vist at konkomitant admini-strering av inhibitoren tillater en definitiv overlevelse hos et stort antall av dyrene. De oppnådde resultater er sammenlignbare med de som observeres når man går frem med en poding av isoallogenisk marg i forbindelse med de behandlede dyr istedet for å benytte inhibitoren.

Protokoll:

3. Fravær av aktivitet av den inhiberende fraksjon på regres. ion av EMT6 tumorer.

Behandlingen av dyr som er bærere av tumoren EMT6 med 4 suksessive injeksjoner av Ara-C på tidspunktene 0, 7, 24 og 30 timer fulgt av en inhibitorinjeksjon 26 timer efter den første Ara-C injeksjon, forhindrer ikke den terapeutiske virkning av Ara-C vis a vis de tumorale celler og tillater overlevelse for dyret som behandles på en måte sammenlignbar med de resultater som oppnås efter en margpoding.

4. Toksisitet.

Den inhiberende fraksjon er ikke toksisk i forhold til CFU-S og medfører ingen letalitet hos de behandlede mus ved de benyttede doser.

Claims (1)

1. Analogifremgangsmåte for syntese av det terapeutisk aktive tetrapeptidet Ser-Asp-Lys-Pro-OH og dettes NAC-Ser-Asp-Lys-Pro-OH-substitusjonsderivater, samt deres farmasøytisk godtagbare salter, karakterisert ved at den omfatter suksessivt, i væskefase, ut fra C-terminal-enden, å føye til egnede aminosyregrupper, hensiktsmessig substituert eller beskyttet på de reaktive grupper og, etter behov, å fjerne beskyttende grupper, i henhold til følgende skjema:

   der Boe er tert.butoksykarbonyl; Z er benzyloksykarbonyl;

   Bzl er benzyl; og Tfa er trifluoreddiksyre.