NO174816B - Fremgangsmåte for fremstilling av human-lysozym, rekombinant DNA-molekyl, ekspresjonsvektorer, samt transformert gjærcelle - Google Patents

Description

Gjenstand for foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for fremstilling av human-lysozym (HLZ). I tillegg skal også mulighetene for terapeutisk anvendelse beskrives ved hjelp av eksempler.

Nærmere bestemt angår oppfinnelsen fremstilling av et løselig, sekreterbart, aktivt humant lysozym fremstilt ved at DNA-sekvensen som koder for humant lysozym uttrykkes i kombinasjon med a-leder-sekvensenj ifølge krav 1.

I detalj befatter oppfinnelsen seg med et bakterie-plasmid som inneholder en cDNA-sekvens for en del av human-lysozym-signalpeptidet, en cDNA-sekvens for hele det ferdige human-lysozym-protein og ved 3'-enden delen av en ikke-kodende sekvens av human-lysozym-genet. Gjenstand for oppfinnelsen er dessuten ekspresjonsvektorer som er plasmider, med de for human-lysozym kodende nukleotidsekvenser som innfellinger og forskjellige vertsorganismer eller kulturer som gjør det mulig å fremstille human-lysozym. Det henvises til kravene.

Lysozymer ér definert som 1,4-8-N-acetylmuramidaser,

som spalter den glykosidiske binding mellom C-1 i N-acetyl-muraminsyre (MurNAc) og C-4 fra N-acetylglukosamin (GlcNAc)

i peptidoglykanet fra bakterier (1). Alexander Fleming oppdaget i 1922 at såvel forskjellig vev og sekreter som også hønse-eggehvite kan lysere noen Gram-positive bakterier. Han betegnet den lytiske faktor som lysozym, dvs. et enzym som er i

stand til å lysere bakterier. Fleming viste at lysozym forekom-mer i vevshomogenater fra brusk og magesekk, i tårer, spytt, sputum, nesesekret, patologisk urin, serum og i leukocytter,

men ikke i urin fra friske individer, i cerebrospinalvæsken

eller i svette (2).

Virkemåten til lysozymet som antibakterielt middel synes

å gjøre seg gjeldende såvel ved sin direkte bakteriolytiske virkning, som over stimulatoriske effekter i sammenheng med fagocytosen til makrofagene (3,4).

Den betydelige rolle som lysozymet har som formidler

ved mikrobeavvisning ved hjelp av alveolaere makrofager fra rotte, kunne påvises: hos intakte bakterier ble det ingen fago-cytose, mens lysozym-skadede bakterier hurtig blir fagocytert, (3). Likeledes kunne det påvises at lysozym direkte kan øke den fagocytiske aktivitet hos polymorfonukleære leukocytter (5)

og for makrofager (4). Undersøkelser angående virkemåten til lysozym på mikroorganismer i munnen ble utført på 7 stereo-typer av Streptococcus mutans, Veillonella alcalescens og på virulente og ikke-virulente stammer av Actinomyces viscosus T14. Resultatene viser at forskjelligartede mekanismer kan være ansvarlig for de bakteriostatiske, lytiske og baktericide egenskaper og at enzymet ikke bare utgjør en selektiv, men også en effektiv faktor mot mikroorganismer i munnen (6). Andre postulerte funksjoner ved lysozymet omfatter immunstimulering (7), den immunologiske og ikke-immunologiske kontroll av verts-membraner med hensyn til en neoplastisk transformasjon (8). Lysozymbestemmelsen fra serum og/eller urin benyttes for diag-nose av forskjellige sykdommer eller som indikator på utvikling av dem. Ved den akutte lymfoblastiske leukemi er lysozym-serum-speilet tydelig senket, mens i tilfelle, av kronisk myelotisk leukemi og de akutte monoblastiske og myelomonocytiske leukemier lysozymkonsentrasjonen i serum er sterkt forhøyet (9, 10).

Den terapeutisk virksomme anvendelse av lysozym er tenke-lig ved behandling av forskjellige bakterie- og virus- (Zona, Herpes Zoster) infeksjoner, ved kolitt, forskjellige smerter, ved allergier, betennelser såvel som i pediatri (maternisering av kumelk ved tilførsel av lysozym).

Lysozym har evne til å øve vekselvirkning med andre biologisk aktive proteiner slik at disse utfører full virkning (Adinolfi, In: Lampert, Woods (eds), Academic Press, London, 1981, 19 - 47). Slike komponenter ville være f.eks. komplement,

•laktotransferrin, som ved dannelse av jern-chelat-komplekser inhiberer formeringen av bestemte mikroorganismer, antistoffer såsom slgA i melk, som potensierer den antibakterielle virkning av laktotransferrinet (Spik et al. Bull. Eur. Physiopath. Resp. 19, 123 - 130, 1983). Dessuten blir lysozym, laktotransferrin og immunoglobuliner funnet koeksisterende i forskjellige natur-lige sekreter såsom spytt, tårevæske, forskjellige melkearter (Jorieux et al., Protides of the biological Fluids, Proe. 31 st Coll. 1984), i bronkialslimhinnen eller i eggehvite. For ytterligere anvendelse kan lysozym fortrinnsvis tjene til lindring av reumatisk feber og reumatiske smerter og har en terapeutisk virkning hos sykdommer i den reumatisk/artritiske formkrets (Third Int. Symp. on Flemings lysozyme, Milan 1964). Senere

ble lysozym også tilskrevet analgetiske egenskaper (Bianchi,

Eur. J. Pharmacol. 71, 211 - 221, 1981). I nyere tid kunne det finnes en antinozizeptiv virkemåte for lysozym (Bianchi, Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 10, 45 - 52, 1983). Denne brede pa-lett for virkemåte hos lysozym gir tilkjenne et tilsvarende stort spektrum for den terapeutiske anvendelse, slik at det av dette kan avledes en betydelig økonomisk verdi.

Ved alle her oppregnede farmasøytiske anvendelser av lysozym bør human-lysozym (HLZ) foretrekkes fremfor det av hønse-eggehvite utvunne lysozym, da uønskede bivirkninger av anafylaktisk og/eller allergisk natur ved anvendelse av arts-fremmede lysozymer snarere er å forvente og kan motvirke en terapi.

Til i dag er morsmelk og menneske-placenta de eneste kommersielle kilder for utvinning av human-lysozym. Disse utgangsmaterialer er dog svært begrenset tilgjengelig, og det er åpenbart at det oppnås forskjelligartede preparater fra gang til gang. Ved benyttelse av den høyt utviklede industri-elle mikrobiologi og den for kort tid siden utviklede rekombi-nante DNA-teknologi skulle det vise seg fordeler for fremstilling av human-lysozym ved hjelp av mikroorganismer.

Genet for hønse-eggehvite-lysozym kunne isoleres (11,

12) og nukleotidsekvensen til hønse-eggehvite-lysozymet mRNA såvel som den av det exon som ligger på genet, bestemmes sammen med dets flankerende regioner (13). Videre ble nukleotidsekvensen til lysozym-genet fra bakteriofag T4 oppklart (14).

Aminosyresekvensen av HLZ er kjent (21, 22, 23), men

ikke den ved denne oppfinnelse fremkommende nukleotidsekvens som koder for HLZ.

EP-patentsøknad, publ. nr. 181 634 beskriver ekspresjon av human-lysozym i gjær og Bacillus subtilis. Bortsett fra at det i EP 181 634 ikke anvendes noen spesiell gjærterminator og intet autentisk HLZ-gen, så er denne HLZ-DNA-sekvens i tilfellet med ekspresjon i gjær ikke i besittelse av noen forhåndssjaltet DNA-sekvens som koder for et lederpeptid. Det dannede HLZ kan således ikke transporteres ut av verten, slik at utformingen av en eksakt tertiærstruktur ved hjelp av tilsvarende disulfid-brodannelse blir vanskeliggjort. Det lærer derfor ikke hvorledes man i henhold til 181 634 kommer frem til autentisk HLZ. Det læres heller ikke hvordan startmetioninet skal fjernes.

Den oppgave som ligger til grunn for foreliggende oppfinnelse, består i å betjene seg av en strategi for å synteti-sere en cDNA med den minimale informasjon av aminosyresekvensen til HLZ, å klone og å bringe denne til ekspresjon av et biologisk aktivt HLZ-protein.

Problemet ble løst ved at man ved hjelp av en mRNA som matriks var i stand til å konstruere bakterie-hybrid-plasmider som inneholder en cDNA som koder for HLZ. HLZ-DNA, som del av bakteriehybrid-vektoren, kan nedstamme fra hvilke som helst HLZ-produserende celler hos mennesker. Eksempler på egnede'celler er placentaceller, leukocytter fra mennesker som lider av akutt monoblastisk og/eller myelomonocytisk leukemi, kolonkarcinomceller fra mennesker, U-937-cellelinjene eller andre HLZ-produserende cellelinjer. Foretrukket i forbindelse med foreliggende opp-, finnelse benyttes U-937-celler (ATCC CRL 1953) fra menneske. HLZ-DNA kan isoleres fra en genbank som inneholder HLZ-genet.

Ved foreliggende oppfinnelse ble det ikke foretrukket kromosomal DNA, da den sannsynligvis inneholder intron innen sin kodende region (f.eks. inneholder hønse-eggehvite-lysozym-gener tre introner (13)), som ikke kan snittes ut ved hjelp av gjær. Ved foreliggende oppfinnelse ble human-lysozym-

cDNA foretrukket.

Den fra cellen U-937 isolerte mRNA er en foretrukken matriks for syntesen av human-lysozym-cDNA. For syntesen av

.den første streng av HLZ-cDNA blir reaksjonen med oligo(dT )lg

som primer startet, som fortrinnsvis danner par med 3'-enden i nevnte mRNA. I nærvær av dNTP og den reverse transkriptase foregår den videre forlengelse av enkeltstreng-cDNA. Enkeltstreng-cDNA kan i tillegg bli konvertert til en dobbelstrenget cDNA ved forskjellige kjente metoder. Ved foreliggende oppfinnelse ble metoden til Gubler og Hoffmann (15) foretrukket. Syntesen av den annen cDNA-streng fra enkeltstreng-cDNA foregikk ved behandling av mRNA-hybridet med RNaseH og DNA polymerase I

i nærvær av dNTPs. Ved hjelp av denne metode oppnås en dobbeltstrenget cDNA som som sådant kan klones direkte. Kloningen av dobbeltstreng-cDNA i nakterievektorer kan gjennomføres i henhold til forskjellige kjente metoder. Dobbeltstrenget cDNA

kan klones direkte som "blunt end"-fragment, over en syntetisk linker eller over den metode som er kjent som "homopolymertailing". Når det gjelder kloning av HLZ-cDNA ble homopolymertailing-metoden foretrukket. Ved denne metode dannes det enkeltstrenger med den terminale transferase ved 3'-enden av HLZ-DNA ved addi-sjon av nukleotider (fortrinnsvis dGTP) ved sine "blunt"- eller "staggered"-ender. I en separat reaksjon lineariseres bakterie-plasmidet med en restriksjonsendonuklease (i tilfellet med kloning av HLZ-cDNA ble vektoren pUC9 foretrukket) og forsynt med komplementære haler (fortrinnsvis dCTP), for oppnåelse av komplementære enkeltstrenger ved deres 3'-ender. I neste skritt blir den homopolymert forlengede dobbeltstreng-cDNA

blandet med den tilsvarende komplementære vektor forsynt med hale, for å tilkoble denne under egnede betingelser. Etter foretatt rekombinasjon blir de CaC^-behandlede E.coli-celler transformert med denne blanding og utplattert på selektive plater. Klonene som inneholder HLZ-cDNA kan bli identifisert ved hjelp av forskjellige kjente metoder. Ved foreliggende oppfinnelse ble klassifiseringen med radioaktivt markerte, syntetiske oligonukleotider foretrukket. Ved hjelp av publi-

sert aminosyresekvens av HLZ-protein ble to satser av oligonukleotider syntetisert i en lengde av 17 baser i hvert tilfelle.

På grunn av det faktum at forskjellige codoner kan spesifisere

en og samme aminosyre, så inneholder hver sats en blanding av forskjellige oligonukleotider.

Syntesen av alle mulige kombinasjoner sikrer at et av

de tilstedeværende oligonukleotider optimalt danner par med HLZ-genet. Anvendelse av to uavhengige pools av 17-mer-oligonukleotider reduserte muligheten for at de "falske" positiver velges.

I klassifiseringseksperimentene blir DNA fra de bakterie-kloner som bærer cDNA-innfellingene, i overensstemmelse med den ved "kolonihybridiseringen" anvendte metode, overført på nitro-cellulosefilter. Nitrocellulosefiltrene blir deretter hybridisert under passende betingelser med de radioaktivt markerte pools human-lysozym-spesifikke 17-merer. Etter identifiseringen av tilsvarende kloner blir plasmid-DNA for hvert klon preparert og innfellingen i henhold til metoden til Maxam og Gilbert (kjemisk metode) eller Sanger (syntese med didesoksynukleotider) sekvensert.

Bestemmelsen av DNA-sekvensen fra cDNA-innfellingen

fra positive kloner gjør det mulig av dette å utlede aminosyresekvensen for det potensielle protein. Sammenligningen mellom denne sekvens og den publiserte HLZ-aminosyresekvens gjør det mulig å fastslå om den klonede cDNA virkelig inneholder den kodende region for HLZ-proteinet.

Generelt kan plasmid-vektorer, som stammer fra arter

som er forlikelig med vertscellene, anvendes i forbindelse med disse verter. Vektoren bærer vanligvis, ved siden av et replikasjonssted, gjenkjennelsessekvenser som gjør det mulig å seleksjonere fenotypisk i transformerte celler. For eksempel blir E. coli vanligvis transformert med pBR322^et plasmid som stammer fra E. coli-arten (Bolivar, et al., Gene 2, 95

(1977). pBR322 inneholder gener for ampicillin- og tetracyklin-resistens og leverer derved enkle midler til å identifisere transformerte celler. pBR322-plasmidet eller også andre må dessuten i seg selv inneholde promotere, eller de må være slik modifisert at de kan anvendes av mikroorganismen til ekspresjon av sine egne proteiner. Promoterene som hyppigst anvendes ved fremstilling av rekombinant DNA, inneholder e-laktamase-(penicillinase) og laktose-promoter-systemer (Chang et al., Nature 275, 615 (1978); Itakura et al., Science 198, 1056 (1977); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979) og tryptofan (trp) promoter-systemer (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980); EP-patentsøknad, publ.nr. 36 776). Mens de nevnte promotere er de som er mest brukt, er det i tillegg også utviklet og benyttet andre mikrobielle promotere. Gen-sekvensen for HLZ kan eksempelvis anvendes under kontroll av Leftward-promoteren til bakteriofagen Lambda (Pl)• Denne promoter er en av de mest kjente promotere, som er styrbar. Styringen blir mulig ved hjelp av lambda-repres-soren, av hvilken det er kjent nabo-restriksjonssnittsteder.

En mutasjon av dette gen, som koder for en termolabil repressor, kan innfelles i en vektor som inneholder en fullstendig HLZ-sekvens. Hvis temperaturen økes til 42°C, blir repres-soren inaktivert og promoteren eksprimert til sin maksimale konsentrasjon. Summen av mRNA som produseres under disse betingelser, burde være tilstrekkelig til oppnåelse av en celle som blant sine nye syntetiske ribonukleinsyrer inneholder ca. 10%

som stammer fra PL~promoteren.

På denne måte er det mulig å etablere en klonbank i hvilken det plasseres en funksjonell HLZ-sekvens i naboskap av et ribosom-bindingssted i varierende avstander til lambda-PL-promoteren. Disse kloner kan så undersøkes og slike med

det høyeste utbytte selekteres.

Ekspresjonen og translasjonen av en HLZ-sekvens kan

også foregå under kontroll av andre regulasjonssystemer, som kan gjelde som "homologe11 til organismen i dens utransformerte form. Således inneholder f.eks. kromosomal DNA fra en laktose-avhengig E. coli en laktose eller Lac-operon, som ved utfelling av enzymet /?-galaktosidase muliggjør laktosenedbrytning.

Lac-kontrollelementene kan oppnås fra bakteriofagen Lambda-plac5 som er infeksiøs for E. coli. Lac-operonet til fagen kan ved transduksjon stamme fra den samme bakterieart. Reguleringssystemer som kan finne anvendelse ved fremgangsmå-

ten i henhold til oppfinnelsen, kan stamme fra plasmidisk DNA

som er særegen for organismen. Lac-promoter-operator-systemet kan bli indusert ved IPTG.

Andre promoter-operator-systemer eller deler derav kan anvendes like godt: eksempelvis arabinose-operator, colicine E^-operator, galactose-operator, alkalisk fosfatase-operator, trp-operator, xylose A-operator, tac-promoter og lignende.

Fortrinnsvis kan en gjær-promoter bli koblet til den HLZ-kodende region på den måte at det blir en effektiv ekspresjon av HLZ. Spesielt bør gjærpromoteren bli posisjonert direkte før den region som koder for ferdig HLZ - med ett ved dette forbindelsessted innfelt translasjonsstartsignal (ATG). Videre kan denne HLZ-ekspresjonsmodul innfelles i forskjelligartede gjærvektorer for så å etablere disse i gjær, over kjente metoder for gjærtransformasjon. Gjærceller som inneholder hybridplasmider, kan dyrkes i forskjellige medier, og det ønskede produkt HLZ kan isoleres derfra og renses ved kjente metoder. Alternativt kan en gjærsignalsekvens innføres ved konstruksjonen av HLZ-ekspresjonsmodulen. I dette tilfelle er gjærceller som er blitt transformert med et slikt plasmid, i stand til å skille ut HLZ gjennom sin cellevegg til dyrkningsmediet, hvorfra det ønskede produkt - HLZ - kan utvinnes og renses videre.

Særlig foretrekkes gjærceller som vertsorganismer for ekspresjonen, da gjærceller er lette å dyrke, betingelsene for fermentering i stor målestokk er etablert og gjærsopper er fri for endotoksiner. Derfor kan ved den foreliggende oppfinnelse fortrinnsvis eukaryote mikroorganismer bli anvendt, såsom gjærkulturer. Saccharomyces cerevisiae er den mest anvendte blant de eukaryote mikroorganismer, selv om et antall av andre arter generelt er oppnåelig.

For ekspresjon i Saccharomyces anvendes vanligvis f.eks. plasmidet YRp7 (Stinchcomb. et al. Nature 282, 39 (1979);

Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschumper et al., Gene

10, 157 (1980)) og plasmidet YEp 13 (Broach et al., Gene 8,

121 - 133 (1979)). Plasmidet YRP7 inneholder TRPI-genet, som tilveiebringer en seleksjoneringsmarkering for en gjærmutant som er ute av stand til å vokse i tryptofan-fritt medium; eksempelvis ATCC nr. 44076. TRP1-delesjonen som karakteristikk for gjærvert-genomet utgjør da et virksomt hjelpemiddel for å påvise transformasjonen, da det dyrkes uten tryptofan. Helt i likhet med dette forholder det seg ved plasmidet YEp13, som inneholder gjærgenet LEU 2, som kan anvendes for komplettering av en LEU-2-mutant. Egnede promotersekvenser for gjærvektorer inneholder den 5 '-flankerende region av ADHI (Animerer, G. , Methode of Enzymology 101, 192 - 201, 1983), 3-Phosphoglycerat Kinase (Hitzeman, et al., J. Biol. Chem. 255, 2073, 1980) eller andre glykolytiske enzymer (Kawasaki og Fraenkel, BBRC 108, 1107 - 1112 (1982)), såsom enolase, glycerolaldehyd-3-fosfat-dehydro-•genase, heksokinase, pyruviatdekarboksylase, fosfofruktokinase, glukose-6-fosfat-isomerase, fosfoglukose-isomerase og glukokinase. Ved konstruksjon av egnede ekspresjonsplasmider kan de med disse gener assosierte terminasjonssekvenser likeledes bli innsatt i ekspresjonsvektoren ved 3'-enden til den sekvens som skal eksprimeres, for å bevirke polyadenylering og terminering av mRNA.

Andre promotere, som i tillegg også har fordelen av transskripsjon kontrollert ved hjelp av vekstbetingelsene, er promoter-regionene til alkohol-dehydrogenase-2, isocytokrom C, den sure fosfatase, de nedbrytende enzymer, som er koblet med nitrogen-metabolismen, den ovenfor nevnte glycerolaldehyd-3-fosfat-dehydrogenase og for de enzymer som er ansvarlig for metaboliseringen av maltose og galaktose. Promotere som regu-lerer ved hjelp av gjærsoppen Mating Typ Locus, eksempelvis promotere av genene BARI, MEC1, ste2, STE3, STE5 kan settes inn ved temperaturregulerte systemer ved anvendelse av tempera-turavhengige sir-mutasjoner. (Rhine, Ph.D. Thesis, University of Oregon, Eugene, Oregon (1979), Herskowitz og Oshima, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, part I, 181 -

209 (1981), Cold Spring Harbor Laboratory).

Disse mutasjoner har innflytelse på ekspresjonen av de hvilende Mating Typ-kassetter av gjærsopper og derved indirekte på de Mating Typ-avhengige promotere. Generelt er dog ethvert plasmid vektor som inneholder en gjærforlikelig promoter, originære replikasjons- og terminasjonssekvenser egnet.

Forekomst av den intakte HLZ dDNA-sekvens muliggjør at HLZ-genet for ekspresjon i andre mikroorganismer, såsom gjær, kan konstrueres. For ekspresjon i forbindelse med oppfinnelsen av HLZ i gjærceller kan derfor f.eks. slike sekresjonsplasmider bli anvendt som enten er sammensatt av elementene ADHI-promoter-a-faktor-leder-HLZ-gen-ADHII-terminator eller en av elementene a-faktor-promoter-a-faktor-leder-HLZ-gen-a-faktor-terminator. DNA-sekvensene av ADHI-promoteren, av ADHII-terminatoren og

av a-faktor-genet er kjent. (Jeffrey, L., et al., J. Biol.

Chem. 257, 3018-25, 1982; Russell, D.W. et al., J. Biol. Chem. 258, 2674 - 2682, 1983; Nucleic Acids Res. 12, 4049 - 4063,

1983).

Et på denne måte fremstilt HLZ-gen kan forbindes funk-sjonelt med en utvalgt gjær-promoter. En slik ekspresjonsen-

het kan dessuten integreres i forskjellige gjærvektorer. Disse kan transformere gjærsopper, hvilket fører til syntese av human-lysozym.

For ekspresjon av HLZ under foretrukken kontroll av ADHI-promoteren kan det konstrueres et plasmid som bak 3<1->enden til ADHI-promoteren inneholder den komplette a-faktor-leder.

Til 3'-enden av a-faktor-lederen ligeres den for ferdig HLZ kodende DNA-sekvens (HLZ-gen) i den riktige orientering til a-faktor-lederen. Foretrukket er en konstruksjon som lar det oppstå en eksakt N-terminus i det dannede HLZ. For den endelige konstruksjon til ekspresjons-kassetten blir ADHII-termina-torsekvensen, som bevirker den enhetlige terminering av HLZ-

genet og bidrar til stabilitet hos mRNA, slik innbygget at den kommer til å ligge direkte i tilknytning til stopp-codonet

10

i HLZ-genet. Et slikt ekspresjonsplasmid inneholder alle beskrevne elementer i den riktige rekkefølge og orientering til hverandre, såvel som de nøyaktige overganger mellom elementene ADHI-promoter, a-faktor-leder, HLZ-gen og ADHII-terminator. Særlig fordelaktig er det når forbindelsen mellom a-faktor-lederen og det derpå følgende HLZ-gen fremstilles slik at det proteasesnittsted som er ansvarlig for modningen av a-faktoren etter LYS ARG ligger nøyaktig foran sekvensen for den første aminosyre i det modne HLZ, slik at det oppnås en eksakt N-terminus for det ved hjelp av vertscellen dannede HLZ-protein.

En slik ekspresjonskassett kan ligeres i forskjellige gjærekspresjonsplasmider. Foretrukket for dette er multicoli-plasmidene YEp13 (Broach, J.R. et al., Gene 8, 121 - 133, 1979), PJDB207 (DSM 3181, deponert 28.12.1984), YIp5 (Struhl, K. et

al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 76, 1035 - 1039, 1979) og pEAS-102. Vektoren pEAS102 kan oppnås ved det at YIp5 fordøyes delvis med Pstl og fullstendig med BamHI og det isolerte 4,3 kb fragment (inneholder URA3-genet) ligeres med 4,4 kb BamHI/Pstl-fragmentet av pJDB207. Med disse gjærvektorer, som bærer en slik ekspresjonskassett, kan gjærceller av begge mating-typer transformeres ved kjente metoder. Det ved hjelp av slike trans-formater produserte og til kulturmediet frigitte HLZ kan lett isoleres ved hjelp av kjente metoder for proteinrensning.

Likeledes foretrukket kan ekspresjon av HLZ-genet også foregå under kontroll av a-faktor-promoteren. For dette innligeres den for ferdig HLZ kodende DNA-sekvens i den riktige orientering mellom a-faktor-promoteren og a-faktor-lederen.

For den fullstendige konstruksjon til ekspresjonskassetten blir a-faktor-promoteren anordnet etter tur med a-faktor-leder, HLZ-gen og a-faktor-terminator. Også i dette tilfelle fremstilles den samme overgang mellom 3'-enden til a-lederen og 5'-

enden til HLZ-genet, slik det er beskrevet ved fremstilling av ekspresjonskassetten under kontrollen av ADHI-promoteren.

En slik ekspresjonskassett kan innbygges i de allerede beskrevne gjærekspresjonsplasmider, med hvilke gjærceller så kan transformeres ved hjelp av kjente metoder.

Foretrukne verter er i dette tilfelle gjærstammer av mating-type a. Dyrkningen av slike transformanter og isole-ringen av det HLZ som settes fri ved hjelp av disse, foregår i henhold til kjente metoder.

Ved hjelp av disse konstruksjoner fremstår det en rekke fordeler: 1. Enhetlig terminering av mRNA og således større stabilitet for denne mRNA . 2. Enkel isolering av HLZ fra det overstående i dyrkningsmediet.

3. Høyere andel av HLZ med den riktige tertiærstruktur,

da disulfidbroer i det utskilte protein lettere kan

dannes enn inne i gjærcellen .

4. Ved sekreteringen blir signal- eller lederpeptidandelen eksakt separert fra det ferdige HLZ endoproteolytisk.

Derved får man en nøyaktig definert N-terminus for proteinet. Det modne HLZ-protein har et lysin ved N-terminus. Plasmidkonstruksjonen kan velges slik at proteasesnittstedet blir posisjonert ved sekresjonsplasmidet før lysincodonet. Derved er den første aminosyre i det utskilte HLZ -lysin. Ved intracellulær produksjon må et start-ATG (metionin) settes før den første aminosyre i det modne lysozym, for at translasjonen overhodet kan begynne. Dette metionin kan, hvis det ikke blir avspaltet ved hjelp av en cellulær mekanisme, virke svært forstyrrende (aktivitet, stabilitet, antigenisitet). 1 tillegg til mikroorganismer er kulturer av multicellu-lære organismer likeledes egnede verter for ekspresjon av HLZ.

I prinsippet er hver av disse kulturer anvendelig, hva enten

de stammer fra virveldyr- eller virvelløse dyrecellekulturer. Størst interesse er det dog for virveldyrceller, slik at formeringen av virveldyrceller i kultur (vevskultur) i de senere år er blitt en rutinemessig metode. (Tissue, Culture, Academic Press, Kruse og Patterson, Editors (1973.) Eksempler på slike nyttige vertcellelinjer er VERO- og HeLa-celler, gullhamster-eggstokk (CHO)-celler og W138, BHK, COS-7 og MDCK-cellelinjer.

Ekspresjonsvektorer for disse celler inneholder vanligvis (hvis det er nødvendig) et replikasjonssted, en promoter som er lokalisert før det gen som skal eksprimeres, sammen med ethvert nødvendig ribosombindingssted, RNA-spleisested, polyade-nyleringssted og transkripsjonene termineringssekvenser.

Ved anvendelse i pattedyrceller tas det ofte sikte på kontrollfunksjoner på ekspresjonsvektorene av viralt materiale. Eksempelvis stammer de vanligvis anvendte promotere fra polyoma, adenovirus 2, og særlig hyppig fra Simian virus 40 (SV 40). Begynnelses- og sluttpromoterene til SV 40 er særlig nyttige,

da begge lett kan oppnås fra viruset som fragment, som også inneholder det virale replikasjonssted for SV '40 (Fiers et al., Nature 273, 113 (1978). Også mindre eller større fragmenter av SV 40 anvendes, forutsatt at de inneholder den tilnær-

met 250bp lange sekvens som rekker fra Hindlll-snittstedet til Bgll-snittstedet i det virale replikasjonssted. Dessuten er

det likeledes mulig, og ofte å anbefale, å anvende promoter-eller kontrollsekvenser som normalt er forbundet med de ønskede gensekvenser, forutsatt at disse kontrollsekvenser er forlike-lige med vertcellesystemene.

Et replikasjonssted kan enten tilveiebringes ved tilsvarende vektorkonstruksjon, for å innbygge et eksogent sted, eksempelvis fra SV 40 eller andre virale kilder (f.eks. polyoma, adeno, VSV, PBV etc.) eller kan tilveiebringes ved hjelp av de kromosomale replikasjonsmekanismer i vertscellen. Hvis vektoren blir integrert i vertscellekromosomet, så er det for det meste tilstrekkelig med sistnevnte forholdsregel.

Transformasjon av cellene med vektorene kan oppnås ved hjelp av en rekke fremgangsmåter. Eksempelvis kan den foregå

ved hjelp av kalsium, hvorved enten cellene vaskes i magnesium og DNA tilsettes de i kalsium suspenderte celler, eller cellene blir utsatt for et kopresipitat av DNA og kalsiumfosfat. Ved etterfølgende genekspresjon blir cellene overført til medier som selekterer transformerte celler. Med polypeptider dreier det seg da ikke utelukkende om det modne human-lysozym (HLZ), som her er beskrevet i detalj, men også om slike som inneholder f.eks. forkortelse av molekyler ved den N- eller C-terminale ende, utbytting av aminosyrer med andre rester, hvorved aktiviteten ikke blir forandret vesentlig.

Det kan forekomme ikke bare gen-sekvenser som koder spesifikt for det angitte HLZ, men også slike sekvenser som koder for et polypeptid med aktivitetsspekteret for HLZ, og som hybridiserer med de viste sekvenser (eller deler av disse) under stringente betingelser (eksempelvis betingelser som selekterer for minst 85%, foretrukket mer enn 90% homologi).

Substansen som fremstilles i henhold til oppfinnelsen kan formuleres på kjent måte for oppnåelse av farmasøytisk anvendelige midler, hvorved polypeptidet vil bli administrert, enten alene eller sammen med andre komponenter, såsom forskjellige antibiotika (tetracyklin, bacitracin), enzymer (a-amylase, papin) eller vitaminer i blanding.

De følgende eksempler beskriver oppfinnelsen i detalj.

Kort beskrivelse av figurene

FIG. 1 viser resultatene fra primer.ekstensjons-eksperimentet,

ved hvilket Ei-0N19 og Ei-ON20 var primeren og matriksen den fra cellelinjen U-937 isolerte RNA.

FIG. 2 viser resultatene fra dot-blot-hybridiseringen.

FIG. 3a viser strukturen til HLZ cDNA (klon HL 14-1) og

3b strategien for bestemmelsen av nukleotidsekvensen til

HLZ-cDNA.

Fig. 4a viser DNA-sekvensen til HLZ cDNA-klon HL 14-1

4b viser restriksjonskartet til HLZ cDNA av klon HL 14-1. FIG. 5 viser sammenligningen mellom publisert HLZ-aminosyresekvens (øvre rekke) og den for cDNA til klon HL 14-1 avle-dede aminosyresekvens (nederste rekke).

FIG. 6 viser multikopihybridvektoren pEAS 102 (konstruksjon

og anvendelse, se tekst s. 10).

FIG. 7 viser forbindelsen mellom ADHI-promoteren og a-faktor-lederen og den videre konstruksjon til pWS215D, i hvilket HLZ-genet er forbundet med a-faktor-lederen i den riktige orientering. FIG. 8 viser såvel linker-ligeringen med Hindlll-linker (eksempel 8b) som den med Sali- og Hindlll-linker (eksempel 9b, fører til pWS208D), for det formål å innbygge HLZ-genet i den riktige orientering til a-faktor-leder resp. til a-faktor-promoteren resp. -terminatoren. FIG. 9 viser in vitro-mutagenese med de syntetiske oligonukleotider EBI 124 og EBI 234 med det mål å fremstille en eksakt overgang mellom a-faktor-lederen og HLZ-genet. FIG. 10 viser konstruksjonen av pWS235D, i hvilken den eksakte 3'-ende til HLZ-genet ble innbygget i den riktige orientering før ADHII-terminatoren. FIG. 11 viser øverst fjerning av det mellom HLZ-genet og ADHII-terminatoren liggende BamHI-sted (pWS25 7D) såvel som den endelige konstruksjon til ekspresjonskassetten (pWS290D).

FIG. 12 viser hvorledes a-faktor-genet fra puC13-derivatet

paF ble klonet som EcoRI-fragment i vektor V2 (puC18-derivat), til konstruksjon se eksempel 9a) (pWS230D).

FIG. 13 forklarer den vei som HLZ-genet ble forbundet i den riktige orientering med a-faktor-promoteren og -terminatoren (pWS231D). FIG. 14a og 14b viser fjerningen av det Pstl-sted som ligger nærmest 5<1->enden i a-faktor-genet (pWS294D) og ferdig-gjøring av ekspresjonskassetten pWS296D under kontrollen av a-faktor-promoteren ved ligering av det under fig. 9 viste mutageniserte Pstl-fragment A2 i det eneste Pstl-sted i pWS294D.

Eksperimentell del

I eksemplene benyttede forkortelser:

HLZ : human-lysozym

RPMI : Roswell Park Memorial Institut

TrisHCL : Tris-(hydroksymetyl)-aminometan, pH justert

med HC1

EDTA : Edtylendiamintetraeddiksyre

DEP : Dietylpyrokarbonat

SDS : Natriumdodecylsulfat

NaAc : Natriumacetat

BSA : Okseserumalbumin

DTT : 1,4-ditiotreitol (1,4-dimerkapto-2,3-butan-diol)

PCI : Fenol: kloroform: isoamylalkohol (15:24:1) Beta-NAD : B-nikotinamidadenindinukleotid

sscDNA : enkeltstreng-cDNA

E. coli : Escherichia coli

SSC : Oppløsning av: 0,15M NaCl, 0,015M natrium-citrat justert med 10N NaOH til pH 7.

Denhardts oppløsning: Oppløsning av 0,1% ficoll, 0,1% polyvinyl-pyrrolidon, 0,1% BSA

TBE : Oppløsning av 0,082M Tris, 0,082M borsyre,

0,002M EDTA pH 8

Eksempel 1: HLZ- aktivitetsbestemmelse fra cellelinje U- 937

Det er kjent at den hematopoetiske cellelinje U-937 fra mennesket produserer human-lysozym (16). For å benytte cellelinjen U-937 fra utgangsmaterialer i PolyA <+>RNA for syntese av HLZ-cDNA ble aktiviteten til HLZ bestemt, som ble satt fri til mediet ved hjelp av U-937-cellene. En frisk i RPMI 1640-medium (10% føtalt kalveserum, 100 enheter/ml (E/ml) penicillin, 50 E/ml streptomycin) inokulert U-937 cellelinjekultur ble dyrket ved 37°C i 3 dager til tetthet 3 x 10<5> celler/ml. Cellene ble fjernet ved sentrifugering og aktiviteten til HLZ som var satt fri i mediet bestemt ved metoden til Gold og Schweiger (17). Etter 2 timers inkubering med radioaktivt substrat ble mengden av frigjort radioaktivitet i alikvote volumdeler på 100(jl, som var tatt fra inkubas jonsblandinger på 2 ml, valgt. Som negativ kontroll tjente kun RPMI-medium. Den kvantitative bestemmelse av HLZ som var satt fri fra U-937-cellene, foregikk etter en oppstilt standardkurve (human-lysozym-aktivitet fra menneskemelk (Sigma) i RPMI-medium). I tabell 1 er resultatene vist.

Som vist i tabell 1, frigjør U-937-celler omtrent 1,5 ug HLZ pr. ml medium til RPMI-mediet. Av dette kunne man trekke den slutning at U-937-cellelinjen utgjør en brukbar kilde for

HLZ-mRNA.

Eksempel 2: Fremstilling av RNA som inneholder human- lysozym- mRNA

a. Isolering av total- RNA

Det histiocytiske lymfom cellelinje U-937 fra mennesket ble dyrket ved 37°C i RPMI-medium 1640 (10% føtalt kalveserum, 100 E/ml penicillin, 50 E/ml streptomycin) (16). Celler fra en 1,6-liters kultur ble samlet ved sentrifugering, vasket én gang med 50 ml iskald 1OmM Tris HCl pH 7,4 / 140 mM NaCl / 1,5 mM MgCl- og resuspendert i 10 ml iskald 10 mM Tri MCttC pH 8,4 / 140 mM NaCl / 1,5 mM MgCl2. Det ikke-ioniske syntetiske vaskemiddel Nonidet P 40 ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 0,5%. Suspensjonen ble hensatt 5 min. i is og deretter kraftig blandet i 10 sek. for lysering av cellemembranene. Kjernene ble deretter fjernet ved centrifugering ved 4°C. Til 10 ml overstående materiale ble det tilsatt: 0,5 ml 20% SDS, 0,25 ml 2M Tris HCl, P„ ri 9,0, 0,1 ml 500mM EDTA pH 7,5. Denne prøve ble tilsatt samme volum av frisk destillert, med 1OmM Tris HCl pH 8 / 1mM EDTA likevektsinnstilt fenol og rystet kraftig i 10 min. Deretter fulgte faseseparering ved sentrifugering. Den vandige fase ble ekstrahert to ganger som beskrevet ovenfor, og til slutt med samme volum av kloroform. 3M kaliumacetat (1/10 volum av den vandige fase) og deretter 2,5 volumdeler etanol ble tilsatt. Løsningen ble hensatt natten over ved -20°C, den utfelte RNA oppsamlet ved sentrifugering, vasket én gang med 3 ml 70% etanol og tørket i vakuum. RNA

ble oppløst i 3 ml vann, utfelt, samlet og tørket og oppløst igjen som angitt ovenfor. Utbyttet var ca. 8 mg RNA.

b. Isolering av polyA RNA

PolyA<+>RNA ble isolert fra total-RNA over oligo (dT)-cellulose (P-L Biochemicals Inc.). 0,5 g oligo (dT)-cellulose ble suspendert i sterilt vann og latt henstå natten over ved 14°C. Neste dag ble en med DEP-behandlet, sterilt vann vasket kolonne (Biorad Plastic, 18 cm, 0 1,5 cm) pakket med 0,5 g oligo (dT)-cellulose, vasket med 3 ml proteinase K (type XI, Sigma) og hensatt 15 min. ved romtemperatur. Proteinase K var

i 0,1 x pakkingspuffer (1x pakkingspuffer: 50mM Tris HCl pH 7,4, 1M NaCl, 1mM EDTA, 0,2% SDS) oppløst til en sluttkonsentrasjon på 1 mg/ml. Til slutt ble kolonnen vasket med 5 ml steril 0,1M NaOH, deretter med sterilt H20; til eluatet fikk en pH-verdi på 8, og endelig med 10 ml 1 x pakkingspuffer. Den i 500|al sterilt H20 resuspendert total-RNA ble fortynnet med 4,5 ml pakkingspuffer, oppvarmet i 5 min. ved 65°C (vannbad)

og med dette fylt i den preparerte oligo (dT)-cellulose-kolonne. Eluatet ble oppsamlet, igjen oppvarmet ved 65°C i 15 min. og igjen fylt i kolonnen. Kolonnen ble vasket med 7 ml pakkingspuffer for eluering av polyA-RNA. Fraksjoner på hver 1ml ble oppsamlet og OD2gQ for hver fraksjon målt. PolyA<+>RNA ble elu-ert med 5 ml sterilt vann. Såvel polyA-RNA som PolyA<+>RNA ble ved hjelp av 0,3M NaAc i nærvær av etanol utfelt ved -20°C

over natten.

Eksempel 3: Test på tilstedeværelse av HLZ- mRNA

a. Syntese av oligonukleotider med blandet sekvens

To pools av HLZ-homologe oligonukleotider med blandet sekvens ble syntetisert i henhold til fastfase-fosfotriester-metoden (20). For konstruksjonen av 17-mer-oligonukleotid-prøveblandingen (Ei-0N19 ble sekvensen til aminosyrerestene 63 - 68 (Tyr Trp Cys Asn Asp Gly) fra Nf^-terminus til human-lysozym-proteinet (21, 22, 23) frembragt. Ei-ON19-prøven besto av en blanding av 16 oliqonukleotider som følger:

For konstruksjon av 17-mer-oligonukleotid-prøveblandin-gen Ei-ON20 ble sekvensen av aminosyrerestene 26-31 (Ala Asn Trp Met Cys Leu) fra NH2~terminus til human-lysozym-proteinet (21, 22, 23) fremdratt. Ei-ON20-prøven besto av en blan-dina av 32 oliaonukleotider som følaer:

b. Primer- ekstensjons- analyse

Den fra U-937-cellelinjen isolerte mRNA ble analysert ved hjelp av primer-ekstensjons-metoden med hensyn på tilstedeværelse av HLZ-mRNA. Ved 5'-enden ble 100 ng av Ei-0N19 eller av Ei-ON20 i en reaksjonssats på 20ul markert radioaktivt i løpet av 60 min ved 37°C. Reaksjonsblandingen besto av 70 mM Tris HCl pH 7,6, 1mM MgCl2, 30 |jCi (Gamma-<32>p)ATP (5000 Ci/mmol, Amersham PB. 218) 100 ug/ml BSA, 1OmM DTT; 1mM spermidin og 2-4 enheter polynukleotid-kinase (New England Biolabs). Reaksjonen ble ved 10 min. oppvarming av blandingen avsluttet ved 70°C.

Primer-ekstensjons-reaksjonen er utført i et 40 /Ltl-reaksjonsvolum i 60 min ved 42°C. Reaksjonsblandingen besto av 50 mM Tris HCl, pH 8,3, 1OmM MgCl2, 1OmM DTT, 4mM natriumpyrofosfat, 1,25 mM dGTP, 1,25 mM dATP, 1,25 mM dCTP, 1,25 mM dTTP, 150 ng mRNA isolert fra U-937-cellelinjen, 40 ng radio-aktivmarkert Ei-0N19 eller Ei-ON20 og 200 enheter revers-transkriptase (BRL). Reaksjonen ble avsluttet ved tilsetning av 50 |il 50mM EDTA, deretter ekstrahert med PCI og felt med etanol. Produktene fra primer-ekstensjonen ble oppsamlet ved sentrifugering, tørket og oppløst i 20 ul av en farvet formamidløsning, bestående av 90% de-ionisert formamid, 10% 10 x TBE, 0,1% xy-lencyanol FF; 0,1% bromfenolblått.

Fra hver prøve ble det påført 10 ni på en 5% polyakrylamid/8M urinstoff-gel. Elektroforesen foregikk i 2 timer ved 15 watt. Etter tørking av gelen ble en Kodak X-Omat RP rønt-genfilm i en Kodak X-Omatic kassett C-2 svertet med denne. Resultatene fra dette eksperiment er vist i fig. 1.

Da begge primere Ei-0N19 og Ei-ON20 er komplementære

til HLZ-mRNA, kunne etter den reverse transkriptasereaksjon bestemte ekstensjonsprodukter fra disse på HLZ-mRNA-matriksen posisjonerte primere forventes (24). Da lengden av HLZ-

mRNA var ukjent, kunne lengden av den syntetiserte DNA ikke forutsies. Følgende kunne imidlertid fastslås: Primeren Ei-0N19 pardanner ved regionen på HLZ-mRNA, som koder for aminosyrerestene 63 - 68, slik at lengden av den syntetiserte DNA må utgjøre minst 203 bp + X (X er antallet av de nukleotider som teller med i ledersekvensen og i den ikke-kodende 5'-region). Samme beregning gir for primeren Ei-ON20 verdien 92 bp + X. Det kunne derfor ventes to bånd

som skulle adskille seg i sin størrelse med 111 bp. Av resultatene på grunnlag av fig. 1 kan man se at det med primeren Ei-0N19 oppnådde sterkeste bånd er omtrent 290 bp langt og

at lengden til det med primeren Ei-ON20 oppnådde sterkeste bånd er ca. 175 bp. Differansen mellom begge disse bånd (115 bp) ligger svært nær den forhåndsberegnede verdi, og det kunne derav trekkes den slutning at det analyserte mRNA-preparat som ble isolert fra cellelinjen U-937, inneholder HLZ-mRNA.

Eksempel 4: Konstruksjon av U- 937- cDNA- genbanken

a) Syntese av cDNA

Syntese av den første streng i cDNA ble utført i et reaks jonsvolum på 50 |il med følgende sammensetning: 50 mM Tris HCl pH 8,3, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 4 mM natriumpyrofosfat,

1,25 mM dGTP, 1,25 mM dATP, 1,25 mM dTTP, 0,5 mM dCTP, 20 |_iCi (Alpha-<32>p) dCTP (3000 Ci / mmol, Amersham, PB. 10205), 100 ug/ml Oligo d(T)18 (New England Biolabs), 40 - 100 ug/ml fra cellelinjen U-937 isolert polyA<+>RNA og 250 enheter revers transkriptase (BRL). Reaksjonen foregikk i 60 min. ved 42°C. Den ble avsluttet ved tilsetning av 50 ul 50 mM EDTA, og reaksjonsproduktene ble ekstrahert med PCI. RNA/DNA-hybrid ble utført med etanol/

2M NH^-acetat ved -20°C natten over. Mengdene av syntetiserte første strenger ble funnet ved bestemmelse av TCA av uløselig radioaktivitet. Fra én eneste reaksjon ble det oppnådd mellom 200 og 300 ng enkeltstrenget cDNA. For syntesen av den annen streng ble enkeltstrengen cDNA pelletert ved sentrifugering, vasket én gang med 80% etanol, tørket og oppløst i et passende volum H20. For å konvertere enkeltstreng-DNA (sscDNA) til dobbeltstreng-cDNA (dscDNA) kan opptil 500 ng sscDNA forarbei-des i et reaks jonsvolum på 100 (al. Reaks jonsblandingen besto av. 20 mM Tris HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 10 mM (NH4)2S04, 100 mM KC1, 0,15 mM Beta-NAD, 50 ug/ml BSA, 40 |aM dNTPs, 8 E/ml E. coli RNaseH (BRL), 230 E/ml DNA polymerase I (New England Biolabs), 10 E/ml E. coli DNA ligase (New England Biolabs). Reaksjonsblandingen ble etter hverandre i 60 min. inkubert ved 12°C og i 60 min. ved 22°C. Reaksjonen ble avsluttet ved tilsetning av EDTA til sluttkonsentrasjon 20 mM. dscDNA ble ekstrahert med PCI og utfelt som beskrevet ovenfor (15).

b) Kloning av dscDNA

En kloningsvektor med lav transformasjonsbakgrunn ble

preparert som følger: 300 |ag av pUC9 plasmid-DNA ble fullstendig fordøyet med restriksjonsendonuklease Pstl. Den fordøyde plasmid-DNA ble renset ved agarosegel-elektroforese, elektro-eluert og utfelt med etanol. En agarosegel-renset vektor gir i transformasjonseksperimenter ca. 1-2 kolonier/ng, mens transformasjonshastigheten med supercoiled pUC9 lå på ca. 2000 - 4000 kolonier pr. ng plasmid-DNA.

Med den på denne måte preparerte pUC9 plasmid-DNA ble det deretter i et reaks jonsvolum på 5 0 (al foretatt en homopolymer-tailing. Reaksjonsblandingen besto av 100 mM kalium-caco-dylat pH 7,5, 2 mM CoCl2, 0,2 mM DTT, 0,9 mM dCTP, 5 |aCi (5-<3>H) dCTP (19 Ci/mmol, Amersham TRK. 352), 5 mg/ml BSA, 28 (ag Pstl - snittet pUC9 plasmid-DNA og 45 enheter terminal transferase (PL-Biochemicals). Reaksjonsblandingen ble inkubert ved 22°C

i 5 min. og reaksjonen avsluttet ved tilsetning av 50 (al 25 mM EDTA og påfølgende inkubasjon i 15 min ved 70°C. Under disse betingelser ble det til-syntetisert ved hver 3<1->ende 22 nukleotider - en lengde som er nødvendig for maksimal transforma-sjonshastighet (19).

Homopolymer-tailingen av dscDNA med dGTP ble utført under samme betingelser, med unntagelse av at det ble anvendt ca. 100 ng av dscDNA pr. reaksjon med 30 enheter terminal transferase i 30 min. ved 37°C. Reaksjonen ble avsluttet ved tilsetning av 50 (al 25 mM EDTA og ved 15 min. varmeinaktivering ved 70°C. Den analytiske reassosiasjon av den med dGTP-hale forsynte dscDNA med den med dCTP-hale forsynte vektor pUC9 foregikk i 50 |al 10 mM Tris HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 150 150mM NaCl i 120 min. ved 58°C. De forskjelligartede forhold av dscDNA til vektor-DNA benyttet man seg av for å få frem det maksimalt oppnåelige antall kloner pr. anvendt mengde av dscDNA. Transformasjonen foregikk over CaC^ - kompetente E. coli RRI celler (19), idet 100(jl av disse celler ble blandet med 50 |al reasso-sias jons-reaksjonsblanding og dette deretter utplattert på LB-plater, som inneholdt 50 pg/ml ampicillin. Det forhold som ga det høyeste transformasjonstall, ble anvendt for "Scale-up"-eksperimenter for fastslåelse av den endelige cDNA-genbank.

Ved anvendelse av 50 ng dscDNA er det oppnådd 20 000 uavhengige kloner.

Eksempel 5: Klassifisering av U- 937- cDNA- genbanken for HLZ-kloner

a. Kolonihybridisering

For å finne frem til positive transformanter som inneholder et fragment eller det komplette HLZ-gen, foregikk først en "Screening" av cDNA-genbanken over kolonihybridisering. Ved transformanter som syntes å være positive, foregikk en ytterligere klassifisering over "dot-blot"-analyse.

Transformantene ble dyrket natten over på LB + ampicillin (50 ug/ml)-plater ved 37°C. Koloniene ble deretter overført til nitrocellulosef ilter (0,45 (am, Schleicher og Schuell) . Såvel plater som filtere ble kjennetegnet på den måte at de ville muliggjøre identifikasjon av positive transformanter. Filtrene ble omhyggelig lagt på platene, latt bero der i 20 min. ved romtemperatur (RT), så tatt opp og plassert på 0,5N NaOH/1,5M NaCl-mettet 3MM filter (3MM Chr, Whatman) (med koloniene oppad). For å fjerne et NaOH-overskudd ble nitrocellulosef iltrene etter 15 min. inkubasjon overført til et tørt 3MM filter og deretter latt bero i 3 min. på 3 MM filter sorn på forhånd var fuktet med 1M Tris CHl pH 7/1,5M NaCl. Filtrene ble deretter dyppet i 3 x SSC i 20 sek., lufttørket og ovnstør-ket ved 80°C i 2 timer. De på denne måte preparerte filtere

ble natten over ved 65°C i 3 x SSC, 0,1% SDS (Serva), 10 mM

EDTA forhåndsvasket under langsom rysting. Pufferen ble byt-

tet ut noen ganger. Forvaskingen ble ansett som avsluttet da det ikke kunne påvises noen spor av bakteriekolonier på filtrene. Umiddelbart etter vaskingen ble filtrene for-hybridisert i 6 x SSC, 1 x Denhardts løsning, 0,5% SDS, 100|ag/ml denatu-

rert kalve-tymus DNA (Sigma), 0,05% natriumpyrofosfat. Etter 3 timers inkubasjon ved 37°C ble filtrene natten over hybridisert ved 37°C med (gamma-<32>p)ATP markert 17-mer Ei-ON19. Hyb-ridiseringsløsningen inneholdt 6 x SSC / 1 x Denhardts løsning, 20|jg/ml gjær-tRNA (type XX, Sigma) 0,05% natriumpyrof osf at,

med polynukleotid-kinase endemarkert 17-mer Ei-ON19. Kinase-reaksjonen er beskrevet i eksempel 3. Etter hybridiseringen ble filtrene vasket i 6 x SSC, 0,05% natriumpyrofosfat som følger: 3 ganger i 5 min. ved RT, 3 0 min. ved 37°C, 10 min.

ved 47°C og 10 min. ved 53°C (valgfritt). Filtrene ble så luft-tørket, og en røntgenfilm (X-Omat RP, Kodak) ble svertet ved hjelp av en "Dupont intensifying screen" i 24 timer ved -70°C. Etter fremkalling av filmene ble 48 kolonier utvalgt, som uten tvil ga sterkere signaler i forhold til bakgrunnen, for videre analyser (dot-blot-analyse).

b. Dot- blot- hybridisering

2 ml-prøver av LB som inneholdt 3 0(ag/ml ampicillin ble inokulert med 4 8 utvalgte kolonier. Kulturene ble dyrket natten over ved 37°C under kraftig rysting. DNA ble preparert ved metoden til Birnboim og Doly (25). Hvert DNA-preparat ble oppløst i 67,5 11 H20, tilsatt 7,5 ul 4N NaOH og deretter inkubert i 1 time ved 65°C i vannbad. Prøvene ble så avkjølt i is, 20 ul 1,5 N HCl og 195 |il 2 x SSC etter hverandre tilsatt. Det totale volum av hver prøve utgjorde 290 [ il. Porsjoner av 145 ul ble filtert over et Bio-Dot-apparat (Bio-Rad) for å fiksere DNA på to nitrocellulosefiltere. Før filtreringen ble nitrocellulosefiltrene fuktet med 2 x SSC i 20 min. Etter filtreringen ble filtrene lufttørket og ovnstørket ved 80°C i 2 timer. Ett filter ble hybridisert med (gamma- 32p)ATP-markert Ei-0N19 17-mer, et annet med (gamma- 32p)ATP-markert Ei-ON20 17-mer. Hybridiserings- og vaskebetingelsene er beskrevet i eksempel

5a. Med filtrene ble en Kodak X-Omat RP røntgenfilm svertet i 6 timer ved -70°C. Seks kloner, som viste positive hybridi-

seringssignaler, ble identifisert og de opprinnelige transformanter betegnet med pHL2, pHL8, pHL 14-1, PHL21, pHL23 og pHL35. Størrelsen på cDNA-innfellingene i de utvalgte kloner ble bestemt ved restriksjonsanalyse. DNA fra de nevnte kloner, som ble isolert ved metoden til Birnboim og Doly, ble fordøyet med BamHI og Hindlll og separert i en 0,8% agarose-minigel i 4 timer (150 v). Plasmidene pHL14-1, pHL21 og pHL23 inneholder 500 bp lange innfellinger. Innfellingene fra pHL2 og pHL8

har en størrelse av 300 bp.

Eksempel 6: Struktur og DNA- sekvens for HLZ- cDNA ( klone HL14- 1)

En av de positive kloner (eksempel 5b) betegnet.HL 14-1, inneholder en ca. 500 bp lang innfelling og ble utvalgt for detaljert analyse. Strukturen til HLZ-cDNA er vist i fig. 3a.

20 ug pHLl4-1 plasmid-DNA ble fullstendig fordøyet med restriksjons-endonukleasene (BamHI og Hindlll, radioaktivt markert ved 5<1->enden med (gamma- <32>p)ATP (eksempel 3b) og deretter spaltet med en annen endonuklease. De på et sted merkede DNA-fragmenter ble separert ved polyakrylamid- eller agarose-gel-elektroforese. Merkede DNA-fragmenter ble gjenvunnet ved elek-troeluering og sekvensert etter metoden til Maxam og Gilbert (26). De øverste piler i fig. 3b viser retning og utstrekning for den ved denne metode gjennomførte sekvensanalyse; stjernene betegner radioaktivt merkede steder. Den interne del av pHLl4-1

-cDNA ble sekvensert ved metoden til Sanger (27). Det HLZ-cDNA-holdige BamHI- Hindlll restriksjonsfragment av pHLl4-1

ble partielt fordøyet med Mnll-restriksjonsendonuklease, forsynt med Klenow-polymerase ved metoden til Maniatis et al. (28) med ("blunt"-ender og klonet i den Smal-snittede vektor M13 mp9. Såvel alle DNA-manipulasjoner med M13 som sekvenseringen ble utført nøyaktig i henhold til den i Amersham-brosjyren "M 13 cloning and sequencing handbook" beskrevne metode. Res-triks jonsf ragmentene som er klonet og sekvensert i henhold til denne metode, vises i fig. 3b (nederste piler). Det er bare vist posisjonene til relevante restriksjonssteder i klon HL14-1. Tilstedeværelse av gjenkjennelsessteder for endonukleasene Mnll, Maelll og Hinfl ble bekreftet eksperimentelt.

Resultatet fra DNA-sekvenseringen er vist i fig. 4. Fra og med nukleotid 2 0 oppstrøms finnes en åpen leseramme i HLZ-cDNA-sekvensen. Nukleotidene 62 - 451 tilsvarer nøyaktig aminosyresekvensen for human-lysozym (fig. 5), fulgt ved transla-sjons-terminasjonscodonet TAA. Nukleotidene 20- 61 som koder for 14 hovedsakelig hydrofobe aminosyrer: 5' Ile Val Leu Gly Leu Val Leu Leu Ser Val Thr Val Gin Gly LYS VAL osv., koder for en del av HLZ-leder- eller signalpeptidet, i likhet med hos andre sekreterte proteiner (29). Aminosyresammensetnin-gen ved tilknytningsstedet ("splice junction") i human-prelysozym er svært lik det fra hønseeggehvite-lysozym (Gin Gly LYS VAL for human-prelysozym mot Leu Gly LYS VAL for hønseegge-hvite-lysozym (Weisman L.S. et al., J. Biol. Chem., 261, 2309 - 2313, 1986).

Eksempel 7: Konstruksjon av pHL14- 2 3

For konstruksjon av ekspresjonsplasmidet for fremstilling av HLZ ble den lengste 5'-enden av HLZ-innfellingen (klon HL14-1, plasmid pHL14-l) kombinert med den lengste 3<1->enden av HLZ-innfellingen (klon HL23, plasmid pHL23) - eksempel 5b. 3'-enden til HLZ-DNA av pHL23 har sekvensen

5'-enden og til Pstl-stedet (fig. 4) tilsvarer DNA-sekvensen av pHL14-l. Ca. 1 av pHL23 ble fordøyet med Pstl og Hindlll ved 36°C (50 mM Tris HCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl) og separert i en 1% agarosegel.

Det fra agarosegelen i henhold til metoden til Dretzen,

G. (Dretzen, G. et al., Anal. Biochem. 112, 295- 298, 1981) isolerte 260 bp PstI/HindIII-fragment inneholder 3'-enden til HLZ-strukturgenet. Dette fragment (ca. 500 ng) ble ligert i pHL14-1 (ca. 50 ng), etter at det 190 bp lange Pstl/Hindlll-fragmentet var fjernet fra pHLl4-1. Ligeringen av DNA ble utført i en 20 \ å1 sats ved 14°C natten over i ligeringspuf f er

(66 mM TrisHCl pH 7,6, 6,6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1mM rATP) såvel som 1U T4 DNA ligase og ligaseblandingen anvendt for transformasjon av kompetente celler av E. coli HB101 i henhold til kjente metoder (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, S. 220, 1982).

Eksempel 8: Konstruksjon av en ekspresjonskassett under kontroll

av ADHI- promoteren

a. Spleising av ADHI- promoteren til a- faktor- lederen

Det ble gått ut fra pUC18-derivat pES103, som inneholder ADHI-promoteren som 1,5 kb langt BamHI/XhoI-fragment. Isteden-for pES103 kan YEp13 (ATCC 37 115) benyttes på samme måte (Ammerer, G., Methods in Enzymology, 101, 192 - 201, 1983).

Ved siden av Xhol-stedet befinner det seg et Pstl- og et Hindlll-sted, slik at et 250 bp langt HindIII/PstI-fragment fra a-faktor-genet av paF som inneholder en stor del av a-faktor-lederen (fig. 7), kan innligeres mellom Hindlll- og Pst-stedet av pES-103. DNA-sekvensen til HindIII/PstI-fragmentet med a-faktor-lederen er publisert (Singh, A. et al., Nucleic Acid Res. 11 (12), 4049 - 4063, 1983).

For dette ble 1 |ig pES103 og 5|jg paF fullstendig fordøyet i 50 mM TrisHCl pH 8,0, 0,10 mM MgCl2, 50 mM NaCl ved 36°C

med Hindlll og Pstl og ligert som beskrevet ovenfor (eksempel 7), hvorved ca. 50 ng pES103 (Hindlll/Pstl) og ca. 500 ng paF (Hindlll/Pstl) ble anvendt. Det fremkommende plasmid, transformert i E. coli HB 101, med den riktige orientering av a-faktor-lederen til ADHI-promoteren ble kalt pWS205D. De ved tilknytningsstedet til ADHI-promoteren manglende 25 bp ved a-faktor-ledersekvensen samt ATG-startcodonet ble erstattet

med en i henhold til fosfotriester-metoden (Efimov, V.A., et al., Nucleic Acid Res. 10, 6675 - 6694, 1982) syntetisert 40-mer-oligonukleotid. For dette formål ble 1|ag av pWS205D fullstendig fordøyet med Xhol og Pstl i 50 mM TrisHCl pH 8,0, 0,

10 mM MgCl2, 50 mM NaCl ved 36°C. Det med Xhol- og Pstl-ender forsynte oliqonukleotid

ble ligert med XhoI/Pstl-snittet pWS205D: oligonukleotidene ble tatt opp i en konsentrasjon av 10pMol/|al vann, i hvert tilfelle 5|al av løsningene av begge DNA-strenger kombinert, 10 min. ved 65°C oppvarmet og etter avkjøling til romtemperatur ble 1|j1 av denne løsningen anvendt for ligasereaksjon ved ligasepuffer og under de betingelser som er beskrevet i eksempel 7. Det fremkomne plasmid pWS209D inneholder således den ca.

1,5 kb lange region med ADHI-promoteren og den komplette a-faktor-leder like til begynnelsen av den kodende region i a-faktoren.

b. Spleising av a- faktor- lederen med HLZ- genet

Da a-faktor-ledersekvensen i pWS209D slutter med et Hindlll-sted og HLZ-genet i pHLl4-23 begrenses ved 3'-enden

av et Hindlll- og ved 5'-enden av et Sall-sted, ble pHl4-23 fullstendig fordøyet med Sali i 6 mM TrisHCl pH8,0, 6 mM MgCl2, 150 mM NaCl ved 3 6°C og de tiloversblevne ender oppfylt med Klenow-polymerase (totalt volum 25 |al i ligasepuffer som i eksempel 7, 0,5 ug snittet DNA, i hvert tilfelle 100 (aM dATP, dTTP, dCTP, dGTP, 1 U Klenow-polymerase, 30 min. romtemperatur). Den påfølgende rensning av de butt-endede Sall-fordøyelsespro-dukter foregikk i 1% agarosegel. Deretter fulgte linkerligeringen med en syntetisk Hindlll-linker (New England Biolabs)

(Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring, Harbor Press, S. 316, 1982). Linkeren ble tatt opp i en konsentrasjon av 1 (jg/|al vann. Kinaseringen av Hindlll-linkeren foregikk i en reaks jonsblanding av 1 |al 10x linkerkinaseringspuf f er (0,66 M TrisHCl pH 7,9, 10 mM ATP; 10 mM spermidin, 0,1 M MgCl2, 150 mM DTT, 2 mg/ml BSA), 1 (al linker, 6 (al H20 såvel som 2 U T4 DNA kinase ved 37°C i 1 time. Linkerligeringen med den kinaserte Hindlll-linker ble utført med ca. 0,5 |ag/jal av den

Sali og Klenow-polymerase behandlede pHLl4-23 i 10 (al 1 x lin-kerkinaseringspuffer med 10 U T4 DNA ligase ved 14°C natten over. Med det oppnådde plasmid pWS2 0 7D, i hvilket HLZ-genet nå flankeres av to Hindlll-sted, ble E. coli HB101 transformert .

Etter Hindlll-fordøyelsen av 1 ug pWS207D (50 mM TrisHCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 36°C) kunne nå HLZ-genet innligeres i Hindlll-snittet pWs209D (5 (ag) som HindIII-fragment bak a-faktor-lederen. For ligasereaksjonen ble det etter sepa-rasjon og isolering av HindIII-fragmentene i Iprosentig agarosegel (Dretzen et al., se ovenfor) anvendt ca. 50 ng av pWS207D og ca. 500 ng av pWS209D i en 20 |al sats bestående av ligeringspuffer (66 mM TrisHCl pH 7,6, 6,6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM DTT, 1 mM rATP og 1 U T4 DNA ligase). Reaksjonen foregikk ved 14°C natten over. Det oppståtte plasmid ble benevnt pWS215D, som inneholder HLZ-genet i den riktige orientering til a-faktor-lederen resp. til ADHI-promoteren.

c. Eksakt overgang mellom a- faktor- leder og HLZ- gen

For fremstilling av en eksakt N-terminus i HLZ-genet

er det nødvendig at proteasesnittstedet, som er ansvarlig for ferdigstillelse av a-faktoren, blir posisjonert eksakt før sekvensen for den første aminosyren i det ferdige HLZ. Således må de overskytende nukleotider (ca. 2 0 dG-dC-par) som stammer fra konstruksjonen av cDNA, såvel som den andel av nukleotider som koder for den autentiske HLZ-leder-sekvens, bli fjernet .

Plasmid pWS215D ble fullstendig fordøyet med Pstl (50 mM TrisHCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 36°C) og et 500 bp langt fragment, som inneholder en stor del av a-faktor-lederen såvel som 5<1->enden av HLZ-genet, isolert fra en 1 prosentig agarosegel. (Dretzen et al. se ovenfor), reklonet etter Carter, P. et al., i M13 amp18-am4 og transformert til E. coli-stammen TG1 .

En rekombinant fag, som oppviser den ønskede orientering, A2, ble benyttet som utgangsmateriale fra enkeltstreng-DNA for mutagenese in vitro. Matriks-DNA ble preparert som

for dideoksy-sekvenseringen (M13 cloning and sequencing handbook, Amersham International plc, Amersham UK). Et 20-mer-oligonukleotid EBI124, som inneholder den ønskede overgang

mellom a-faktor-leder og HLZ-gen, og et 17-mer-seleksjonsoligo-nukleotid EBI234, som korrigerer den i M13-vektoren tilstedeværende ambermutasjon, ble syntetisert i henhold til fosfotriester-metoden (Efimov, v.A. et al., Nucleic Acid Res. 10, 6675 - 6694, 1982), renset over preparativ polyakrylamidgel-elektroforese og anvendt som primer for syntesen av den annen DNA-streng. Oligonukleotid-mutagenesen ble utført i det vesentlige ved metoden til Zoller, M.J. og Smith, M. DNA 3, 479 - 488, 1984: 150 pmol av seleksjonsoligonukleotidet EBI234 med sekvensen og 150 pm av den mutagene primer EBI124 med sekvensen

ble fosforylert med 4 U T4 polynukleotid-kinase (New England Biolabs) i 20 ul 50 mM TrisHCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 1 mM rATP,

5 mM DTT ved 37°C i 45 min. og deretter oppvarmet ved 70°C

i 10 min. De kinaserte primere, hver 7,5 pmol, ble hybridisert mot 0,5 pmol matriks-DNA i 10 fil 10 mM TrisHCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, hvorved det ble oppvarmet til 100°C i 3 min. og deretter avkjølt til romtemperatur i løpet av 1 time. Den renaturerte blanding ble avkjølt i is, volumet justert til 20 (al 10 mM TrisHCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 25 mM NaCl, 0,25 mM dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) 0,25 mM rATP og primeren utvidet med 1 U av det store fragment fra DNA-polymerase I (Biolabs)

i nærvær av 10 U T4 DNA-ligase (Biolabs). Reaksjonen ble utført ved 14°C i 16 timer. Små alikvoter av blandingen av 0,1, 1,5 og 10 (al ble så benyttet til å transf ektere kompetente celler av E. coli HB2154 (supressor-fri) mens cellerasen ble fremstilt med HB2155 (Carter P., et al., Nucleic Acid Res. 13, 4431 - 4443, 1985).

Av de 222 ved hjelp av den transfekterte DNA oppnådde plater ble 84 overført til en LB-plate til det utviklet seg kolonier av infiserte bakterier (37°C, 16 timer). En nitrocellulose-"blot" ble preparert og klassifisert med det <32>p-markerte mutagene oligonukleotid EBI124. Nitrocellulose-filteret ble forhåndsvasket i 6 x SSPE (0,9 M NaCl, 0,06 M NaH2P04, 6 mM EDTA) ved romtemperatur i 5 min., forhybridisert i hybridiseringspuffer (6 x SSPE, 1% Sarkosyl (Sigma), 100 |ag/ml tilfeldig spaltet tRNA) i 15 min ved 37°C og hybridisert ved romtempera-

tur (22°C) i 16 timer i hybridiseringspuffer med 0,4 x 10g

-32

cpm/ml prøve. Prøven ble 5'-endemerket med (y P) ATP som følger: 30 pmol av den mutagene primer EBI124 ble fosforilert med 4 U T4 polynukleotidkinase (Biolabs) i 20 ul 50 mM TrisHCl pH 7,6, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM spermidin, 100 ug/ml BSA og 10 pmol (y~ P) ATP (5000 Ci/mmol, Amersham) ved 37°C

i 45 min. Reaksjonsblandingen ble deretter kromatografisk renset på Biogel P-6DG (Biorad) i TE-puffer (10 mM TrisHCl

-32

pH 7,5, 1 mM EDTA) for å skille ikke-innbygget (y P) ATP

fra de <32>P-merkede oligonukleotider.

Etter hybridiseringen ble filtrene vasket 3 ganger i

6 x SSC (0,9 M NaCl, 0,09 M Na-citrat) ved romtemperatur i

5 min. og 1 gang i forhåndsoppvarmet 6 x SSC ved 37, 47,5,

50 og 56°C i 5 min. og autoradiografert etter hver vaskeprosess. Den ved 56°C (TD+2°C) utførte autoradiografi gjorde en klon synlig, A2/25, som hybridiserte sterkt mot det mutagene oligonukleotid. Den sannsynlige mutantfag ble platerenset, igjen klassifisert for identifisering av ren mutantfag og sekvensert for verifisering av delesjonen.

Dobbelstrenget DNA fra klon A2/25 ble preparert i henhold til Yanisch-Perron et al. (Yanish-Perron et al., Gene 33, 103 - 119, 1985) og spaltet med Pstl (ca. 5 ug i 50 mM TrisHCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 36°C).

Det 440 bp lange Pstl-fragment, som nå oppviser den ønskede overgang mellom a-faktor-leder og ferdig HLZ, ble isolert fra en 1 prosentig agarosegel som beskrevet (Dretzen et al., se ovenfor) og anvendt for de nedenfor nærmere beskrevne ligeringer (eksempel 8e og 9d).

d. ADHII- Terminator og 3'- ende av HLZ- genet

ADHII-terminatoren (Beier, D.R., Young, E.T., Nature

.300, 724 - 728, 1982; Russell, D.W. et al., J. Biol. Chem.

258, 2674 - 2682, 1983) ble isolert fra plasmid pAS5 på den måte at 5 \ xq av pAS5 med Sphl/Xbal ble fordøyet (6 mM TrisHCl pH 7,4, 6 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 1 mM DTT; 36°C) og som beskrevet isolert fra en 1 prosentig agarosegel. DNA-sekvensen til ADHII-terminatoren er beskrevet av Russell, D.W. et al., (se ovenfor). Fordøyingen av pUC18 (Vieira, J. Messing, J., Gene 19, 259 - 268, 1982; Yanisch-Perron et al., Gene 33, 103 - 119, 1985) ble utført med SphI og Xbal under de ovenfor angitte

betingelser. Deretter ble ca. 50 ng av den fordøyede vektor og ca. 500 ng av ADHII-terminatoren (Sphl/Xbal-fragment) i en reaks jonssats på 20 (al i ligeringspuf f er (66 mM TrisHCl pH 7,6, 6,6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM rATP) ligert med 1 U T4 DNA-ligase ved 14°C natten over. Med det oppnådde plasmid pWS213D ble E. coli HB101 transformert.

Da HLZ-DNA fra pHLl4-23 etter stoppcodonet fremdeles oppviser ytterligere nukleotider fra en ikke-kodende region, såvel som en strekning av 2 0 dC-dG-par, som stammer fra frem-stillingen av cDNA, ble disse fjernet. For dette formål ble PHL14-23 fordøyet med Maelll (20 mM TrisHCl pH 8,0, 6 mM MgCl2, 360 mM NaCl, 1 mM DTT, 45°C) og isolert (Dretzen et al, se ovenfor).

Det oppnådde 280 bp lange MaeIII-fragment ble snittet

nøyaktig i stoppcodonet og inneholder 3'-enden til HLZ-genet.

De gjenstående ender ble oppfylt med Klenow-polymerase, idet ca. 0,5 (ag av den med Maelll snittede DNA i et totalt volum av 25 |al ligasepuffer (se ovenfor) ble bragt til reaksjon med i hvert tilfelle 100 |aM dATP, dTTP, dCTP, dGTP og 1 U Klenow-polymerase i 3 0 min. ved romtemperatur. Ca. 1 |ag pWS213D ble fordøyet med Smal (6 mM Tris HCl pH 8,0, 6 mM MgCl2, 20 mM KC1) ved 36°C og det butt-endede MaeIII-fragment av pHL14-23 (ca. 500 ng) ligert inn i Smal-stedet av pWS213D (ca. 50 ng)

(betingelser som beskrevet ovenfor).

Det fremkomne plasmid med den riktige orientering for HLZ-genet til ADHII-terminatoren ble kalt pWS235D. Dette plasmid inneholder 3'-enden til HLZ-genet til inklusive stoppcodonet og i tillegg ADHII-terminatoren. Mellom HLZ-genet og ADHII-terminatoren befinner det seg dessuten et BamHI- og et Xbal-snittsted, som stammer fra multikloningsstedet til plasmid

pUC18. Da BamHI-stedet forstyrrer ved videre konstruksjoner, ble det fjernet. For dette formål ble pWS235D snittet med BamHI ved 36°C (6 mM TrisHCl pH 8,0, 6 mM MgCl2, 150 mM NaCl,

1 mM dtt), de gjenstående ender oppfylt med Klenow-polymerase

(se ovenfor) og en Sall-linker innbygget etter de allerede beskrevne betingelser (eksempel 8b). Det fremkomne plasmid ble kalt pW257D og med dette E. coli HB101 transformert. For-bindelsessekvensen mellom 3'-enden til HLZ-genet og 5'-enden til ADHII-terminatoren lyder:

1= 3'-ende av HLZ, fordøyet med Maelll og oppfylt

med Klenow-polymerase, med stoppcodonet TAA

2= Restandel av Smal-kloningsstedet (pWS213D)

3= Åpnet og med Klenow-polymerase oppfylt BamHI-sted 4= Sall-linker (New England Biolabs)

5= Annen ende av BamHI-stedet fra 3 (åpnet og oppfylt med Klenow-polymerase)

6= Xbal-sted og start av ADHII-terminatoren e. Konstruksjon av ekspresjonskassetten

Det i eksempel 8b konstruerte plasmid pWS215D (ca.

1 1g) ble fordøyet med Pstl og Hindlll (betingelser som i ek-smepel 8a), hvorved det totale HLZ-gen såvel som en stor del'

av a-faktor-lederen ble snittet ut med det oppnådde 4,2 kb-fragment. Under de samme betingelser ble pWS257D fordøyet med Pstl og Hindlll og det oppnådde fragment ligert med ADHIII-terminatoren og 3'-enden av HLZ-genet inn i Pstl/Hindlll-stedet. Ligasereaksjonen var som beskrevet ovenfor (eksempel 8d). I

det oppnådde plasmid pWS218D ligger 3'-enden til HLZ-genet, som ender méd stoppcodonet, så vel som i tilknytning til dette ADHII-terminatoren direkte ved begynnelsen av a-faktor-lederen. For ferdiggjørelse av ekspresjonskassetten mangler fremdeles en stor del av a-faktor-lederen og 5'-enden til HLZ-genet, såvel som den korrekte overgang mellom disse to elementer. Derfor ble det i eksempel 8c fremstilte mutageniserte 4 40 bp lange Pstl-fragment (ca. 500 ng) ligert inn i Pstl-snittstedet av pWS218D (ca. 50 ng) ved de ovenfor beskrevne betingelser. Plasmidet med den riktige orientering av det 440 bp lange Pstl-fragment (5'-enden til HLZ-genet og størstedelen av a-faktor-lederen (3'-ende)) til ADHI-promoteren, resp. til 3'-enden av HLZ-genet ble benevnt pWS290D.

Plasmidet pWS290D inneholder således alle beskrevne elementer i den riktige rekkefølge og orientering til hverandre, såvel som de modifiserte, eksakte overganger mellom de enkelte elementer: 1450 bp ADHI-promoter, 260 bp a-faktor-leder (ender med en sekvens, som koder for et proteasesnittsted), 390 bp

■ i rv I \ J HLZ-gen (begynner med et lysincodon med påfølgende sekvens

for det ferdige HLZ-protein og ender med stoppcodonet til HLZ-genet) , 330 bp ADHII-terminator.

f. Ekspresjon av HLZ i gjær

Ekspresjonskassetten pWS290D (5^g) ble fordøyet med Hindlll og BamHI ved 36°C (50 mM TrisHCl pH 8,0 , 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl) og ligert inn i den likeledes med Hindlll og BamHI snittede multikopivektor pJDB207 (1ug).

Såvel ekspresjonskassetten pWS290D (5 ng) som multikopi-vektoren pJDB207 (1 ug) (Beggs, J.D., Gene cloning in yeast,

i: Williamson, R. (Ed.), Genetic engineering, Vol. 2, Academic Press, London 1981, 175 - 203; DSM 3181) ble fordøyet med Hindlll og BamHI ved 36°C (50 mM TrisHCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl). Inn i det således åpnede multikopiplasmid pJDB207 (ca.

50 ng) ble det preparerte HindIII/BamHI-fragment (ca. 500 ng) ligert (20 ul sats med ligeringspuffer og under de betingelser som er angitt i eksempel 7, med 1 U T4 DNA-ligase). Med dette plasmid 129/29 ble forskjellige hetero-talliske gjærstammer av Saccharomyces cerevisiae transformert som følger (Beggs, J.D., Nature 275, 104 - 109, 1978): Fra en over natten i YPD

(1% Bacto gjærekstrakt, 2% Bacto pepton, 2% glukose) dyrket forkultur ble det inokulert 10 7 celler/ml i 50 ml YPD og 2 generasjoner dyrket ved 28°C (vanligvis i 3 timer). Ved 5000 opm ble sentrifugering utført i 5 min, cellene resuspendert i 5 ml SED (1 M sorbitol, 25 mM EDTA pH 8,0, 50 mM DTT) og rystet langsomt i 10 min. ved 30°C. Ved 1600 opm ble sentrifugering utført i 5 min., det ble resuspendert i 5 ml SCE (1 M sorbitol, 0,1 M Na3 citrat, pH 5,8, 10 mM EDTA), 100 ul av dette tatt ut suspendert i 2,9 ml H20. Dannelse av sfæroblaster ble målt ved 600 nm. Deretter foregikk en behandling med 50 (al glusulase under langsom rysting ved 28°C: Etter forskjellige tidspunkter ble det igjen tatt ut 100 ul sfæroblaster, suspendert i 2,9 ml H20 og E^qq bestemt.

Da ekstinksjonen ved 600 nm var sunket til ca. 30%

av utgangsverdien (for det meste etter 20 - 30 min.), ble cellene avsentrifugert (bordsentrifuge) ved 1600 opm. Sfæroblas-tene ble vasket én gang med 5 ml CaS (1 M sorbitol, 10 mM CaCl2, 10 mM TrisHCl pH 7,5), langsomt avsentrifugert igjen og tatt opp i 0,5 ml CaS. Alikvote mengder av sfæroblaster ble tatt

ut, 1 ug plasmid-DNA (129/29) tilsatt (ved større volumer av DNA-løsning må denne innstilles til 1M sorbitol), hensatt 15 min. ved romtemperatur og 1 ml PEG (20% v/v PEG 4000, 10 mM CaCl2, 10 mM TrisHCl pH 7,5, steril-filtrert) tilsatt. Dette ble hensatt i 15 min. ved romtemperatur, avsentrifugert ved 1600 opm (bordsentrifuge), pelleten resuspendert i 150 ul SOS

(1 M sorbitol, 33% v/v YPD, 6,5 mM CaCl2, 13,5 ug av den fil-tersteriliserte aminosyre, som det seleksjoneres på) og hensatt i 20 min. ved 30°C. Denne blanding ble lett rystet i 3 ml ved 45°C forhåndsavkjølt toppagar (1 M sorbitol, 2,5%

agar, 0,67% BYNB wo aa (Bacto gjasr-nitrogenbase uten aminosyrer), 2% glukose, 1% 100 x aminosyre-mix), helt ut på bunn-agarplater (2% agar, 0,67% BYNB wo aa, 2% glukose, aminosyremix slik som ved toppagar) og dyrket i 2 - 4 dager ved 3 0°C.

Den 100 x aminosyremix - leu inneholdt i hvert tilfelle

2 g/l adeninsulfat, arginin, uracil, asparagin, glutamin, his-tidin, metionin, lysin, tyrosin, fenylalanin, valin, treonin, tryptofan. Transformerte gjærstammer (Saccharomyces cerevisiae) ble dyrket på sc-leu (0,67& Bacto-gjær nitrogenbase uten aminosyrer, 5% glukose, 1% 100 x aminosyremix -leu) ved 30°C.

Følgende tabell viser resultatene fra lysozym-ekspresjonen. Mengdeverdiene av lysozym ble bestemt ved spesifikk anti-stoff binding til lysozym (Elisa-test).

Eksempel 9; Konstruksjon av en ekspresjonskassett under kontroll av a- faktor- promoteren

Publiserte arbeider (Bitter, G.A. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81, 5330 - 5334, 1984; Brake, A.J. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81, 4642 - 4646, 1984) beskriver innfelling av heterologe gener mellom Hindlll og Sall-stedet til a-faktor-genet. Derved virker sekvensen mellom EcoRI-

og Hindlll-stedet som promoter og som lederpeptid, sekvensen mellom Sali og EcoRI som transkripsjonsterminator.

a. Kloning av g- faktoren i en egnet vektor

a-faktor-genet ble isolert fra pUC13-derivatet paF (5ug) som EcoRI-fragment (100 mM TrisHCl pH 7,5, 5 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 36°C) og klonet i vektoren V2. Vektoren V2

ble konstruert som følger: pUC18 ble spaltet med Saml og Hindlll endene oppfylt med Klenow-polymerase som allerede beskrevet,

og den gjenværende andel av pUC18 religert, slik at den oppnådde vektor V2 bare bærer tre (EcoRI, Sstl, Kpnl) av de opprinnelige 10 kloningssteder. Således inneholder vektor V2 intet Hindlll-og Sall-sted mer, slik at de eneste snittsteder for begge disse enzymer befinner seg i a-faktor-genet. Vektor V2 (1 ug) ble fordøyet med EcoRI og ca. 500 ng EcoRI-fordøyet paF ligert i ca. 5 0 ng EcoRI-fordøyet V2 (ligasereaksjon som beskrevet i eksempel 7). Det oppnådde og i E. coli HB101 transformerte plasmid pWS230D ble anvendt for videre konstruksjoner (eksempel 9b, c). Pstl/Bglll-fragmentet av plasmid pWS230D (fig. 14a) inneholder den omtrent 900 bp lange promoter. Det ved siden av dette liggende Pstl-sted ligger ca. 25 bp innenfor det trans-laterte område.

Ca. 25 bp før Pstl-stedet, som er nabo til de fire HindIII-steder, såvel som at det ligger videre oppstrøms, befinner de for transkripsjon av a-faktor-genet nødvendige DNA-regioner seg. Ledersekvensen til a-faktoren begynner ca. 25 bp til venstre for dette annet Pstl-sted (ATG) og ender temmelig nøy-aktig ved det første av de fire Hindlll-steder. Lengden utgjør ca. 280 bp. Terminatoren ligger mellom Sali- og EcoRI-stedet.

b. Spleising av HLZ- genet med a- faktor- genet

For at HLZ-genet kan bli innebygget i den riktige orientering til a-faktor-promoteren resp. -terminatoren, må restrik-sjonssnittstedenes Hindlll og Sali, som flankerer DHL14-23,

bli ombyttet. For dette formål ble ca. 5 ug av pHL14-2 3 snittet med Sali (6 mM TrisHCl pH 8,0, 6 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 36°C) resp. Hind III (50 mM TrisHCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 36°C), de gjenstående ender i hvert tilfelle oppfylt

med Klenow-polymerase (0,5 ug snittet DNA i 25 ul reaksjons-

volum som i eksempel 8b) og reaksjonsblandingen renset i 1 prosentig agarosegel. En Hindlll-linker (New England Biolabs) ble innligert i Sali- (pWS207D) og en Sall-linker (New England Biolabs) i Hindlll-stedet (pWS206D) (i hvert tilfelle ca. 0,5 ug/ul av DNA-fragmentene), som beskrevet i eksempel 8b, og transformert i E. coli HB101. De oppnådde plasmider pWS206D og pWS207D (hvert ca. 5ug) ble snittet med EcoRI og Pstl (50 mM TrisHCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 36°C) og ligert til hverandre under betingelsene fra den ovenfor beskrevne ligasereaksjon (eksempel 7), hvorved plasmid pWS208D ble oppnådd.

Også her oppviser den i eksempel 8d beskrevne 3'-ende av HLZ-genet det problem at etter stoppcodonet er det videre nukleotider tilstede. Av denne grunn ble 3'-enden til HLZ-genet forkortet like til stoppcodonet på følgende måte: Plasmid pWS257D (konstruksjon i henhold til eksempel 8d) inneholder 3'-enden til HLZ-genet like til stoppcodonet, i tilknytning . til dette et Sall-sted såvel som ADHII-terminatoren, som dog er uten betydning for denne konstruksjon. Plasmidene pWS208D og pWS257D ble fullstendig fordøyet med Sali og Pstl (Pstl i 50 mM TrisHCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 36°C; 1 time, hvoretter NaCl-konsentrasjonen ble øket til 150 mM og Sali tilsatt) og renset i en 1 prosentig agarose og isolert (Dretzen et al., se ovenfor). Sall/Pstl-fragmentet av pWS257D,

som inneholder 3'-enden fra HLZ-genet, erstatter Sall/Pstl-fragmentet fra pWS208D, idet fragmentet fra pWS257D (ca. 500 ng) ble ligert inn i Sall/Pstl-stedet av pWS208D (ca. 50 ng) som . beskrevet ovenfor. Det fremkomne plasmid pWS212D inneholder nå det komplette HLZ-gen som Hindlll&Sall-fragment, hvorved HLZ-genet ender ved 3'-enden med stoppcodonet. Plasmidene pWS212D og pWS230D (eksempel 9a) ble fullstendig fordøyet med Hindlll og Sali (Hindlll i 50 mM TrisHCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 36°C, 1 time, NaCl-konsentrasjonen ble forhøyet

til 150 mM og Sali tilsatt), slik at det. fra pWS212D utsnittede HLZ-gen kunne innligeres som Hindlll/Sall-fragment (ca. 500 ng)

(isolert fra en 1 prosentig agarosegel som beskrevet ovenfor)

i den med Hindlll/Sall åpnede vektor (ca. 50 ng) (ligasereaksjon som beskrevet i eksempel 7). I det fremkomne plasmid pWS231D ligger HLZ-genet nå i den riktige orientering til a-faktor-promoteren og -terminatoren.

c. Fjerning av et Pstl- sted fra a- faktor- genet

a-faktor-genet inneholder 2 Pstl-steder. Det som ikke ligger i det kodende område, er svært til hinder for den videre konstruksjon, slik at dette ble fjernet på følgende måte: Plasmid pWS230D (konstruksjon, se eksempel 9a) ble partielt snittet med Pstl, idet 10 ug pWS230D ble fordøyet i 50 mM TrisHCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl med 10 U Pstl i 10 min. ved 36°C. Fra en 1 prosentig agarosegel ble de fragmenter isolert som nøyaktig oppviser et snitt (fragmentene B og C

i fig. 14a). For total fordøyelse av de 3'-gjenstående ender med Mung Bean Nuclease ble ca. 1 ug av den således oppnådde lineariserte DNA fra pWS230D tatt opp i 13 ul H20 og 2 ul 10 mM ZnCl2, 1 ul 4 M NaCl, 2 ul 0,3 M natriumacetat pH 4,75, 2 ul Mung Bean nuklease (300 U, Pharmacia) •■ tilsatt. Denne blanding ble hensatt i 15 min. ved romtemperatur og deretter direkte påført en 1 prosentig agarosegel og fragmentene isolert fra gelen (Dretzen et al., se ovenfor). Deretter foregikk relige-ring av fragmentene B og C (betingelser som vist i eksempel 7), hvorved Pstl-stedet, som var blitt snittet ved den parti-elle fordøyelse, ble ødelagt og de ikke-snittede ble bibeholdt. På denne måte kunne et plasmid bli isolert i hvilket det ønskede Pstl-sted ikke mer var tilstede og det annet allikevel var bibeholdt (C). Såvel dette plasmid (C) som pWS23lD ble fullstendig fordøyet med Pstl og Bglll (50 mM TrisHCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 36°C). Det isolerte C2-fragment (850

bp) fra C (ca. 500 ng) ble innligert i PstI/BglII-fordøyet pWS231D (ca. 50 ng) (ligasereaksjon som beskrevet i eksempel 7), slik at plasmid pWS294D ble oppnådd.

Dette plasmid pWs294D inneholder nå et a-faktor-gen med et Pstl-sted, i hvilket 3'-enden til HLZ-genet er innfelt 1 den riktige orientering.

d. Konstruksjon av ekspresjonskassetten

Plasmid pWs294D inneholder a-faktor-promoteren og begynnelsen på a-faktor-peptidet like til Pstl-snittstedet (ca.

2 0 bp lederpeptid) såvel som dertil tilknyttet 3<1->enden til

HLZ-genet fra og med Pstl-stedet til stoppcodonet. For en fullstendig ekspresjonskassett mangler fremdeles 3'-enden til a-faktor-lederen, 5'-enden til HLZ-genet såvel som den korrekte overgang mellom begge disse elementer. Plasmid pWS294D (ca.

1 ug) ble fullstendig fordøyet med Pstl (50 mM TrisHCl pH 8,0,

10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 36°C) og det mutageniserte 440 bp lange Pstl-fragment fra plasmidet A2/25 (eksempel 8c) (ca.

500 ng) tilsvarende eksempel 8e innligert i Pstl-stedet av pWS294D.

Det oppnådde plasmid pWS296D inneholder ekspresjonskas-

setten som består av 900 bp promotersekvens fra a-faktor-gen,

260 bp a-faktor-leder (identisk med den i eksempel 8e beskrevne lengde av sekvensen), 390 bp HLZ-gen (identisk med den i ek-

sempel 8e beskrevne lengde av sekvensen), 290 bp a-faktor-termi-

nator.

Claims (5)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av humant lysozym (HLZ), karakterisert ved at a) en vertscelle, fortrinnsvis en gjærcelle, transformeres med

en ekspresjonsvektor, hvorved denne ekspresjonsvektor inneholder i) en ADHl-promotor eller en a-faktor-promotor, ii) en a-faktor-leder, iii) et DNA-molekyl som koder for HLZ og har sekvensen eller eller en sekvens som er minst 85 % homolog med en av de ovenstående sekvenser og som koder for biologisk aktivt HLZ, iv) en a-faktor-terminator eller en ADHII-terminator, b) vertscellen dyrkes under betingelser som gjør at HLZ blir uttrykt og utskilt, c) det oppdelte HLZ isoleres og renses.

2. Rekombinant DNA-molekyl, karakterisert ved at det består av: a) en nukleotidsekvens som koder for humant lysozym (HLZ), og som er valgt blant følgende sekvenser: eller b) en sekvens som koder for en a-faktor-leder i gjær, knyttet til 5<1->enden av a).

3. Ekspresjonsvektorer som omfatter DNA-molekylet angitt i krav 2, karakterisert ved at de er plasmidet pWS 215D (fig. 7), pWS290D (fig. 11), pWS231D (fig. 13) eller pWS296D (fig. 14b).

4. Rekombinant DNA-molekyl som koder for HLZ, karakterisert ved at et HLZ-gen er forbundet med en ledersekvens i gjær og at det er minst 85 % homologt med et DNA-molekyl i henhold til krav 2, og som koder for biologisk aktivt HLZ.

5. Transformert gjærcelle, karakterisert ved at den inneholder et rekombinant DNA-molekyl i henhold til et av kravene 2 til 4, og som kan uttrykke det gitte gen.