NO163407B - Analogifremgangsmaate for fremstilling av nye terapeutisk aktive guaninderivater. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstilling av nye derivater av guanin for selektiv bekjempelse av virus slik som herpes virus, osv., som kan forårsake forskjellige sykdommer hos dyr inkludert menneske. Slike sykdommer innbefatter både vanlige infeksjoner og neoplastiske sykdommer, dvs. kreft.

Effekten av virus på kroppsfunksjoner er sluttresultatet

av endringer som forekommer ved de cellulære og sub-

cellulære nivåer. Patogene forandringer på det cellulære nivå er forskjellig for forskjellige kombinasjoner av viruser og vertceller. Mens noen viruser kan bevirke en generell ødeleggelse (dreping) av visse celler, kan andre omdanne celler til en neoplastisk tilstand.

Viktige vanlige virale infeksjoner er herpes dermatitis (inkludert herpes labialis), herpes keratitis, herpes genitalis, herpes zoster, herpes encefalitis, infektiøs mononukleose og cytomegalovirusinfeksjoner som alle for-årsakes av viruser tilhørende herpes virusgruppen. Andre viktige virale sykdommer er influensa A og B som for-

årsakes av influensa A- og B-virus, respektivt. En annen viktig vanlig viral sykdom er viral hepatitt og spesielt er hepatitt B-virusinfeksjoner utbredt. Effektive og selektive antivirale midler er nødvendig for behandling av disse sykdommer, samt for andre sykdommer forårsaket av virus.

Flere forskjellige viruser av både DNA- og RNA-typen er

blitt vist å bevirke tumorer hos dyr. Effekten av cancerogene kjemikalier kan på dyr resultere i aktive-

ring av latente tumorviruser. Det er mulig at tumor-

viruser er involvert i humane tumorer. De mest sannsyn-

lige humane tilfeller som er kjent i dag, er leukemier, sarkomer, brystkarsinomer, burkitt-lumfomer, nesesvelg-karsinomer og cervicalkrefttyper hvor RNA-tumorviruser

I •

og herpesviruser er indikert. Dette gjør forsknirigen vedrørende selektive inhibitorer for tumorogene viruser og deres funksjoner til en viktig bestrebelse på å behandle cancer.

Guaninderivater er tidligere beskrevet i følgende refe-ranser: Synthetic Communications 2 (6), 345-351 (|l972) , US patent 4.199.574, US patent 4.355.032, europeisk patentsøknad 82401571.3 (publikasjonsnummer 74 .30J6) og europeisk patentsøknad 81850250.2 (publikasjonsnummer 55.239); den sistnevnte referanse beskriver antiyirale forbindelser med formelen:

hvor R^ og R£ kan være valgt fra hydrogen, hydroksy og fluor. i

De ovennevnte nye terapeutisk aktive guaninforbinclelsene som fremstilles ifølge oppfinnelsen, har den generelle formel:

hvor m er 1 eller 2,

i

n er 1 eller 2, hvorved m er 1 når n er 2, og m er 2 når n er 1,

R' er (CH„) OH eller COOH,

3. Z p

p er 1-4,

R£ og R£ er uavhengig valgt fra hydrogen eller (CH2)pOH, forutsatt at minst en av R£ eller R£ er hydrogen; eller R£ og R£ som sammen utgjør en ytterligere karbon-karbon-binding, gir dannelse av et alkyn, og med den ytterligere forutsetning at når m er 2, og n er 1, og Ra er (Cf^pOH, så er p 2-4;

eller et fysiologisk akseptabelt salt, geometrisk eller optisk isomer derav.

Forbindelsene med formel (I) utøver en antiviral effekt og inhiberer visse virale funksjoner inkludert tumorogene funksjoner og multiplisering av viruser. Videre har forbindelsene med formel (I) spesiell høy affinitet til viral tymidinkinase som er meget viktig for antiviral aktivitet når forbindelsene anvendes i celler med et høyt nivå tymidin.

De ovenfor definerte forbindelser med formel (I) og deres geometriske isomerer og fysiologisk akseptable salter derav er således nyttige for terapeutisk og/eller profylaktisk behandling av virussykdommer, og som kan være nyttig for terapeutisk og/eller profylaktisk behandling av kreft forårsaket av virus.

Et effektivt, selektivt antiviralt middel med akseptable bivirkninger bør ha en selektiv inhiberende effekt på

en spesifikk, viral funksjon hos det virus som skal be-kjempes. Det er derfor et formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe nye forbindelser for bekjempelse av virusinfeksjoner som representerer antivirale midler

som utøver en selektiv inhiberende effekt på virale! funksjoner, men som bare utøver en ubetydelig inhiberende effekt på vertcellenes funksjoner.

i

Et spesielt viktig område for bruk av forbindelsene'; i foreliggende oppfinnelse er for behandling av herpes virusinfeksjoner. Blant herpes virusene kan nevnes herpes simplex type 1 og 2, varicella (herpes zoster), virus som bevirker infektiøs mononukleose (dvs. Epstein-Barr virus)

og cytomegallovirus. Viktige sykdommer forårsaket av

i herpes viruser er herpes dermatitis (inkludert herpes labialis), herpes genitalis, herpes keratitis, herpes encefalitis og herpes zoster.

i

1 Et annet mulig område for bruk av forbindelsene med formel (I) er for behandling av kreft og tumorer, spesielJ de som er forårsaket av viruser. Denne effekt kan oppnås på forskjellige måter, dvs. ved inhibering av transformasjonen av virusinfiserte celler til en neoplastisk tilstand, ved inhibering av spredningen av virus fra transformerte celler til andre normale celler og ved å stoppe veksten av virustransformerte celler.

i i

Et annet bruksområde for forbindelsene i foreliggende oppfinnelse er inhibering av transformerte celler p.g.]ia<. >tilstedeværelsen i disse celler av spesifikke herpe's virus-enzymer slik som tymidinkinase.

i

Mulige bruksområder for forbindelsene med formel I m.h.t. kreft-kjemoterapi er behandling av leukemier, lymfcmer inkludert Burkitt-lymfomer og Hodgkin's sykdom, sarkomer, brystkarsinomer, nese-svelg-karsinomer og cervikalkrefttyper i hvilke virus er indikert. Alle mulige bruksområder for forbindelsene i foreliggende oppfinnelse med hensyn til kreft-kjemoterapi er behandling av multiple myeloma og kreft i lungene (og bronkiene), maven, leveren, tarmen, blæren, leppene, knoklene, nyrene, eggstokkene, prostata, buksputtkjertelen, huden (melanoma), rectum, spyttkjertlene, munnen, spiserøret, testiklene, hjernen (og hjernens og ryggmargens hinner), skjoldbrusk-kjertelen, galleblæren (og kanaler), nesen, strupen, for-bindelsesvev, penis, vulvae, vagina, livmoren og tungen.

Som en oppsummering kan det nevnes at forbindelsene med

formel (I) har spesiell anvendelse for:

a) behandling av sykdommer forårsaket av virus hos dyr inkludert menneske; b) inhibering av multiplisering av virus, spesielt herpes virus hos dyr, inkludert menneske;

c) behandling av virusinduserte, neoplastiske sykdom-

mer hos dyr inkludert menneske, ved inhibering av veksten

av celler som uttrykker virale funksjoner;

d) inhiberin<g> av veksten av virustransformerte celler hos dyr inkludert menneske; . e) behandling av virusinduserte neoplastiske sykdommer hos dyr inkludert menneske, ved inhibering av multiplikasjonen av tumorviruser; f) behandling av neoplastiske sykdommer hos dyr inkludert menneske.

De nye forbindelsene i foreliggende oppfinnelse har enten formelen:

hvor m er 1 eller 2, og n er 1 eller 2, hvorved m er 1 når

n er 2, og m er 2 når n er 1, R<3>' er (CH_) pOH eller COjOH, og hvor p er 1-4 med den ytterligere forutsetning at hår m er 2, og n er 1, og R' er (CH-) OH, så er p 2-4; eller

a * P

et fysiologisk akseptabelt salt eller optisk isomer derav; eller formelen:

hvor R£ og R£ uavhengig er valgt fra hydrogen eller (CH2)pOH, hvor p er 1-4, med den forutsetning at minst en av R£ og R£ er hydrogen, eller R£ og R£ sammen utgjør en ytterligere karbon-karbon-binding for dannelse av et alkyn; eller et fysiologisk akseptabelt salt eller geometrisk isomer■derav.

Forutsetningen i definisjonen av m, n og Ra ■ ovenfor, '!betyr at følgende spesifikke forbindelser, inkludert salter og optiske isomerer derav, utgjør en del av foreliggende oppfinnelse: Forbindelsene med formel II inneholder et asymmetrisk senter når og (CH2) OH er forskjellig. Følgelig eksisterer de i to optiske former som utgjør et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen.

Følgende spesifikke forbindelser, inkludert salter og geometriske isomerer derav, omfattes av de nye forbindelsene:

Når R£ ikke er CH^OH, så eksisterer forbindelsen som to geometriske isomerer,

Forbindelsene med formel (I) omfatter følgende forbindelser: j 9-[4-hydroksy-2-(hydroksymetyl)butyl]guanin, j 9- [4-hydroksy-3-karboksybutyl]guanin,

9-[hydroksy-3-karbamoylbutyl]guanin,

9-[4-hydroksy-3-formylbutyl]guanin,

9-[4-hydroksy-3-ureidobutyl]guanin, 9-[5-hydroksy-3-(hydroksymetyl)pentyl)guanin, 9-[6-hydroksy-3-(hydroksymetyl)heksyl)guanin, 9-[4-hydroksy-2-karboksybutyl]guanin, j 9-[4-hydroksy-2-karbamoylbutyl]guanin, i 9-(4-hydroksy-2-formylbutyl]guanin, 9-[4-hydroksy-2-ureidobutyl]guanin, 9-[4-hydroksy-2-(hydroksyetyl)butyl]guanin, 9-[5-hydroksy-2-(hydroksyetyl)pentyl)guanin, 9-[6-hydroksy-2-(hydroksyetyl)heksyl]guanin, 9-[4-hydroksy-3-(hydroksymetyl)-2-butenyl]guanin, 9-(4-hydroksy-2-butenyl)guanin, cis-9-(4-hydroksy-2-butenyl)guanin,. 9- (4-hydroksy-2-butynyl)guanin.

En foretrukken undergruppe av forbindelser i foreliggende oppfinnelse oppnås når Ra ' er (CH2)pOH slik som hydroksy-met<y>l eller hydroksyetyl.

Ytterligere foretrukne forbindelser i oppfinnelsen jer 9- [4-hydroksy—3-(hydroksymetyl)-2-butenyl]guanin og cis-9-(4-hydroksy-2-butenyl)guanin.

Forbindelsen med formel III, hvor R£ og R£ danner en binding, har antiviral aktivitet, og nevnte forbindelse kan også virke som et mellomprodukt for forbindelser med formel III,

i

hvor R^ og R£ er hydrogenatomer.

j

I

Fremstillingsmetoder

Forbindelsene med formel (I) fremstilles ifølge oppfinnelsen ved en av de nedenstående fremgangsmåter A-E.

A. Kondensasjon av en acyklisk syrekjede, hvor de funksjonelle gruppene eventuelt kan være beskyttet, til N-9-stillingen i et guaninderivat, fulgt av fjerning av de beskyttende gruppene, gjennom en eller flere kjemiske reaksjoner.

hvor m, n og R31 . er som definert ovenfor i formel I. X 3og Y er generelt valgt fra grupper som kan reagere med hverandre for dannelse av en optisk beskyttet forbindelse med formel I. Xa er f.eks. en gruppe slik som klor, brom, jod, eller en gruppe OSO_R_ hvor R_ er alkyl inneholdende 1-8 karbon-

£. 13 / 3

atomer, fluorert alkyl inneholdende 1-8 karbonatomer slik som trifluormetyl, arylalkyl slik som benzyl, eller!aryl.

Y er f.eks. hydrogen eller et kvartært ammoniumion slik

som tetrabutylammonium. R^a er hydrogen eller en beskyttende gruppe av hvilken en rekke forskjellige er kjent for fagmannen på området (se f.eks. "Protective Groups in Organic Chemistry", T. W. Greene, Wiley 1981; "Methoden

der Organischen Chemie", Houben-Weyl VI/lb; og "Comprehensive Organic Chemistry", D. H. R. Barton and W. D. Ollis, utgivere, 1979, vol. 1, side 623-629.

Noen eksempler på R, er acylgrupper slik som acetyl eller

ja

benzoyl, alkoksykarbonyl- eller aryloksykarbonylgrupper, silylgrupper slik som f.eks. tert.-butyldimetylsilyl, arylalkyl slik som benzyl og triarylmetyl eller SO^ _R_ / a hvor R.. <(l har den ovenfor angitte betydning.

R2~ a er Ra ' som definert ovenfor i formel I, eller kan i være

CN, COORga, CH(OR9a)2, CH(SRga)2, NHCONHR^ eller (CH2)pOR9a hvor p har den ovenfor angitte betydning, RoQ a er subtstituert silyl eller som definert ovenfor for R_ og R_ er som

7a ^ 9a

definert ovenfor for RQ , eller RD og RQ kan i tillegg sammen med R^a danne en toverdig gruppe, dvs. et cyklisk derivat slik som f.eks. en lakton eller en annen cyklisk ester, ortosyre, acetal, eter eller forbindelse av silyltypen. RD , SL er hydroksy, klor, brom, jod, merkapto, alkyltio inneholdende 1-8 karbonatomer, S0 c0. R- I . Si som definert ieller

et oksygenderivat OR^ga hvor R-^Qa er alkylaryl slik; som benzyl, substituert silyl, fosforyldiester, fosfinojtioyl eller S0oR_, hvor R-, er som definert. R. og Rr er like

2 7a 7a 4a 3 5a

eller forskjellige og er R^a som definert.

i i Kondensasjonen utføres fortrinnsvis i et organisk oppløsnings-middel slik som f.eks. dimetylformamid, etanol, acejtonitril eller diklormetan, ved en temperatur mellom 0 og 10u°C i

fra en time til tre dager i nærvær av en base (når Y er H), slik som f.eks. kaliumkarbonat.

i

Etter kondensasjon blir forbindelsene hydrolysert ved 0-100°C i 1-24 timer med syre eller base slik som f.eks. eddiksyre, saltsyre' (1-35%) i vann, natriumhydroksyd (1-20%) i vann, ammoniakk (1-25%) i vann eller metanol, eller hydrogenert med hydrogengass i et organisk oppløsnings-middel slik som f.eks. etanol eller dimetylformamid over en metallkatalysator i 1-24 timer ved et trykk på 100-5000 kPa (1-50 atmosfærer). Når R2a er CH(SRga)2, kan hydrolysen utføres med en reagens slik som merkuriklorid i et separat trinn.

B. Kondensasjon av en umettet sidekjede hvor de funksjonelle gruppene eventuelt kan være beskyttet, til N-9-stillingen i et guaninderivat med base-katalyse fulgt av reduksjon og/eller fjerning av beskyttende grupper

hvor R. , R,- og R, har den ovenfor angitte betydning,

4 cl D 3. DS

R, . er CN, CONH- eller COORQ , og RK er COORp^ eller 14a 2 oa 3 15a oa

R,c er C00Ro eller CHo0RQ . hvor R„ og RQ har den oven-loa Oa ^ "a oa ya

for angitte betydning og i tillegg sammen kan danne] en toverdig gruppe, dvs. et cyklisk derivat slik som f.eks.

et lakton eller en annen cyklisk ester, ortosyre, acetal, eter eller forbindelse av silyltypen, og R16a er CONH2,

COOH eller CH2OH.

Kondensasjonen utføres fortrinnsvis i et organisk oppløsnings-middel slik som f.eks. dimetylformamid, etanol, ace'tonitril eller diklormetan, ved en temperatur mellom 0 og 10p 1 oC i fra en til tre dager i nærvær av en base-katalysator slik som f.eks. kaliumkarbonat, natriummetoksyd, natriumhydrid eller tetrabutylammoniumhydroksyd.

i

i

C. Reduksjon eller selektiv reduksjon av Iderivati-serte eller aktiverte karboksylsyregrupper, fulgt ajv fjerning av beskyttende grupper, i

hvor m, n, R, , R. , Rc og R, har de ovenfor angitte

3a 4a 5a 6a \ betydninger, R' er R, som definert ovenfor eller en

lia ba j gruppe slik som (CH3^ 2N-CH0~ * et aktivert karboksyl-syrederivat, R12a er <R>2a eller en gruppe (CH2^ p-<i>C0Rna' hvor R„ , R, ,. og p har den ovenfor angitte betydning, og

za 11 a 2

R.- er R1 eller R som definert ovenfor. \

13a a a |

Reduksjonen kan utføres med hydrogengass eller hydrogen utviklet in situ, med et metall som katalysator eller, fortrinnsvis, et hydrid-reduksjonsmiddel i et organisk oppløsningsmiddel.

D. Kondensasjon av en acyklisk sidekjede, hvor de funksjonelle gruppene eventuelt kan være beskyttet, til N-9-stillingen i et guanidinderivat, fulgt av fjerning av de beskyttende grupper, gjennom en eller flere kjemiske reaksjoner.

hvor R^ og R£ har den ovenfor angitte betydning i formel I. og Y er generelt valgt fra grupper som kan reagere med hverandre for dannelse av en eventuelt beskyttet forbindelse med formel I. x, er f.eks. en gruppe slik som klor, brom, jod eller en gruppe OSC^Rg^ hvor Rgb er alkyl inneholdende 1-8 karbonatomer, fluorert alkyl inneholdende 1-8 karbonatomer slik som trifluormetyl, arylalkyl slik som benzyl, eller aryl. Y er f.eks. hydrogen eller et kvartært ammonium-

I

ion slik som tetrabutylammonium. er hydrogen eller en hydroksybeskyttende gruppe, og fagmannen kjenner en jrekke forskjellige slike grupper (se f.eks. Protective Groups in Organic Chemistry", T. W. Greene, Wiley 1981;

"Metoden der Organischen Chemie", Houben-Weyl VI/lb; og "Comprehensive Organic Chemistry", D. H. R. Barton og W. D. Ollis eds., 1979, vol. 1, side 623-629.

Noen eksempler på R^ er acylgrupper slik som acetyl eller benzoyl, alkoksykarbonyl- eller aryloksykarbonylgrupper, silylgrupper slik som f.eks. tert.-butyldimetylsilyl, arylalkyl slik som benzyl og triarylmetyl, eller S02R8b hvor Rgk har den ovenfor angitte betydning. i

""<*-\> i

R2j3 er R^ og R^^ er R£ som definert ovenfor' i formel I, eller begge kan være (CI^) p ORg^, hvor p er 1-4, og Rg^ er som: definert for R 3b# og Rg^ og R3b er like eller forskjellige, og kan ytterligere sammen danne en toverdig gruppe, dvs. et cyklisk derivat slik som f.eks. en karbonatester, tiokarbonatester eller de tilsvarende ortosyre-cykliske derivatene, eller forbindelser av typen cyklisk acetal. R^ er hydroksy, klor, brom, iod, merkapto, alkyltio inneholdende 1-8 karbonatomer, S0_Ro,

Z OD

hvor Rgtø er som definert eller et oksygenderivat OR^qj-, hvor R10b er a-*-kyl' arylalkyl slik som benzyl, substituert silyl, fosforyldiester, fosfinotioyl eller S0„Ro, hvor

Z OD j

Rgb er som definert. R5b og er like eller forskjellige, og er R^ som definert.

Kondensasjonen utføres fortrinnsvis i et organisk opp-løsningsmiddel slik som f.eks. dimetylformamid, etanol, acetonitril eller diklormetan, ved en temperatur mellom 0 og 100°C i fra en time til tre dager i nærvær av en base (når Y er H), slik som f.eks. kaliumkarbonat. j

i i

Etter kondensasjon blir forbindelsene hydrolysert ved 0-100°C i 1-24 timer med syre eller base slik som f.eks. eddiksyre, saltsyre- (1-35%) i vann, natriumhydroksyd (1-20%)

i.

i vann, ammoniakk (1-25%) i vann, eller metanol.

E. Kondensasjon av en umettet sidekjede, hvor de funksjonelle gruppene eventuelt kan være beskyttet, til N-9-stillingen i et guaninderivat med metallkatalyse, fulgt av fjerning av de beskyttende gruppene, gjennom en eller flere kjemiske reaksjoner.

hvor R£, R£, R2b, R4b, <R>5b,<R>6b og R?b har den ovenfor angitte betydning.

Kondensasjonen utføres fortrinnsvis i et organisk opp-løsningsmiddel slik som f.eks. dimetylformamid, etanol, acetonitril eller diklormetan, ved en temperatur mellom 0 og 100 C i fra 1 time til tre dager i nærvær av en metallkatalysator, slik som f.eks. tetrakis(trifenylfosfin)-palladium(0).

De beskrevne metoder A-C kan anvendes for oppnåelse av

av blandinger av opriske isomerer, eller i passende tilfeller en enkelt optisk isomer. Videre kan en enkelt optisk isomer oppnås fra de racemiske blandingene ved i og for seg kjente metoder.

De beskrevne metoder D-E kan anvendes for oppnåelse av blandinger av geometriske isomerer, eller i passende tilfeller en enkelt geometrisk isomer. Videre kan en enkelt, geometrisk isomer oppnås fra de isomere blandingene ved i og for seg kjente metoder.

Utgangsmaterialene i de ovenfor angitte metoder A-E

enten kjente forbindelser eller kan fremstilles ved fremgangsmåter som er kjent for fagmannen.

Disse grupper av nye forbindelser kan fremstilles på i og for seg kjent måte.

Salter

Fysiologisk akseptable salter av forbindelser med

formel (I) fremstilles ved hjelp av i og for seg kjente metoder. Saltene er nye forbindelser, og omfatter et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen. Metallsalter kan fremstilles ved behandling av et metallhydroksyd med en forbindelse ifølge oppfinnelsen. Eksempler på metallsalter som kan fremstilles på denne måten, er salter inneholdende Li, Na og K. Et mindre oppløselig metallsalt kan utfelles fra en opp-løsning av et mer oppløselig salt ved tilsetning av en egnet metallforbindelse. Syresalter kan fremstilles ved behandling av en forbindelse med formel (I) med en syre slik som HCl, HBr, H2S04, eller en organisk sulfon-syre.

Forbindelsene med formel (I) kan administreres systemisk eller lokalt, og vil i klinisk praksis normalt administreres topisk, oralt, intranasalt, ved injeksjon, ved infusjon, eller ved inhalering i form av et farmasøytisk preparat omfattende den aktive bestanddel i form av den opprinne-lige forbindelsen eller eventuelt i form av et farmasøytisk akseptabelt salt derav, i forbindelse med en farmasøytisk akseptabel bærer som kan være et fast, halvfast eller væske-, formig fortynningsmiddel eller en svelgbar kapsel,

og slike preparater omfatter et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen. Forbindelsen kan også anvendes uten bærer-materiale. Som eksempler på farmasøytiske preparater kan nevnes tabletter, oppløsninger, dråper, slik som nesedråper, øyedråper, preparater for topisk anvendelse slik som salver, geléer, kremer og suspensjoner, aerosoler for inhalering, nesespray, liposomer, osv. Vanligvis vil det aktive stoff omfatte mellom 0,01 og 99, eller mellom 6,1 og 99 vekt-%

av preparatet, f.eks. mellom 0,5 og 20% for preparater for injeksjon og mellom 0,1 og 50% for preparater for oral administrasjon.

Flytende preparater for oral anvendelse kan være i form

av eleksirer, siruper eller suspensjoner, f.eks. opp-løsninger inneholdende fra 0,1 til 20 vekt-%

aktivt stoff, sukker og en blanding etanol, vann, glycerol, propylenglykol og eventuelt aroma, sakkarin og/eller karboksymetylcellulose som et dispergeringsmiddel.

For parenteral anvendelse ved injeksjon kan preparater omfatte en vandig oppløsning av det aktive legemiddelet, eller et fysiologisk akseptabelt salt derav, helst i en konsentrasjon på 0,05-10%, og eventuelt også et stabiliseringsmiddel og/eller bufferstoffer i vandig oppløsning. Doseringsenheter av oppløsningen kan med fordel være innelukket i ampuller.

For topisk anvendelse, spesielt for behandling av herpes virusinfeksjoner på hud, kjønnsorganer og i munn og øyne, er preparatene hensiktsmessig i form av en oppløsning, salve, gel, suspensjon, krem eller lignende. Mengden av aktivt stoff kan variere, f.eks. mellom 0,05-20 vekt-%

i

av det aktive stoff. i

Det er således ifølge oppfinnelsen funnet at forbindelsene

j

med formel I og de fysiologisk akseptable saltene dérav kan anvendes for å inhibere herpes virus-multiplikasjon. Forbindelsene med formel I o- fysiologisk akseptable salter derav er nyttige i terapeutisk og/eller profylaktisk behandling av virusinfeksjoner.

En foretrukken forbindelse med formel I innbefatter forbindelsen hvor Rc' l er CH £, »OH når m er 2 og n er 1; eller et

-fysiologisk akseptabelt salt derav, ved behandling av herpes virus-infeksjoner. i Følgende eksempler illustrerer fremstillingen av forbindelser ifølge oppfinnelsen. Eksempel 1 9-[ 4- hydroksy- 2-( hydroksymetyl) butyl] guanin (metode |C)

En suspensjon av natriumborhydrid (135 mg, 3,57 mmol) og tørket litiumbromid (22 0 mg, 2,53 mmol) i 4 ml tørket og destillert diglyme ble omrørt ved romtemperatur i en halv time. Etter tilsetning av dimetyl-2-(2-amino-6-klorpurin-9-ylmetyl)suksinat (215 mg, 0,656 mmol) og 3 dråper tri-metylborat, ble blandingen omrørt ved romtemperatur i natten over og, deretter holdt ved 100°C i 5 timer. iOpp-løsningsmiddelet ble fordampet i vakuum, og resten oppløst i 10 ml 70% maursyre i vann og holdt ved 50°C natten over. Blandingen ble inndampet i tørrhet i vakuum, oppløst i vann, nøytralisert med natriumhydrogenkarbonat og inn-

dampet i vakuum. Kromatografi (silisiumdioksydgel, etylacetat + metanol + vann 4+3+1 volumdeler) og omkrystallisering fra vann, ga 99 mg 9-[4-hydroksy-2-(hydroksymetyl)butyl]-guanin. Forbindelsen ble renset ved preparativ HPLC (Porasil C1g reversert-fasekolonne; metanol + vann 20+80) for oppnåelse av et rent produkt etter omkrystallisering fra vann, smp. 235°C.

■"■H NMR (DMSO-dg) : a 1,43 (m, 2H) CH2CH2OH; 2,09 (m, 1H) CH; 3,34 (d, 2H) CHCH2OH; 3,47 (t, 2H) CH2CH2OH; 3,96 (ABX system, 2H) NCH2; 6,25 (bred s, 2H) NH2; 7,59 (s, lH) HQ; 10,4 (bred s, 1H) NH. Utgangsforbindelsen, dimetyl- 2-( 2- amino- 6- klorpurin-9- ylmetyl)- suksinat ble fremstilt som følger: (Metode B)

En blanding av 2-amino-6-klorpurin (4,07 g, 0,024 mol), dimetylitakonat (5,00 g, 0,032 mol), og natriumhydrid (55% i olje, 0,2 g) i 50 ml tørt dimetylformamid, ble omrørt ved romtemperatur i tre dager. Omkring 50 ml vann ble tilsatt, og blandingen ble vasket med n-heksan (2x50 ml) og deretter ekstrahert med 2 x 50 ml diklormetan. De kombinerte CH2CH2~ekstraktene ble vasket med 2 x 20 ml vann, tørket med magnesiumsulfat og inndampet i vakuum. Behandling med eter og tørking ga et hvitt, krystallinsk produkt. Kromatografi (silisiumdioksydgel, kloroform + metanol 15+1) ga 5,54 g (71%) eller omkrystallisering (MeOH-H20) ga 5,15 g (66,1%) dimetyl-2-(2-amino-6-klor-purin-9-ylmetyl)suksinat.

UV spektrum i EtOH, X (nm): 310 (247).

. r max

NMR (CDClj) a 2,67 (dd, 2H) CH2COO; 3,46 (m, 1H) CH; 3,70 (2s, 2x3H) OCH3; 4,42 (ABX system, Jgem=14 Hz, 2H) NCH2; 5,35 (bred s, 2H) NH2: 7,79 (s, 1H) Hg.

Eksempel 2

9-[ 4- hydroksy- 3-( hydroksymetyl) butyl] guanin (metode A)

En blandingav 2-amino-6-klorpurin (1,275 g, 7,5 mmol) og kaliumkarbonat (0,69 g, 5 mmol) i tørr dimetylformamid (30 ml) ble sonikert i 15 minutter, benzyl-2-benzyloksymetyl-4-brombutyleter (1,82 g, 5 mmol) ble tilsatt, og blandingen ble sonikert i fire timer og deretter omrørt natten over. Etter inndampning i vakuum ble resten ekstrahert med 3 x 50 ml kloroform, og ekstrakten ble inndampet i tørrhet i vakuum. Kromatografi (silisiumdioksydgel, kloroform + metanol 20+1 beregnet på volum) ga 0,58 g (26%) ren forbindelse 4-(2-amino-6-klorpurin-9-yl)-2-benzyloksymetylbutylbenzyleter. En liten prøve av nevnte forbindelse ble omkrystallisert fra toluen. Smp. 108,5-109,5°C.

<1>H NMR (CDC13): a 1,96 (m, 3H) N-C-CH2CH; 3,48 (ABX system,

4H) (CH(CH20)2: 4,13 (t, 2H) NCH2; 4,46 (s, 4H) OCH2Ph:5,49

(s, 2H) NH2; 7,30 (m, 10H) fenyl; 7,69 (s, 1H) Hg.

F jerning av beskyttelsesgrupper

En oppløsning av 4-(2-amino-6-klorpurin-9-yl)-2-benzyloksy-metylbutylbenzyleter (0,904 g, 2 mmol) i 25 ml 80% vandig maursyre ble holdt ved 100°C i en time, palladiumkatalysator (10% på karbon, 0,40 g) ble tilsatt, og blandingen ble hydrogenert ved romtemperatur og atmosfæretrykk med effektiv omrøring i 45 minutter. Etter inndampning i vakuum til tørrhet ble resten oppvarmet til koking med 50 ml vann,

1 ml konsentrert, vandig ammoniakk ble tilsatt, oppløsningen ble kokt forsiktig i en kort periode, og deretter inndampet til tørrhet. Omkrystallisering fra vann ga 0,23 g (45%) 9-[4-hydroksy-3-(hydroksymetyl)butyl]guanin. Smp. 252-262°C (dekomponering, langsom oppvarming) eller 26 4-26 5°C (hurtig neddypping av kapillæret). <1>H NMR (DMSO-d6):o 1,51 (m, 1H) CH; 1,76 (q, 2H) N-C-CH2; 3,42 (ABX system, 4H) 2CH20; 4,02 (t, 2H) NCH2; 6,29 (bred s, 2H) NH2; 7,64 (s, 1H) Hg; 10,3 (bred s, 1H) NH.

Utgangsforbindelsen, benzyl-2-benzyloksy-4-brombutyleter ble fremstilt som følger:

a) Dietyl-( 2, 2- dimetoksyetyl) malonat

Dietylmalonat (168,18 g, 1,05 mol) ble tilsatt til en

oppløsning av natriumetoksyd (fra 23,0 g, 1,00 mol natrium) i 500 ml tørr etanol ved 50°C i løpet av 45 minutter. Bromacetaldehyddimetylacetal (74,2 g, 1,06 mol) blje tilsatt ved den samme temperaturen i løpet av 45 minutter,

og blandingen ble tilbakeløpskokt natten over. Etanol ble inndampet i vakuum, og resten ble oppløst i 200 ml vann og ekstrahert med 3 x 300 ml eter. Ekstraktene ble tørket (MgS04), inndampet og destillert i vakuum for oppnåelse

av 115,0 g (46%) av tittelforbindelsen. Kp.97-101°C

(0,6 mm Hg).

1H NMR (CDC1): 6 1,30 (t, J=7Hz, 6H) 2C-CH3; 2,20 (dd, J=5Hz og 7Hz, 2H) CH-CH2; 3,35 (s, 6H) 20CH3; 3,44 (t, 1H) COCHCO; 4,20 (q, J=7Hz, 4H) 20CH-; 4,42 (t, J=5Hz), 1H)

O-CH-O.

I

b) 4, 4- dimetoksy- 2-( hydroksymetyl) butanol

Dietyl-(2,2-dimetoksyetyl)malonat (115,0 g, 0,46 mol)

ble tilsatt til en suspensjon av litiumaluminiumhydrid (38,0 g, 1,00 mol) i 400 ml tørr eter i en hastighet for opprettholdelse av en forsiktig tilbakeløpskoking. Etter omrøring i 15 minutter ble 40 ml vann, 40 ml 15% vandig NaOH og 120 ml vann tilsatt, og omrøring ble fortsatt inntil en hvit suspensjon ble oppnådd. De uorganiske i

saltene ble frafiltrert og ekstrahert med flere 200 ml porsjoner tetrahydrofuran (THF). De kombinerte organiske ekstraktene ble inndampet og destillert to ganger i vakuum for oppnåelse av 50,23 g (66,5%) av tittelforbindelsen. Kp. 116-125°C (0,02 mm Hg).

■"■H NMR (CDC13) : 6 1,6-2,1 (m, 3H) CH2"CH; 3,35 (s, 6H) 20CH3; 3,67 (d, 4H) 2CH20; 4,48 (t, J=5Hz, 1H) O-CH-0.

c) Benzyl- 2-( benzyloksymetyl)- 4, 4- dimetoksybutyl-eter

Natriumhydrid (55% i olje, 32,72 g, 0,75 mol) ble vasket to ganger med n-heksan og suspendert i 200 ml THF. 4,4-dimetoksy-2-(hydroksymetyl)butanol (49,26 g, 0,3 mol) ble tilsatt dråpevis for opprettholdelse av en forsiktig utvikling av hydrogengass. Benzylkloridet (94,94 g,

0,45 mol) ble tilsatt i løpet av 30 minutter, og blandingen ble tilbakeløpskokt natten over, avkjølt, fortynnet med 50 ml etanol og fordampet i vakuum. Resten ble suspendert i ca. 200 ml vann, og ekstrahert med 3 x 100 ml eter. De kombinerte organiske ekstraktene ble.tørket (MgS04) og destillert i vakuum. Tittelforbindelsen (94,34 g, 91%)

ble oppnådd ved 197-200°C (0,01 mm Hg).

<1>H NMR (CDC13): 6 1,67 (diffus t, 2H) CHCH2CH; 2,02 (m, 1H) CH; 3,23 (s, 6H) 20CH3; 3,46 (d, 4H) 2CH20; 4,43 (s, 4H) 20CH2Ph; 4,43 (t, 1H) O-CH-O; 7,27 (bred S, 10H),

fenyl.

d) 4- benzyloksy- 3- benzyloksymetylbutan- l- ol

En blanding av benzyl-2-benzyloksymetyl-4,4-dimetoksy-butyleter (51,62 g, 0,15 mol), eddiksyre (70 ml), vann (30 ml), og THF (100 ml) ble tilbakeløpskokt i 2 timer og deretter inndampet i vakuum. Resten ble oppløst i eter, og oppløsningen vasket med vandig kaliumkarbonat-oppløsning og vann, tørket (MgSO^), og inndampet i vakuum. Resten av uren 4-benzyloksy-3-benzyloksymetyl-butanal (kvantitativt utbytte) ble oppløst i 100 ml THF og tilsatt i løpet av 30 minutter til en suspensjon av litiumaluminiumhydrid (7,6 g, 0,20 mol) i 100 ml THF. Deretter ble 8 ml vann, 8 ml 15% vandig NaOH og 24 ml vann tilsatt, og blandingen ble omrørt inntil en hvit, sandaktig suspensjon ble oppnådd. De uorganiske saltene ble frafiltrert og vasket med flere porsjoner THF. De kombinerte ekstraktene ble inndampet i vakuum for oppnåelse av 41,93 g (93%) av tittelforbindelsen.

<1>H NMR (CDC13): 6 1,66 (q, 2H) CH2CH20; 2,05 (m, 1H) CH; 3,0 (t, 1H) OH; 3,46 (d, 4H) CH(CH20)2; 3,64 (q, 2H) CH2OH; 4,47 (s, 4H) 2 OCH2Ph; 7,30 (m, 10H) fenyl.

e) Benzyl- 2- benzyloksymetyl- 4- brombutyleter

En oppløsning av 4-benzyloksy-3-benzyloksymetylbutan-l-ol

(41,75 g, 139 mmol) i 150 ml tørr diklormetan ble avkjølt i is-vannbad. Trifenylfosfin (42,0 g, 160 mmol) ble til-

satt under omrøring og deretter N-bromsuksinimid (26,0 g, 146 mmol) i porsjoner i løpet av 15 minutter. Etter en time ved romtemperatur ble eter (400 ml) tilsatt, og det ut-felte trifenylfosfinoksyd frafiltrert. Oppløsningen ble konsentrert i vakuum til et lite volum og mer eter ble tilsatt for å ekstrahere produktet fra utfelt trifenylfosfinoksyd. Til slutt ble dette ekstraksjons-utfellings-trinnet gjentatt med lett petroleum for oppnåelse, etter inndampning, av 33,55 g (66%) uren tittelforbindelse. •"■H NMR (CDC13) : 6 1,98 (q, 2H) Br-C-CH2; 2,15 (m, 1H) CH; 3,45 (t, 2H) BrCH2; 3,47 (m, 4H) CH(CH20)2; 4,47 (s, 4H) 20CH2Ph; 7,30 (m, 10H) fenyl.

Eksempel 3

9-[ 4- hydroksy- 2-( hydroksymetyl) butyl] guanin (metode C)

Dimetyl-2-(2-amino-6-klorpurin-9-ylmetyl) suksinat (8,00 g, 0,0244 mol) ble oppløst i 200 ml tert.butanol ved 50°C, litiumborhydrid (2,66 g, 0,122 mol) ble tilsatt i porsjoner, og blandingen ble omrørt i en time. Deretter ble 100 ml vann tilsatt, og omrøringen ble fortsatt natten over, de uorganiske saltene ble frafiltrert, og oppløs-ningen ble inndampet i tørrhet i vakuum. Resten ble funnet å inneholde 78 mol-% 2-amino-6-tert.butoksy-9-[4-hydroksy-2(hydroksymetyl)butyl]purin sammen med 6-klorforbindelsen.

1H NMR (DMSO-dg) : 6 1,10 (s, 9H) C(CH3)3; 1,38 (my<:>"<;>2H) CH2CH2OH; 2,14 (m, 1H) CH; 3,34 (d, 2H) CHCr^OH;<1> 3;45 (diffus t, 2H) CH2CH2OH; 4,06 (t, ABX system, 2H)^NCH2;

'v 4,5 (meget bred s) OH; 6,77 (s, 2H) NH2: 8,08 "j:(s>'"'lH) H8.

<13>C NMR (DMSO-dg) : 6 31,41, C(CH3)3; 31,92, CH2C<H>2<:>0H; 37,88, CH; 45,01, NCH2; 58,72 og 61,3, 2CH2OH; 6'6-)65, C(CH3)3; 123,59, C5; 143,91, C8; 149,53, C6, 154^'59,

C4; 159,87, C2.

Fjerning av beskyttelsesgruppe

En oppløsning av uren 2-amino-6-tert.butoksy-9-[4-hydroksy-2-(hydroksymetyl)butyl]purin (436 mg, 1, 41 mmol) i 6 ml 50% vandig maursyre ble holdt ved 100°C i tre timer og deretter inndampet i tørrhet i vakuum. Mer vann ble tilsatt, og blandingen ble lyofilisert. Resten ble holdt ved 100°C i to timer med 10 ml 2M vandig ammoniåkk.' Ammoniakken ble fjernet med en strøm av nitrogengass, oppløsningen ble oppvarmet til koking, en liten mengde fast stoff ble fjernet, og filtratet ble avkjølt i■ kjøleskap for oppnåelse av 200 mg krystallinsk ' 9-[4-hydroksy-2-(jydroksymetyl) butyl] guanin.

<13>C NMR (DMSO-d,): 6 31,80, CHoCH_0K; 38,17, CH;l'J44 , 35, NCH2; 58,80 og 60,94, 2CH2OH; 116,64, C5; 138,05> C8; 151,57, C4; 153, 57, C2; 156, 92, C6.

Eksempel 4

Fremstilling av 4-( 2- amino- l, 6- dihydro- 6- oksopurin- 9- yl)-2- hydroksymetylsmørsyre (metode A)

2-amino-6-klorpurin (3,37 g, 19,9 mmol), 4-brom-2-hydroksy-metylsmørsyreetyleter (4,49 g, 19,9 mmol) og vannfritt kaliumkarbonat (2,72 g g, 19,9 mmol) ble blandet med 50 ml dimetylformamid, og blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 92 timer. Blandingen ble deretter filtrert og filtratet inndampet. Resten ble ekstrahert med 3 x 50 ml kloroform, og de kombinerte ekstraktene ble inndampet. Flamme-kromatografi (silisiumfioksydgel, kloroform-metanol 10:1) og to omkrystalliseringer fra vann ga 0,995 g av 4-(2-amino-6-klorpurin-2-yl)-2-hydroksymetylsmøresyreetylesteren. <13>C NMR (CDC13): ppm 173,56, 159,40, 153,81, 151,16, 142,38, 124,89, 62,61, 61,11, 45,08, 41,91, 28,46 og 14,16.

Fjerning av beskyttelsesgruppe

4-(2-amino-6-klorpurin-9-yl)-2-hydroksymetylsmørsyreetyl-ester (0,80 g) i 50 ml. IM saltsyre ble tilbakeløpskokt i tre timer og deretter inndampet i vakuum, inndampet på

nytt med 3 x 10 ml vann, og resten ble oppløst 'i-'5-ml vann. pH-verdien ble deretter justert til 6-7'med'fåst natriumbikarbonat. Den oppnådde oppløsning ble|filtrert,

og pH-verdien ble justert til 4 med eddiksyre.jEtter avkjøling til 0°C ble bunnfallet frafiltrert og vasket med vann. Omkrystallisering fra vann ga 0,43 gi 4-(2-amino-l,6-dihydro-6-oksopurin-9-yl)2-hydrbksymetyl-

j

smørsyre. j

13 '

C NMR (DMSO-d6): ppm 174,80 (C=0), 157,09 (CS),

153,64 (C2), 151,38 ( CA), 137, 49 (C8) , 116,84 :(C5) ,

62,15 (CH2OH) , 45,59 (CH) , 41,33 (NCH2) og 28,66: (N-CH2-CH2) .

Utgangsforbindelsen, 4-brom-2^hYdrokSYmetYlsmø'resYr

_ — — — "~ — —[ ~~ ——— Sålester ble fremstilt som følger: j

2-hydroksymetylbutyrolakton [G. Claesson et al|. Arkiv for kemi 28, 173 (1967)], (3,0 g) ble oppløst i 2Q ml etanol, .og oppløsningen ble mettet med hydrogenbromid ved 0C. Etter henstand ved 0°C i 0,5 timer ble oppløsningsmiddelet inndampet ved et lavt trykk. Resten ble blandet med is-vann, og blandingen nøytralisert med 10% vandig natriumkarbonat. Blandingen ble deretter ekstrahert flere ganger med dietyleter, og de kombinerte eterekstraktene ble vasket med mettet, vandig natriumklorid og tørket over vannfritt-natriumsulfat. Etter inndampning av oppløsningsmiddelet ble resten oppløst i 25 ml kloroform og filtrert. Inndampning av oppløsningsmiddelet ga 4,59 g av forbindelsen 4-brom-2-hydroksymetylsmørsyreetyleter.

i

<13>C NMR (CDC13): ppm 174,14, 62,54, 61,08, 46,02, 31,45, 38,89 og 14,26.

i

Eksempel 5

9-[ 4- hydroksy- 2-( hydroksymetyl) butyl] guaninhydroklorid

9-[4-hydroksy-2-(hydroksymetyl)butyl]guanin (46 mg; eksempel 1) ble oppløst i 0,4 ml IM vandig saltsyre,

og oppløsningen ble lyofilisert (0,1 mm Hg) natten over. Resten (53 mg, kvantitativt utbytte) ble oppløst i noen dråper varm etanol og utfelt med flere volumdeler tetrahydrofuran for oppnåelse av et hvitt, krystallinsk produkt. Smp.^ 85°C (d).

<1>H NMR (D20) : 6 1,61 (m, 2H). CH2CH2OH; 1,87 (m, 1H) ;

2,31 (septet, 1H) CH, 3,57 (d, 2H) CHCH2OH; 3,72 (diffus g) CH2CH2OH; 4,32 (m, 2H) NCH2; 4,90 (s) HDO; 8,96 (s, 1H) Hg.

Eksempel 6

9-[ 4- hydroksy- 3-( hydroksymetyl)- 2- butenyl] guanin (metode D)

Uren l-benzyloksy-2-benzyloksymetylbut-3-en-2-ol)

(1,42 g, 3,16 mmol) i 10 ml CH2C12 ble tilsatt til 0,71 g tionylklorid (6 mmol) og 2 dråper DMF i 10 ml CH2C12, og oppløsningen ble omrørt i en halv time og inndampet i vakuum. Toluen ble tilsatt, og blandingen ble inndampet i vakuum for oppnåelse av uren l-benzyloksy-2-bensyloksy-metyl-4-klorbut-2-en.

En blanding av 1,61 g 2-amino-6-klorpurin (9,5 mmol)

og 1,31 g finmalt vannfritt K2C03 (9,5 mmol) i 50 ml tørr dimetylformamid (DMF) ble holdt ved 100°C i 5 minutter og avkjølt. Ved 10°C ble den urene 1-benzyloksy-

2-benzyloksymetyl-4-klorbut-2-en i 25 ml tørr DMF tilsatt under omrøring i fire timer. Etter tb dagré ved romtemperatur ble blandingen inndampet i vakuum, resten ble ekstrahert med 2 x 25 ml kloroform, og ekstraktet inndampet til tørrhet. Kromatografi (silisiumdioksydgel, CHCl3+MeOH 19+1) ga 0,25 g (18%) 4-(2-amino-6-ki'orpurin-9-yl)-l-benzyloksy-2-benzyloksymetyl-2-butenj (TLC på silisiumdioksydgel, CHCl3+MeOH 13+1 volumdeler, Rf 0,62) .

<1>H NMR (CDC13-CD30D): 6 4,05 og 4,19 (2s,'2x2H) C(CH20)2; 4,49 og 4,55 (2s, 2x2H) benzylsk CH2; 4,70

(d, 2H) N-CH2; 5,85 (t, 1H) CH=; 6,2 (bred s, 2H) NH2; 7,3 (bred s, 10H) fenyl; 7,49 (s, 1H) Hg.

■ ' ■ ■ y ■ -■■ ■

Fjerning av beskyttelsesgruppe

i i

En oppløsning av 4-(2-amino-6-klorpurin-9-yl)-1-benzyloksy-2-benzyloksymetyl-2-buten (1,48 mg, 0,329 mmol), 1,8 ml trifluoreddiksyre og 0,2 ml vann i en forseglet ampulle ble holdt ved 110°C i 17 timer. Etter avkjøling ble blandingen fortynnet med 2 ml vann, oppvarmet til koking i 1 minutt og inndampet til tørrhet i vakuum, oppløst i vann og inndampet på nytt. Kromatografi (silisiumdioksydgel, etylacetat + metanol + vann 70+20+10 volumdeler) ga 34 mg (41%) 9-[4-hydroksy-3-(hydroksymetyl)r2-butenyl]-guanin.

(

<1>H NMR (DMS0-d6): 6 3,96 og 4,10 (2d, 2x2H);= C(CH20)2; 4,68 (d, 2H) N-CH2; 4,83 (2t, 2H) 20H; 5,60| (t, 1H) CH= 6,50 (bred s, 2H) NH2; 7,66 (s, 1H) Hg; 10,6 (bred s, 1H)

NH.

UtgangsforbindeIsen l-benzYloksY-2-benzYloksvm 3-en-2-ol, ble fremstilt som følger,

En oppløsning av 4,0 g vinylbromid (37,4 mmol) i 8 ml

tørr tetrahydrofuran (THF) ble tilsatt til 0,94 g Mg (38,7 mmol) i 3 ml THF under N2 ved ca. 60°C, og blandingen ble tilbakeløpskokt (C02-etanol-kondensator) i en time.

En oppløsning av 7,4 g (27,4 mmol) av 1,3-bis(benzyloksy)-propan-2-on (Araki Y. et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1981, 19) i 25 ml THF ble tilsatt dråpevis ved 10°C,

og blandingen ble omrørt ved omgivelsestemperatur i to timer. Deretter ble 8 ml av en 20% vandig NH^Cl-oppløsning tilsatt, og den organiske fasen ble inndampet, oppløst i eter, tørket med MgS04 og inndampet i vakuum for oppnåelse av 7,90 g l-benzyloksy-2-benzyloksymetylbut-3-en-2-ol som en uren olje.

■"■H NMR (CDC13) : <5 2,67 (s, 1H) OH; 3,50 (s, 4H) C(CH20)2; 4,55 (s, 4H) 20CH2 Ph; 5,0-6,3 (m, 3H) CH2=CH; .7,32 (bred s, 10H) fenyl.

Eksempel 7 | C is- 9- ( 4- hydroksy- 2- butenyl) guanin (metode El)

i 2-amino-6-klorpurin (3,4 g), butadienmonoepoksyd (1,65 g) og tetra-kis (trifenylfosfin)palladium (0) (1,0 g) i tørr dimetylformamid (75 ml) ble omrørt under, en hydrogen-atmosfære og oppvarmet ved 60°C i 4 5 minutter. Opp-løsningen ble inndampet i vakuum (0,1 mm Hg) og resten ble triturert med varm kloroform (4 x 50 ml). De kombinerte kloroformoppløsningene ble konsentrert (25 ml.volum) og fortynnet med eter (100 ml). Det gummiaktigejbunnfall ble oppsamlet, tørket og triturert med varm 1,2-dimetoksy-etan (3 x 50 ml). De kombinerte oppløsningene ble inndampet i vakuum (0,1 ml Hg) for oppnåelse av:en uren blanding (4 g) som ble separert på en kolonne av silisiumdioksydgel (500 g) eluert med kloroform + metanol 10+1

(800 ml) fulgt av kloroform + metanol 8+1. Fraksjoner på ca. 15 ml ble oppsamlet, og forbindelsen cis-4-(2-amino-6-klorpurin-9-yl)-2-buten-l-ol ble oppnådd som et mindre produkt (0,2 g) i fraksjoner 74-78. Smp. 160-165°C.

UV spektrum, A (nm): 0,1 M HC1 241,1 315

0,1 M NaOH 246/ 308

1 i

H NMR (DMSO-d,): 6 4,20 (t, J 5,4Hz, 2H) CH!0; 4,76 (d,

J 6,8Hz, 2H) NCH2; 5,54-5,83 (m, 2H) CH=CH; '6,69 (s, 2H) - HN2; 8,06 (s, 1H) Hg.

Fjerning av beskyttelsesgruppe

Cis-4-(2-amino-6-klorpurin-9-yl)-2-buten-l-ol (50 mg) i maursyre-vann 7+3 (5 ml) ble oppvarmet ved 45°C under en nitrogenatmosfære i 20 timer. Oppløsningsmiddelet ble inndampet i vakuum, og resten ble tørket. Vann (0,5 ml) ble tilsatt, og oppløsningen ble nøytralisert med vandig ammoniakk. Bunnfallet ble filtrert, vasket med vann, etanol og eter, og tørket for oppnåelse av forbindelsen cis-9-(4-hydroksy-2-butenyl)guanin (40 mg).

■""H NMR (DMS0-d6) : 6 4,15 (diffus t, 2H) CH20; 4,65-4,90 (ABX system, 2H) NCH2; 5,75 (m, 2H) CH=CH; 6,52 (bred s, 2H) NH2; 7,66 (s, 1H) HQ.

Eksempel 8

9-( 4- hydroksy- 2- butynyl) guanin (metode D)

N-bromsuksinimid (1,78 g, 10 mmol) ble tilsatt i porsjoner til en omrørt suspensjon av 2-butyn-l,4-diol (2,50 g, 30 mmol) og trifenylfosfin (2,62 g, 10 mmol) i 20 ml diklormetan ved romtemperatur. Etter en time jble den ureagerte butyndiol fjernet ved filtrering. Oppløsningen ble inndampet i vakuum til et lite volum, oppløst i 20 ml tørr dimetylformamid (DMF) og tilsatt til en suspensjon av 2-amino-6-klorpurin (1,70 g, 10 mmol) og finmalt vann-^ fritt K2C03 (2,07 g, 15 mmol) i 75 ml tørr DMF, omrørt ved 0°C. Omrøringen ble fortsatt ved romtemperatur i tre

i

dager. Deretter ble blandingen inndampet i vakuum til tørrhet. Kromatografi (silisiumdioksydgel, CHCl^ + MeOH 7+1) ga 467 mg (20%; etter omkrystallisering fra yann for fjerning av 2-butyn-l,4-diol) av 4-(2-amino-6-klorpurin-9-yl)-2-butyn-l-ol (TLC på silisiumdioksydgel, CHC13 + MeOH 5+1; Rf 0,57).

1H NMR (DMSO-dJ : 6 4,10 (dt, 2H) CHo0; 4 , 96 ' (t,. J=2 . OHz,

6 • l ■■■ ;■ 2H) NHC12; 5,12 (t, J=5,9Hz, 1H) OH; 6,89 (bred s, 2H) NH2; 8,17 (s, 1H) Hg. 13C NMR (DMSO-dg): 6 32,79 (NHCl2); 49,07 (CH20); 77,80 og 85,19 (C*C); 123,43 (C5); 142,43 (C8); 149,82 (C6); 153,69 (C4); 160,01 (C2).

Fjerning av beskyttelsesgruppe

En oppløsning av 4-(2-amino-6-klorpurin-9-yl)-2-butyn-l-ol (140 mg, 0,59 mmol) i 2 ml 50% vandig maursyre ble holdt ved 80°C i seks timer, og deretter inndampet til tørrhet i vakuum. Resten ble oppløst i 2 ml vann-kons. vandig ammoniakk 1+1, og oppløsningen ble holdt ved 80°C i en time, og deretter inndampet i vakuum til tørrhet. Omkrystallisering fra vann ga 90 mg (70%) 9-'(4-hydroksy-2-butynyl)guanin. !

i i

<1>H NMR (DMSO-d6): 6 4,09 (m, 2H) CH20; 4,84 (t, J=2.0Hz,

2H) NCH2; 5,11 (t, J=6.0Hz, 1H) OH; 6,44 (bred s, 2H) NH2; 7,73 (s, 1H) Hg.

Biologiske forsøk

Den inhiberende effekten til forbindelsen med for-

mel (I) på herpes virus ble testet ved bruk av de nedenfor beskrevne metoder. Den cellulære toksisiteten til forbindelsene på vertceilefunksjoner ble også testet.

I det følgende er forbindelsen 9-[4-hydroksy-2-(hydroksymetyl) butyl]guanin (base) betegnet VSA 671, forbindelsen 9-[4-hydroksy-3-(hydroksymetyl)butyl]guanin (base) er betegnet VIS 873, forbindelsen cis-9-(4-hydroksy-2-butenyl)-guanin (base) er betegnet VSA 151, og forbindelsen 9-[4-hydroksy-3-(hydroksymetyl)-2-butenyl]guanin (base)

er betegnet VSA 668. Herpes simplex type 1 virus er betegnet HSV-1, herpes simpleks type 2 virus er betegnet HSV-2, og varicella zoster virus er betegnet VZV.

I. Inhibering av virusmultiplikasjon i cellekulturer

Inhiberingen av HSV-1 (stamme C42) med VSA 671, VIS 873, VSA 151 og VSA 668 har blitt målt i en plague-reduksjons-analyse i vero (nyre hos grønn ape) -celler og i HEL

(human embryonisk lunge) -celle som beskrevet av Ejercito et al., J. Gen. Virol. 2 357 (1968). Effekten på VZV

(flere stammer) -multiplikasjon i HL (human lungefibro-blast) -celler av VSA 671 ble bestemt ved måling av dannelsen av sene antigener ved hjelp av ELISA-teknikken som beskrevet av B. Wahren & al., H. Virological methods 6, 141-149 (1983). Resultatene er vist i tabell 1.

II. Affinitet til VSA 671, VIS 873, VSA 151 og^ VSA 668 for herpes virus- indusert tymidinkinase

Inhiberingskonstanter (K^) som viser affiniteten for

HSV-1 tymidinkinase, ble bestemt ifølge metoden til A.' Larsson et al., Antimicrob. Agents Chemoter.. 23, 664 (198.1) . Tnhihfrinosknnstanten er vist i tabell 2.

En høy affinitet for den virale tymidinkinasen er en fordel for antiviral aktivitet under betingelser når forbindelsene må konkurrere med tymidin. VSA 671 har en affinitet i nærheten av den til det naturlige substrat, tymidin (Km0,42/,um) .

Testrapport A

Forbindelsen 9-[4-hydroksy-2-(hydroksymetyl)-butyl]-guanin fremstilt ifølge oppfinnelsen og med formelen: har blitt sammenlignet med den strukturelt nærmestliggende tidligere kjente forbindelse 9-(2,4-dihydroksybutyl)guanin fra EP 55239 (eksempel 12), med formelen:

i følgende tester 1-3.

Test 1, - Inhibering av HSV- 1 plakkdannelse i vero- celler

Inhiberingen av virus stamme HSV-1 C-42 med VSA 671 og VIS 715 har blitt målt i en plakkreduksjonsanalyse i vero (nyre hos grønn ape)-celler som beskrevet av Ejercito et al., J. Gen. Virol. 2 357 (1968) . IC,---verdiene ble avledet fra nær-responsstudier med 6 forskjellige konsentrasjoner av hver forbindelse. Verdiene er gjennomsnittet av minst to forskjellige forsøk (kfr. test I på side 52 i foreliggende beskrivelse).

De ovenfor angitte data viser at bare 0,2 ^um av VSA 671

er nødvendig for å gi en 50% inhibering av HSV-1 plakkdannelse mens 64 / ,um av VIS 715 er nødvendig for å gi 50% in' hj i• b•ering av HVS-1 plakkdannelse, dvs. en forskjell på 320 gå'nger.

Test 2 - inhibering av Varicella zoster virus ( VZV), multiplikasjon i HL- celler J, .

Effekten på VZV (flere stammer)-multiplikasjon.i HL (human lungef ibroblast) -celler med VSA 671 og VIS 715• blej bestemt ved måling av dannelsen av sene antigener ved hjelp av ELISA-teknikken som beskrevet av B. Wahren et al., J. Virological methods 6, 141-149 (1983), (kfr. tabell 1, tredje kolonne, i foreliggende beskrivelse). j,

■ i

For oppnåelse av en 50% inhibering av VZV er en konsentrasjon på l,3-2,5^um av VSA 671 tilstrekkelig, mens en konsentrasjon på 300 / ,um av VIS 716 er nødvendig. Ved en slik hrøy konsentrasjon som 300 ^um er forbindelsen VIS 715 ikke relevant for inhibering av VZV-dannelse.

Test 3 - affi nitet hos VSA 671 og VIS 715 for herpes virus-indusert thym idinkinase

Inhiberingskonstanter (i^) som viser affiniteten,, f or HSV-1 thymidinkinase hos VSA 671 og VIS 715 ble bestem^ ifølge metoden til A. Larson et al., Antimicrob. Agents Chemoter. 23, 664

(1983) (kfr. tabell 2, side 53 i foreliggende beiskrivelse).

De ovenfor angitte data viser at VSA 671 har mye høyere affiniteter for HSVI-1 thymidinkinase enn VIS 715. En høy affinitet for den virale thymidinkinase er en fordel for antiviral aktivitet under betingelser hvor forbindelsene må konkurrere med thymidin. VSA 671 har en affinitet som er nær den til det naturlige substratet, thymidin Km 0,42^um. Jo høyere Ki-verdien er, desto lavere er affiniteten til thymidinkinasen.

Testrapport B

Det ble foretatt en sammenligning, mellom en forbindelse fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, nemlig 9-[4-hydroksy-2-(hydroksymetyl)butyl)guanin som racemat samt som optiske isomerer: og den strukturelt mest nærliggende beslektede forbindelse 9-[(2-hydroksy-l-(hydroksymetyl)etoksy]metyl)guanin, som er beskrevet i EP 72027 og har formelen:

Testen viser de antivirale effektene mot Varicella zoster virus (VZV) i cellekultur. Man bestemte den infeksiøse mediandosen ID^q, dvs. mengden av VZV som frembringer infeksjoner i 50% av testindividene, ved måling av. dannelsen av VZV-antigen.

j

Test. Antivirale effekter mot Varicella zoster yirus ( VZV)

i cellekultur

Effekten på VZV^multiplikasjon i HL-celler av VSA 671,

VSA 671 (+), VSA 671 (-) og DHPG ble bestemt-ved jmåling av dannelsen av VZV-antigen. Humane embryoniske lurjgefibroblaster (HL) ble dyrket i Eagle's MEM, 2% kalveserum og antibiotika. Varicella zoster virus (VZV) stamme pE ble oppnådd.fra Avdeling for Medisinsk Virologi, BMC, Uppsale, Sveriqe. Sammenflytende

i

HL-celler ble infisert med to forskjellige fortynninger av virus. Etter en inkubasjonsperiode på 1 1/2 time ble medium inneholdende forskjellige konsentrasjoner av forbindelser tilsatt. Ved 50-70% cytopatisk effekt (CPE) etter 5-7 dager ble cellene innhøstet, og VZV-antigener kvantifisert'ved hjelp av ELISA-teknikken som beskrevet av Sundqvist, V. A. og Wahren, B. i Devel. Biol. Stud. 52 (1982), side 245-253, "Development of Sensitive and enzymelinked immuno assays for herpes virus antigen and applications". Resultatene er vist i nedenstående tabell. !

i

I II. Cellulær toksisitet

VSA 671, VIS 873, VSA 151 og VSA 668 ble testet med hen-blikk på cellulær toksisitet på humane embryoniske celler som beskrevet av K. Stenberg [Biochemical Pharmacology 30, 1005-1008 (1980)]. Alle forbindelser viste lav cellulær toksisitet (tabell 3) ved konsentrasjoner som inhiberer herpes virus-multiplikasjon til mer enn 90% (se tabell 1).

IV. Dyreforsøk

a) Forsøk med kutan herpes virus-infeksjon på marsvin ble utført som tidligere beskrevet av S. Alenius og B. Dberg

[Archives of Virology 58, 277-288 (1978)]. Forsøkene viste at VIS 873 hadde en terapeutisk effekt på kutane herpes virus-infeksjoner når den ble påført topisk som vist på tabell 4. 30^,ul av oppløsning eller oppløsningsmiddel

ble tilsatt topisk tre ganger pr. dag i fire dager med start 24 timer etter inokulering.

b) Behandling av en "systemisk" HSV-1 eller HSV-2 infeksjon i mus med VSA 671 eller VIS 873 i.p. ble utført

som beskrevet i A. Larsson et al., Antimicrob. Agents Chemiter. 23, 664-670 (1983).

Mus ble infisert med 10^ pfu (plaque-dannende enheter)

HSV-1 (C42) eller IO<4> pfu HSV-2 (stamme 91075) i.p., og behandling ble startet en time etter infeksjon. Behand-lingen besto av to daglige i.p.-doser av hver nukleocid-analog, oppløst i fosfat-bufret saltoppløsning i fem dager. Kumulativ dødelighet (behandlet v.s. ubehandlede dyr) ble bestemt i løpet av forsøket, dvs. 21 dager. Resultatene er vist i tabell 5.

Beste måte for utførelse av oppfinnelsen

Blant forbindelsene med formel (I) har forbindelsene 9-[4-hydroksy-3-(hydroksymetyl)butyl]guanin, 9-[4-hydroksy-(2-hydroksymetyl)butyl]guanin og cis-9-(4-hydroksy-2-butenyl)guanin spesielt gunstig virkning for behandling av herpes virus-infeksjoner. Forbindelsen 9-[4-hydroksy-2-(hydroksymetyl)butyl]guanin har vist en meget god effekt mot varicella zoster virus-multiplikasjon.

Claims (2)

1, Analogifremgangsmåte for fremstilling av tera

peutisk aktive guaninforbindelser med formelen:

hvor m er 1 eller 2,

n er 1 eller 2, hvorved m er 1 når n er 2, og m er 2 når

n er 1, R' er (CH,) OH eller COOH,

cl Z p

p er 1-4,

Rfa og Rfa' er uavhengig valgt fra hydrogen eller (CH2)pOH,

forutsatt at minst en av R£ eller R^ er hydrogen; eller

Rfa og R£ sammen utgjør en ytterligere karbon-karbon-

binding gir dannelse av et alkyn, og med den ytterligere

forutsetning at når m er 2 og n er 1, og R' er (CH0) OH,

CL Æ, p så er p 2-4;

eller et fysiologisk akseptabelt salt, geometrisk eller optisk isomer derav, karakterisert ved at man: A. for fremstilling av forbindelser med formel (I) hvor

A er Aa, kondenserer en forbindelse med formelen:

til N-9-stillingen i et guaninderivat med formelen

fulgt av fjerning av eventuelle beskyttelsesgrupper J^a' <R>3a' <R>6a' i J?vi^-Jce formler m og n har den ovenfor angitte betydning; X& er en avspaltningsgruppe slik som klor, brom eller iod; Y er hydrogen eller et kvartært ammoniumion; R,•3 cl er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe slik som acyl, alkoksykarbonyl eller arylkarbonyl; R0 er COOH, COOR0_ eller

ZcL 03 (CH2)pOR9a, hvor p er som definert ovenfor; Rga er alkyl, arylalkyl eller aryl; Rga er en gruppe R^ a som definert ovenfor; RO , 3 er en avspaltningsgruppe slik som gruppen

Xo som definert ovenfor, OH eller OR,A , hvor R.„ er alkyl

a lua lua eller arylalkyl; eller B. for- fremstilling av en forbindelse med formel (I) hvor A er A 3.kondenserer en forbindelse med formelen:

til N-9-stillingen i et guaninderivat med formelen

i

i fulgt av fjerning av eventuelle beskytteIsesgrupi per Ro ,a, R14a' <R>15a' * hvilke formler Rga er som definert under A, R,, er COORfl . og R, c er CO0Ro. eller CHo0RQJ hvor RQ

14a oa isa ca z ya, oa og Rga er som definert under A; eller i C. for fremstilling av forbindelser med formel I hvor A er Aa, reduserer derivatiserte eller aktiverte karboksylsyregrupper i en forbindelse med formelen: I i

fulgt av fjerning av eventuelle beskyttelsesg<r>jupper Rga#

<R>in i <R>no i i hvilken formel m, n, R,„ og R,J er som definert

10a 12a oa 10a

under A; og B^a er en 9ruPPe <R>2a eller en gruppe (CK2^p-lCOORi0a' hvor R,_ og p er som definert under A; eller ; D. for fremstilling av forbindelser med formel I hvor A er

Ab, kondenserer en forbindelse med formellen:

til N-stillingen i et guanidinderivat med formelen:

fulgt av fjerning av eventuelt beskyttelsesgrupper ^b' R3b' R6b' R7b' * hvilke formler: Xb er en avspaltningsgruppe slik som klor, brom eller iod; Y er hydrogen eller et kvartært ammoniumion; R3b er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe slik som acyl, alkoksykarbonyl eller aryloksykarbonyl; R2b er R^' eller (CH2^pOR9b og R7b er Rb" eller *CH2*pOR9b' hvor p er 1-4, og hvor Rgb er en gruppe R3fa som definert ovenfor; R6b er hydroksy eller en avspaltningsgruppe slik som klor, brom, iod eller OR10bf hvor R10b er alkirl eller arylalkyl; og R^' og R^" er som definert ovenfor; eller E. for fremstilling av forbindelser med formel I hvor

A er Ab, kondenserer en forbindelse med formelen:

til N-9-stillingen i et guaninderivat med formelen

fulgt av fjerning av eventuelle beskyttelsesgrupper ^ 2b' <R>6b' R^b, i hvilke formler ^ 2b' R6b °^ <R>7b er som ^efinert un^er D;

hvoretter en oppnådd forbindelse eventuelt omdannes til et fysiologisk akseptabelt salt eller geometrisk isomer.

2. Analogifremgangsmåte ifølge krav 1, for fremstilling av 9-[4-hydroksy-2-(hydroksymetyl)butyl]guanin eller en optisk isomer eller fysiologisk salt derav, karakteri-

sert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.