NO162024B - Analogifremgangsmaate ved fremstilling av nye terapeutisk virksomme peptider. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstilling av nye peptider som antagoniserer den antidiuretiske og/eller vaso-pressor virkning av arginin vasopressin in vivo.

Forsøk på å utvikle klinisk nyttige syntetiske antagonister med in vivo antidiuretisk og/eller vasopressorisk virkning mot arginin vasopressin, det antidiuretiske hormon (ADH), har ført til syntese og farmakologisk undersøkelse av flere hundre analoger av neurohypofysikalske peptider, oksytoksin og vasopressin.

Analoger som effektivt kan antagonisere in vivo vasopressorresponsen ovenfor ADH er rapportert av Dyckes et al., J. Med. Chem. , vol. 17 (1974), s. 250; Manning et al., J. Med. Chem., vol. 20 (1977) s. 1228; Bankowski et al., J. Med. Chem.,

vol. 21 (1978) s. 850; Kruszynski et al., J. Med. Chem.,

vol. 23 (1980). s. 364 og Lowbridge et al., J. Med. Chem.,

vol. 21 (19781 s. 313.

Kruszynski et al. rapporterte at [1-(3-merkapto-&, Ø-cyklopentametylenpropionsyre), 2-(O-metyl)-tyrosin]arginin vasopressin og (l-p-merkapto-3, fj-cyklopentametylenpropionsyre] - arginin vasopressin er potente vasopressorantagonister men at de besitter meget lav antidiuretisk aktivitet.

Manning et al. (1977 ). har beskrevet syntese av (1-deaminopenicillamin-4'-valin-8-D-arginin]-vasopressin og Lowbridge et al. har beskrevet syntesen av [ 1- (&-merkapto-|3, 3-cyklopentametylenpropionsyre)-4-valin-8-D-arginin]-vasopressin. Begge disse forbindelser utviser lav antidiuretisk aktivitet men er potente antagonister mot vasopressorresponsen ovenfor AVP.

Analoger av vasopressin eller oksytoksin med antagoniserende antidiuretiske responser ovenfor ADH er rapportert av Chan et al., Science, vol. 161 (1968) s. 280 og J. Pharmacol. Exp. Ther., vol. 174 (1970) s. 541 og vol. 196 (1976) s. 746; Nestor et al., J. Med. Chem., vol. 18 (1975) s. 1022 og Larsson et al., J. Med. Chem., vol. 21 (1978) s. 746. Ingen av disse rapporterte forbindelser har vist seg farmakologisk- eller klinisk nyttige som en antidiuretisk antagonist. Syntese og evaluering av vasopressinanaloger med foretret tyrosin i 2-stillingen, valin i 4-stillingen og D- eller L-Arg i 8-stillingen, som in vivo antagoniserer den antidiuretiske virkning av ADH er rapportert av Sawyer et al., Science,

vol. 212 (1981) på s. 49 og av Manning et al., J. Med. Chem-, vol. 24 (1981) s.701.

Syntetiske vasopressiner er også vist i de følgende US patenter: 3.371.080, 3.415.805, 3.418.307, 3.454.549, 3.497.491, 4.148.787.

I US patent nr. 3.371.080 er det angitt at 2-fenylalanin-8-ornitin-vasopressin utviser en vasokonsentrisk virkning lik den for naturlig vasopressin med en lav antidiuretisk aktivitet. De gjenværende patenter viser syntetiske vasopressiner med høy eller relativt spesifikk antidiuretisk aktivitet.

Syntetiske modifikasjoner av oksytoksin er vist i US patentene nr. 3.691.147 og 3.700.652.

Det er derfor åpenbart at det er et eksisterende behov for utvikling av farmakologisk og klinisk aktive antagonister mot den antidiuretiske virkning av ADH og som er effektive in vivo.

En ytterligere hensikt er å tilveiebringe antagonister med vasopressorvirkningen av ADH, som utviser lav antidiuretisk aktivitet.

Oppfinnelsen vedrører fremstilling av nye antagonister mot den antidiuretiske virkning av ADH, hvilke forbindelser har formelen

hvor X er D-Phe, D-Val, D-Leu, D-Ile, D-Arg, D-Norvalin, D-norleucin, D-cykloheksylalanin, D-a-aminosmørsyre, D-treonin eller D-metinonin; W er Pro, Z er D-eller L-Arg, og A er Val eller Gin, eller hvor X er D- eller L-Tyr-X', hvor X' er hydrogen, metyl, etyl, n-propyl, isopropyl eller butyl, W er Pro eller A<3> -pro og Z er L- eller D-Arg og når X er Tyr-X<1> er W A3 -Pro. Det som er karakteristisk ved fremgangsmåten fremgår av kravet.

I fig. 1 er vist urinosmolaliteter som funksjon av tiden for rotter behandlet intraperitonealt med en forbindelse ifølge oppfinnelsen.

Fig. 2 viser urinutskillelser som en funksjon av tiden for rotter behandlet med en forbindelse ifølge oppfinnelsen.

Forbindelsene som fremstilles i henhold til oppfinnelsen er derivater av argininvasopressin (AVP). Aminosyrene fore-ligger i L-formen hvis ikke annet er indikert. Sammenhengen mellom de fulle navn og forkortelsene er som følger: dAVP, 1-deamino-arginin vasopressin; dPAVP, [1-deaminopenicillamin] arginin vasopressin; d(CH2).^AVP, [1- (3-merkapto-P,P~ cyklopentametylenpropionsyre)]-arginin-vasopressin; dVDAVP, 1- deamino[4-valin,8-D-arginin]vasopressin; dPVDAVP, [1-deaminopenicillamin, 4-valin, 8-D-arginin] vasopressin; d (CH2). ^VDAVP , [1-(p-merkapto-p,p-cyklopenta-metylenpropionsyre)- 4-valin, 8-D-arginin] vasopressin; dTyr(Me)AVP, 1-deamino[2-(O-metylX-tyrosin]arginin vasopressin; dPTyr(Me)AVP [1-deaminopenicillamin, 2- (O-metyl) tyrosin] arginin vasopressin; d (CH2)5Tyr ( Me). VDAVP, [1- (P-merkapto-p, p-cyklopentametylenpropionsyre)., 2-0-metyltyrosin, 4-valin, 8-D-arginin] vasopressin; d(CH2)5Tyr (Et)VDAVP, [1-(P-merkapto-p,p-cyklo<p>entametylenpropionsyre), 2- 0-etyltyrosin, 4-valin, 8-D-arginin]vasopressin, d(CH2)5 Tyr (Me)VAVP, [1- (P~merkapto-P, P-cyklopenta-metylenpropion-syre), 2-(O-metyl)tyrosin, 4-valin]arginin vasopressin; d(CH2)^ Tyr (Et)VAVP, [1-(P-merkapto-p,p-cyklopentametylenpropionsyre) , 2-0-etyltyrosin, 4-valin] arginin vasopressin; d (CH2). ,-Tyr (i-Pr)VDAVP, [1-(P-merkapto-p,p-cyklopentametylenpropionsyre1, 2-(0-isopropyl)tyrosin, 4-valin, 8-D-arginin] vasopressin; d (CH2) 5Tyr (n-Pr) -VDAVP, [1- (p-merkapto-p,p-cyklopentametylenpropionsyre), 2-(0-n-propyl)tyrosin, 4-valin, 8-D-arginin] vasopressin; d (CH2) 5Tyr (i-Pr) VAVP, [1-(P-merkapto-p,p-cyklopentametylenpropionsyre)., 2-(0-isopropyl)-tyrosin, 4-valin] arginin vasopressin; d (CH2 ).j-Tyr (n-Pr). VAVP, [1- (P-merkapto-p, p-cyklopentametylenpropionsyre), 2-(0-n-propyl)tyrosin, 4-valin] arginin vasopressin; og d(CH2)5Tyr(Et}V A 3 -Pro 7AVP, [1-(P~ merkapto-p, p-cyklopentametylenpropionsyre)., 2- (0-etyl) tyrosin, 4-valin, 7-(3 ,4-dehydroprolin). J arginin vasopressin; d(CH2)_,--D-Tyr VDAVP, [l-p-merkapto-p,P-cyklopentametylen-propionsyre), 2-D-tyrosin, 4-valin, 8-D-arginin vasopressin; d(CH2)^ D-

Tyr VAVP, [ 1- (p-merkapto-P, P-cyklopentametylenpropionsyre)., 2-D-tyrosin, 4-valin]-arginin vasopressin; d(CH2)5~D-Phe<2 >VDAVP, [1-(P-merkapto-P,P-cyklopentametylenpropionsyre), 2-D-fenylalanin, 4-valin, 8-D-arginin] vasopressin; d(CH2)^ D-

Phe VAVP, [1 (P-merkapto-P,p-cyklopentametylenpropionsyre). , 2-D-fenylalanin, 4-valin]-arginin vasopressin; d(CH2)^ [Gly 2] VAVP, [1-(P-merkapto-p,P-cyklopentametylenpropionsyre), 2-glycin, 4-valin]-arginin vasopressin; d(CH2)5~[D-Ala 2] VAVP, [1-(&-merkapto-3,p-cyklopentametylenpropionsyre), 2-D-alanin, 4-valin]-arginin vasopressin; d(CH2).5 [D-Val 2] VAVP [1- (P~ merkapto-P,p-cyklopentametylenpropionsyre), 2-D-valin, 4-valin]-arginin vasopressin; d(CH2)^ [D-Leu 2] VAVP, [l-(P-merkapto-p,p-cyklopentametylenpropionsyre), 2-D-leucin , 4-valin]-arginin vasopressin; d(CH,,)5 [D-Ile 2] VAVP, [1-(P-merkapto-P, P-cyklopentametylenpropionsyre)., 2-D-isoleucin, 4-valin]-arginin vasopressin; og d(CH2)5 [D-Arg 2] VAVP, [1-(P-merkapto-P,P-cyklopentametylenpropionsyre), 2-D-arginin, 4-valin]-arginin vasopressin.

De aktive peptider ble fremstilt ved fastfasesyntesen som beskrevet av Bankowski et al. (1978), supra; Merrifield, J.

Am. Chem. Soc., vol. 85 (1963) s. 2149 og Biochemistry,

vol. 3 (1964). s. 1385; Manning, J. Am. Chem. Soc, vol. 90

(1968) s. 1348; Manning et al., J. Med. Chem., vol. 19 (1976)

s. 376; Lowbridge et al., J. Med. Chem., vol. 20 (1977) s. 1173; Manning et al., J. Med. Chem., vol. 16 (197 3) s. 97 5; Kruszynski et al. (1980), supra; Sawyer et al., (1981)., supra eller Manning et al. (1981). supra.

Peptider inneholdende A -Pro i 7-stillingen ble også fremstilt på denne måte. Innarbeidelse av A 3-Pro i peptidene er beskrevet av Felix et al., J. Peptide Protein Res., vol. 10 (1977) s. 299 og Botos et al., J. Med. Chem., vol. 22 (1979) s. 926.

Opprinnelige forsøk på å konstruere en antagonist mot en antidiuretisk virkning av arginin vasopressin (AVP) innebefatter fremstilling av [l-deaminopenicillamin-4-valin-8-D-arginin] vasopressin (dPVDAVP) av Manning et al. (1977), supra, og [1-(p-merkapto-p-p-cyklopentametylenpropionsyre-4-valin-8-D-arginin] vasopressin (d(CH2l^VDAVP), Lowbridge

(1978), supra. Disse analoger ble fremstilt ved å erstatte

de to hydrogenatomer på p-karbonet i 1-stillingen i det meget aktive og selektivt antidiuretisk virkende peptid 1-deamino

[4-valin, 8-D-arginin] vasopressin (dVDAVP), Manning et al., J. Med. Chem., vol. 16 (1973), s. 975, med henholdsvis to metylgrupper og en cyklopentametylengruppe. Disse substi-tuenter hadde tidligere vist seg å omdanne den meget potente oksytoksiske agonist 1-deamino-oksytoksin (dOT) til potente antagonister mot den oksytoksiske respons av oksytoksin, spesielt [1-deaminopenicillamin] oksytoksin (dPOT). og [1-(3-merkapto-&, 3-cyklopentametylenpropionsyre). ] oksytoksin (d(CH2)50T). Se, Hope et al., J. Biol. Chem., vol. 237 (1962) s. 1563, Schulz et al., J. Med. Chem., vol. 9 (1966) s. 647 og Nestor et al., J. Med. Chem., vol. 18 (1975) s. 284.

Overraskende var verken dPVDAVP eller d(CH2)5VDAVP en antagonist mot den antidiuretiske effekt av AVP selv om de henholdsvis utviste 0,1 og kun 0,0001 av den antidiuretiske aktivitet av dVDAVP. Hver var imidlertid en potent antagonist ovenfor vasopressorvirkningen av AVP, uttrykt som pA2. pA2 angir den negative logaritme (med 10 for den gjennomsnitt-lige molare konsentrasjon av en antagonist som vil nedsette den spesifikke biologiske virkning med 2x enheter for agonisten til et responsnivå på x enheter av agonisten. dPVDAVP og d(CH2)^VDAVP utviste antivasopressor pA2 verdier på henholdsvis 7,82 og 7,68.

Oppdagelsen av at disse to vasopressorantagonister dPVDAVP

og d(CH2)5VDAVP førte til undersøkelse av effekter av 3,3~di-metyl og 3,3-cyklopentametylensubstitusjoner i 1-stillingen i andre analoger av AVP, spesielt i kombinasjon med substi-tusjon med O-metyltyrosin i 2-posisjonen i den meget aktive antidiuretiske og vasopressoragonist 1-deamino-arginin vasopressin (dAVP). i håp om erholdelse av et antivasopressorpeptid som var mere potent og selektivt enn dPVDAVP eller d(CH2)5 VDAVP. Se Huguenin et al., Heiv. Chem. Acta., vol. 49 (1966) s. 695; Manning et al., J. Med. Chem., vol. 19 (1976) s. 842 og Law et al., J. Am. Chem. Soc, vol. 82 (1960) s. 4579.

Oppdagelsen av de antidiuretiske antagonister d(CH2)^Tyr(alk) VAVP, Sawyer et al., (1981), supra Manning et al., (1981) supra, førte til syntese av analoger som var tosubstituerte i andre posisjoner. Forsterket anti-antidiuretiske potenser ble utvist av forskjellige 0-alkyl-D-tyrosinanaloger, Manning et al., i Peptides, Structure, Function, Dan H. Rien og E. Gross, eds., Pierce Chemical Co (under trykking) og J.

Med. Chem. (submitted). De ualkylerte D-tyrosinisomerer av d(CH2)5VDAVP og d(CH2)5VAVP, dvs. d(CH2)5D-Tyr-VDAVP og d(CH2)5 D-Tyr-VAVP ble også vist å være anti-antidiuretika. Forsøk

på ytterligere å forsterke den anti-antidiuretiske potens og selektivitet har ført til syntese av analoger av d(CH9),-D-Tyr 2 VAVP og d(CH2)5D-Tyr 2VDAVP inneholdende andre D-amino-syrer i steden for D-tyrosin i tostillingen, i henhold til foreliggende søknad.

Det ble overraskende funnet av Bankowski et al. (1978) at

av [ 1-deaminopenicillamin]-arginin vasopressin (dPAVP). og [1-deaminopenicillamin, 2-(O-metyl)tyrosin]arginin vasopressin (dPTyr(Me)-AVP), dPAVP var mindre potent enn både dPVDAVP eller d (CH2 )_,-VDAVP men dPTyr(Me)AVP hadde en antivasopressor pA2 verdi på 7,96 og var det mest potente antivasopressorpeptid til da kjent.

Innvirkningen på antivasopressorpotensen ved kombinasjon av |3, (3-cyklopentametylen og O-metyltyrosin substitueringer i dAVP ble utviklet i henhold til denne oppfinnelse til å gi [1- (|3-merkapto-(3, |3-cyklopentametylenpropionsyre) , 2-(O-metyl)-tyrosin)-arginin vasopressin (d (CH2) 5Tyr (Me).AVP) med strukturen

Denne forbindelse hadde en meget høy antivasopressorpotens og en meget svak antidiuretisk aktivitet slik som det umety-lerte 2-tyrosinderivat d(CH2)5AVP.

De fremstilte forbindelser som har aktivitet som antagonister mot den antidiuretiske aktivitet til arginin vasopressin hører med til 4-valin-8-arginin vaso-pressinserien med formel I hvori Tyr er D- eller L-formen og X' og Z er:

Forbindelser med formel II er som ovenfor hvori P^o i 7-stillingen er erstattet med A^-Pro.

Forbindelsene med formel I er beslektet med tidligere rapporterte antagonister mot vasopressoreffekten av ADH, [1- ((3-merkapto-p1, p-cyklopentametylenpropionsyre).-4-valin-8-D-arginin] vasopressin d(CH2)5VDAVP, Lowbridge et al. (1978). Selv om den ikke er en antagonist mot den antidiuretiske virkning av ADH in vivo så var denne analog en konkurrer-ende antagonist mot nyrebark adenylate cyklase av ADH in vitro, Butlen et al., Mol. Pharmacol., vol. 14 (1978) s. 1006. Arbeidet til Larsson et al. (1978), supra, indikerte også muligheten for å lage O-alkyl-tyrosin substitusjoner for å omdanne denne type peptid til en antagonist mot den antidiuretiske effekt in vivo.

Forbindelser med formel II inneholder en A^-Pro^ enhet som av Botos et al., supra er antatt å bidra til den høye antidiuretiske aktivitet av visse AVP analoger.

Som vist ved intraperitoneal administrasjon av forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen i normalt hydrerte bevisste rotter er (O-etyl)-tyrosinsubstitusjon i 2-stillingen i forbindelser med formel I mere effektive enn (O-metyl)tyrosin-substitusjonen. (O-propyl)-tyrosinforbindelser med formel I har også en imponerende anti-ADH aktivitet. Imidlertid

en 2-(O-Et)-tyrosinforbindelse med formel II er den mest effektive anti-ADH forbindelse evaluert opptil nå. 8-L-argininanaloger er mere potente enn de tilsvarende 8-D-argininanaloger.

Det synes som om at høyere doser av d(CH2)5Tyr(Et)VAVP full-stendig blokkerer den antidiuretiske virkning av endogent ADH. For eksempel en 30 ,ug/kg dose av d(CH2)5Tyr(Et)VAVP øket urinstrømmen til et middel på 27 ml/kg pr. time i løpet av den andre timen etter injeksjon. Spontan urinstrøm for hunrotter homozygotisk for Brattleborostammen som overhodet ikke utskiller noe ADH er gjennomsnittlig 32 ml/kg/h, Sawyer, et al., Endocrinology, vol. 95 (1974) s. 140.

Viktigheten av mindre strukturelle modifikasjoner er indikert av observasjonene at tilsvarende |3,(3-dietyl og (3,3~dimetyl-analoger av d(CH2)5Tyr(Et)VAVP ikke utviser påvisbar antagonistisk aktivitet ved antidiuretisk bestemmelse hos rotter ved intravenøs administrasjon. Tilstedeværelse av 4-valin bidrar også til antagonistisk aktivitet; Substituering av en 4-glutaminenhet i d(CH2)5Tyr(Et)VAVP fører til tap av antagonistisk aktivitet.

Forbindelser fremstilt ifølge oppfinnelsen som har Gin i 4-stillingen som antagoniserer vasopressoreffekten av AVP

er nyttige ved farmakologiske studier med hensyn til AVP's rolle ved regulering av blodtrykk under normale og pato-fysiologiske betingelser. Kliniske anvendelser innebefatter anvendelser som diagnostiske og terapeutisk antihypertensive midler. For terapeutiske formål vil forbind-

eisene bli anvendt på samme måte som kjente antihypertensive medisiner Captopril, D.B. Case et al., "Progress in Cardio-vascular Diseases," vol. 21 (1978) s. 195.

Forbindelsene med formel I og II er meget effektive antagonister mot den antidiuretiske virkning av ADH. De kan derfor anvendes i farmakologiske studier over bidragene fra ADH til et antall patologiske tilstander vedrørende vannretensjon. Det er ytterligere antatt at de vil være effektive og spesifikke midler for behandling av syndromet for utilstrekkelig utskillelse av ADH, dvs. Schwartz-Bartter syndromet eller SIADH. Dette syndrom kan komplisere et antall forstyrrelser innebefattende carcinoma, lungesykdom-mer, hjernesykdommer og hodeskader, Bartter et al., Am. J. Med., vol. 42 (1967) s. 790.

I henhold til foreliggende oppfinnelse ble det funnet at visse d(CH2)^VAVP derivater med en D-aminosyre forskjellig fra tyrosin og større enn alanin i 2-stillingen er mere potente antagonister mot den antidiuretiske virkning av AVP enn forbindelser inneholdende D- eller L-tyrosineterenheter eller en D-tyrosinenhet i 2-stillingen i d (CH2). ,/VAVP eller d(CH2)5VDAVP.

Foretrukne forbindelser fremstilt ifølge oppfinnelsen er de hvori 8-substituenten er Arg eller 2-substituenten er D-Phe, D-Val, D-Leu og D-Ile.

Som vist ved intravenøs administrasjon av forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen til normalt hydrerte bevisste rotter og til hydrerte rotter anestisert med etanol så utviser forbindelsene med D-Phe, D-Val, D-Leu eller D-Ile substi-tuenter i 2-stillingen høye pA2 verdier og effektive doser nær eller under de laveste hittil kjente effektive doser.

Forbindelser med D-Phe, D-Val, D-Leu eller D-Ile i 2-stillingen og Arg i 8-stillingen er også rene antidiuretiske antagonister, dvs. at disse forbindelser har ingen transient antidiuretisk agonisme. Ytterligere er disse forbindelser mere selektive i deres aktivitet som følge av de høyere anti-ADH/antivasopressoraktivitetsforhold enn tidligere kjente forbindelser.

Forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan anvendes i blåndinger med konvensjonelle eksipienter, eksempelvis fysio-logisk og farmasøytisk akseptable organiske eller uorganiske bærere egnet for parenteral eller enteral anvendelse og som ikke innvirker nedsettende på de aktive forbindelser.

Egnede farmasøytisk akseptable bærere innebefatter bl.a. vann, saltoppløsninger, alkoholer, vegetabilske oljer, poly-etylenglykoler, gelatin, laktose, amylose, magnesiumstearat, talkum, silisiumdioksyd, viskøs paraffin, parfymeolje, fett-syremonoglycerider og diglycerider, pentaerytritol fett-syreestere, hydroksymetylcellulose, polyvinylpyrrolidon, etc. De farmasøytiske preparater kan steriliseres og om ønsket blandes med hjelpemidler såsom smøremidler, preserverings-midler, stabilisatorer, fuktemidler, emulgatorer, salter for å innvirke på det osmotiske trykk, puffere, farge- smaksett-ende og/eller aromatiske bestanddeler o.l. som ikke innvirker ødeleggende på de aktive forbindelser.

For parenteral eller intranasal administrasjon er spesielt anvendbare oppløsninger, fortrinnsvis vandige oppløsninger såvel som suspensjoner, emulsjoner eller implantanter innebefattende suppositorier. Ampuller er egnede enhetsdoser.

De fremstilte forbindelsene er generelt administrer-bare til dyr, innebefattende pattedyr, såsom husdyr, kjele-dyr, mennesker, kveg, katter og hunder. En diuretisk effek-tiv daglig dose av de aktive forbindelser kan administreres parenteralt i enkeltdose eller som oppdelte doser over døgnet.

Parenteral eller intranasal administrasjon er foretrukket og de anti-antidiuretiske forbindelser fremstilt ifølge oppfinnelsen er spesielt nyttige ved behandling av mennesker beheftet med vannretensjon som følge av en hvilken som helst sykdomsårsak. For dette formål kan de administreres i det vesentlige på samme måte som de kjente forbindelser oksytoksin og vasopressin for å oppnå de ønskede fysiologiske effekter.

Det vil forstås at de aktuelt foretrukne mengder av de aktive anvendte forbindelser vil variere i henhold til spesi-fikt anvendte forbindelser, den spesielle formulerte sammen-setning, anvendelsesmetode og organismen som behandles. Op-timale administrasjonsforhold under eller i et gitt sett av betingelser kan fastsettes av en fagmann under anvendelse av konvensjonelle dosebestemmelsesforsøk i henhold til de ovenfor gitte retningslinjer.

Foretrukne fremstilte antidiuretiske antagonister

er [1-(3-merkapto-3,3-cyklopentametylenpropionsyre)-2-(0-etyl)tyrosin, 4-valin]-arginin vasopressin og mest foretrukket er 8-L-argininforbindelsen. Også foretrukket er den tilsvarende A 3 -Pro <7> forbindelse.

Andre foretrukne forbindelser er de hvori X er D-Phe, D-Val, D-Leu eller D-Ile og Z er L-Arg. D-Ile eller D-Phe forbindelsene er mest foretrukne.

I de etterfølgende eksempler er de angitte temperaturer ukorrigerte °C. Hvis intet annet er indikert er alle deler og prosentangivelser pr. vekt.

Klormetylert harpiks("Bio-Rad Bio-Beads SX-1") ble forestret i henhold til fremgangsmåten ifølge Gisin, Heiv. Chim. Acta, vol. 56 (1973) s. 1476 med Boc-Gly inntil 0,47 mmol/g og /<s>>0,64 mmol/g var innarbeidet. Aminosyrederivatene innebefattende Boc-Tyr(Me) (Rf (A) 0,7; Rf (B) 0,8) ble levert av Bachem Inc., eller fremstilt.

Trietylamin (TEA) og N-metylmorfolin (NMM) ble destillert fra ninhydrin.

Eddiksyre anvendt som HCl-eddiksyrespaltemiddel ble opp-varmet under tilbakeløpet med bortriacetat og destillert fra denne forbindelse. Dimetylformamid (DMF) ble destillert under nedsatt trykk umiddelbart før anvendelse. Metanol ble tørket med magnesiummetoksyd og destillert. Andre oppløs-ningsmidler og reagenser var av analytisk grad.

Tynnsjiktkromatografi (TLC). ble utført på silikagelplater (0,25 mm, "Brinkmann Silplate") under anvendelse av det følgende oppløsningsmiddelsystem: A. cykloheksan-kloroform-eddiksyre (2:8:1 v/v);

B. propan -1-ol-ammoniakk (34%) (2:1 v/v).; C. etanol (95%).-ammoniakk (34%) (3:1 v/v); D. kloroform-metanol (7:3 v/v); E. butan-l-ol-eddiksyre-vann (4:1:5 v/v, øvre fase); F. butan-l-ol-eddiksyre-vann-pyridin (15:3:3:10 v/v). De på-førte mengder var 10-50 ug. Den minimale lengde av kromatogrammene var 10 cm. Kloroplatinatreagens og joddamp ble anvendt for fremkalling av kromatogrammene.

Aminosyreanalysene av peptidene ble utført ved fremgangsmåten i henhold til Spackman et al., Anal. Chem., vol. 3 0

(1958) ved 1190 ved at peptidprøver med en vekt på ca. 0,5 mg ble hydrolysert med konstant kokende saltsyre (400 pl), i evakuerte og forseglede ampuller i 18 h ved 120 oC. Analysen ble utført under anvendelse av "Beckman Automatic Amino Acid Analyzer, Model 121").. Molarforhold er basert på Gly = 1,00. Elementæranalyse ble utført av Galbraith Laborato-ries, Inc., Knoxville, Tenn. De analytiske resultater for elementene indikert med de respektive symboler var innen + 0,4% av de teoretiske verdier. Optisk dreining ble målt med et Bellingham Stanley, Ltd., Model A polarimeter, type pl.

EKSEMPEL 1

B- ( S- Benzylmerkapto) - B, B- cyklopentametylen- propionyl- Tyr ( Me).-Phe- Gln- Asn- Cys( Bzl)- Pro- Arg( Tos)- Gly- NH^• (a) Kombinasjon av fastfase og oppløsningsmetoder. Boc-Tyr(Me)-Phe-Gln-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Gly-NH2, fremstilt i henhold til fremgangsmåten ifølge Bankowski et al.,

J. Med. Chem., vol. 21 (1976) s. 842 (319 mg, 0,26 mmol).,

ble oppløst i TEA (6,5 ml) og omrørt ved romtemperatur i 40 min. Kald eter (20 mil ble tilsatt til å gi et presipi-tat som ble filtrert og vasket med eter (5 :x 10 ml). Produktet ble tørket under vakuum over natriumhydroksydperler. Dette materialet (318,5 mg) ble oppløst i DMF (0,8 ml) hvor-til var satt N-metylmorfolin (10 pl). Den resulterende oppløsning hadde en pH på 7-8, målt med et fuktig pH papir. Etter nøytralisering ble oppløsningen omrørt ved romtemperatur i 30 min. og en oppløsning av p-nitrofenyl B-(S-benzylmerkapto)-3,B-cyklopentametylenpropionat, Nestor et al., J. Med. Chem. vol. 18 (1975) s. 284, (445 mg, 1,155 mol i 0,4

ml DMF) ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur. Etter 7 2 h omrøring viser tynnsjiktskromatografi-analyse under anvendelse av system D at blandinger, fremdeles inneholdt spor av det frie oktapeptidamid. N-hydroksybenzotriazol monohydrat, Konig et al., Chem. Ber., vol. 103 (1970) s. 788, (39,3 mg, 0,26 mmol) ble tilsatt. Koblingen var full-stendig i løpet av 5 h. Presipitatet ble filtrert, vasket med kald etylacetat (4 x 10 ml) og tørket under vakuum. Råproduktet (33 0 mg) ble utfelt to ganger fra DMF-metanol til å

gi acylpeptidamidet (295,2 mg, 77,3%) : smp. 209-211°C; [ct]^<4>

= -43,6° (C 0,5, DMF).; Rf(E). 0,45, Rf(F) 0,63 Anal. (C73<Hg>4 014<S>3) C, H, N.

Aminosyreanalyse: Tyr, 0,80; Phe, 1,01;

Glu, 1,04; Asp, 1,02; Cys(Bzl), 0,98; Pro, 1,06;

Arg, 1,01; Gly, 1,00; NH^ 2,91. (b) Totalsyntese på harpiks.

Boc-Tyr (Me).-Phe-Gln-Asn-Cys (Bzl) -Pro-Arg (Tosl-Gly-harpiks (1,11 g, 0,4 mmol fremstilt fra Boc-Gly-harpiks under anvend-

else av fastfasemetoden) ble omdannet til acyloktapeptidharpiks (1,167 g), vektfdrøkelse 57 mg, 97,6% av det teoretiske)

i en avbeskyttelse, nøytralisering og kobling med p-nitrofenyl-3-(S-benzylmerkapto)-3,3-cyklopentametylenpropionat,

se Nestor supra. Harpiksen ble ammonolysert, Manning, J. Am. Chem. Soc, vol. 90 (1968) s. 1348. Produktet ble ekstrahert med dimetylformamid (DMF). Etter inndampning av opp-løsningsmidlet under vakuum ble resten presipitert ved tilsetning av vann. Råproduktet (410 mg) ble utfelt to ganger fra DMF-etanol til å gi acyloktapeptidet (302 mg, 50,7% basert på det opprinnelige glycininnhold i harpiksen); smp. 206-208°C (decomp); Rf (E), 0,45, Rf (F) 0,63; [a]^<4> = -43,1°

(C 1, DMF). Anal. (C^Hg^^) C, H, N.

Aminosyreanalyse: Tyr, 0,79; Phe, 1,01;

Glu, 1,03; Asp, 1,04; Cys(Bzl), 0,97; Pro, 1,03;

Arg, 0,99; Gly 1,00; NH3, 2,95.

EKSEMPEL 2

3~( S- benzylmerkapto)- 3, 3- cyklopentametylenpropionyl- Tyr( Bzl)-Phe- Gln- Asn- Cys( Bzl)- Pro- Arg( Tos)- Gly- NH^.

Boc-Tyr(Bzl)-Phe-Gln-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Arg(Tos)Gly-harpiks (1,46 g, 0,5 mmol) ble omdannet til acyloktapeptidharpiks (1,55 g, vektforøkelse 70 mg, 95,9% av det teoretiske) som i eksempel 1 i en syklus omfattende avbeskyttelse, nøytraliser-ing og kobling med p-nitrofenyl 3-(S-benzylmerkapto)-3/3-cyklo-pentametylenpropionat . Produktet erholdt ved ammonolyse av harpiksen ble ekstrahert med DMF. Oppløsningen ble inndampet under vakuum og resten presipitert ved tilsetning av vann. Råproduktet (723 mg) ble utfelt fra DMF-etanol og DMF-2% vandig AcOH. (488 mg; 62,4% basert på opprinnelig Gly-innhold i harpiksen); 23

smp. 183-185°C; Rf(E) 0,38; Rf(D) 0,41; [o]D = -32,9°

(C 1 DMF). Anal. (C? 9^98^lå0i4S3) C, H, N.

Aminosyreanalyse: Tyr, 0,97; Phe, 1,02;

Glu, 1,05; Asp, 1,01; Cys(Bzl), 0,98; Pro, 1,04;

Arg, 0,98; Gly, 1,00; NH3.

EKSEMPEL 3

[ 1-( B- merkapto- 3, B- cyklopentametylenpropionsyre), 2-( O- metyl) tyrosin] arginin vasopressin.

(a) Fra nonapeptidamid

En oppløsning av det beskyttede nonapeptidamid, fremstilt som i henhold til eksempel 1, (170 mg, 0,114 mmol) i 400 ml ammoniakk (tørket over natrium og omdestillert) ble omrørt ved kokepunktet med natrium fra en bit av metallet inneholdt i et tynt glassrør inntil en lyseblå farve vedvarte i opp-løsningen i 3 0 s, i henhold til duVigneaud, J. Am. Chem. Soc, vol. 76 (1959) s. 3115. Tørr iseddik (0,4 ml) ble tilsatt for å fjerne farven. Oppløsningen ble inndampet. En oppløsning av resten i vandig eddiksyre (0,2%; 800 ml) ble behandlet med 2M ammoniumhydroksydoppløsning til å gi en oppløsning med pH 7,5. Til denne omrørte oppløsning ble gradvis tilsatt et overskudd av en oppløsning av kaliumjern (Ill)cyanid (0,01M, 11,4 ml), Hope et al., J. Biol. Chem., vol. 237 (1962) s. 1563. Den gule oppløsning ble ytterligere omrørt i 90 min. og i 60 min. med anionbytterharpiks BioRad AG-3, CL form, 10 g). Suspensjonen ble filtrert langsomt gjennom et sjikt av harpiksen (80 g fuktig vekt). Harpiks-sjiktet ble vasket med 300 ml vandig 0,2%-ig eddiksyre og det kombinerte filtrat og vaskinger ble lyof ilisej. t. Det resulterende pulver (1386 mg) ble avsaltet på en "Sephadex G-15" kolonne (110 x 2,7 cm) og eluert med vandig eddiksyre (50%-ig). med en gjennomstrømningshastighet på 4 ml/h i henhold til teknikken beskrevet av Manning et al., J. Chromatog. vol. 38 (1968) s. 396. Eluatet ble fraksjonert og overvåket med hensyn til absorpsjon ved 280 nm. Fraksjoner omfattende hovedtoppen ble slått sammen og lyofylisert. Resten (55,5 mg) ble ytterligere underkastet gelfiltrering på en "Sephadex G-15" kolonne (100 x 1,5 cm) og eluert med vandig eddiksyre (0,2M) med en strømningshastighet på 2,5 ml/h. Peptidet ble eluert i en enkel topp (absorpsjon 280 nm). Lyofilisering av de aktuelle fraksjoner ga vasopressinanalogen (49 mg, 37,3%) Rf(E) 0,19; Rf(F) 0,30; [a]^<2->59,6 (c0,19, IM AcOH).

Aminosyreanalyse: Tyr, 0,81; Phe 1,01;

Glu, 1,04; Asp, 0,98; Pro, 1,04; Arg, 0,95; Gly, 1,00;

NH3, 3,10. Analyse etter oksydasjon med permaursyre før hydrolyse i henhold til Moore, J. Biol. Chem., vol.238 (1963)

s. 235, ga et Cys (03H).-Gly forhold på 1,03:1,00.

(b) Fra acyloktapeptid.

Behandling av acyloktapeptidet<:>(160 mg, 0,107 mmol) som ovenfor beskrevet under (a) ga analogen (64 mg, 51,7%), som ikke kunne skjelnes fra den fremstilt som ovenfor ved hjelp av TLC: [a]^<3>-59,l° (C 0,5, IM AcOH).

Aminosyreanalyse: Tyr, 0,80; Phe, 1,02; Glu, 1,02; Asp, 0,98; Pro, 1,03; Arg, 0,96; Gly 1,00; NH3, 3,05. Analyse utført etter permaursyreoksydasjon før hydrolyse ga et Cys-(03H)-Gly forhold på 1,02:1,00.

EKSEMPEL 4

[ 1-( 3- merkapto- B, B- cyklopentametylenpropionsyrelJ arginin vasopressin.

Behandling av acyloktapeptidet (173 mg, 0,111 mmol) som beskrevet i eksempel 3 (a) ga analogen (66 mg, 52,5%) Rf (E) 0,19, Rf(F) 0,43. [a]<23> -58,7° (C 0,5, IM AcOH).

Aminosyreanalyse: Tyr, 0,96; Phe, 0,98; Glu, 1,01; Asp, 1,01; Pro, 1,05; Gly, 1,00; NH3, 2,95. Analyse etter permaursyre-oksydas jon før hydrolyse ga et Cys(03H)-Gly forhold på 1,01: 1,00.

EKSEMPEL 5

[ 1-( B- merkapto- B, B- cyklopentametylenpropionsyre), 2-( 0- alkyl) tyrosin, 4- valin]-( L- og D-)- arginin vasopressin. Forbindelsene i denne serie ble fremstilt ved fastfasesyntese modifisert som angitt i Manning et al., J. Med. Chem., vol.

16 (1973) s. 975 og Kruszynski et al., J. Med. Chem., vol.

23 (1980) s. 3 64, til å gi beskyttede mellomprodukter for hver analog. Fremgangsmåtene ifølge Bodanszky et al., J. Am. Chem. Soc, vol. 81 (1959) s. 5688 og J. Org. Chem., vol. 39

(1974) s. 444, hvorved anvendes en p-nitrofenylester fremmet ved hjelp av anvendelse av hydroksybenzotriazol (Konig et al., supra) ble anvendt for kobling av 3-(S-benzylmerkapto-3,3-cyklopentametylenpropionsyre i henhold til Nestor, supra for erholdelse av forløperforbindelser. Hver forløper ble av-blokkert (duVigneaud, supra) med natrium i flytende ammoniakk. De resulterende disulfhydrylforbindelser ble oksydativt syklisert med kaliumjern(III)cyanid (Hope et al., supra). Analogene ble avsaltet og renset ved gelfiltrering på "Sephadex G-15" i en totrinnsfremgangsmåte under anvendelse av henholdsvis 50%-ig eddiksyre og 0,2M eddiksyre som eluer-ingsmidler. Renheten og identiten av hver analog ble bestemt ved tynnsjiktskromatografi i tre forskjellige oppløsnings-middelsystemer,Kruszynski et al., J. Med. Chem., Vol. 23

(1980) s. 364, og ved aminosyreanalyser som angitt ovenfor.

Boc- Phe- Val- Asn- Cys( Bzl)- Pro- D- Arg( Tos)- Gly- harpiks Boc-Gly-harpiks (1,562 g, 1,0 mmol, Gly) ble underkastet

seks sykler av avbeskyttelse, nøytralisering og kobling til å gi det beskyttede heptapeptidylharpiks A (2,522 g, 1,0 mmol).

Boc- Phe- Val- Asn- Cys( Bzl)- Pro- Arg( Tos)- Gly- harpiks

Den beskyttede heptapeptidylharpiks B (2,522 g, 1,0 mmol) ble fremstilt fra 1,562 g (1,0 mmol) Boc-Gly-harpiks under anvendelse av fastfasemetoden.

Boc- Tyr ( Me)- Phe- Val- Asn- Cys ( Bzl) - Pro- D- Arg ( Tos),- Gly- harpiks En enkeltsyklus fastfasepeptidsyntese med Boc-Tyr(Me) som karboksybestanddel omdannet heptapeptidylharpiks A (1,2 61 g, 0,5 mmol) til den tilsvarende tert-butyloksykarbonyloktapep-tidylharpiks C (1,35 g, 0,5 mmol).

Boc- Tyr( Et)- Phe- Val- Asn- Cys( Bzl)- Pro- D- Arg( Tos- Gly- harpiks Heptapeptidylharpiksen A (1,261 g, 0,5 mmol) ga tert-butyl-oksykarbonyloktapeptidylharpiksen D (1,3 57 g, 0,5 mmol) i en syklus med fastfasepeptidsyntese med Boc-Tyr(Et) som karboksybestanddel .

Boc- Tyr( Me)- Phe- Val- Asn- Cys( Bzl)- Pro- Arg( Tos)- Gly- harpiks Heptapeptidylharpiks B (1,261 g, 0,5 mmol). ble omdannet til beskyttet oktapeptidylharpiks E (1,35 g, 0,5 mmol) i en syklus omfattende avbeskytning, nøytralisering og kobling med Boc-Tyr(Me).

B-( S- benzylmerkapto)- B, B- cyklopentametylenpropionyl- Tyr( Et)-Phe- Val- Asn- Cys( Bzl)- Pro- Arg( Tos)- Gly- harpiks Heptapeptidylharpiksen B (1,261 g, 0,5 mmol) ble omdannet

til acyloktapeptidharpiks (1,43 g, 0,5 mmol) i to sykler med fastfasepeptidsyntese under anvendelse av henholdsvis som karboksykomponent: Boc-Tyr(Et) og p-nitrofenyl 3~(S-benzylmerkapto) -3,3-cyklopentametylen-propionat.

Boc- Tyr ( Me) - Phe- Val- Asn- Cys ( Bzl) - Pro- D- Arg ( Tos),- Gly- NHp

Den beskyttede oktapeptidharpiks C (1,35 g, 0,5 mmol) ble ammonolysert og produktet ekstrahert med varm DMF. Produktet ble utfelt ved tilsetning av vann. Råproduktet ble omutfelt fra DMF-etanol-etyleter til å gi det rene produkt som et hvitt pulver (0,581 g, 88,52% basert på det opprinnelige Gly innhold i harpiksen) smp. 239-240°C; [a]<24> = -14,9° (C = 1, DMF); Rf(E), 0,54, Rf(D), 0,73; Anal. (<C>63<H>85<N>13<0>14<S>2) C' H,

N.

Aminosyreanalyse: Tyr, 1,02; Phe, 0,98; Val, 1,02; Asp, 1,00; Cys(Bzl), 0,98; Pro, 1,01; Arg, 0,97; Gly, 1,00; NH3, 2,1.

Boc- Tyr( Et)- Phe- Val- Asn- Cys( Bzl)- Pro- D- Arg( Tos)- Gly- NH2 Behandling av den beskyttede oktapeptidharpiks D (1,357 g,

0,5 mmol X ga som ovenfor Boc-oktapeptidamidet (0,535 g, 80,69% regnet på harpiksens opprinnelige Gly innhold) smp. 211-213°C; [a]24 = -16,4° (C = 1, DMF); Rf(E), 0,61, Rf(D), 0,83; Anal.

(<C>64<H>87<N>13°14<S>2) <C>' <H>' <N>"

Aminosyreanalyse: Tyr, 0,99; Phe, 1,00; Val, 1,01; Asp,

1,02; Cys(Bzl), 0,98; Pro, 1,00; Arg, 0,98; Gly, 1,00; NH^, 2,13.

Boc- Tyr( Me)- Phe- Val- Asn- Cys( Bzl)- Pro- Arg( Tos)- Gly- NH^ Behandling av den beskyttede oktapeptidharpiks E (1,35 g,

0,5 mmol) som ovenfor ga det tilsvarende Boc-oktapeptidamid (0,597 g, 90,96% beregnet på harpiksens opprinnelige Gly-

innhold). Smp. 216-217°C (avspaltning); [a]24 = -34,82° (C =

1, DMF) ; Rf(E), 0,54, Rf(D), 0,73; Anal. (C^H^N^C^^)

C, H, N.

Aminosyreanalyse: Tyr, 0,99; Phe, 1,00; Val, 1,02; Asp, 1,01; Cys(Bzl), 0,98; Pro, 1,01, Arg, 0,98; Gly, 1,00; NH^, 2,09.

P-( S- benzylmerkapto- B, g- cyklopentametylenpropionyl- Tyr( Et)-Phe- Val- Asn- Cys( Bzl)- Pro- Arg( Tos)- Gly- NH2

Den beskyttede acyloktapeptidharpiks (1,43 g, 0,5 mmcl) ble ammonolysert og produktet ekstrahert med varm DMF. Produk-

tet ble utfélt ved tilsetning av vann. Råproduktet ble gjenutfelt fra DMF-etanol-etyleter til å gi det rene produkt.

(0,490 g, 66,54% regnet på harpiksens opprinnelige Gly innhold), smp. 211-213° C; [a]^<4> = -39,8° (C = 1, DMF); Rf(E), 0,59, Rf(D), 0,75; Anal. (Cy ^gyN^0^^) c> H,.N.

Aminosyreanalyse: Tyr, 0,99; Phe, 1,01; Val, 1,01; Asp,

1,01; Cys(Bzl), 0,99; Pro, 1,02; Arg, 0,98; Gly, 1,00;

NH3, 2,07.

B-( S- benzylmerkapto)- B, B- cyklopentametylenpropionyl- Tyr( Me)-Phe- Val- Asn- Cys( Bzl)- Pro- D- Arg( Tos) Gly- NH2

Tert-butyloksykarbonyloktapeptidamidet fremstilt som oven-

for (0,270 g, 0,206 mmol) ble oppløst i TFA (3 ml) og fikk henstå ved romtemperatur i 20 min. Kald eter ble tilsatt og utfelt materiale ble filtrert og vasket med eter (5 x 10 ml). Produktet ble tørket under vakuum over natriumhydroksydperler. Dette materialet (250 mg) ble oppløst i DMF (0,8 ml) til hvilken oppløsning N-metylmorfolin ble tilsatt til å gi en oppløsning på pH 7-8 (fuktig pH papir). Den nøytriali-serte oppløsning blé omrørt ved romtemperatur i 20 min. En oppløsning av p-nitrofenyl B-(S-benzylmerkapto-B,B-cyklo-pentametylenpropionat (0,135 g, 0,37 mmol) og N-hydroksybenzotriazolmonohydrat (57 mg, 0,37 mmol) i DMF (1,0 ml) ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur over natten og TLC (system E) viste at reaksjonen var full-stendig. Metanol (80 ml) og eter (20 ml) ble tilsatt under kraftig omrøring. Det utfelte materialet ble filtrert, vas-

ket med en blanding av metanol-eter (8:2) og tørket under vakuum. Råproduktet (27 0 mg) ble gjenutfelt fra DMF-metanol til å gi acylpeptidamidet (263 mg, 75,2%); smp. 220-221°C; [a]24 = -25,7° (C = 1, DMF);Rf(E), 0,55, Rf(D), 0,83;

Anal. (C73<H>95<N>i3°i3<S>3) c> E> N-

Aminosyreanalyse: Tyr, 0,98; Phe, 1,01; Val, 1,02;

Asp, 1,02; Cys(Bzl), 0,97; Pro, 1,03; Arg, 1,0; Gly, 1,00; NH3, 2,06.

B- ( S- benzylmerkapto- B, B- cyklopentametylenpropionyl- Tyr ( Et) - Phe- Val- Asn- Cys( Bzl)- Pro- D- Arg( Tos)- Gly- NH2

Tert-butyloksykarbonyloktapeptidamidet (0,3 98 g, 0,3 mmol) ble avbeskyttet og koblet med p-nitrofenyl B-(S-benzylmerkapto) -3 rB-cyklopentametylenpropionat (0,232 g, 0,6 mmol) som ovenfor beskrevet til å gi acyloktapeptidamidet (0,361 g, 81,67%) smp. 222-224° C; [ ol]^ ° <=> -<2>2,8° (C = 0,5, DMF); Rf(E), 0,5, Rf(D), 0,83; Anal. (<C>74<H>97<N>13013S3) C, H, N.

Aminosyreanalyse: Tyr, 1,0; Phe, 1,02; Val, 1,03; Asp, 1,02; Cys(Bzl), 0,98; Pro, 1,03; Arg, 0,99; Gly, 1,00; NH^, 2,11.

3~( S- benzylmerkapto)~ 3> 3~ cyklopentametylenpropionyl- Tyr( Me)-Phe- Val- Asn- Cys( Bzl)- Pro- Arg( Tos)- Gly- NH^

Tert-butyloksykarbonyloktapeptidamidet (0,3 94 g, 0,3 mmol) ble avbeskyttet og koblet med p-nitrofenyl 3~(S-benzylmerkapto)-3,3-cyklopentametylenpropionat (0,23 2 g, 0,6 mmol) som ovenfor angitt til å gi acyloktapegtidamidet (0,388 g, 88,65%); smp. 211-214° C; [a]<21> = -39,2° (C = 1, DMF); Rf(E), 0,47, Rf

(D), 0,85; Anal. (C^H^N^C^^) C, H, N.

Aminosyreanalyse: Tyr, 0,99; Phe, 1,02; Val, 1,03; Asp, 1,01;

Cys(Bzl), 0,99; Pro, 1,02; Arg, 0,99; Gly, 1,00; NH3, 2,04.

[ 1-( 3~ merkapto- 3, 3- cyklopentametylenpropionsyre), 2-( 0- etyl) tyrosin, 4- valin]- arginin vasopressin

En oppløsning av beskyttet acyloktapeptidamid (140 mg, 0,095 mmol) i 400 ml ammoniakk (tørket og redestillert fra natrium) ble omrørt og behandlet ved kokepunktet med natrium inneholdt i et lite glassrør inntil en lyseblå farve bestod i oppløsningen i 30 s. Tørr eddiksyre (0,4 ml) ble tilsatt for å fjerne farven. Oppløsningen ble inndampet ved å føre nitrogen gjennom flasken. Etter 5 min. ble resten oppløst i vandig eddiksyre (10%-ig, 50 ml) til hvilken var tilsatt 800 ml vann. Oppløsninen ble behandlet med 2M ammoniumhyd-roksydoppløsning til å gi en oppløsning med pH-6,5. Overskudd av en oppløsning av kaliumjern(III)cyanid (0,01M, 16 ml) ble gradvis tilsatt under omrøring. Den gule oppløsningen ble ytterligere oppløst i 10 min. og deretter i 10 min. med en anionbytteharpiks (Bio-Rad AG-3, Cl form, 10 g fuktig vekt). Suspensjonen ble langsomt filtrert gjennom et sjikt av harpiksen (50 g fuktig vekt). Etter vasking av sjiktet med vandig eddiksyre (0,2%, 200 ml) ble det kombinerte filtrat og vaskinger lyofilisert. Det resulterende pulver (1,63 g) ble avsaltet på en "Sephadex G-15" kolonne (110 x 2,7 cm) ved eluering med vandig eddiksyre (50%-ig) med en strømnings-hastighet på 5 ml/h. Eluatet ble fraksjonert og observert med hensyn til absorpsjon ved 28 0 nm. Fraksjoner omfattende hovedtoppen ble slått sammen og lyofilisert. Resten (28 mg) ble underkastet gelfiltrering på en "Sephadex G-15" kolonne (100 x 1,5 cm). Produktet ble eluert med vandig eddiksyre (0,2M) med en strømningshastighet på 4 ml/h. Peptidet ble eluert ved en enkelt topp (absorpsjon 280 nm). Lyofilisering av de aktuelle fraksjoner ga vasopressinanalogen (24 mg, 20,6%). TIC Rf(E), 0,31, Rf(F), 0,62; [a]D = -65,1° (C = 0,2, IM AcOH).

Aminosyreanalyse:

Tyr, 1,00; Phe, 1,01; Val, 1,01, Asp, 1,01; Pro, 1,01; Arg, 1,00; Gly, 1,00; NH^, 1,97. Analyse etter permaursyreoksydasjon før hydrolyse ga et Cys (O^HJ-Gly forhold på 1,01:1,00. [ 1-( B- merkapto- B, p- cyklopentametylenpropionsyre], 2-( O- metyl) tyrosin, 4- valin, 8- D- arginin] vasopressin Peptidmellomproduktet (168 mg, 0,115 mmol) ble redusert med natrium i flytende ammoniakk, reoksydert, avionisert og renset som ovenfor til å gi 49,5 mg av produktet (35,5%) R^ (E) , 0,30, Rf(F), 0,61; [a]<23> = -46,4° (C = 0,4, IM AcOH). Aminosyreanalyse: Tyr, 0,98; Phe, 1,01; Val, 0,98; Asp, 0,99; Pro, 1,03; Arg, 0,98; Gly, 1,00; NH^ i 12,1. Analyse etter permaursyreoksydasjon før hydrolyse ga et Cys(03H)-Gly forhold på 1,03:1,00.

[ 1-( B- merkapto- B, B- cyklopentametylenpropionsyre), 2-( 0- etyl) tyrosin, 4- valin, 8- D- arginin] vasopressin

Utbyttet av analogen fra 167 mg (0,113 mmol) av mellompro-duktet var 29 mg (20,9%). Rf(E), 0,29, Rf(F), 0,57; [a]2<3> =

-41,1° (C = 0,3, IM AcOH).

Aminosyreanalyse: Tyr, 0,98; Phe, 1,01; Val, 1,03; Asp, 0,99; Pro, 1,03; Arg, 1,02; Gly, 1,00; NH3, 1,98. Analyse etter permaursyreoksydasjon før hydrolyse ga et Cys (O^HJ-Gly forhold på 1,01:1,00.

[ 1-( B- merkapto- B, B- cyklopentametylenpropionsyre), 2-( O- metyl) tyrosin, 4- valin]- arginin vasopressin

Behandling av acyloktapeptidet (17 4 mg, 0,119 mmol) som ovenfor ga 51,5 mg av produktet (35,6%.

Rf(E), 0,28, Rf(F), 0,60; [a]23 = -66,3° (C = 0,4, IM AcOH).

Aminosyreanalyse: Tyr, 0,99; Phe, 1,01; Val, 1,02; Asp, 1,01; Pro, 1,00; Arg, 1,01; Gly, 1,00; NH3, 2,11. Analyse etter permaursyreoksydasjon før hydrolyse ga et Cys(03H)-Gly forhold på 1,03:1,00.

EKSEMPEL 6

[ 1-( B- merkapto- p, 6- cyklopentametylenpropionsyre), 2-( 0- etyl) tyrosin, 4- valin, 7-( 3, 4- dehydroprolin)] arginin vasopressin Forbindelsen ble fremstilt som i eksempel 5 under anvendelse av /\ <3->prolin i steden for prolin.

EKSEMPEL 7

[ 1-( B- merkapto- B, B- cyklopentametylenpropionsyre), 2- sub-stituert, 4- valin, 7- prolin]-( L- og D-) arginin vasopressin Forbindelsene i denne serie ble fremstilt som i eksempel 5. Renheten ble bestemt ved TLC analyse på silikagel i to opp-løsningsmiddelsystemer: E. butanol/eddiksyre/vann (BAW) (4: 1:5) eller F. butanol/eddiksyre/vann/pyridin (15:3:3:10).

Resultatene var:

EKSEMPEL 8

Antagonisme mot vasopressoreffekten ble bestemt i henhold

til Dyckes et al., J. Med. Chem., vol. 17 (1974) s. 969. Verdiene er uttrykt som pA2 verdier, definert av Schild et al., Br. J. Pharmacol., vol. 2 (1947) s. 189.

Aktiviteten som antidiuretiske agonister ble bestemt ved intravenøs injeksjon av forbindelsene som skulle under-søkes i etanolanestiserte "water-loaded" rotter i henhold til Sawyer et al., Endocrinology, vol. 63 (1958) s. 694.

Antagonistiske effekter ble bestemt og uttrykt som "effektive doser" og som pA2 verdier. Den "effektive dose" er definert som dosen (i nmol/kg) som reduserer den observerte respons fra 2x enheter av agonisten inj isert 20 min. etter dosen av antagonisten til en respons med lx enheter av agonisten. Bestemte in vivo "pA2" verdier representerer den negative logaritme av den effektive dose dividert med det antatte fordelingsvolum (67 mL/kg). Resultatene er gitt i tabell I. Resultatene vist i tabell I viser at forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen, særlig [1-(3-merkapto-B,B-cyklopentametylenpropionsyre) , 8-arginin] vasopressin og [1-(B-merkapto-B,B-cyklopentametylenpropionsyre), 2-(O-metyl)tyrosin, 8-arginin] vasopressin antagoniserer vasopressoreffekten av arginin vasopressin samt også utviser en markant nedsettelse i antidiuretisk aktivitet.

EKSEMPEL 9

[1-(B-merkapto-B,B-cyklopentametylenpropionsyre)-2-(O-alkyl) tyrosin-4-valin-8-(L- og D-) arginin]-vasopressin forbindelsene evaluert som i eksempel 8 var svake antidiuretiske agonister. De forårsaket en initial submaksimal inhibering av urinstrømmen som varte i ca. 10 min. etterfulgt av en inhiberingsperiode mot virkningen av ADH som varte 1 - 3 h, avhengig av dosen. Denne inhibering var reversibel, dvs.

den kunne overvinnes ved å heve dosen av ADH. Gjentatte ana-lyser muliggjorde en bestemmelse av den ".effektive dose" for hver analog og ble definert som dosen som reduserte den antidiuretiske virkning til 2x enheter av ADH injisert 20 min. etter dosering av antagonisten til å være lik responsen til lx enheter injisert før antagonisten. De bestemte effektive doser for disse analoger (i nmol/kg) og antivaspressor-aktiviteten er gitt i tabell II.

Mens [1-(3-merkapto-B,3-cyklopentametylenpropionsyre)-2-(O-alkyl)tyrosin-4-valin-8-(L- og D-) arginin] vasopressin forbindelsene var svake antidiuretiske agonister som forårsaket en initial submaksimal inhibering av urinstrømmen som varte i ca. 10 min., etterfulgt av en inhiberingsperiode mot virkningen av ADH som varte 1 - 3 h utviste de foretrukne forbindelser fremstilt ifølge oppfinnelsen, indikert med stjerne i den etterfølgende tabell, ingen antidiuretisk agonistisk aktivitet. De foretrukne forbindelser fremstilt ifølge oppfinnelsen er også mere selektive enn tidligere kjente antidiuretiske antagonister med hensyn til antivasopressoraktivitetene, som vist ved forholdene antivasopressor/anti-antidiuretisk effektive doser:

EKSEMPEL 10

(a) Antagonismen for [1-(B-merkapto-B,B-cyklopentametylenpropionsyre) , 2-(0-alkyl)tyrosin, 4-valin]-(L- og D-)-argin vasopressin forbindelsene ovenfor endogent ADH ble vist ved injeksjon av forbindelsen intraperitonealt til bevisste rotter. Urin ble oppsamlet 4 h etter injeksjonene. De angitte data i den etterfølgende tabell er middeltall + SE (standard feil) for resultatene for grupper på 4-6 rotter. P<0,05 og P<0,005 er gitt for forskjeller mellom middel-verdiene for rotter som ble gitt antagonistene og midler for effekten for de samme rotter injisert med oppløsningsmiddel alene. Den midlere middelverdien for urinutskillelseshastig-heten for kontrollene for oppløsningsmiddelinjiserte rotter var 0,9 + 0,1 ml/kg/h og den midlere osmolalitet var 1544 + 85 mOsm/kg H20 (n=32). (b) Intakte hunrotters (vekt 200-240 g) respons ovenfor intraperitoneal injeksjon av d(CH2)^Tyr(Et)VAVP ble bestemt i et blokkeksperiment hvori hver rotte ble inngitt oppløs-ningsmiddel og begge doser av ADH antagonisten. Injeksjonene ble gitt med minst to døgns mellomrom. Rottene fikk drikke vann fritt. Injeksjonene ble gitt kl. 11.00 hvoretter spontant utskilt volum ble oppsamlet hver time i 4 timer. Fig. 1 viser urinens osmolalitet som funksjon av tiden. Urinosmolalitetene for kontrollene (injisert med oppløsnings-middel) ble midlet over 2 h perioder p.g.a. for sjelden urinering.

Fig. 2 viser urinavgivelsen som en funksjon av tiden.

I de to figurer viser de vertikale linjer gjennom punktene de indikerte SE'verdier. (Standard feil).

EKSEMPEL 11

Forbindelser hvori Tyr i 2-stillingen tilhører D-seriene

og er uforetret (X' = H) fremstilles i henhold til eksemplene 1-5. Forbindelsene hvori Z- er L-Arg er meget aktiv som en

antagonist mot den antidiuretiske aktivitet for arginxn vaso-pressinet.

Claims (1)

1. Analogifremgangsmåte ved fremstilling av en terapeutisk aktiv forbindelse med den generelle formel hvor X er D-Phe, D-Val, D-Leu, D-Ile, D-Arg, D-norvalin, D-norleucin, D-cykloheksylalanin, D-a-amincsmør syre, D-treonin eller D-metionin; W er Pro, Z er D- eller L-Arg og A er Val eller Gin, eller hvor X er D- eller L-Tyr-X', hvor X' er hydrogen, metyl, etyl, n-propyl, isopropyl eller butyl, W er Pro eller A 3-Pro og Z er L- eller D-Arg og når X er Tyr-X' er W A3-Pro,karakterisert ved(a) behandle en Boc-Gly-harpiks ved fastfasesyntese ved seks sykler omfattende avbeskyttelse, nøytralisering og kobling med en valgt aminosyre til å gi en tilsvarende beskyttet heptapeptidylharpiks med formelen Boc-Phe-A-Asn-Cy(Bzl)-W-Z(Tos)-Gly-harpiks hvori A, W og Z har den ovenfor angitte betydning, (b) behandle den tilsvarende beskyttede heptapeptidylharpiks dannet i trinn (a) ved fastfasepeptidsyntese i en sykel omfattende avbeskyttelse, nøytralisering og kobling med Boc-X for å gi den tilsvarende tert-butoksykarbonyloktapeptidyl-harpiks med formelen Boc-X-Phe-A-Asn-Cy(Bzl)-W-Z(Tos)-Gly-harpiks (c) ammonolysere den tilsvarende beskyttede oktapeptidylharpiks dannet i trinn (b) til det tilsvarende Boc-oktapeptidamid med formelen Boc-X-Phe-A-Asn-Cy(Bzl)-W-Z(Tos)-Gly-NH2, hvori X, A, W og Z har den ovennevnte betydning, (d) omdanne det tilsvarende Boc-oktapeptidamid dannet i trinn (c) til det tilsvarende B-(S-benzyl-merkapto)-B,B-cyklopentametylenpropionyl-oktapeptidamid med formelen

   ved kobling av en nøytralisert, avbeskyttet oppløsning av et tilsvarende tert-butoksykarbonyl-oktapeptidamid med p-nitrofenyl-3-(S-benzylmerkapto)-3,B-cyklopentametylenpro-pionat i nærvær av N-hydroksybenzotriazolmonohydrat, og (e) redusere et tilsvarende 3_(S-benzylmerkapto)-3,B-cyklopentametylen-propionyloktapeptidamid dannet i trinn (d) med natrium i flytende ammoniakk og syklisere den resulterende disulfhydrylforbindelse ved oksydering med kaliumjern(III)cyanid.