NO160177B

NO160177B - Gel device for two-dimensional gel electrophoresis.

Info

Publication number: NO160177B
Application number: NO83832486A
Authority: NO
Inventors: Robert S Ledley
Original assignee: Univ Georgetown
Priority date: 1981-11-24
Filing date: 1983-07-07
Publication date: 1988-12-12
Also published as: AU1101283A; NO160177C; NO832486L

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en gelanordning for todimensjonal gelelektroforese, og mer spesielt en sporforsynt gelanordning hvori skjevheter og spredning (diffusjon) av proteiner i gelen elimineres eller i det minste minimaliseres. The present invention relates to a gel device for two-dimensional gel electrophoresis, and more particularly to a grooved gel device in which biases and spreading (diffusion) of proteins in the gel are eliminated or at least minimized.

Det menneskelige legeme inneholder proteiner som har be-merkelsesverdig forskjellig størrelse, oppbygning og opp-gave. De varierer i molekylvekt fra noen tusen til mer enn en million. De kan strekkes til lange, sterke fibre eller vikles til kompakte kuler. De eksisterer i en rekke forskjellige former slik som: strukturelle proteiner, for-bindelsesvev-proteiner, kontraktil-muskelproteiner, enzymer, hormoner, antistoffer, transportmolekyler (slik som hemoglobinet som bringer oksygen til cellene), lagrings-proteiner, celleoverflate-receptorer og lignende. The human body contains proteins that are remarkably different in size, structure and composition. They vary in molecular weight from a few thousand to more than a million. They can be stretched into long, strong fibers or wound into compact balls. They exist in a number of different forms such as: structural proteins, connective tissue proteins, contractile muscle proteins, enzymes, hormones, antibodies, transport molecules (such as the hemoglobin that brings oxygen to the cells), storage proteins, cell surface receptors and the like .

En av de tradisjonelle metodene for separering av proteiner for identifikasjonsformål er elektroforese som ganske enkelt betyr "ført av elektrisitet". Proteiner fra f.eks. One of the traditional methods of separating proteins for identification purposes is electrophoresis which simply means "conducted by electricity". Proteins from e.g.

en blod- eller urinprøve, kan hensiktsmessig preparert bli separert i et elektrisk felt fordi hver forskjellig protein-type føres med en litt forskjellig hastighet avhengig av den netto elektriske ladning til et gitt molekyl. Denne metode, endimensjonal elektroforese, har vist seg å være et meget virkningsfult vitenskapelig verktøy. a blood or urine sample, can be suitably prepared and separated in an electric field because each different protein type is carried at a slightly different rate depending on the net electric charge of a given molecule. This method, one-dimensional electrophoresis, has proven to be a very effective scientific tool.

I midten av 1970-årene ble todimensjonale teknikker for separering av proteiner utviklet. En slik teknikk ble betegnet "gel-elektroforese" og omfatter en teknikk som differensierer proteiner som beveger seg gjennom en gel til klart oppstrekede bånd som kan identifiseres som spesifikke proteiner eller grupper av proteiner. Metoden separerer proteiner som beveger seg i en retning ved deres elektriske ladning til enkle rader. Deretter vendes gelen om på siden og en detergent tilsettes for å samvirke elektrisk med proteinene og bringe dem til å bevege seg i en annen retning og ved denne bevegelse i den andre retningen sorteres de ut ved størrelse. Dessuten, når den todimensjonale gelen farges med et fargestoff, blir resultatet en nettverkslignende serie av protein-"flekker", idet radene er adskilt horisontalt ved deres elektriske ladning og vertikalt ved størrelse. Et slikt "proteinkart" kan separere mange flere proteiner fra en prøve enn det som er mulig med endimensjonal elektroforese. In the mid-1970s, two-dimensional techniques for separating proteins were developed. One such technique was termed "gel electrophoresis" and involves a technique that differentiates proteins moving through a gel into clearly defined bands that can be identified as specific proteins or groups of proteins. The method separates proteins that move in one direction by their electrical charge into single rows. The gel is then turned on its side and a detergent is added to interact electrically with the proteins and cause them to move in another direction and by this movement in the other direction they are sorted out by size. Moreover, when the two-dimensional gel is stained with a dye, the result is a network-like series of protein "spots", the rows being separated horizontally by their electrical charge and vertically by size. Such a "protein map" can separate many more proteins from a sample than is possible with one-dimensional electrophoresis.

Geler benyttet på den sistnevnte måte kan deretter skannes, idet gelen oppdeles i et meget stort antall (f.eks. Gels used in the latter way can then be scanned, the gel being divided into a very large number (e.g.

en eller to millioner) meget små firkanter hvor hver firkant undersøkes og analyseres ved hjelp av velkjente databe-handlingsteknikker. Når først hver firkant er analysert i detalj, kan de tilsvarende data lagres for fremtidig til-bakekalling, forsterkning og fremvisning. Dessuten kan tetthetsdataene omdannes til fargeforskjeller for lettere skjelning og betraknihg på en dataskjerm. I tillegg kan "bakgrunnsstøyen", som typisk er tilstede i en slik skanningavledet informasjon, filtreres ut ved hjelp av et datasystem og skjevheter i selve gelen kan også korrigeres. En detaljert behandling av slike todimensjonale elektroforetiske metoder er angitt i "High Resolution Two-Dimensional Electrophoresis of Proteins", av Patrick H. 0'Farrell, one or two million) very small squares where each square is examined and analyzed using well-known data processing techniques. Once each square is analyzed in detail, the corresponding data can be stored for future recall, amplification and display. In addition, the density data can be converted into color differences for easier discrimination and consideration on a computer screen. In addition, the "background noise", which is typically present in such scan-derived information, can be filtered out using a computer system and biases in the gel itself can also be corrected. A detailed treatment of such two-dimensional electrophoretic methods is given in "High Resolution Two-Dimensional Electrophoresis of Proteins", by Patrick H. 0'Farrell,

The Journal of Biological Chemistry, volum 250, nr. 10 The Journal of Biological Chemistry, Volume 250, Number 10

(25. mai 1975), sidene 4007-4021. (May 25, 1975), pages 4007-4021.

For såvidt angår gelanalyse ved anvendelse av data- As far as gel analysis using data-

skanning, bør man være klar over at det er viktig at oppløs-ningen minimaliseres i sterkest mulig grad. På den annen side har forsøk å minimalisere oppløsning tidligere blitt forstyrret av forekomsten av det fenomen som er kjent som diffusjon (spredning). Det vil si, under den første-dimensjonsfasen av den elektroforetiske metode, blir proteinene fordelt i bredden over gelen og deretter, under den andre-dimensjonsfasen av metoden, blir proteinene fordelt i lengderetning gjennom gelen langs respektive baner eller kanaler. Under den sistnevnte metode kan diffusjon (spredning) av proteinene finne sted og derved gi en for-dreiet fordeling av proteinene og dette har uheldig inn- scanning, one should be aware that it is important that the resolution is minimized as much as possible. On the other hand, attempts to minimize resolution have previously been hampered by the occurrence of the phenomenon known as diffusion. That is, during the first-dimensional phase of the electrophoretic method, the proteins are distributed widthwise across the gel and then, during the second-dimensional phase of the method, the proteins are distributed longitudinally through the gel along respective lanes or channels. During the latter method, diffusion (spreading) of the proteins can take place and thereby give a distorted distribution of the proteins and this has an unfortunate effect

virkning på den oppløsning som kan oppnås ved gelskanning-metoden. effect on the resolution that can be achieved by the gel scanning method.

I tillegg til dette blir under fremstillingen av geler selve den fysiske gel ofte utsatt for skjevheter, og dette har uheldig innvirkning på prosessen ved hjelp av hvilken proteinene fordeles i bredden og i lengden i gelen under den elektroforetiske metode. Dette representerer en ytterligere årsak for uheldig diffusjon (spredning) av proteinet i gelen og har igjen en ytterligere uheldig innvirkning på de data som avledes fra skanningen av gelen under data-skanning-operasjonsfasen. In addition to this, during the preparation of gels, the physical gel itself is often exposed to distortions, and this has an adverse effect on the process by which the proteins are distributed in width and length in the gel during the electrophoretic method. This represents a further cause for unfavorable diffusion (spreading) of the protein in the gel and in turn has a further unfavorable impact on the data derived from the scanning of the gel during the data scanning operation phase.

Foreliggende oppfinnelse angår en gel med spor, og mer spesielt et sporforsynt gelarrangement hvori fordreiing og spredning (diffusjon) av proteinflekker i gelen elimineres eller i det minste minimaliseres. Mer spesielt, ifølge oppfinnelsen, er et plastunderlag for holdning av gelen ut-formet med spor slik at når gelen anbringes anbringes på plastunderlaget, fyller gelen sporene i plastunderlaget og danner derved en sporforsynt gelanordning. The present invention relates to a gel with grooves, and more particularly a grooved gel arrangement in which distortion and spreading (diffusion) of protein spots in the gel is eliminated or at least minimized. More particularly, according to the invention, a plastic substrate for holding the gel is designed with grooves so that when the gel is placed on the plastic substrate, the gel fills the grooves in the plastic substrate and thereby forms a grooved gel device.

Som et resultat av anvendelse av et sporforsynt plastunderlag ved fremgangsmåten for fremstilling.av gelen, hindres eller i det minste minimaliseres, fordreiing av selve den fysiske gel. Dette hindrer videre diffusjon (spredning) av protein under den elektroforetiske metode og således reduseres og minimaliseres oppløsning. As a result of using a grooved plastic substrate in the method of manufacturing the gel, distortion of the physical gel itself is prevented or at least minimized. This further prevents diffusion (spreading) of protein during the electrophoretic method and thus resolution is reduced and minimized.

Når først gelen er dannet på det sporforsynte plastunderlaget, kan et glass- eller plasttoppdeksel eller -plate anbringes over gelen, og gelen kan hensiktsmessig anordnes slik at en konvensjonell elektroforetisk metode kan utføres. Under den sistnevnte metode vil proteiner som ellers har tendens til å diffundere eller spredes under deres dispersjon i lengden langs gelen ikke gjøre dette, og derved hindres oppnåelsen av forvrengte resultater under dataskanningen av gelen. Once the gel is formed on the grooved plastic substrate, a glass or plastic top cover or plate can be placed over the gel, and the gel can be conveniently arranged so that a conventional electrophoretic method can be performed. Under the latter method, proteins that otherwise tend to diffuse or disperse during their dispersion along the length of the gel will not do so, thereby preventing the achievement of distorted results during the data scan of the gel.

Det er derfor et hovedformål med foreliggende oppfinnelse It is therefore a main purpose of the present invention

å tilveiebringe en gel med spor og mer spesielt en sporforsynt gelanordning. to provide a grooved gel and more particularly a grooved gel device.

Det er ytterligere et formål med foreliggende oppfinnelse There is a further object of the present invention

å tilveiebringe en sporforsynt gelanordning fordi fordreining av selve den fysiske gel, hvilket ellers ville bli intro-dusert under fremstillingen, hindres. to provide a grooved gel device because distortion of the physical gel itself, which would otherwise be introduced during manufacture, is prevented.

Et annet formål med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en sporforsynt gelanordning hvori diffusjon (spredning) av proteiner under en elektroforetisk fremgangsmåte utelukkes eller minimaliseres. Another object of the present invention is to provide a grooved gel device in which diffusion (spreading) of proteins during an electrophoretic procedure is excluded or minimized.

De ovenfor angitte og andre formål, som vil fremgå i det føl-gende, og oppfinnelsens natur, vil klarere forstås under henvisning til følgende beskrivelse og de medfølgende tegninger. The above stated and other purposes, which will appear in the following, and the nature of the invention, will be more clearly understood with reference to the following description and the accompanying drawings.

Det er således ifølge oppfinnelsen tilveiebragt en gelanordning for todimensjonal gelelektroforese, og denne anordning er kjennetegnet ved de trekk som fremgår fra krav 1-3. Fig. 1 er et perspektivriss av en sporforsynt gelanordning ifølge foreliggende oppfinnelse. Fig. 2 er et planriss av den sporforsynte basisplate benyttet i den sporforsynte gelanordning ifølge oppfinnelsen. Fig. 3 er et frontriss av den gelforsynte anordning ifølge oppfinnelsen. Thus, according to the invention, a gel device for two-dimensional gel electrophoresis has been provided, and this device is characterized by the features that appear from claims 1-3. Fig. 1 is a perspective view of a grooved gel device according to the present invention. Fig. 2 is a plan view of the grooved base plate used in the grooved gel device according to the invention. Fig. 3 is a front view of the gel-supplied device according to the invention.

Oppfinnelsen i foreliggende søknad skal i det følgende be-skrives mer fullstendig under henvisning til de forskjellige figurer på tegningene. The invention in the present application shall be described more fully below with reference to the various figures in the drawings.

Som det fremgår fra fig. 1 som er et perspektivriss av foreliggende sporforsynte gelanordning, omfatter den sporforsynte gelinnretning 10 hovedsakelig en sporforsynt basisplate 12 og en topplate 14. En gitt del 16 av basisplaten 12 har spor anordnet i lengderetningen for mottagelse av en gel plassert derpå. Sporene er fortrinnsvis anordnet i en meget fin orden, idet mellomrommet mellom sporene er av størrelsesorden på en brøkdel av en millimeter. As can be seen from fig. 1 which is a perspective view of the present grooved gel device, the grooved gel device 10 mainly comprises a grooved base plate 12 and a top plate 14. A given part 16 of the base plate 12 has grooves arranged in the longitudinal direction for receiving a gel placed thereon. The tracks are preferably arranged in a very fine order, the space between the tracks being of the order of a fraction of a millimetre.

Fremgangsmåten for oppbygging av en sporforsynt gelanordning ifølge foreliggende oppfinnelse vil nå bli beskrevet under henvisning til fig. 2 som er et planriss av en sporforsynt basisplate 12. Den sporforsynte basisplaten 12 er fortrinnsvis laget av plast eller et annet lignende ikke-ledende materiale og, som tidligere nevnt, inneholder en del 16 som har spor anordnet derpå med meget smale mellomrom. Med den sporforsynte basisplaten anbragt i en horisontal stilling anbringes en gel derpå på en slik måte at gelen fylles i spor-rommene i delen 16 til basisplaten 12. The method for constructing a grooved gel device according to the present invention will now be described with reference to fig. 2 which is a plan view of a grooved base plate 12. The grooved base plate 12 is preferably made of plastic or another similar non-conductive material and, as previously mentioned, contains a part 16 which has grooves arranged thereon at very narrow intervals. With the grooved base plate arranged in a horizontal position, a gel is placed thereon in such a way that the gel is filled in the groove spaces in the part 16 of the base plate 12.

Figur 3 er et frontriss av den sporforsynte gelanordning ifølge foreliggende oppfinnelse. Som det fremgår derfra vil gelen når den først er anbragt på den sporforsynte del 16, fylle sporene og dermed danne en ensartet, stabil og godt understøttet sporforsynt gelstruktur på basisplaten 12. Figure 3 is a front view of the grooved gel device according to the present invention. As can be seen from there, the gel, once placed on the grooved part 16, will fill the grooves and thus form a uniform, stable and well-supported grooved gel structure on the base plate 12.

Som ytterligere vist på figurene 1 og 3, er en topplate 14 deretter anbragt på toppen av den sporforsynte basisplaten 12 slik at gelen blir beliggende derimellom. Topplaten 14 As further shown in Figures 1 and 3, a top plate 14 is then placed on top of the grooved base plate 12 so that the gel is located between them. Top plate 14

er fortrinnsvis av plast, glass eller annet ikke-ledende og transparent materiale. is preferably made of plastic, glass or other non-conductive and transparent material.

Selvfølgelig må en eller annen slags adgangsanordning eller åpning (ikke vist) tilveiebringes i den sporforsynte gelinnretning slik at når topplaten 14 først.er anbragt på Of course, some kind of access device or opening (not shown) must be provided in the grooved gel device so that when the top plate 14 is first placed on

den sporforsynte basisplaten 12 med gelen beliggende derimellom i den sporforsynte del 16, så kan proteinprøver innføres ved et gitt punkt i delen 16. Når først slike proteiner er innført i den sporforsynte del 16, kan den elektroforetiske prosess utføres. Det vil si, iløpet av den første fasen kan proteiner separeres i overensstemmelse med isoelektrisk punkt ved isoelektrisk fokusering i den første dimensjon, og deretter, iløpet av den andre fasen, the grooved base plate 12 with the gel situated between them in the grooved part 16, then protein samples can be introduced at a given point in the part 16. Once such proteins have been introduced into the grooved part 16, the electrophoretic process can be carried out. That is, during the first phase, proteins can be separated according to the isoelectric point by isoelectric focusing in the first dimension, and then, during the second phase,

separeres proteiner i overensstemmelse med molekylvekt ved elektroforese i en annen dimensjon. proteins are separated according to molecular weight by electrophoresis in another dimension.

Mer spesielt, som nevnt tidligere, blir iløpet av den første fasen gelelektroforese utført ved å påføre et elektrisk felt i bredden over gelen (dvs. i en retning fra venstre mot høyre på figurene 1-3). Dette differensierer proteiner som beveger seg gjennom gelen til klart avgrensede bånd More specifically, as mentioned earlier, during the first phase gel electrophoresis is performed by applying an electric field across the width of the gel (ie in a direction from left to right in Figures 1-3). This differentiates proteins moving through the gel into clearly defined bands

som kan identifiseres som spesifikke proteiner eller grupper av proteiner. Teknikken separerer proteiner som beveger seg i en enkelt retning, i kraft av deres elektriske ladning, til enkle rader. which can be identified as specific proteins or groups of proteins. The technique separates proteins that move in a single direction, by virtue of their electrical charge, into single rows.

Deretter vendes gelen på siden og en ytterligere elektroforetisk prosess utføres (f.eks. kan en detergent tilsettes for å samvirke elektrisk med proteinene i hver av de enkelte rader). Proteinene i hver rad forårsakes til å bevege seg i en annen retning, i lengderetningen over gelen (dvs. fra bunnen til toppen på figur 2), og proteinene blir på denne måten sortert ut etter størrelse. The gel is then turned on its side and a further electrophoretic process is carried out (eg a detergent can be added to interact electrically with the proteins in each of the individual rows). The proteins in each row are caused to move in a different direction, longitudinally across the gel (ie from the bottom to the top in Figure 2), and the proteins are thus sorted by size.

Til slutt, som nevnt ovenfor, dersom den todimensjonale gelen deretter farges med et fargestoff, blir resultatet en nettverkslignende serie av protein-"flekker" med kolonnene separert horisontalt etter elektrisk ladning og vertikalt etter størrelse. Dette "proteinkart" kan deretter under-kastes en data-skanningsbehandling hvorved en avsøker forbundet med et datasystem kan avsøke overflaten av den sporforsynte gel (på en måte lik den hvorved en televisjon raster-skannderes) for derved å utvikle data vedrørende "proteinkartet". Under henvisning til figur 3, kan denne skanndering foretas i kraft av topplatens 14 transparens (som, som nevnt tidligere, fortrinnsvis er av plast, glass eller annet transparent, ikke-ledende materiale). Finally, as mentioned above, if the two-dimensional gel is then stained with a dye, the result is a network-like series of protein "spots" with the columns separated horizontally by electrical charge and vertically by size. This "protein map" can then be subjected to a data-scanning process whereby a scanner connected to a computer system can scan the surface of the track-provided gel (in a manner similar to that by which a television is raster-scanned) to thereby develop data relating to the "protein map". With reference to Figure 3, this scanning can be done by virtue of the transparency of the top plate 14 (which, as mentioned earlier, is preferably made of plastic, glass or other transparent, non-conductive material).

Det skal videre bemerkes at, under den elektroforetiske metode, og spesielt under den andre fasen derav, så vandrer proteiner i lengderetningen langs den sporforsynte del 16 It should further be noted that, during the electrophoretic method, and especially during the second phase thereof, proteins migrate longitudinally along the grooved portion 16

(figur 2) til basisplaten 12 (fra bunn til topp som sett på figur 2). Siden den sporforsynte basisplaten 12 ble benyttet under fremgangsmåten for tildannelse av gelen, vil gelen ha en ensartet konstruksjon og vil ha meget liten eller ingen fysisk fordreiing. Dette tjener til å utelukke diffusjon eller spredning av proteinene når de vandrer i lengderetningen langs den sporforsynte del 16. (figure 2) to the base plate 12 (from bottom to top as seen in figure 2). Since the grooved base plate 12 was used during the process of forming the gel, the gel will have a uniform construction and will have very little or no physical distortion. This serves to preclude diffusion or spreading of the proteins as they travel longitudinally along the grooved portion 16.

Videre, på grunn av tilstedeværelsen av sporene i den sporforsynte del 16, under den andre fasen av den elektroforetiske metode, vil proteinenes naturlige diffusjon eller spredning etterhvert som de vandrer i lengderetningen langs den sporforsynte del 16, bli minimalisert eller eliminert i kraft av kanaliseringen av en effekt av sporene som inne-holdes i den sporforsynte del 16. Det vil si, veggene i sporene i den sporforsynte del 16 virker slik at de inhi-berer diffusjon (spredning) av proteinet i bredden etterhvert som det vandrer i en langsgående retning (fra bunn til topp på figur 2) langs den sporforsynte del 16 på basisplaten 12. Furthermore, due to the presence of the grooves in the grooved portion 16, during the second phase of the electrophoretic method, the natural diffusion or spreading of the proteins as they travel longitudinally along the grooved portion 16 will be minimized or eliminated by virtue of the channeling of an effect of the grooves contained in the grooved part 16. That is, the walls of the grooves in the grooved part 16 act in such a way that they inhibit diffusion (spreading) of the protein in the width as it travels in a longitudinal direction ( from bottom to top in Figure 2) along the grooved part 16 of the base plate 12.

Claims

1. Gel device for two-dimensional gel electrophoresis including a base part (12) which has a lateral direction and a longitudinal direction, and a gel layer arranged on said base part, characterized in that the base part has a grooved part (16) which has a number of fine grooves running in the longitudinal direction, and is filled with said gel layer, the grooves having such a distance from each other and size that they prevent lateral spread in the gel layer of protein that has been electrophoretically separated in said lateral direction when the protein moves electrophoretically in said longitudinal direction.

2. Device according to claim 1, characterized in that the base part (12) comprises a non-conductive material, preferably plastic or glass.

3. Device according to claim 1, characterized in that a top part (14) which is placed on the base part (12) with said gel lying in between, consists of a non-conductive material, preferably glass or plastic, and that it is preferably transparent.