NO169351B - Masseundersoekelsesmetode for deteksjon av enkeltbasemutasjoner i multiple loci i genomisk dna ved bruk av denatureringsgradient-gelelektroforese fulgt av effektiv overfoeringog hybridisering til forskjellige prober - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte til å påvise enkeltbasemutasjoner i multiple loci i humant genomisk DNA.

Nærmere bestemt angår oppfinnelsen en fremgangsmåte til å utføre masseundersøkelser på genomisk DNA for deteksjon av enkeltbasemutasj oner.

Evnen til å påvise enkeltbasemutasjoner i humant genomisk DNA er av grunnleggende betydning i diagnosen av genetiske sykdommer og i påvisning av både induserte og spontane mutasjoner i ondartede cellelinjer. Southern blotting-teknikk for påvisning av bortfall eller tilstedeværelse av restriksjonsenzym-gjen-kjennelsessekvenser er begrenset av det faktum at de fleste enkeltbasesubstitusjoner ikke forandrer en restriksjonsendo-nukleasegjenkjennelsessekvens.

En nylig utviklet fremgangsmåte øker i betydelig grad antallet enkeltbasemutasjoner som kan påvises i et spesielt DNA-fragment. Fremgangsmåten er basert på smelteegenskapene av DNA-fragmentene og bruken av denatureringsgradient-elektroforesen som vist av 1. Fischer, S.G. og Lerman, L.S. (1983) Proe. Acad. Sei. USA 80: 1579-83, 2. Myers, R.M., Fischer, S.G., Maniatis, T. og Lerman, L.S.

(1985) Nucl. Acids Res. 13: 3111-3129,

3. Lerman, L.S., Silverstein, K. og Grinfeldt, E. in Molecular

Biol. of Homo Såpens. Cold Spring Harbor Lab. (1986) pp. 285-297, 4. Myers, R.M. og Maniatis, T. (1986) in Molecular Biol. of Homo Sapiens. Cold Spring Harbor Lab. pp 275-284.

DNA-fragmenter som skiller seg fra hverandre ved enkeltbase-substitusjoner kan separeres fra hverandre ved elektroforese i polyakrylamidgeler inneholdende en stigende gradient av DNA-denatureringsmidlene urea og formamid. To identiske DNA-fragmenter som bare avviker ved et enkelt basepar vil opprinnelig bevege seg gjennom polyakrylamidgelen med konstant hastighet. Etter hvert som de vandrer inn i en kritisk konsentrasjon av denatureringsmiddel, smelter spesielle doméner inne i fragmentene for å gi partielt denaturert DNA. Smelting av et domene ledsages av en brå reduksjon i mobilitet. Den posisjon

i denatueringsmiddelgelen hvor reduksjonen i mobilitet observe-res, svarer til smeltetemperaturen av dette domene. Da en enkeltbasesubstitusjon inne i det smeltede domene fører til en smeltetemperaturforskjell, vil partiell denaturering av de to DNA-fragmenter finne sted på forskjellige steder i gelen. DNA-molekylene kan derfor separeres på basis av meget små forskjeller i smeltetemperaturen.

De tidligere beskrevne teknikker for å analysere genomisk DNA-fragmenter ved bruk av denatureringsgradient-gelelektroforese (DGGE) baserer seg imidlertid på to trinn før elektroforese: 1) denaturering av DNA-fragmenter og 2) resammenføying av trå-der til en radioaktivt merket probe (Myers, R.M. og Maniatis, T. (1986) in Molecular Biol. of Homo Sapiens. Cold Spring Harbor Lab. pp. 275-284, Noll, W.W. og Collins, M. (1987) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84: 3339-3343). Disse teknikker begrenser derfor det antall forskjellige loci som skal analyseres til ett i hvert forsøk og bare svært få sekvensvariasjoner i et lite DNA-område kan påvises. Probene som kan anvendes, er begrenset til genomiske prober dersom ikke bare eksoner skal analyseres.

Hensikten med den foreliggende oppfinnelse er å utvikle en fremgangsmåte til effektiv overføring av delvis smeltede genomiske DNA-fragmenter fra polyakrylamidgelen for å kunne analysere for mutasjoner i flere forskjellige loci på den samme DNA-prøve ved bruk av en rekke forskjellige prober på den samme blotting. Dette oppnås i henhold til oppfinnelsen ved at DNA-fragmenter underkastes denatureringsgradient-gelelektroforese (DGGE) etterfulgt av effektiv overføring til en nylonmembran, karakterisert ved at der ved elektroforesen anvendes en polyakrylamidgel (PAG) blandet med lavtemperatur-gelerende (LTG) agarose i buffer og at polyakrylamidgelen er tverrbundet med et reversibelt tverrbindingsmiddel, som fortrinnsvis er diallyltartardiamid (DATD), som lar seg spalte etter at elektroforesen er utført, at gelen etter elektroforese behandles med perjodsyre for spalting av tverrbindingene introdusert ved det nevnte tverrbindingsmiddel, og at nylonmembranen til slutt hybridiseres til forskjellige utvalgte prober.

Problemene med de tidligere beskrevne overføringsteknikker

har vært at bare noen få prosent av fragmentene blir overført fra disse DGGE-geler. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen letter i høy grad identifikasjonen av DNA-polymorfismer som ikke påvises ved restriksjonsenzymer i et stort antall forskjellige loci. Denne teknikk bør derfor også være nyttig i masseundersøkelse (screening) for mutasjoner innenfor et hvilket som helst DNA-fragment hvor en probe eksisterer.

Oppfinnelsen skal nå belyses nærmere under henvisning til teg-ningene .

Fig. 1 er en skjematisk skisse av plasmidet NJl/4.1

Fig. 2a er et autoradiogram av selve gelen hvor radioaktive fragmenter fra plasmidet NJl/4.1 er kjørt i perpendikulær DGGE. Fig. 2b er et autoradiogram av membranen etter overføring av fragmenter fra gelen vist på fig. 2a. Fig. 3 er et autoradiogram av genomiske DNA-fragmenter hybridisert med NJl/4.1 etter parallell DGGE og overføring til membran.

Et egnet apparat som kan benyttes i forsøkene består av en rektangulær beholder med et nedre bufferkammer og et øvre bufferkammer forbundet med hverandre via en pumpekrets, to parallelle glassplater for mottagelse av gelen som skal underkastes elektroforese, anordnet på avstand fra hinannen ved avstandsstykker og klemmer, og en øvre og nedre elektrode til elektroforese av gelen, idet det hele er nedsenket i et vannbad utstyrt med termostat og rørerorgan for direkte kontroll av temperaturen i den rektangulære indre beholder inneholdende glassplatene. Fig. 1 viser en skisse av .plasmidet NJl/4.1 som inneholder en del av et humant collagen-gen (C0LIA2). Restriksjons-setet for enzymene Hindlll, Xbal og EcoRl er markert med henholdsvis H, X og E. Fragmentene A, B og C som fremkommer etter kutting med enzymene H+X er også markert. Fig. 2a. viser et autoradiogram av en DGGE-gel. Plasmidet NJl/4.1 ble først kuttet med enzymene Hindlll og xbal, endemerket med radioaktive nukleotider og deretter applisert langs hele gelen og kjørt i en perpendikulær gradient fra 0-80 % denaturant. I et O-felt ble det kjørt en standard med kutt av et plasmid som ga kjente DNA-fragmentstørrelser. Fig. 2b viser et autoradiogram av gelen på fig."2a etter over-føring av fragmentene til en membran ifølge oppfinnelsen. Fig. 3 viser umerkede fragmenter av NJl/4.1 kuttet med enzymene H+X samt genomisk DNA spaltet med H+X som er kjørt i parallell DGGE med en gradient fra 25-30 % denaturant. Etter endt elektroforese ble fragmentene overført til en membran som beskrevet i oppfinnelsen, og hybridisert med proben NJl/4.1 som på forhånd var gjort radioaktiv med de beskrevne metoder (tilfeldig priming metode).

Eksempel

i Gelene ble fremstilt fra 7,5 % akrylamid og 2% lavtemperatur-gelerende agarose (LGT) i TAE-buffer (40 mM Tris pH 7,4, 20 mM

natriumacetat og 1 mM EDTA) med en lineært økende konsentra-sjonsgradient av formamid og urea. 100% denatureringsmiddel svarer til 40% formamid + 7M urea. Akrylamidoppløsningen inne-holdt det reversible tverrbindingsmiddel diallyltartardiamid (DATD) (Akrylamid: DATD = 12,5:1) istedenfor bisakrylamid. Opp-løsninger av akrylamid, agarose og denatureringsmiddel ble blandet for å gi to oppløsninger for fremstilling av en gradient med det ønskede denatureringsmiddel-konsentrasjonsområde. Gelene ble støpt mellom to glassplater (20x20 cm) med et 1,5 mm avstandsstykke ved blanding av de to oppløsninger av forskjellige denatureringsmiddel-konsentrasjoner i en lineær gradient-mikser og gravitasjonsdrypping inn i toppen eller siden av pla-tene for henholdsvis parallelle eller perpendikulære geler. Straks før hellingen av gelene ble ammoniumpersulfat (30 pl, 200 mg/ml) og TEMED (12 p 1) satt til hver oppløsning. Alle kje-mikalene som ble benyttet til fremstilling av gelen var av meget ren elektroforetisk kvalitet.

Humant genomisk DNA ble isolert fra EDTA-antikoagulert fullblod ved Triton-X-100 lysemetoden beskrevet av Kunkel et al. (1977), Proe. Nati. Acad. Sei. Isolerte DNA-prøver ble spaltet

med restriksjonsenzymet Hindlll ved 37°C over natten ved bruk av fire enzymenheter/pg DNA fulgt av en andre spaltninq med restriksjonsenzymet Xbal. Alle prøvene ble analysert ved Southern blot ved bruk av en probe for kollagen (i)a-2-kjede (COLIA2-gen) for å bestemme størrelsen av fragmentene. DNA-overføring ble utført ved alkalisk blotting og hybridisering ble utført i 0,5M fosfatbuffer med 7% SDS, pH 7,2, ved 65°C (Børresen, A.L. (1986). Annals of Clin. Res. 18: 258-263).

Plasmidpreparering av plasmid NJI/4.1 inneholdende et 4.1 kb-fragment av det humane C0LIA2-gen ble utført ved bruk av standard dyrkingsmetoder (Maniatis, T., Fritsch, E.F. og Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). Plasmidet ble spaltet med restriksjonsenzymene Hindlll og Xbal, hvilket ga tre forskjellige fragmenter. Disse fragmenter ble radioaktivt merket ved endemerking ved anvendelse av det store fragment (Klenow) av DNA-polymerase I og 0,2 ym av hver av dGTP, dATP, dT.TP og (alfa- p)-dCTP ved værelsetemperatur i 30 minutter som angitt i referansen ovenfor (Maniatis).

Radioaktiv merking av plasmidet NJl/4.1 for hybridisering ble utført ved anvendelse av den tilfeldige primingmetode (Feinberg, A.P. og Vogelstein, B. (1983). Anal. Biochem. 132).

Elektroforesen ble utført i et akvarium med TAE-buffer varmet opp til 60°C i et apparat som er angitt ovenfor. I dette apparat kan to geler underkastes elektroforese samtidig. Gelene ble underkastet elektroforese ved 100-150 volt og 20-30 mA i 16-20 timer. Etter elektroforese ble en av glassplatene fjernet og gelen overført til den glatte side av et stykke plastbelagt filterpapir (benchcoat). Når radioaktivt merkede fragmenter ble underkastet elektroforese, ble gelen pakket inn i Saranwrap og underkastet autoradiografi ved -70°C i 1-5 timer.

Før overføring av fragmenter fra gradientgelene ble tverrbindingene i polyakrylamidgelen fjernet. Gelen som var anbragt på den glatte side av det plastbelagte filterpapir, ble overført med dette til et kar, og en oppløsning på 2% perjodsyre ble forsiktig helt over gelen. Etter 30-40 minutter ved værelsetemperatur ble perjodsyren suget opp og en TS-oppløsning (0,4M NaOH + 0,6M NaCl) bie forsiktig helt opp i karet for å dekke gelen. Etter 30 minutter ble TS-oppløsningen suget opp og et filterpapir (VJhatman^3 ) , bløtet i TS, ble plassert oppå gelen. Sandwich-konstruksjonen med det plastbelagte filterpapir, gel og vanlig filterpapir ble deretter anbragt oppå et Southern-overføringsapparat med filterpapiret nederst. Det plastbelagte filterpapir ble fjernet og en nylonmembran bløtet i destillert vann ble plassert oppå gelen og dekket med

flere ark filterpapir og cellestoff. Et lodd på ca. 1 kg ble plassert på toppen. Blotting ble utført i alkalisk oppløsning (TS) i 5-6 døgn. Etter blotting ble membranen forsiktig fjernet fra gelen og dersom radioaktive fragmenter skulle analyseres

ble både gelen og membranen pakket inn i Saranwrap og underkastet autoradiografi hver for seg. Membraner med ikke-radioaktivt DNA ble nøytralisert og hybridisert med 3 2p-merkede prober

i 0,5M fosfatbuffer, pH 7,2, med 7% SDS ved 65°C over natten fulgt av vaskinger med høy stringens i 1-0,5 % SDS ved 65°C.

Autoradiografier ble utviklet ved -70°C-

Plasmidet NJl/4.1 inneholder en del av COLIA2-genet og detekte-rer to RFLP (Restriksjonsenzym - fragmentlengde. - <p>olymorfisme) som tidligere er blitt beskrevet (Børresen, A. L.,

(1986). Annals of Clin. Res. 18: 258:263). Ved bruk av rest-riks jonsenzymer Hindlll og xbal skjæres plasmidet i tre fragmenter, 5.2 kb, 2.1 kb og 1.1 kb i størrelse, bestemt ved Southern blott-analyse. Fragmentet på 2.1 kb (fragmenter B,

fig. 2) inneholder et av RFLP-ene, nemlig Mspl-polymorfismen.

De tre fragmenter ble endemerket og brukt som et modellsystem i DGGE, overføringen og hybridiseringsforsøkene. <p>erpendikulært DGGE i gradienten fra 0-80 % av de tre fragmenter viste at fragment B hadde en fin S-formet smeltekurve med et smeltepunkt ved ca. 32% denaturering (fig. 2a). Den forlengede alkaliske overføring etter fjerning av den reversible tverrbinding i polyakrylamidgelen med perjodsyre, viste at mer enn 95% overføres til nylonmembranen (fig. 2b). Ikke-merket NJl/4.1 Hindlll + Xbal-fragmenter ble underkastet elektroforese og overført til nylonmembraner ved anvendelse av de samme betingelser som for det merkede fragment. Hybridisering av membranen med merkede prober (merket ved tilfelding priming) viste at hybridisering fant sted med alle konfigurasjoner av fragmentene. Humant genomisk DNA kuttet med Hindlll + Xbal ga tre fragmenter (2.1 kb, 1.3 kb, 1.15 kb) som hybridiserte til NJl/4.1-proben på et Southern blot. Det største fragment svarer til fragment B i plasmidet og inneholder således Mspl-polymorfismen med én enkeltbase-mutasjon. Perpendikulært DGGE av humane genomiske DNA-fragmenter (150 Vg kuttet med Hindlll + Xbal) viste at de to korteste fragmenter har smeltekurver som er forskjellige fra fragment B og som derfor ikke virker forstyrrende inn på tolkningen av resultatene i de parallelle geler.

Parallelle denatureringsgradient-geler med plasmidfragmenter og humane genomiske DNA-fragmenter viste hybridisering ned til ca. 10 pg plasmid eller 10 <y>g genomisk DNA. Dette gir en detek-sjonsgrense på tilnærmet den samme som en Southern analyse (fig. 3).

DNA fra både heterozygote og homozygote individer for Mspl-polymorf ismen ble kuttet med Hindlll + Xbal og kjørt på parallelle denatureringsgradient-geler, etterfulgt av overføring, blotting og hybridisering til NJl/4.1 proben. Forskjellig mig-rasjon av bånd B i de forskjellige individer ble observert. Således kunne en enkeltbase-forskjell i fragment B mellom individer påvises i analyse av genomisk DNA ved denne teknikk.

Den denatureringsgradient-gelelektroforeseteknikk som er beskrevet av Fischer og Lerman kan påvise over 50% av alle mulige enkeltbase-substitusjoner i DNA-fragmenter på 100-1000 bp i lengde. Dersom probene kobles til et GC-rikt lite DNA-fragment synes det som om mer enn 90% av alle mulige basesub-stitusjoner kan påvises. En begrensning av denne tidligere beskrevne teknikk er imidlertid at den omfatter bruken av enkelttrådede prober og hybridisering i løsning før elektroforese. Derfor kan ikke DNA-et i gelen benyttes sammen med andre prober og bare sekvensvariasjon i et lite DNA-område kan påvises etter en elektroforese. Totalt genomisk DNA, kuttet med restriksjonsenzymer til små fragmenter, kan underkastes denatureringsgradient-gelelektroforese direkte. Det har imidlertid vært store vanskeligheter forbundet med overføringen av disse fragmenter med forskjellige konfigurasjoner fra polyakrylamid-matriksen til en membran. Elektroblotting overfører bare tilnærmet 10% av DNA og vil også bevirke svelling av gelen, noe som gjør det vanskelig å sammenligne båndmønsteret fra hvert individ. Den teknikk som her er beskrevet hvor der anvendes en polyakrylamidagarose-blanding og et reversibelt tverrbindingsmiddel i PAG, løser imidlertid overføringsproblemet. Etter fjerning av tverrbindingene kan gelen lett ekvilibreres med TS og ingen svelling finner sted. Den ved lav temperatur gelerende agarose gjør det mulig å helle gelene ved 25°C og gradienten kan dannes langsomt, hvilket er meget viktig. Da gelene kjøres ved 60°C, må lavtemperaturgelerende agarose snarere enn lav smeltetemperatur-agarose anvendes. Agarosegelen etter fjerning av polyakrylamidkryssbindingen er ikke særlig sterk, slik at gelene må håndteres med forsiktighet, men ved bruk av plastbelagt filterpapir (benchcoat) er det lett å håndtere denne sandwich-konstruksjon. Blotting i TS var mest effektiv etter 4-6 dager.

Modifisering av DGGE med den overføringsteknikk som her er beskrevet letter i høy grad analysen av DNA-variasjon i genomisk DNA hvor restriksjonsenzymer ikke fanger opp noen forskjell. For å undersøke genomisk DNA for mutasjon eller variasjon i flere forskjellige loci bør den følgende strategi anvendes: Først bestemmes de restriksjonsenzymer som gir et passende antall små fragmenter (300-2000 kb) på Southern blot-analyse. Deretter kjøres en perpendikulærgradient-gel for å bestemme smeltekurven av de forskjellige fragmenter. Denne perpendikulærgradient-gel, på ett bestemt restriksjonskutt for DNA

kan benyttes for flere forskjellige prober etter blotting. Deretter blir tre parallellgradient-geler kjørt med gradienter fra henholdsvis 0-30, 30-60 og 60-90% denaturering. For en bestemt probe benyttes den denatureringsgradient som omfatter smeltepunktet av det fragment som er av interesse.

Med denne strategi kan en masseundersøkelse (screening) for enkeltbasemutasjon innenfor et antall forskjellige loci for deteksjon av mutasjoner i ondartede cellelinjer eller DNA-variasjon i forskjellige individer utføres på en enkelt DNA-prøve. Automatisering av denne teknikk vil sannsynligvis redusere kost-nadene av disse forsøk og gi enda mer utbredt anvendelse av denne teknikk.

Teknikken kan benyttes i masseundersøkelseprogrammer for genetiske sykdommer for gener som predisponerer for sykdommer såsom Coronar hjertesykdom (CHD) og kreft, til overvåkning av individer for øket mutasjon og i forsøkssystemer for evaluering av et medikament for dets mutagene aktivitet.

Claims (6)

1. Fremgangsmåte til masseundersøkelse (screening) og deteksjon av enkeltbasemutasjoner i multiple loci i genomisk DNA, hvor DNA-fragmenter underkastes denatureringsgradient-gelelektroforese (DGGE) etterfulgt av effektiv overføring til en nylonmembran karakterisert ved at der ved elektroforesen anvendes en polyakrylamidgel (PAG) blandet med lavtemperatur-gelerende agarose (LGT) i buffer og at polyakrylamidgelen er tverrbundet med et reversibelt tverrbindingsmiddel, som fortrinnsvis er diallyltartardiamid (DATD), som lar seg spalte,etter at elektroforesen er utført, at gelen etter elektroforese behandles med perjodsyre for spalting av tverrbindingene introdusert ved det nevnte tverrbindingsmiddel, og at nylonmembranen til slutt hybridiseres til forskjellige utvalgte prober.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at denatureringsmiddelet er formamid og urea og har en lineært økende konsentrasjonsgrad, idet 10 0% denaturering svarer til 40% formamid + 7 M urea.

3. Fremgangsmåte som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at gelen for elektroforesen er en polyakrylamidgel (PAG) inneholdende 5-15%, fortrinnsvis 7,5% akrylamid og 1-2% lavtemperatur-gelerende agarose (LGT) i TAE-buffer.

4. Fremgangsmåte som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at forholdet mellom DATD og akrylamid er 1:10-1:30, fortrinnsvis 1:12,5.

5. Fremgangsmåte som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at perjodsyren som gelen behandles med har en konsentrasjon på 2%.

6. Fremgangsmåte som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at DNA-fragmentene fra gelen med det spaltede tverrbindingsmiddel overføres til en nylonmembran ved alkalisk overføring og at hybridisering med genspesifikke prober utføres.