NO166303B - Fremgangsmaate ved kvantitativ bestemmelse av protein c ogaktivatorpreparat til gjennomfoering av fremgangsmaaten. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et aktivatorpreparat av den art som er angitt i krav l's ingress, og ikke-terapeutiske anvendelser av aktivatorpreparatet til bestemmelse av protein C.

Protein C er et proenzym i hemostasesystemet som foreligger

i blodplasmaet hos mennesker og pattedyr, hvilket aktiveres av et kompleks av trombin og det uoppløselige blodkarpro-teinet.trombomodulin ved delvis proteolyse til serinpre-teasen protein Ca. Protein Ca bevirker på den ene side den hydrolytiske spaltning av levringsfaktoren V (akselerin) og VIII (antihemofil faktor A) og på den annen side en aktivering av fibrinolysen. Virkningen av protein C forsterkes gjennom protein S, fosfolipid og kalsium og hemmes av en spesifik inhibitor som foreligger i plasma.

Takket være disse egenskaper og virkninger inntar protein C en sentral stilling ved regulering av hemostasen; det hindrer levring i området av intakte blodkar, uten å innskrenke den blodstillende virkning i nærheten av skadede blodkar.

Protein C er et glycoprotein med en molekylærvekt på ca. 60.000, hvilket syntentiseres i avhengighet av vitamin K i leveren. Den inneholder i sitt molekyl flere T-karboksy-glutaminsyreestere, som er nødvendige for binding av kalsium og dannelse av enzym-fosforlipid komplekset. Anti-koaguleringsterapi med vitamin K-antagonister fører til dannelse av Acarboksy-Protein C, hvilket riktignok også har enzymaktivitet, men som ikke kan forsterkes ved fosfolipid og kalsium.

Arvet eller oppstått mangel eller molekylær misdannelse av protein C fører hos mennesker til forhøyet tilbøyelighet til trombosedannelse.

Utførlige beskrivelser av protein C finnes i Kisiel, W. og Davie, E.W., Proteim C, Methods in Enzymology 80, 320-332

(1981) og Witt, I., Protein C - Ein neuer Faktor der Haemo-stase. I: L. Roka und E. Spanuth (Red.) Neue Aspekte in der Gerinnungsdiagnostik S. 1-16 (1984) Stuttgart, New York: Schattauer Verlag.

Protein C har antigene egenskaper, hvilket muliggjør dets kvantitative bestemmelse ifølge en immunologisk teknikk.

Ifølge den enzymbundne immunabsorpsjonsteknikk (ELISA, se I. Witt, loe. eit.) forløper protein C-bestemmelsen slik at man danner det spesifikt mot protein C rettede antistoff ved immunisering av kaniner, binder dette til en bærer av kunststoff og bringer prøven i kontakt med den antistoff-ladete bærer, hvorved antigenet "protein C" bindes av antistoffet. Herpå tilsettes antistoffet, som er koblet med peroksidase, i overskudd, og bindes til det adsorberte protein Cs resterende frie antigene determinanter. Etter utvasking av overskuddet av markert antistoff bestemmes den ved immunabsorpsjon bundne perioksidase-aktivitet ved hjelp av o-fenylendiamin. Den bundne peroksidase-aktivitet er porporsjonal med protein C-konsentrajonen i prøven. Det finnes kommersielt tilgjengelig en testkombinasjon til protein C-bestemmelse i henhold til ELISA-teknikken (ELISA-Protein C, Boehringer Mannheim, BRD).

I henhold til en immunoelektroforetisk metode (R.M. Bertina, Thrombosis & Haemostasis 48(1), 1-5 (1982), opptas antistoffet mot protein C i en agaroseløsning, som deretter helles ut til en plate, prøven påføres på antistoffplaten og denne settes i flere timer under likestrøm i en egnet apparatur. Ikke utfelt protein vaskes nå fra gelplaten og de dannede, rakettformede utfellingssoner gjøres synlig gjennom farging med amidosvart. Lengden av utfellingssonene er proporsjonal med protein C-konsentrasjonen i prøven. Ferdige antistoff-plater til protein C-bestemmelse er kommerisielt tilgjenge-lige, som for eksempel "Assera®-Plate Protein C", Diagnos-tica Stago, Asniéres, Frankrike.

Protein C kan videre også bestemmes etter et radioimmunologisk prinsipp, idet man merker det spesifike anti-protein C-antistoff med en radioaktiv isotop som for eksempel <125>I og måler bindingen til protein C i prøven radiologisk. En radioimmunologisk fremgangsmåte for protein C-bestemmelse ble beskrevet av K. Ikeda og J. Stenflo i Thrombosis Research 39, 297-306 (1985).

De nevnte immunologiske fremgangsmåter for protein C-bestemmelse har dog flere ulemper. Høyrene preparater av protein C til fremstilling av det spesifikke antistoff er nødvendig, da en forurensning av antigenet med plasmaproteiner ville føre til et antistoff med for bred bindingsevne, som ville vise en for høy protein C-konsentrasjon i prøven. Immuno-logiske metoder er videre så arbeids-, apparatur- og tid-krevende, at deres praktiske anvendelse kun kommer på tale når pasientens tilstand på den ene side rettferdiggjør dette og på den andre side tillater den lange ventetid. Den diagnostiske utsagnskraft på grunnlag av immunologiske protein C-bestemmelser er dessuten begrenset, fordi disse fremgangsmåter foruten aktiverbart, enzymatisk funksjone-rende protein C også omfatter dettes patologiske former samt forbrukt, inaktivert enzym bundet til inhibitoren.

Den krevende rensing av protein C samt fremstillingen av antistoffpreparater faller bort, og bestemmelsen blir spesifikk for aktivt protein C når det ikke måles på grunnlag av de antigene egenskaper, men derimot på grunnlag av enzym-funksjonen.

Protein C kan bestemmes funksjonelt, idet man aktiverer proenzymet og måler den dannede enzymaktivitet på et naturlig eller syntetisk substrat.

I henhold til fremgangsmåten beskrevet av Kisiel og Davie (Kisiel, W. og Davie, E.W., Protein C Methods in Enzymology 80, 320-332 (1981)), bestemmes protein C i kromatografi-fraksjoner under anvendelse av kaolin-cefalin-levringstiden for menneskelig sitratplasma som indikatorreaksjon. I et første trinn aktiveres den protein C-holdige prøve ved 30-60 minutters inkubering med trombin og deretter nøytraliseres trombinoverskuddet ved tilsetning av antitrombin III og heparin. I et andre trinn tilsettes en aliquot del av aktive-ringsblandingen til normalplasma, koaguleringssystemet aktiveres ved tilsetning av kalsiumklorid, cefalin og kaolin, og tiden inntil koagulering måles. Nedbrytingen av faktor V og VIII som bevirkes av det aktiverte protein C, forårsaker en forlengning av koaguleringstiden sammenlignet med en kontrollprøve uten protein C; denne forlengning er proporsjonal med protein C-innholdet i prøven.

Denne fremgangsmåte omfatter riktignok spesifikt det funk-sjonsdyktige protein C, men den kan kun anvendes for inhi-bitorfrie protein C-preparater, fordi protein C-inhibitoren som inneholdes i plasma, inaktiverer enzym raskere enn det dannes ved trombinaktivering.

I henhold til fremgangsmåten beskrevet av Francis og Patch (R.B. Francis og M.J. Patch; A functional assay for protein C in human plasma. Thromb. Res. 32, 605-613 (1983), kobles forstyrrelsen ved protein C-inhibitoren ut, idet man behand-ler henholdsvis prøven og pasientplasmaet som skal undersø-kes med bariumcitrat for å adsorbere protein C, mens inhibitoren forblir i løsning. Fra det avsentrifugerte adsorbat elueres protein C ved behandling med natriummorfolinetyl-sulfat, vaskes og aktiveres delvis ved 60 minutters inkubering med cx-trombin. Deretter inaktiveres trombinet med antitrombin III og heparin og deretter nøytraliseres hepa-rinene med protaminsulfat. Protein C-aktiviteten i den på denne måte forberedte prøve bestemmes så på menneskelig normalplasma med måling av den forlengede kaolin-cefalin-koaguleringstid.

Fra en fortynningsserie av normalplasma og de derved bestemte levringstider settes det opp en kalibreringskurve, i hvilken protein C-innholdet i pasientplasma kan avleses i prosent av normalen.

De spesielle ulemper ved fremgangsmåten beskrevet av Francis og Patch ligger i at den er meget omstendelig og i den lange inkuberingstiden med trombin, hvilken til tross for dette ikke fører til fullstendig aktivering av den foreliggende protein C-mengde, fordi det ville være nødvendig med 4 timers inkubering ved 37<*>C ved den anvendte forsøksanord-ning.

Arbeidet av Bertina et al. (R.M. Bertina, A.W. Broekmans,

C. Krommenhoek-van Es og A. van Wyjn-Gaarden: The use of a functional and immunological assay for plasma protein C in the study of the heterogeneity of congenital protein C deficiency. Thrombosis and Haemostasis 51, 1-5 (1984)), be-skriver en fremgangsmåte for protein C-bestemmelse i pasientplasma, som anvender den direkte spaltning av et kromogent substrat som indikatorreaksjon i stedet for den komplekse hemming av kaolin-cefalin-levringstiden. I henhold til denne fremgangsmåte adskilles protein C fra pasientplasma ved adsorpsjon på aluminiumhydroksyd ogieluering med etylendiamintetraeddiksyre, aktiveres med trombin i 4 5 minutter ved 37°C, trombin hemmes med antitrombin III og heparin og til slutt bestemmes det aktiverte protein C ved måling av p-nitroanilinavspaltningen fra det syntetiske, kromogene substrat pyroglutamyl-L-prolyl-L-arginin-p-nitroanilid.

Adsorbsjonsfasen og aktiveringen med trombin som anvendes i alle de beskrevne fremgangsmåter ved funksjonell protein C-bestemmelse i plasma har en ufordelaktig virkning på nøy-aktigheten av bestemmelsen og på bestemmelseshastigheten.

Adsorpsjon og eluering er ikke kvantitativt løpende, temperatur- og tidsavhengige trinn, gjennomføring av dem må standardiseres og krever derfor kvalifisert personale. Dessuten forandrer de stoffer som anvendes til eluering forsøksmediets elektrolyttsammensetning og påvirker derved omsetningen av substratet.

Trombin aktiverer protein C langsomt og ufullstendig og det må etter fullført aktivering hemmes med antitrombin III og heparin eller med hiridin, for at det ikke selv skal reagere med substratet og når det anvendes av et naturlig substrat forespeile falskt lave eller når det anvendes et syntetisk substrat forespeile falskt høye protein C-verdier. For at det tilsatte antitrombin og heparin ikke igjen skal forlenge kaolin-cefalin-levringstiden og forårsake forfalsket høye resultater, må heparin nøytraliseres med protaminsulfat når protein C skal bestemmes ved hjelp av en levringsmetode. Innsetningen av trombin som aktivator ved fotometrisk bestemmelse av protein C forutsetter dessuten at det kromogene substrat som anvendes til måling av protein C-aktiviteten ikke eller kun i liten grad selv spaltes av trombin.

Til nå er det ikke kjent praktisk anvendbare bedre alterna-tiver til protein C-aktivering med trombin. Riktignok på-skyndes aktiveringen med trombin sterkt gjennom trombomodu-lin; dog er dette vannuoppløselige protein idag ikke tilgjengelig i anvendbar form.

En likeledes påskynnende tilsetning av kalsium kan ikke skje i plasma, fordi derigjennom ville levringssystemet og dermed andre proteaser enn protein C bli aktivert, hvilke igjen på sin side reagerer med det naturlige eller syntetiske substrat.

Faktor X-aktivatoren som er isolert fra giften fra Russel-slangen, utøver i henhold til Kisiel og Davie gjennom sin proteaseaktivitet likeledes en aktiverende virkning på protein C, men denne aktivering forløper enda langsommere enn aktiveringen med trombin og kan derfor ikke anvendes til bestemmelse av protein C. Trypsin, som likeledes bevirker en proteolytisk aktivering av protein C, kan ikke anvendes, da den som uspesifisk protease både aktiverer og inaktiverer en rekke andre plasma-proenzymer og foruten dette også reagerer med de anvendte substrater.

Proteaser med trombinaktig substratspesifisitet, som det fibrinopeptid A avspaltende batroxobin fra Bothrops atrox-gift eller ancrod fra Agkistrodon rhodostoma-gift, det fibrinopeptid B avspaltende enzym fra Agkistrodon contortrix-gift, det trombocyttaktiverende enzym trombocytin fra B. atrox-gift aktiverer ikke protein C, og den ved stafylokoagulase fra protrombin dannede trombinkoagulase eller det ved ekarin fra protrombin dannede meizotrombin utviser lignende egenskaper som trombin og utgjør derfor ingen fordel fremfor denne.

Det ble overraskende funnet at et protein fra giften fra kobberhodeslangen Agkistrodon contortrix, hvilken ikke ut-øver trombinlignende aktiv virkning på fibrinogen og trombocytter, som i motsetning til trombin hverken avspalter fibrinopeptid A eller B fra fibrinogen og hverken utløser aggregasjons- eller frisetningsreaksjoner på trombocytter, bevirker en meget sterk og rask aktivering av renset protein C. Det ble videre funnet at dette slangegiftprotein kan aktivere protein C i så sterkt fortynnet plasma at den foreliggende protein C-inhibitor praktisk talt ikke kan virke, eller at det oppstår et aktiveringsprodukt, som ikke kan hemmes av plasma-protein C-inhibitoren, slik at nødven-digheten av en omstendlig adskillelse av protein C og inhibitor ved adsorpsjon faller bort. Det ble foruten dette funnet at det protein C-aktiverende slangegiftprotein ikke utøver påvisbar proteaseaktivitet og derfor hverken angriper et naturlig eller et syntetisk substrat. I motsetning hertil utøver trombin en spaltende virkning på syntetiske substrater samt en koagulerende virkning på naturlige substrater, noe som medfører at de uønskede virkninger av trombinet må oppheves ved tilsetning av en nøyaktig utmålt mengde av en spesifikk inhibitor. Det ble endelig funnet at protein C med denne aktivator kan aktiveres så raskt at en funksjonell bestemmelse av protein C med vanlige automatiske anordninger er mulig.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte ved bestemmelse av protein C, i et medium som inneholder sistnevnte, hvilken fremgangsmåte er kjennetegnet ved at man lar giften fra slangen Agkistrodon contortrix eller giften fra en slangeart som inngår i en immunologisk kryssreaksjon med giften fra Agkistrodon contortrix, eller et fra de nevnte gifter isolerbart protein C-aktiverende aktivatorpreparat virke så lenge til proenzymet protein C er aktivert maksimalt til en protease med protein Ca-aktivitet, og at mengden av det dannede aktiverte protein C bestemmes ved fotometrisk bestemmelse av mengden av det fargede eller fluoriserende spaltningsprodukt som dannes ved den katalytiske hydrolytiske virkning av det aktiverte protein C på et syntetisk kromogent substrat, eller ved måling av den forlengede levringstid hos et naturlig substrat, hvilket bevirkes av det aktiverte protein C.

Spesifisiteten av protein G-aktiveringen i menneskelig sitratplasma ble verifisert ved hjelp av spesifikke proteasesubstrater og -inhibitorer, samt ved måling på faktormangelplasma. Ved inkubering av plasma med aktivatorpreparat i henhold til oppfinnelsen aktiveres ingen enzymer som spalter plasma-kallikreinsubstratet Bz-L-Pro-L-Phe-L-Arg-pNA faktor Xa-substratet CH3S02-D-Leu-Gly-L-Arg-pNA eller plasminsubstratet Tos-Gly-L-Pro-L-Lys-pNA. Målt på de kromogene substrater H-D-CHG-L-Pro-L-Arg-pNA og H-D-Pro-L-Pro-L-Arg-pNA, finner man i normalplasma og i plasma som mangler faktorene VII, XI eller X ved aktivering med aktivatorpreparatet i henhold til oppfinnelsen amidolytiske ak-tiviteter av samme størrelsesorden, mens det ved hjelp av aktivatorpreparatet i henhold til oppfinnelsen i et protein C-fritt menneskelig plasma ikke frembringes protein C-sub-stratene 2AcOH-H-D-Pro-L-Pro-L-Arg-pNA og 2AC0H-H-D-Lys(Cbo)-L-Pro-L-Arg-pNA -spaltende aktivitet. I forhold til det kromogene substrat H-D-ProL-Pro-L-Arg-pNA hemmes ikke den ved aktivatoren i henhold til oppfinnelsen i plasmadan-nede protein C-aktivitet ved tilsetning av den spesifikke trombininhibitor hirudin eller ved tilsetning av den polyvalente menneskelige urin-trypsininhibitor. Tilsetning av den polyvalente proteaseinhibitor aprotinin til plasma før inkubering med protein C-aktivatoren i henhold til oppfinnelsen hindrer spaltningen av kromogene protein C-substrater fullstendig. Tilsetning av aprotinin etter gjennomført aktivering og allerede løpende substratspaltning hemmer reaksjonen momentant og fullstendig. Tilsvarende hemmes også renset, ved hjelp av insolubilisert trombin aktivert humant protein C fullstendig av aprotinin. Disse resultater beviser at aktivatoren i henhold til oppfinnelsen aktiverer protein C spesifikt og derved hverken fører til dannelse av trombin, plasmin, faktor Xa, plasmakallikrein eller til dannelse av en annen enzymaktivitet som spalter de kromogene protein Ca-substrater. Nøyaktigheten av protein C-bestemmelsen i plasma ved hjelp av aktivatoren i henhold til oppfinnelsen og et kromogent substrat kunne videre bevises ved forsterkning av det fysiologiske plasma-protein C-speil med tilsatt protein C. Protein C-innholdet som ble funnet i det forsterkede plasma, tilsvarte summen av fysiologisk og tilsatt protein C-mengde. Foruten dette kunne funksjonsevnen for protein C-bestemmelsesmetoden i henhold til oppfinnelsen bevises ved aktivitetsmålinger i blandinger av protein C-fritt og normalt menneskelig plasma samt ved aktivitetsmålinger på normalt menneskelig plasma med økende tilsetninger av anti-protein-C-antistoffer.

Oppfinnelsen vedrører videre et av slangegifter fremstillbart aktivatorpreparat som har den egenskap at det omdanner protein C fra mennesker og hvirveldyr, for eksempel sau, geit, ku, hest, gris, kanin og høne til aktivert protein C.

Som utgangsmateriale ved fremstillingen av protein C-aktivatorpreparater i henhold til oppfinnelsen egner seg gifter fra solenoglyfe slanger (slanger med bevegelige, rørformede gifttenner), hvilke tilhører hoggorm-familien (viperidae), særlig gruppen crotalinae, og innenfor denne art trekant-hodene (Agkistrodon). Særlig egner seg giften fra arten A. contortrix, giften fra dennes underarter som for eksempel A. contortrix contortrix, A. contortrix laticinctus, A. contortrix mokeson, A. contortrix phaeogaster, A contortrix pictigaster samt giften fra arter som inngår en immunologisk kryssreaksjon med giften fra A. contortrix, som for eksempel A. piscivorus, giften av dennes underarter som for eksempel A. piscivorus piscivorus, A. piscivorus conanti, A. piscivorus leucostoma, og giften fra arten A. bilineatus samt dens underarter, som for eksempel A. bilineatus bilineatus, A. bilineatus taylori og A. bilineatus russelous.

En oversikt over den zoologiske klassifisering av slange-faunaen finnes hos G. Underwood, Classification and distri-bution of venomous snakes in the world. I: C.Y. Lee (Red.) Snake venoms s. 15-40, Berlin, Heidelberg, New York: Springer-Verlag (1979). Kommentarer til den immunologiske kryssreaksjon mellom giftene fra ulike slangearter og antistoffer fra serum fra immuniserte pattedyr finnes hos S.A. Minton, Common antigens in snake venoms, loe. eit., s. 847-862 .

Mens antistoff i alminnelighet bare reagerer med det antigen som anvendes i immuniseringshensikt (dvs. med det homologe antigen), finnes det visse unntakelser, dvs. kryssreaksjoner, hvor et visst antistoff reagerer ikke bare med det homologe antigen, men også med andre stoffer. På bakgrunn av kjemiske undersøkelser er det blitt påvist at kryssreaksjoner er betinget ved strukturelle likheter mellom antigenene. Begre-pet "kryssreaksjon" refererer til det serologiske slektskap mellom forskjellige individuelle antigener hvis molekyler øyensynlig oppviser likeartede strukturelle grupper. Immuno-logiske kryssreaksjoner kan f.eks. påvises som følger: Hos en gruppe kaniner dannes antistoffer ved gjentatte intramuskulære innsprøytninger av enzym A (antigen A). Disse dyrs serum inneholder anti-A-antistoff som, når det blir brakt i berøring med enzym A (antigen A), danner et kompleks i form av en felling. En annen gruppe kaniner immuniseres mot enzym B (antigen B). Disse dyrs serum inneholder anti-B-antistoff som med enzym B (antigen B) danner et kompleks i form av en felling. Når det ikke finner sted en reaksjon mellom anti-A-antistoff og anti-B-antistoff, henholdsvis mellom anti-B-antistoff og anti-A-antistof f, så finner det ikke sted en kryssreaksjon mellom A og B. Hvis det derimot opptrer en precipitinreaksjon mellom anti-A-antistoff og anti-B-antistoff, henholdsvis mellom anti-B-antistoff og anti-A-antistoff, så opptrer det en kryssreaksjon mellom A og B.

Isoleringen og rensingen av protein C-aktivatoren fra slangegift kan skje ved hjelp av kjente fremgangsmåter for proteinadskillelse som for eksempel fraksjonert etanol eller ammoniumsulfatfelling, høy- eller lavtrykkskromatografi på molekylærsikt- eller ionebyttesystemer, affinitetskromato-grafi, preparativ elektroforese eller ved en kombinasjon av flere av de nevnte teknikker. En aktuell oversikt over proteinseparasjonsfremgangsmåter finnes hos R. Scopes, Protein purification, New York, Heidelberg, Berlin: Springer-Verlag (1982).

Aktivatorpreparat i henhold til oppfinnelsen kan eksempel-vis fremstilles ved kromatografi av den ovenfor definerte slangegift, for eksempel av A. contortrix-giften på en anionbytter med for binding av proteiner egnet for porøsitet, for eksempel tverrfornettet dietylaminoetyldextran (DEAE-Sephadex® A-50) eller dietylaminoetylcellulose og eluering med natriumfosfatbuffer ved nøytral pH og tiltagende ionestyrke, avsalting av de protein C-aktiverende fraksjoner ved ultrafiltrering og påfølgende frysetørking.

Det på denne måte fremstilte aktivatorpreparat, utprøvd i en konsentrasjon på 2 jig pr. ml på menneskelig fibrinogen, bevirker innen 10 minutter ingen levring og utprøvd på en ikke oppvarmet humanfibrinplate innen 15 timer ingen fibri-nolyse.

Målt på det syntetiske kromogene substrat H-D-Pro-L-Pro-L-Arg-pNA aktiveres renset menneskelig protein c ved pH 8, ionestyrke 0,15 og 37'C gjennom aktivatorpreparatet i en konsentrasjon på 2 pg protein pr. 1 ml testblanding innen maksimalt 10 minutter.

Den protein C-aktiverende virkning av aktivatorpreparatet nedsettes ikke ved 15 timers inkubering av sistnevnte med 2,5 pmol diisopropylfluorfosfat pr. 1 ml ved pH 8 eller ved 15 timers inkubering med 1 mg jodacetamid pr. 1 ml ved pH 7 eller ved tilsetning av 0,05 jjmol etylendiamintetraeddiksyre-dinatriumsalt pr. 1 ml. Den protein C-aktiverende virkning av aktivatorpreparatet hemmes videre hverken gjennom trombininhibitorene antitrombin III, heparin og hirudin eller gjennom den polyvalente proteaseinhibitor aprotinin.

Aktivatorpreparatet i henhold til oppfinnelsen kan også fremstilles ved oppløsning av slangegiften i et vandig medium, fjerning av uønskede giftbestanddeler fra oppløsning-en enten ved fraksjonert alkoholfelling, fraksjonert saltfelling eller varmebehandling ved sur pH for å fremstille en for-renset giftfraksjon, videre rensing av den for-rensede giftfraksjon ved kromatografi på en anionbytter med en for bindingen av proteiner egnet porøsitet, for eksempel tverrfornettet dietylaminoetyldekstran eller dietylaminoetylcellulose, og eluering med natriumfosfatbuffer ved nøytral pH og ved tiltagende ionestyrke, videre kromatografi på en kationbytter, for eksempel det tverrfornettede karboksymetyldekstran eller karboksymetylcellulose og eluering med en natriumacetatbuffer ved sur pH, konsentrasjon av det protein C-aktiverende eluat ved ultrafiltrering, av salting og sluttrensing av konsentratet ved kromatografi på en molekylær silgel, for eksempel en tverrfornettet dekstrangel, under anvendelse av fortynnet vandig eddiksyre som elueringsmiddel og påfølgende frysetørking.

Det på denne måte fremstilte aktivatorpreparat utmerker seg ved at det i en konsentrasjon på 0,1-0,5 pg pr. ml vandig reaksjonsblanding ved pH 6-8 og ved en temperatur fra 20-40°C aktiverer maksimalt det i 0,05 ml normalt menneskelig sitratplasma inneholdte protein C innen høyden 10 minutter, at det i en konsentrasjon på 5 pr ml forsøksblanding hverken forårsaker en levring av menneskelig fibrinogen i løpet av 10 minutter eller en lyse av menneskelig fibrin i løpet av 15 timer, at det ikke aktiverer protrombin og levringsfaktor X, at det fra protein C-fritt plasma ikke genererer amidolytisk aktivitet, at den protein C-aktiverende virkning ikke nedsettes ved 15 timers inkubering med 2,5 jjmol diisopropylfluorfosfat pr. 1 ml ved pH 8 eller ved inkubering med 1 mg jodacetamid pr. 1 ml ved pH 7 eller ved tilsetning av 0,05 pmol etylendiamintetraeddiksyre-dina-triumsalt pr. 1 ml, at den protein C-aktiverende virkning hverken hemmes gjennom trombininhibitorer som antitrombin III, heparin og hirudin eller gjennom den polyvalente proteaseinhibitor aprotinin, at det ikke mister sin protein C-aktiverende virkning ved 10 minutters oppvarming ved 70°C ved pH 3 til 8 eller ved 24 timers lagring ved 20-25°C ved pH 2 til 8, at det viser betraktelig aktivitetstap etter 1 time ved pH 9, at det mister sin aktiverende virkning etter tilsetning av 4% natriumdodecylsulfat eller 5 pmol mangan-II-laktat pr. 1 ml, at det kun mister lite av sin aktivitet ved 24 timers behandling med ditiotreitol ved pH 7, at det nøytraliseres med polyvalent mot amerikanske huleslanger (crotalinae) rettet antiserum, at det etter reduksjon med ditiotreitol og påfølgende alkylering med jodacetamid i polyakrylamidgel-elektorforesen i nærvær av natriumdodecylsulfat og farging med comassiblå oppviser en eneste sone med en relativ elektroforetisk mobilitet, som tilsvarer en molekylvekt på 39.000 + 3.000, at det i den analytiske ultrasentrifugering oppviser en sedimentasjonskonstant (S20w) på 2,65 + 3%, noe som tilsvarer en molekylvekt på 36.800 + 5%, at det elueres på en kalibrert søyle med tverrfornettet dekstrangel (Sephadex® G-100) med et spesifikt volum (Kav), hvilket tilsvarer en molekylvekt på 37.000, at det ved isoelektrisk fokusering oppviser et bestemt isoelektrisk punkt på 3,0 + 0,2, at den spesifikke absorpsjon i enprosentig vandig oppløsning ved 280 nm og 1 cm s j ikttykkelse (a,280 1%) utgjør 13,5 + 0,5, at det utviser lem et innhold av hydrokarboner på 20 + 3%, at det i en konsentrasjon på 1 ug/ ml testblanding ved inkubering med et kromogent substrat i henhold til patentkrav 5 eller 6 ved pH 7-8,5 og 37°C ikke forårsaker en større økning av absorp-sjonen målt ved 405 nm og 1 cm sjikt-tykkelse enn 0,01 pr. minutt, at det etter intravenøs administrering i en dose på 80 U pr. kg kroppsvekt til kaniner forlenger den aktiverte partialtromboplastintid i plasma til minst det dobbelte av utgangsverdien, at det etter en intravenøs dose på 80 U pr. kg kroppsvekt ikke utløser akutte toksiske symptomer eller adferdsforstyrrelser på kaniner, at det etter flere gangers subkutan administrering ansporer dannelsen av antistoffer hos kaniner, og at antistoffet som foreligger i serum hos kaninene som er immunisert mot aktivatorpreparatet, danner et ved immunodiffusjon påvisbart, utfellende kompleks.

Som naturlige substrater ved måling av virkningen av aktivert protein C over en inaktivering av faktorene V og VIII i levringsforsøk kan man anvende friskt, frosset eller fryse-tørret blodplasma fra mennesker eller pattedyr med de vanlige kalsiumionbindende tilsetninger, som citrat eller oksa-lat, eller plasmatilberedninger som ved oppvarming, pH-innstilling eller behandling med enzymer, absorpsjons- eller proteinfellingsmidler ér befridd for inhibitorer eller for komponenter som ikke er relevante for en protein C-bestemmelse. Det kan også anvendes levringsfaktorkonsentrater fremstilt fra blodplasma og biproduktene, hvilke har anvendelse for terapeutiske formål og også faktormangelplas-maer.

Som syntetisk substrat for den direkte fotometriske måling av aktiviteten av det aktiverte protein C egner seg oligopeptider, særlig di- eller tripeptidyl-L-argininderiva-ter, hvis C-terminale arginin er forbundet med en kromogen gruppe over en enzymatisk med aktivert protein C-spaltbar amidbinding, og deres salter med mineralsyrer eller organiske syrer.

Særlig kan anvendes forbindelser med formel

i hvilken n betegner tallet 3 eller 4, R<2> betyr hydrogen eller a) en rettkjedet eller forgrenet alkanoylgruppe med 2 til 6 karbonatomer, b) en co -karboksyl-, co -metoksykarbonyl- eller co -etok-sykarbonylgruppe med 2 til 4 karbonatomer i alkanoyl-gruppen, c) en rettkjedet eller forgrenet alkoksykarbonylgruppe med 1 til 4 karbonatomer i alkoksygruppen, d) alkylsulfonylgruppe med 1 til 2 karbonatomer i alkylresten, e) en usubstituert eller substituert benzoylgruppe eller f) en i kjernen usubstituert eller substiuert benzylok-sykarbonylgruppe,

R<3> betyr hydrogen eller en i henhold til a) til og med f) for R<2> definert gruppe og i tillegg når n = 3, en amidino-eller tosylamidinogruppe, og R<1> betyr p-Ni-trofenylamino-, 1- eller 2-naftylamino-, 4-metoksy-2-naftylamino-, 4-metyl-cumaryl-(7)-amino-, 1,3-di(metoksykarbonyl)-fenyl(5)-amino-, kinonylamino- eller nitrokinonylaminogruppe og deres salter med en mineralsyre eller organisk syre.

Som eksempler på slike syntetiske substrater kan det nevnes H-D-Pro-L-Pro-L-Arg-pNA, D-pyroglu-L-Pro-L-Arg-pNA, H-D-Lys (c-Cbo)-L-Pro-L-Arg-pNA, H-D-Lys-L-Pro-L-Arg-pNA og deres salter, særlig deres hydroklorider og acetater.

Da det protein C-aktiverende aktivatorpreparat i henhold til oppfinnelsen (slangegiftprotein) i motsetning til trombin ikke utøver oppvisbar proteaseaktivitet og derfor ikke kan spalte syntetiske protein C-substrater, kan det ved bestemmelse av aktivert protein C i henhold til fremgangsmåten av foreliggende oppfinnelse også anvende slike substrater som er ubrukbare ved de vanlige fotometriske metoder til bestemmelse av protein C i plasma, fordi det ikke bare spaltes av aktivert protein C, men også av det til aktivering innsatte trombin.

I denne kategori av syntetiske substrater faller eksempel-vis de følgende forbindelser: 2AcOH.H-D-CHG-L-Pro-L-Arg-pNA 2AcOH.H-D-CHG-L-Ala-L-Arg-pNA, Tos-Gly-L-Pro-L-Arg-pNA.AcOH og fenylsulfonyl-Gly-L-Pro-L-Arg-pNA.AcOH.

De i formlene ovenfor benyttede forkortelser har følgende betydninger: Ala = alanin; Arg = arginin; Cbo = karbo-benzooksy; CHG = cycloheksylglycin; Lys = lysin; pNA = p-ni-troanilid; Pro = prolin; pyroglu = pyroglutaminsyre.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen muliggjør videre

å bestemme aktiviteten av protein C-inhibitorer kvantitativt, idet man til en kjent mengde protein C tilsetter en inhibitorholdig prøve, deretter overfører protein C med aktivatorpreparatet til aktivert protein C, etter en egnet reaksjonstid bestemmer den ikke hemmede protein Ca-aktivitet ved hjelp av et syntetisk eller naturlig substrat og utfra differansen mellom forelagt og restlig protein Ca-aktivitet beregner inhibitorinnholdet.

Eksempel 1

Fremstilling av et protein C-aktivatorpreparat fra A. contortrix-gift

200 mg Agkistrodon contortrix-gift ble løst i 1 ml 0,015 M natriumfosfatbuffer, pH 6,8, sentrifugert, og supernatanten ble påført på en med den samme buffer ekvilibrert søyle med DEAE-Sephadex® A-50 (kryssbundet dietylaminoetyldekstran) med format 2,6 x 90 cm. Heretter ble det eluert med buffere med en lineær gradient, blandet av 0,015 M natriumfosfat-buf f er, pH 6,8 og 0,4 M natriumklorid i 0,015 M natriumfos-fatbuf f er, pH 6,8, og fraksjoner på henholdsvis 2 0 ml ble oppsamlet. Den protein C-aktiverende virkning av de enkelte fraksjoner ble bestemt ved at man inkuberte et kommersielt tilgjengelig bariumcitrat-eluat fra humanplasma, inkuberte 1 mU pr. ml (plasma barium citrat eluat, Sigma-Chemie GmbH, Munchen, BRD) med prøven i 15 minutter ved 30°C, pipetterte 0,1 ml derav til 0,1 ml menneskelig normalplasma, tilsatte til denne blanding ved 37'C 0,1 ml kefalin-ellagsyrereagens (Actin®, Dade, Aguada, Puerto Rico, USA) og 0,1 ml 0,025 M kalsiumklorid, satte straks i gang en stoppeklokke og bestemte tiden til levring. De protein C-aktivatorinnehol-dende prøver bevirket en forlengning av levringstiden fra 34 sekunder (kontroll uten eluant) til 60 til 90 sekunder, alt etter aktivatorinnhold.

Den protein C-aktiverende aktivitet forelå i fraksjonene 40

- 45 (se vedlagte figur). De samlede aktive eluater fra 8 kromatografi-charger ble under ultrafiltrering konsentrert, vasket saltfri, tatt opp i 0,1 M glycin, pH 7,4 og fryse-tørket. Det ble erholdt 830 mg frysetørket produkt med et proteininnhold på 16,5%. 5 pg av det erholdte aktivatorpreparat (0,825 yiq protein) bevirker ved 37'C og pH 8,0 i løpet av av 7,5 minutter den maksimale aktivering av 40 mU renset menneskelig protein C, målt på det syntetiske, kromogene substrat 2AcOH.H-D-Pro-L-Pro-L-Arg-pNA.

Eksempel 2

Fotometrisk bestemmelse av renset.protein C

Av en stamoppløsning av menneskelig protein C, isolert og renset med bariumsitratabsorpsjon og påfølgende eluering, kromatografi på tverrfornettet dietylaminoetyl-agarose, kromatografi på dekstransulfat-agarose og preparativ polyakrylamidgel-elektroforese, med et proteininnhold på 1,1 mg pr. ml, ble det fremstilt en fortynningsrekke med 0,1 M Tris-HCl-Puffer, pH 8,0.

Protein C-innholdet i disse fortynninger ble bestemt ved at man i en fotometrikuvette tilsatte 0,010 ml protein C-for-tynning til 0,200 ml av en oppløsning av 0,025 mg/ml av den i henhold til eksempel 1 fremstilt protein C-aktivator, inkuberte ved 37 °C i 7,5 minutter, tilsatte 1,390 ml tris-imidazolpuffer, pH 8,4, ionestyrke 0,3, og 0,400 ml av det kromogene substrat 2AcOH.H-D-Pro-L-Pro-L-Arg-pNA, 4 pmol pr ml, og registrerte den gjennom det frisatte p-nitroanilin bevirkede absorpsjonsøkning (A A) ved 405 nm kontinuerlig.

Ut fra absorpsjonsøkningen pr. tidsenhet ble etter den følgende ligning protein C-innholdet i prøven beregnet:

V = testvolum

v = prøvevolum

c = millimolar ekstinksjonskoeffisient for p-nitroanilin U = Internasjonal enzymenhet, enzymmengden som under standardbetingelser omsetter 1 jamol substrat pr. minutt.

Den målte substratspalting som bevirkes av aktivert protein C er proporsjonal med protein C-innholdet i prøven (se tabell 1) .

Eksempel 3

Fotometrisk bestemmelse av protein C i plasma

Protein C-innholdet i menneskelig sitratplasma ble bestemt ved at man i en fotometrikuvette tilsatte 0,05 ml plasma til 0,200 ml protein C-aktivator (fremstilt i henhold til eksempel 1, 0,025 mg/ml), inkuberte ved 37°C.i 7,5 minutter, tilsatte 1,550 ml tris-imidazolpuffer, pH 8,4, ionestyrke 0,3, og 0,200 ml av det kromogene substrat 2AC0H.H-D-CHG-L-Pro-L-Arg-pNA, 4 pmol/ml og registrerte kontinuerlig den ved det frisatte p-nitroanilin fremkalte absorpsjonsøkning ved 405 nm.

Etter den under eksempel 2 oppførte formel ble det beregnet et protein C-innhold på 0,90 U pr. ml plasma.

Eksempel 4

Bestemmelse av protein C i plasma i henhold til en levringsmetode

0,1 ml reagens til bestemmelse av den aktiverte partial-tromboplastin-tid (Actin®, DADE, Aguada, Puerto Rico, USA), 0,1 ml plasma og 0,1 ml av aktivatoren fremstilt i henhold til eksempel 1 (200 pg/ml) ble inkubert ved 37'C i 60 sekunder, tilsatt 0,1 ml kalsiumkloridoppløsning 0,025 M, og

med en stoppeklokke ble tiden til levringen begynte bestemt.

Som modell for protein C-mangelfullt plasma ble normalplasma tilsatt ulike doser av et i handelen tilgjengelig anti-protein C-antistof f preparat (Merz und Dade, Diidingen, CH) .

Levringen av normalplasma forlenges flere ganger ved aktivering av protein C, tilsetning av anti-protein C fører til en doseavhengig nedsettelse av levringstiden (tabell 2).

Eksempel 5

Fremstilling av høyrent protein C-aktivatorpreparat fra A. contortrix-gift 1 g A. contortrix-gift ble løst i 100 ml vann, pH-verdien for denne oppløsning ble innstilt på 3,0 med o-fosforsyre 1 N og den sure giftoppløsning ble holdt på 70 + 2'C i 10 minutter på et vannbad, deretter avkjølt til 20 °C, pH-verdien innstilt til 7,2 med natronlut 1 N, den blakkede løsning ble sentrifugert og supernatanten ble fortynnet med destillert vann til et volum på 100 ml, for slik å fremstille en for-renset giftfraksjon.

Den for-rensede giftfraksjon ble påført en med 0,015 M natriumfosfatbuffer, pH 6,8 ekvilibrert søyle med DEAE-

Sephadex® A-50 av format 2,6 x 90 cm og eluert med en fortynningsrekke blandet av 0,015 M natriumfosfatbuffer, pH 6,8 og 0,4 M natriumklorid i 0,015 M natriumfosfatbuffer,

pH 6,8, og fraksjoner på henholdsvis 20 ml ble samlet. Den protein C-aktiverende virkning for de enkelte fraksjoner ble bestemt ved at man til 0,1 ml menneskelig sitratplasma tilsatte 0,1 ml prøve (1 : 350 i vannfortynnet fraksjon) og 0,1 ml kefalin-ellagsyrereagens (Actin) og 0,1 ml 0,025 M kalsiumkloridoppløsning, en stoppeklokke ble straks satt i gang og tiden til levring ble bestemt. Den protein C-aktivatorinneholdende prøve bevirker en forlenging av levringstiden fra 34 sekunder opptil 200 sekunder, alt etter aktivatorinnhold.

De protein C-aktiverende fraksjoner ble samlet, konsentrert ved ultrafiltrering til 1/10 av eluatvolumet, tatt opp i 0,05 M natriumacetatbuffer, pH 5,0 og innstilt til 100 ml, påført en søyle, CM-Sephadex® C-50, ekvilibrert med en fortynningsrekke blandet av 0,05 M natriumacetatbuffer, pH 5,0 og 0,4 M natriumklorid i 0,05 M natriumacetatbuffer, pH 5,0, og fraksjoner på henholdsvis 20 ml ble samlet, hvilke etter den ovenfor beskrevne metode ble testet for protein C-aktiverende virkning.

De protein C-aktiverende fraksjoner ble blandet sammen, konsentrert ved ultrafiltrering til 1/25 av sine volumer, innstilt på 25 ml med 1% eddiksyre i destillert vann og påført en med 1% eddiksyre i vann ekvilibrert kolonne av Sephadex® G-100 og eluert med 1% eddiksyre, og fraksjoner på 20 ml ble samlet, som igjen etter den innledningsvis beskrevne metode ble undersøkt for protein C-aktiverende virkning.

De protein C-aktiverende fraksjoner ble samlet og frysetør-ket. Det ble oppnådd et saltfritt aktivatorpreparat som i polyakrylamidgel-elektroforese utviser en eneste sone og utviser en protein C-aktiverende aktivitet på 35 U pr. mg. En enhet (U) protein C-aktivator er den mengde som fullstendig aktiverer den i 1 ml normalt, menneskelig sitratplasma inneholdte mengde av protein C under standardbetingelser.

Eksempel 6

Fremstilling av aktivert protein C

25 mg aktivatorpreparat ifølge eksempel 6 ble løst i 100 ml 0,1 molar natriumkarbonatbuffer, pH 8,3, 0,5 molar av NaCl. Oppløsningen ble tilsatt 5 g CNBr-Sepharose 4B (AB Pharmacia, Uppsala), som først var vasket med 0,001 N saltsyre. Blandingen ble rørt i 2 timer ved 20-25°C. Etter avsluttet reaksjon ble blandingen filtrert gjennom et glassfilter G3 og det frafiltrerte insolubiliserte aktivatorpreparat ble vasket 5 ganger med henholdsvis 3 0 ml natriumkarbonatbuffer av den ovenfor anførte sammensetning. For å avmette even-tuelt foreliggende reaktive CNBr-grupper ble det insolubiliserte aktivatorpreparat rørt i 2 timer med 100 ml 0,5% etanolamin i natriumkarbonatbuffer av den ovenfor anførte sammensetning, igjen samlet på et glassfilter og vasket 3 ganger med 300 ml natriumkarbonatbuffer.

En enhet bariumsulfat-eluat fra menneskelig plasma (Sigma-Chemie GmbH, Miinchen, BRD) løst i 100 ml destillert vann ble filtrert på et membranfilter, porestørrelse 0,4 u. Denne oppløsning, som inneholdt en ved hjelp av D-Lys(Cbo)-L-Pro-L-Arg-pNA bestemt mengde på 0,9 U protein C pr. ml, ble tilsatt det insolubiliserte aktivatorpreparat, rørt i 2 timer ved romtemperatur og deretter filtret over et glassfilter. Filtratet hadde et innhold på 0,95 U aktivert protein C.

Eksempel 7

Fremstilling av høyrenset protein C-aktivatorpreparater av giften fra Agkistrodon contortrix contortri, Agkistrodon piscivorus piscivorus og Agkistrodon bilineatus 1 g av giften fra hver av A. C. contortrix (sammenlignings-gift), A.p. piscivorus og A. bilineatus, som skrev seg fra Miami Serpentarium, Salt Lake City, USA, ble oppløst i 20 ml natriumfosfatbuffer (pH 6,8, 0,015 M). Løsningene ble sentrifugert i 5 minutter ved 4000 rpm. Løsningene ble over-ført på søyler med Heparin-Eupergit (Rohm GmbH, Darmstadt, BRD) (format 2,6 x 40 cm) som først var blitt ekvilibrert med fosfatbuffer (pH 6,8, 0,015 M). Søylene ble deretter spylt med en løsning av 0,1 mol/l natriumklorid i fosfatbuffer (pH 6,8, 0,015 M) for å fjerne uaktive ledsager-substanser. Deretter ble alle tre satser av protein C-aktivatoren eluert med en løsning av 0,3 mol/l natriumklorid i fosfatbuffer (pH 6,8, 0,015 M) og oppsamlet i fraksjoner på 2 0 ml. Disse ble undersøkt på protein C-aktiverende virkning ifølge den i eksemplene 1 og 6 beskrevne metode.

De protein C-aktiverende fraksjoner for hver sats ble slått sammen til separate blandinger. Hver blanding ble tilsatt det dobbelte egenvolum av mettet ammoniumsulfatløsning og fikk stå i 1 time ved 20°C. De erholdte, protein C-ak-tivatorholdige felninger ble oppsamlet på membranfiltere med en porestørrelse på 0,45 jj, oppløst i 50 ml destillert vann og oppvarmet i vannbad i 10 minutter ved 60°C. De i hver sats oppståtte felninger ble fjernet ved sentrifugering ved 4 000 rpm. De klare supernatanter ble befridd for resterende ammoniumsulfat ved gelkromatografi på Sephadex® G-15-søyler (format 2,6 x 95 cm). For å påvise protein C-aktivitet i fraksjonene ble igjen metoden som er beskrevet i eksemplene 1 og 6, anvendt. Ammoniumsulfat ble påvist ved sulfatfelling ved hjelp av bariumklorid.

De sammenslåtte aktive, ammoniumsulfatholdige fraksjoner ble filtrert gjennom en vandig ammoniumacetatløsning (0,1 M, pH 8,2) ekvilibrert søyle av 70 ml hydroksylapatitt. Filtratet ble deretter kromatografert på en kationebytter-søyle (MONO S™, Pharmacia, Uppsala, Sverige) under anvendelse av en lineær natriumacetatbuffergradient med natriumkloridkonsentrasjoner på fra 0 til 1 mol/l ved hjelp av et FPLC-apparat (Pharmacia). De fraksjoner som inneholdt protein C-aktivatoren, ble identifisert etter den metode som er beskrevet i eksemplene 1 og 6, og slått sammen til stan-dardløsninger, adskilt etter sats og giftart.

Utbytter, egenskaper og virkninger av de fra de 3 giftarter erholdte standardløsninger med protein C-aktivatorpreparater er oppstilt i tabell 4.

Claims (7)

1. Aktivatorpreparat for ikke-terapeutiske anvendelser hvor protein C omvandles til aktivert protein C, hvilket aktivatorpreparat har den egenskap at det omvandler proenzymet protein C til en protease med protein Ca-aktivitet, og har hverken fibrinogenkoagulerende eller fibrinogen-spaltende aktivitet, karakterisert ved at det fremstilles av giften fra slangen Agkistrodon contortrix eller giften fra en slangeart, hvilken med giften fra Agkistrodon contortrix inngår en immunologisk kryssreaksjon, a) ved kromatografi på en anionbytter med egnet porøsitet for binding av proteiner, for eksempel tverrfornettet dietylaminoetyldekstran eller dietylaminoetylcellulose, b) eluering med natriumfosfatpuffer ved nøytral pH og tiltagende ionestyrke, c) avsalting av de aktive fraksjoner ved ultrafiltrering og d) etterfølgende frysetørring.

2. Aktivatorpreparat i henhold til krav 1 i høyrenset form, karakterisert ved at det er fremstilt a) ved oppløsning av slangegiften i et vandig medium, b) fjerning av uønskede giftbestanddeler fra oppløsningen enten ved fraksjonert akoholfelling, fraksjonert saltfelling eller varmebehandling ved sur pH for å fremstille en for-renset giftfraksjon, c) videre rensing av den dannede forrensede giftfraksjon ved kromatografi på anionbytter med for binding av proteiner egnet porøsitet, for eksempel tverrfornettet dietylaminoetyldekstran eller dietylaminoetylcellulose, d) eluering med natriumfosfatbuffer med nøytral pH og tiltagende ionestyrke, e) ytterligere kromatografi på en kationbytter, for eksempel tverrfornettet karboksymetyldekstran eller karboksymetylcellulose, f) eluering med en natriumacetatbuffer ved sur pH, g) konsentrering av det protein C-aktiverende eluat ved ultrafiltrasjon, h) avsalting og sluttrensing av konsentratet ved gelfelling med for eksempel en tverrfornettet dekstrangel, under anvendelse av fortynnet vandig eddiksyre som elueringsmiddel, og i) etterfølgende frysetørking.

3. Aktivatorpreparat i henhold til krav 1, karakterisert ved at det i en konsentrasjon på 2 pg protein pr. ml testblanding, ved pH 8 og ionestyrken 0,15 og ved 37°C aktiverer maksimalt det i 0,05 ml normalt menneskelig citratplasma foreliggende protein C innen 10 minutter, at det i en konsentrasjon på 2 pg protein pr. ml testblanding hverken bevirker en levring av det menneskelige fibrinogen innen 10 minutter eller en lyse av menneskelig fibrin innen 15 timer.

4. Aktivatorpreparat i henhold til krav 2, karakterisert ved at det i en konsentrajson på 0,1 - 0,5 jjg pr. ml vandig reaksjonsblanding ved pH 6-8 og ved en temperatur fra 20-40'C aktiverer maksimalt det i 0,05 ml normalt menneskelig citratplasma inneholdte protein C i løpet av høyst 10 minutter, og at det i en konsentrasjon på 5 pg pr. ml testblanding hverken forårsaker en levring av menneskelig fibrinogen i løpet av 10 minutter eller en lyse av menneskelig fibrin innen 15 timer.

5. Anvendelse av aktivatorpreparatet ifølge krav 1-4 til bestemmelse av protein C i et medium som inneholder protein C, ved at man a) på det nevnte medium lar innvirke et aktivatorpreparat ifølge kravene 1-4, inntil proenzymet protein C er aktivert maksimalt til en protease med protein Ca-aktivitet, og at man bestemmer mengden av det aktiverte protein C ved (1) fotometrisk måling av mengden av det fargede eller fluoriserende spaltningsprodukt som oppstår ved den katalytiske, hydrolytiske virkning av det aktiverte protein C på et syntetisk kromogent oligopeptidsubstrat som inneholder en over en amidbinding bundet kromogen gruppe som er avspaltningsbar med aktivert protein C, hvorved denne målte mengde er proporsjonal med mengden av protein C som finnes i prøveblandingen, eller (2) ved måling av den forlengede levringstid som bevirkes av aktivert protein C hos et naturlig substrat, idet denne forlengede levringstid er proporsjonal med mengden av protein C som finnes i forsøksblandingen, eller b) tilsetter det nevnte medium et syntetisk, kromogent oligopeptidsubstrat som inneholder en over en amidbinding bundet kromogen gruppe som er avspaltningsbar med protein C, og det nevnte aktivatorpreparat, at man følger den hydrolytiske frisetting av det fargede eller fluoriserende spalt-ningsproduktet fra det nevnte medium fra den målte maksimale hastighet før substrathydrolysen.

6. Anvendelse i henhold til krav 5, ved at det som syntetisk oligopeptidsubstrat anvendes hydrokloridet eller acetatet av H-D-Pro-L-Pro-L-Arg-pNA, H-D-Lys-(E-Cbo)-L-Pro-L-Arg-pNA eller H-D-CHG-L-Pro-L-Arg-pNA.

7. Anvendelse i henhold til krav 5, ved at det som naturlig substrat anvendes friskt, frossent eller frysetørket plasma fra mennesker eller hvirveldyr eller en plasmatilberedning som fremdeles inneholder fibrinogen, protrombin og blodfak-torene X, V og VIII.