NO165202B - Askorbat-resistent bredomraadet glucoseproeveblanding. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en blanding for påvisning

av nærvær og/eller bestemmelse av konsentrasjon av et reduserende sukker, slik som glukose i en prøve.

Analyse av testprøver for nærvær av reduserende sukker finner anvendelse i mange ubeslektede vitenskaper. Den foreliggende oppfinnelse egner seg for slike ulike yrker som bryggeri-industri, biokjemisk forskning og medisinsk diagnostikk.

I bryggeri-industri blir f.eks. stivelse omdannet til flere sukkerarter, slik som maltose, før den aktuelle fermentering. Nærværet av maltose blir derfor omsorgsfullt kontrollert

for å sikre høyt utbytte fra utgangsmaterialet av korn.

Mange biokjemiske systemer krever glukose i omsorgsfullt kontrollerte konsentrasjoner som energikilder for deres celleaktivitet, og forskningen av slike system nødvendiggjør at disse konsentrasjoner blir omsorgsfullt kontrollert.

Den medisinske utøvelse anvender sukkeranalyse i stort omfang ved diagnosering og ved kontroll av slike sykdommer som diabetes mellitus, som kjennetegner seg selv ved abnorme høye glukosekonsentrasjoner i blod og urin.

Det er dessuten tilgjengelige mange analyttiske metoder

for påvisning av nærværet av peroksydatiske virksomme substanser i prøver, slik som urin, fekale suspensjoner og mave- og tarminnhold. Hemoglobin og dets derivater er typ-iske representanter for slike "peroksydatiske aktive" substanser da disse reagerer på en lignende måte som enzymet peroksydase. Slike substanser er også her beskrevet som pseudoperoksydaser. Peroksydatiske aktive substanser er enzymlignende ved at de katalyserer redox reaksjonen mellom peroksydet og benzidin, o-tolidon, 3,3', 5,5'-tetrametylben-zidin, 2,7-diaminofluoren eller lignende benzidin-type indikator substans, hvorved de gir en påviselig respons slik

som en farveforandring. De fleste metoder for bestemmelse av nærværet av okkult blod, i prøver baseres på denne pseudo-peroksydasevirkning.

Området for foreliggende oppfinnelse omfatter således

et meget stort antall anvendelser. Den finner anvende-lighet hvor som helst hvor sukkeranalyser har en betydelse, det være seg i bryggeri, mat-industri, vitenskapelig forskning eller medisin. Dessuten egner den seg for et ulikt antall teknikker for bestemmelse av nærværet av en peroksydase eller pseudoperoksydase. Den foreliggende oppfinnelse finner i virkeligheten anvendelse i hvilket som helst område hvor dens enestående evne til å gi en påviselig respons kan tilpasses. Hvilket som helst system som til sist kan fremskaffe H2O2 som et reaksjonsprodukt eller som inneholder peroksydase eller en pseudoperoksydase er egnet for anvendelse av foreliggende oppfinnelse, som andre systemer er slike som vanninnholdende hypoklorid i swimming pool eller andre sterkt oksyderende systemer.

Beskrivelse av den tidligere teknikkens stilling.

Historien om sukkeranalyse er kanskje mest bemerkelsesverdig fordi den har undergått dramatiske forandringer gjennom de forløpne år, både i anvendelse av base kjemikalier og dens format. De fleste av disse analyser kan karakteri-seres som oksydasjonssystemer som, når redusert, setter i gang reaksjonsbetingelser som leder til en påviselig respons, slik som en fargeforandring eller forandring av bølge-lengde av ultrafiolett lys som absorberes eller reflekteres av systemet. Reduserende sukker vil således omdanne sølv-oksyd til metallisk sølv og, dersom en oppløsning av sukker appliseres på et stykke filterpapir impregnert med sølvoksyd, utvikles en sort prikk. F. Feigl, Chem. Ind. vol, 57, side 1161, London (1938). På lignende måte gir O-dinitrobenzen og 3,4- og 3,5-isomerene av dinitroftalsyre en følsom farge-reaksjon (danner fiolette skygger) når oppvarmet med reduserende sukrer i Na2CC>3 . T. Momose, et al., Chem. Pharm. Bull. Tokyo, vol. 12, side 14 (1964); F. Feigl, Spot Tests in Organic Analysis, 7. utg., side 338-339, Elsevier Publ.

Co., New York (1966).

Men så tidlig som 1849 var det kjent at reduserende sukrer

i en alkalisk oppløsning av CuS04 vil føre til utfelling av gult til rødt kobber(I)oksyd (oksyhydråt). H. Fehling, Ann., vol. 72 (1849). Se også B. Herstein, J. Am. Chem. Soc., vol. 32, side 779 (1910). Denne tidelige milestein, kjent som Fehling's prøve, ledet til utviklingen av en langt bedre følsom prøve som anvender sølvoksyd i ammoniakk, den såkalte Tollens reagens, som reagerer lett med reduserende midler for å gi et sort bunnfall av metallisk sølv, danner ofte et speil på innerveggene av glassreaksjonskar. B. Tollens, Ber., vol. 14, side 1950 (1881); vol 15, side 1635, 1828 (1882).

På grunn av den realtive store utbredelse av diabetes mellitus og dens medfølgende alvorlige kliniske følger, oppsto stor interesse fra de biologiske og medisinske fag i utviklingen av nye teknikker for analyse av glukosenivåer i urin og serum. Denne sterke interesse ledet til utviklingen av flere prosedyrer som sterkt avvikte fra den tidligere oppløsnings-kjemi. Disse anvender forfinede biokjemiske systemer som kan innarbeides i tørre, dypp-og-les innretninger, anvendt i oppløsnings- eller suspensjonsteknikker, eller i forbindelse med spektrofotometrer og andre hardvarer.

Av disse nye teknikker, egner en av disse seg spesielt bra for sukkeranalyse, nemlig et enzymatisk system hvori analyt-ten, f.eks. glukose, er et substrat for et bestemt enzym, hvor reaksjonsproduktene er egnet for frembringelse av en påviselig respons fra en familie av indikatorforbindelser, noe unøyaktig angitt i faget som "benzidin- type indikatorer". Disse forbindelser kan undergå fargeforandringer i nærvær

av hydrogenperoksyd og enzymet peroksydase. Glukose/

oksydase systemet eksempliggjør den tidligere teknikkens stilling, hvori glukose oksyderes til glukonsyre med den tilknyttede dannelse av ^ 2^ 2 i henn°ici til:

B-D-glukose 5-glukonolaceton D-glukonsyre

<*> Koenzym-flavin adenin dinukleotidet ;<*> Samme, redusert form.

Det er den tilknyttende dannelse av hydrogenperoksyd som muliggjør de etterfølgende, indikatorbeslektede trinn som leder til påviselig fargedannelse eller andre påviselige responser. Således reagerer en benzidin-type indikator i nærvær av hydrogenperoksyd og peroksydase ved forandring av dens lysabsorbsjonsevne.

I praksis anvendes denne teknologi for glukoseanalyse i form av dypp-og-les reagens-strimler.

I store trekk omfatter disse en plaststrimmel hvorpå en ende av denne er anbragt til en del av et absorbsjons-papir impregnert med hensiktsmessige enzymer, indikatorforbindelse og buffere som de vesentlige aktive ingredienser. De blir anvendt ved dypping av den reagens-bærende ende i prøven, fjernelse av denne og ved sammenligning av enhver fargedannelse i papiret med et standard fargekart som er kalibrert for forskjellige glukosekonsentrasjoner. Flere patenter som anses å vedrøre foreliggende oppfinnelse med hensyn til dens anvendelse for glukoseanalyse er blitt utgitt. US patent nr. 2.848.308, tilhører Alfred II. Free, beskrev og krevde beskyttet den enzymkjemi hvorved glukose-oksydase, peroksydase og en benzidin-type indikator ble anvendt i en reagensstrimmel for bestemmelse av glukose i urin eller andre kroppsvæsker. US patent nr.3.753.863, til-hører Speck, beskriver anvendelsen av lavere lakanpolyoler for å "stabilisere" indikatoroppløsninger av benzidintypen. US patent nr. 4.071.317, tilhører Lam, beskriver stabili-seringen av en okkult blodsensitiv sammensetning ved anvendelse av bestemte sulfon-, sulfooksyd- og amid-forbindelser som fortynningsmidler under fremstillingen av sammensetningen. Den sistnevnte sammensetning omfatter en organisk hydrogenperoksyd forbindelse og en indikatorforbindelse slik som av benzidin-typen.

Endelig, beskriver US patent nr. 4.336.330 og 4.318.285,

som tilhører patentsøkeren. bestemmelsen av et bredt område av glukosekonsentrasjoner. Dette brede området er muliggjort ved anvendelse av bestemte polymerer i en reagens-innholdende bærematriks. Mens det sistnevnte patent uttrykkelig lærer anvendelsen av et kryssbundet urea formal-dehyd harpiks, anvender det førstnevnte polystyren. I ingen av disse to patenter, eller i de andre ovenfor nevnte, er det noen beskrivelse av den foreliggende patentsøkte blanding for anvendelse som en indikator for måling av glukose. Heller ikke er det omtalt dens resistens mot innvirkning

av askorbat.

Som tilfellet av sukkeranalyse, har det med årene blitt utviklet flere metoder for peroksydase eller pseudoperoksydase analyse som baseres på enzym-lignende katalyse av oksydasjonen av farge-dannende indikatorer i nærvær av hydrogenperoksyd. Opprinnelig omfatter disse våte kjemiske prosedyrer og "dypp-og-les" type reagens-inneholdende strimler. Av førstnevnte er et typisk eksempel publisert i Richard M. Henry, et al., Clinical Chemistry Principles and Techni-ques, Hagertown, Maryland: Harper og Row (1974), side 1124-1125. Denne prosedyre omfatter anvendelsen av iseddik-syre (buffer), difenylamin (indikator), og hydrogenperoksyd. Mens slike våtmetoder har godtgjort å være analyttisk egnet, har de ikke desto mindre alvorlige ulemper, ikke minst har reagensene liten stabilitet og utilstrekkelig følsomhet.

De mangler som hefter med slike reagensoppløsninger, er

at minskningen av stabilitet (null følsomhet) er så hurtig at frisk reagensoppløsninger må fremstilles etter noen dagers lagring, en nødvendighet som fører til både urimelig tids-forbruk for analysepersonalet og dårlig økonomi da kostbare reagenser må kastes.

En andre metode for bestemmelse av peroksydatiske virksomme substanser og den som nå er foretrukket av de fleste i kli-nisk analysevirksomhet og av analyttikere anvender "dypp-og-les" reagens-strimler. Disse omfatter i det vesentlige en porøs papirmatrix bundet til en plaststrimmel eller et håndtak. Matrix'en er impregnert med en bufret blanding av et organisk hydrogenperoksyd og O-tolidin. Ved neddypping

i en væske som inneholder hemoglobin, myoglobin, erotrocyter eller andre pseudoperoksydaser, utvikles en blåfarge i matrixen.Intensiteten av denne er proporsjonal til konsentrasjonen av den peroksydatiske aktive substans i prøven. Ved sammenligning av fargen som er utviklet i matrixen, mot et standard fargekart, kan analyttikeren bestemme på en semi-kvantitativ base, mengden av ukjent substans som er tilstede i prøven.

Fordelene med reagensstrimler i forhold til våtkjemiske metoder er i det vesentlige i dobbelt forstand: strimler er lettere å anvende da hverken fremstillingen av reagensene eller hjelpeapparater er nødvendig, og det fåes større stabilitet av reagensene, og dette gir en større nøyaktighet, følsomhet og økonomi.

Som det kan ses av det foregående, omhandler litteraturen systemer for måling av nærværet og/eller konsentrasjonen av glukose i vandige systemer. Det er imidlertid et alvorlig problem som er forbundet med mange av disse systemer som gjør dem i det minste uegnet og i det verste tilfellet upå-litelig unøyaktig. Kilden for dette problem er nærværet av askorbationer i prøven. F.eks. dersom analysen skal utføres for glukose i urin og pasientens diett har høyt innhold av vitamin C (askorbinsyre), vil resultatene for mange av de tidligere glukose-prøve metoder være ukorrekt negative, eller vil gi en avlesning som er lavere enn den aktuelle konsentrasjon av glukose. Dette problem forårsakes av tilbøyeligheten for askorbinsyre til å redusere en indikator straks etter dens oksydasjon, hvorved fremskaffes en forsinkelsesperiode under hvilken fargedannelsen forsin-kes. Dersom glukoseprøven således avhenger av dannelsen av farge ved en spesiell hastighet, vil nærværet av askorbinsyre minske denne hastighet, hvorved fåes falske resultater som er lavere enn hva resultatene skulle være. Den foreliggende oppfinnelse fremskaffer på den andre side dobbelte fordeler ovenfor tidligere systemer. Den foreliggende oppfinnelse muliggjør glukoseanalyser over et uvanlig bredt område av konsentrasjoner, dvs. fra 0 til ca. 5000 mg/dl.

Samtidig har systemet overraskende blitt funnet å være resistent mot ugunstige virkninger av askorbinsyre.

En annen teknikk som vedrører foreliggende oppfinnelse

den som omhandler reaksjonen mellom 4-aminoantipyrin (her-etter 4-AAP) og fenoliske forbindelser. Det er kjent at en blå kromofor utvikles fra den oksydative kobling av 4-AAP og kromotropsyre. Wong et al., Inter. J. of Biochem., 13, 159-163 (1981). Således er 4-AAP egnet for kobling med kromotropsyre i nærvær av peroksyd for dannelse en blå farge. Også kjent er påvisningen av catecholer ved anvend-

else av 4-AAP som gir en lett blårød farge. LaRue et al., Anal. Chim Acta., 31, 400-403 (1964). En nylig offentlig-gjort artikkel som omhandler bestemmelsen av fenol ved anvendelse av 4-AAP, beskriver forstyrrelse ved nærvær av bestemte oksydasjonsmidler i systemet. Blandt mange oksydative ioner som er nevnt, er I^C^ som leder til falske, negative resultater. Norwitz et al., Analytical Chemistry, 51, 1632-1637

(1979). Endelig er det beskrevet et system som anvender

4-AAP og 3,5-diklor-2-hydroksybenzensulfonsyre i en direkte enzymatisk analyse for urinsyre. Fossati et al., Clinical Chemistry, 26, 227-231 (1980).

I de ovenfor omtalte fire artikler som vedrører 4-AAP og fenoliske koblingsmidler, er ikke omtalt analysen av glukose hvor et bredt område av konsentrasjoner er påviselige. Videre er problemet vedrørende forstyrrelser av askorbat ikke omtalt på noen måte. Foreliggende oppfinnelse omhandler helt og holdent disse to sider og sluttresultatet er en bred-området glukcsetest-innretning som har oppsiktsvekkende mini-mal følsomhet for askorbat. Dessuten angis i den ovenfor refererte artikkel av Norwitz' at 4-AAP analysemetoden er føl-som for feil ved nærvær av oksydasjonsmidler. Det blir i artik-kelen drøftet at dette forårsakes av oksydativ spaltning av fenol.

For å sammenfatte teknikkens, stilling i forhold til foreliggende oppfinnelse, har sukker-følsomme kjemikalier begynt å vise seg på den analyttiske scene så tidlig som i midten av det nittende århundre med innføringen av Fehling's opp-Jøsning og Tollens' reagens. De fleste av de "rene kjemiske" systemer som siden har fremkommet, har blitt avløst av biokjemiske systemer, spesielt de som omfatter en sukkeroksy-dase, peroksydase og en peroksyd-følsom indikator av benzidin-typen. Ikke bare er det ønskelig å være istand til å måle glukose eller andre analytter over et utvidet konsentrasjonsområde, men det er likeledes nødvendig at de målte resultater ikke omfatter unøyaktigheter på grunn av nærvær av askorfoin-syre (vitamin C) i prøven. Den foreliggende oppdagelse gjør det mulig å realisere begge disse ønskede formål.

Foreliggende oppfinnelse vedrører således en sammensetning

for påvisning av nærvær og/eller bestemmelse av konsentrasjon av glukose i en væskeformet prøve, omfattende glukoseoksydase, peroksydase og en indikator, egnet til å gi en påvirkelig respons i nærvær av peroksydase og H2°2' kjennetegnet ved at indikatoren er en blanding av to komponenter, hvor den ene har strukturen

^ ucu cmure nar strukturen

i hvilke R er den samme eller forskjellig og betyr H eller alkyl med 1-6 karbonatomer, R' er aryl og R" er alkyl med 1-6 karbonatomer.

Sammensetningen er egnet for bestemmelse av glukosekonsentrasjoner over et bredt område, f.eks. fra 0 til ca. 50000 mg av glukose pr. dl. av prøven. Dessuten er sammensetningen resistent mot forstyrrelser fra nærvær av askorbat i prøven.

Forbindelsen er fortrinnsvis 4-aminoantipyrin og 4-metylcatechol.

Fig. 1-3 er fremskaffet for å ytterligere illustrere foreliggende oppfinnelse. De er grafiske fremstillinger av data som henholdsvis er fremkommet fra eksempel I-III, som nedenfor angitt. Fig. 1 og 2 fremstiller den oppsiktsvekkende reduksjon av indikatorbleking fra de reduserende virkninger av askorbat som er virkeliggjort ved foreliggende oppfinnelse, såvel som en bemerkelsesverdig øket farge-dannelseshastighet. Fig. 3 viser nøyaktigheten av de foreliggende beskrevne indikatorer ved bestemmelse av glukose.

I fig. 1 er opptegnet (i u mol pr. sek.) farge fremkaller hastighet (hvite kolonner) og bleke hastighet (skraverte kolonner) for henholdsvis 4-amino-antipyren/4-metylcatechol (venstre side), anilin (midtre) og m-anisidin (høyre side).

I fig. 2 er fargefremkallerhastighet (hvite kolonner) og blekehastighet (skraverte kolonner) uttrykt som forandring i absorbsjonskoeffesient pr. sekund, opptegnet for følg-ende indikatorer (fra venstre): catechol/4-aminoantipyren; 4-aminoantipyren; 3,5-diklor-2-hydroksybenzen sulfonsyre; fenyl; kromotrofsyre.

I fig. 3 er tilsynelatende glukosekonsentrasjon (mg/dl) opptegnet mot virkelig glukosekonsentrasjon (mg/dl). Den øvre kurve representerer standarden, den midtre kurve systemet 4-aminoantipyren/4-metylcatechol med 50 mg/dl askorbat og den nedre kurve systemet 2-amino-8-naftol-3,6-disulfonat med 50 mg/dl askorbat.

I den følgende beskrivelse er betegnelsene R, R' og R" anvendt for beskrivelse av forbindelsene som utgjør indikatoren for sammensetningen i henhold til oppfinnelsen. R omfatter H eller lavere alkyl. Med "lavere alkyl" menes en alkyl-gruppe som har 1 til ca. 6 karbonatomer. Omfattet er slike alkylgrupper som metyl, etyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, iso-butl, tert.-butyl, og forskjellige isomerer av pentyl og heksyl. Disse alkylgrupper kan være substituert eller usubstituert forutsatt at en spesiell substituent ikke for-styrrer ved påviselsen av glukose.

På lignende måte, henviser betegnelsen "aryl" til substitu-enter til 4-AAP strukturen som er aromatisk i oppbyggingen, dvs. som har et ringsystem kjennetegnet av benzen og sammen-smeltede ringsystemer kjennetegnet av fenantren, naftalen o.l. Som i tilfelle av lavere alkyl, omfatter aryl disse aromatiske grupper i deres substituerte og usubstituerte former forutsatt at en spesiell substituentgruppe ikke for-styrrer glukoseanalysereaksjonen.

Sammensetningen omfatter i tillegg til indikatoren, enzymene glukoseoksydase og peroksydase. Det foretrukne peroksydase-enzym er pepperrot peroksydase, skjønt andre også er virk-ningsfulle ved oppfinnelsen. Glukoseoksydase kan fås fra mycella av fungi slik som Aspergilli og Penicillia så vel som fra forskjellige kommersielle distributører.

Indikatoren er hovedbestanddelen i foreliggende oppfinnelse ved fremskaffelse av muligheter for et bredt konsentrasjonsområde som samtidig er upåvirkelig av ugunstige virkninger av askorbat på prøveresultatene. Den omfatter en blanding av forbindelser, en av disse er 4-AAP eller et derivat derav, og den andre er en 4-alkylcatechol.

En bærematrix blandet med den foreliggende sammensetning omfatter en innretning for fremskaffelse av et verktøy for oppnåelse av hurtig, pålitelige resultater ved glukoseanalyse. Bærematrix'en er vanligvis en porøs substans', slik som filterpapir. Andre substanser som er egnet som en bærematrix er filt, porøse kjeramiske strimler, revede eller sammenfiltrede glassfibre, tre, ratine materialer og leirholidge substanser. Et annet alternativ er en plastoverflate slik som polystyren-film på hvilken sammensetningen kan belegges ved anvendelse av egnede bindemidler. Alle slike bærematrix-materialer er egnede for anvendelse. Filterpapir har blitt funnet å være spesielt gunstig.

Ved dannelse av innretningen blir sammensetningen fremstilt som angitt i de etterfølgende eksempler og blir deretter blandet med den passende bærematrix. F.e'ks. hvor det som foretrukket matrix-materiale anvendes filterpapir, blir papiret neddyppet i en oppløsning av sammensetningen, fjernet og tørket. Papiret som bærer sammensetningen kan også

bli festet til en ende av en polystyrenstrimmel hvorved den andre enden tjener som et håndtak.

Innretningen anvendes ved å kontakte den med en prøve som mis-tenkes å inneholde.glukose. Ved anvendelse av strimler blir enden som bærer sammensetningen, neddyppet i prøven (f. eks. urin), fjernet og avlest med hensyn til en respons slik som en fargeforandring eller prosentvis absorbsjon (eller reflek-sjon) ved en bestemt bølgelengde. I tilfelle hvor tilsyne-komsten av eller forandring i farge er den påviselige respons, kan anvendes et sammenlignings fargekart for å oppnå en semi-kvantitativ analyse av glukosekonsentrasjon ved sammenligning av fargen fremkalt av innretningen med farge kort blokker, hvor hver av disse er fargefremkalt av innretningen med standard glukoseoppløsninger av forskjellige kjente konsentrasjoner .

I de fleste av de tidligere kjente "dypp-og-les" glukoseprøve-innretninger, anvendes reagenser som er egnet til å analysere i et konsentrasjonsområde fra 0 til 500 mg/dl. Den foreliggende oppfinnelse muliggjør analyse i et område i en størrel-sesorden større, dvs. 0-5000 mg/dl. Mens de tidligere kjente innretninger er følsomme for nævær av askorbat som ofte gir falske negative resultater, oppviser dessuten foreliggende sammensetning en uventet resistens mot askorbat. Disse fordeler muliggjør i et bredt område semi-kvantitative resultater som er pålitelige tross nærvær av askorbat i prøven.

En gunstig måte å feste det impregnerte papir til en bærer slik som en polystyrenstrimmel, er ved anvendelse av en dobbeltsidig klebetape. Filterpapiret kan festes til en side av tapen, laminatet tilpasses størrelsen, og anbringes på

en side av plaststrimmelen via den andre klebesiden av tapen.

De følgende eksempler er fremskaffet for ytterligere å lære gjenstand for foreliggende oppfinnelse.

Foretrukne utførelsesformer blir beskrevet og betydnings-fulle data blir presentert og analysert.

Eksempel 1.

Forskjellige indikatorer.

Et eksperiment ble utført for å undersøke forskjellige indikatorer, innbefattet den ifølge foreliggende oppfinnelse, for å bestemme (a) virkningene av askorbat på dens peroksyd-katalyserte oksydasjon og (b) de relative hastigheter av fargefremkalling. Dataene som er fremskaffet av eksperimentet viser at en indikator ifølge foreliggende oppfinnelse, 4-aminoantipyrin og 4-metylcatechol, er mange ganger bedre enn anilin og m-anisidin med hensyn til disse to forhold. Disse resultater er tydelig innlysende i fig. 1.

Ekvimolare mengder av indikatorene ble anvendt i separate reagensoppløsninger, indikatoren ifølge oppfinnelsen omfatter 4-AAP og 4-metylcatechol (4-MC) i ekvimolare mengder, summen svarer til like molare mengder av hver av de andre indikatorene. Hver sammensetning som ble fremstillet, inneholdt således de samme reagenser unntatt for indikatoren, og alle sammensetninger inneholder ekvimolare mengder av deres respektive indikatorer. Indikatorene som ble anvendt, er 4-AAP/4MP, anilin og m-anisidin. 3 1,0 ml kuvetter ble fylt med følgende ingredienser og konsentrasjoner i destillert vann til 1,25 ml oppløsning. 3 oppløsninger som inneholder de ovenfor angitte ingredienser ble fremstilt: Den første inneholder 4-AAP og 4-MC som indikatoren, hver forbindelse er tilstede i en konsentrasjon av 1,0 mM; den andre oppløsning inneholder anilin med 2,0 mM, og den tredje inneholder m-anisidin med 2,0

mM.

Hver oppløsning ble målt spektrofotometrisk etter tilsetning av tilstrekkelig H2^2 ^or ^ gjøre oppløsningen 2,0 mM i <H>2°2 °9 de resPektive hastigheter ved fargefremkalling ble målt pr. enhetstid over et 2 minutters intervall.

Etter måling av fargefremkalling i 2 minutter, fulgte til-setningen av peroksyd, tilstrekkelig askorbat ble tilsatt for å gjøre oppløsningen 0,5 mM med askorbat. Den resulterende blanding ble deretter målt fotometrisk med hensyn til hastighet ved avfarging på grunn av reduksjon av indikatoren av askorbat. Hastighetsdataene, uttrykt i umol/sek er som følgende:

Dataene er opptegnet i fig. 1. Som kan ses, viste 4-AAP/ 4-MC indikatorsystemet en hurtigere fargefremkallingshastig-het og en lavere askorbat avfargningshastighet enn hvilken som helst av anilin eller m-anisidin. Den uimotståelige konklusjon er at 4-AAP/4MC er betydelig mer resistent mot askorbatforstyrrelse og fremskaffer en pålitelig, bredom-rådet prøve for glukose.

Eksempel 2.

Forskjellige fenolkomplekser.

Et eksperiment ble utført for å sammenligne effektene av forskjellige fenolforbindelser på 4-AAP i nærvær av ^ 2Q2

og peroksydase. Dataene som ble oppnådd, er opptegnet i fig. 2 og viser at 4-MC, langt overskrider andre fenol-derivater i kontakt med 4-AAP ved å gi hurtigere fargefremkalling og minsker fargeblekning på grunn av den ugunstige effekt av askorbat.

4-AAP ble således oksydert av H2°2 og Peroksydase' enten alene eller med forskjellige fenolforbindelser, spesielt fenol, kromotrofsyre (CTA), 4-metylcatechol (foreliggende oppfinnelse) og 3,5-dikloro-2-hydroksybenzen sulfonsyre (DHSA). Hastigheten ved fargefremkalling ble studert fotometrisk ved en bølgelengde hvor den bestemte oksyderte indikatoren viste sterkest lysabsorbsjonskoeffesient. Hastigheten ved fargedannelsen ble målt og sammenlignet med hastigheten ved fargedannelse i fravær av fenol-forbindelsen. Dataene som ble oppnådd, ble normalisert ved å anta at hastigheten for fargedannelsen for 4-AAP alene er lik 1,00.

Til hver av 5 kuvetter ble tilsatt en vandig oppløsning

som inneholder 10 mM av 4-aminoantipyrin. Til 4 av kuvettene ble tilsatt tilstrekkelig fenolforbindelse for å bringe konsentrasjonen til 10 mM. Hver oppløsning var 0,311 M

med hensyn til citrat og hadde en pH på 5,0. Pepperrot peroksydase ble tilsatt for å gi konsentrasjon av 50 mg/pl til 1 (ag/ml, avhengig av enzymaktivitet. Deretter ble tilsatt H202 til en sluttkonsentrasjon av 10 mM. De relative hastigheter av fargefremkalling ble målt og de resulterende data ble normalisert til den samme enzymkonsentrasjon.

For hver analyse, når den optiske tetthet hadde nådd 0,6, ble askorbinsyre tilsatt hurtig for å gi en kuvettekonsentra-sjon av 200 |iM, og forandringen i lysabsorbs jon ble målt. Dataene fra eksperimentet er gitt i følgende tabell, og

er opptegnet i fig. 2.

Det er klart fra det ovenfor angitte, at 4-metylcatechol danner farge med aminoantipyrin mange ganger hurtigere enn noen av de andre koblere som er studert og at den oksyderte indikatorfarge er mer resistens mot bleking av askorbinsyre .

EKSEMPEL 3.

Fremstilling av prøveinnretning med 4-AAP/4-MC

og med 2-amino-8-naftol-3,6-disulfonsyre.

Et eksperiment ble utført hvor prøveinnretninger for måling av glukose ble fremstilt. Et sett av innretninger inneholdt som indikator 4-AAP og 4-MC, det andre 2-amino-8-naftol-3,6-disulfonsyre. Begge indikatorsystemer har omtrent den samme ekstinksjonskoeffesient.

En dyppe-oppløsning ble fremstilt inneholdende følgende ingredienser:

Et stykke av "Shatman 31ET" filterpapir ble dyppet i denne oppløsning og tørket ved 60°C i 15 minutter.

På lignende måte ble fremstilt et prøvepapir (innretning)

fra en identisk oppløsning med unntak av at 2,0 ml av 1

M 2-amino-8-naftol-3,6-disulfonsyre i etanol ble anvendt istedet for 4-AAP og 4-MC.

Begge innretninger ble kort neddyppet i glukoseoppløsninger av kjente konsentrasjoner, og inkubert i 60 sekunder. En andre serie av glukoseoppløsninger inneholdende 50 mg/dl askorbinsyre ble anvendt for å måle virkningene av askorbat.

Innretninger fra begge sett ble kalibrert ved dypping i

den askorbat-frie glukose, inkubering i 60 sekunder og måling av fargedannelse. Deretter ble innretningene studert i forbindelse med askorbat-inneholdende glukoseoppløsningene, ved anvendelse av den samme prosedyre. Resultatene er opp-ført nedenfor og opptegnet i fig. 3.

Resultatene angir klart forbedret askorbatresistens med aminoantipyrin/metylcatechol reagens strimmelen.

Claims (2)

1. Blanding for påvisning av nærvær og/eller bestemmelse av konsentrasjon av glukose i en prøve, omfattende glukoseoksydase, peroksydase og en indikator, egnet til å gi en påvirkelig respons i nærvær av peroksydase og H^ O^ r karakterisert ved at indikatoren er en blanding av to kompo- nenter, hvorav den ene har strukturen og den andre har strukturen i hvilke R er den samme eller forskjellig og betyr H eller alkyl med 1-6 karbonatomer, R<1> er aryl og R" er alkyl med 1-6 karbonatomer.
2. 2. Sammensetning i henhold til krav 1, karakterisert ved at forbindelsene er 4-aminoantipyrin og 4-metylcatechol.