NO164479B

NO164479B - ANALOGUE PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF THERAPEUTICALLY ACTIVE PEPTID RELATIONS.

Info

Publication number: NO164479B
Application number: NO883008A
Authority: NO
Inventors: Ole Didrik Laerum
Original assignee: Nycomed As
Priority date: 1986-11-06
Filing date: 1988-07-05
Publication date: 1990-07-02
Also published as: DK369888D0; DK171992B1; DK369888A; NO883008L; NO164479C; NO883008D0

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for The present invention relates to a method for

fremstilling av nye peptider med en stimulerende effekt på bloddannelsen (hemopoiesen). production of new peptides with a stimulating effect on blood formation (haemopoiesis).

Benmargcellene skriver seg fra pluripotente stamceller som modner for å danne en kompleks populasjon av morfologisk distinkte celler, nemlig megakariocytter, erytrocytter, The bone marrow cells derive from pluripotent stem cells that mature to form a complex population of morphologically distinct cells, namely megakaryocytes, erythrocytes,

granulocytter og lymfocytter. Bare ca. 10% av stamcellene er under celledeling til enhver tid. I en initial fase av modningen blir hver av de prolifererende stamceller "committed" til bestemt morfologisk distinkt form som tilslutt fører til en av de ovennevnte fire modne celletyper. Mens cellene prolifererer, granulocytes and lymphocytes. Only approx. 10% of stem cells are undergoing cell division at any given time. In an initial phase of maturation, each of the proliferating stem cells is "committed" to a certain morphologically distinct form which eventually leads to one of the above-mentioned four mature cell types. As the cells proliferate,

taper de gradvis evnen til ytterligere proliferasjon, og de modne cellene, for eksempel erytrocytter eller granulocytter, they gradually lose the ability to further proliferate, and the mature cells, for example erythrocytes or granulocytes,

kan ikke lenger inngå deling. Siden modne celler kontinuerlig dør, er det følgelig vesentlig at proliferasjonsevnen av de mindre modne celler, særlig stamcellene "committed" for margdannelse, opprettholdes. can no longer enter into division. Since mature cells continuously die, it is consequently essential that the proliferation capacity of the less mature cells, especially the stem cells "committed" to marrow formation, is maintained.

Vi har nå funnet en gruppe av nye peptider som er i stand We have now found a group of new peptides that are capable of

til å stimulere proliferasjonen av margdannende stamceller. to stimulate the proliferation of myeloid stem cells.

I henhold til oppfinnelsen, fremstilles således forbindelser According to the invention, compounds are thus produced

med formel (I): with formula (I):

hvor samtlige aminosyre-enheter har L-konfigurasjon, where all amino acid units have L configuration,

A utgjør A constitutes

eller et hydrogenatom; B utgjør or a hydrogen atom; B constitutes

eller en hydroksygruppe; or a hydroxy group;

n og m utgjør uavhengig av hverandre heltallene 1 eller 2; a og b utgjør uavhengig av hverandre heltallene 0 eller 1; R, R' og R" utgjør uavhengig av hverandre en hydroksygruppe eller en aminogruppe; og de fysiologisk akseptable salter derav under den forutsetning at når A og B utgjør henholdsvis et hydrogenatom og en hydroksygruppe, b ikke kan være 0. n and m are independently the integers 1 or 2; a and b independently constitute the integers 0 or 1; R, R' and R" independently constitute a hydroxy group or an amino group; and the physiologically acceptable salts thereof under the condition that when A and B constitute respectively a hydrogen atom and a hydroxy group, b cannot be 0.

Forbindelsene med formel (I) er således symmetriske dimerer. The compounds of formula (I) are thus symmetrical dimers.

Når A utgjør en glutaminrest eller en prolinrest, er det å foretrekke at a=b=l, n=2 m=l, R og R' utgjør hydroksygrupper og B utgjør en lysinrest. When A constitutes a glutamine residue or a proline residue, it is preferred that a=b=1, n=2 m=1, R and R' constitute hydroxy groups and B constitutes a lysine residue.

Når B utgjør en argininrest, er det å foretrekke at A utgjør en pyroglutamatrest, a=b=l, n=2, m=l og R og R' utgjør hydroksygrupper. When B forms an arginine residue, it is preferred that A forms a pyroglutamate residue, a=b=1, n=2, m=1 and R and R' form hydroxy groups.

En foretrukket gruppe av forbindelser er slike hvor b=l, m=l og R, R' og R" utgjør hydroksygrupper. A preferred group of compounds are those where b=1, m=1 and R, R' and R" constitute hydroxy groups.

Spesielt foretrukne forbindelser fremstilt i henhold til oppfinnelsen er som følger (under bruk av konvensjonell biokjemisk notasjon for aminosyrene og ved å lese fra N-enden): Particularly preferred compounds prepared according to the invention are as follows (using conventional biochemical notation for the amino acids and reading from the N-terminus):

En annen spesielt foretrukket forbindelse er (pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys)2 dvs. den forbindelse hvori a=b=l, m=l, n=2, R og R' utgjør hydroksygrupper, A utgjør en pyroglutamatrest og B utgjør en lysinrest. Another particularly preferred compound is (pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys)2, i.e. the compound in which a=b=1, m=1, n=2, R and R' form hydroxy groups, A forms a pyroglutamate residue and B constitutes a lysine residue.

Fysiologisk akseptable salter av peptidene fremstilt i henhold til oppfinnelsen innbefatter syreaddisjonssalter, så som hydrokloridet, hydrobromidet, sulfatet, etc, samt salter med baser så som alkalimetallsalter, f.eks. natrium- eller kaliumsalter, jordalkalimetallsalter, f.eks. kalsiumsaltet, eller aminsalter. Physiologically acceptable salts of the peptides prepared according to the invention include acid addition salts, such as the hydrochloride, hydrobromide, sulfate, etc., as well as salts with bases such as alkali metal salts, e.g. sodium or potassium salts, alkaline earth metal salts, e.g. the calcium salt, or amine salts.

Noen av forbindelsene med formel (I) er dimerer av forbindelsene beskrevet og krevet beskyttet i vår Europeiske patentsøknad nr. 83.307210.1. Denne siste søknad angår en liten gruppe hemoregulerende peptider som har en hemmende effekt på granulopoiesen. Some of the compounds of formula (I) are dimers of the compounds described and claimed to be protected in our European Patent Application No. 83.307210.1. This last application concerns a small group of haemoregulatory peptides which have an inhibitory effect on granulopoiesis.

Som følge av de ytterst små mengder som er tilgjengelig av den naturlige granulopoiese-faktor, har strukturen av den naturlige substans aldri blitt bestemt. Den er aldri oppnådd i krystallinsk eller helt ren form, og det er ikke kjent hvorvidt dette kunne oppnås ved kun å benytte materiale fra naturlige kilder. Det er postulert at faktoren har strukturen pyroGlu-Asp-Asp-Cys-LysOH, men, som meddelt i vår ovennevnte Europeiske patentsøknad, har den syntetiske forbindelse med denne struktur vist seg å være inaktiv. Man har registrert at når den naturlige granulopoiese-hemmende faktor utsettes for oksyderende betingelser, dannes en forbindelse med stimulerende virkning. Dette produkt er imidlertid heller aldri blitt isolert eller bestemt. Peptidene fremstilt i henhold til oppfinnelsen kan derimot oppnås i ren form egnet for farmasøytisk bruk og i relativt store mengder. Due to the extremely small amounts available of the natural granulopoiesis factor, the structure of the natural substance has never been determined. It has never been obtained in crystalline or completely pure form, and it is not known whether this could be achieved by using only material from natural sources. It has been postulated that the factor has the structure pyroGlu-Asp-Asp-Cys-LysOH, but, as disclosed in our above-mentioned European patent application, the synthetic compound with this structure has been shown to be inactive. It has been recorded that when the natural granulopoiesis-inhibiting factor is exposed to oxidizing conditions, a compound with a stimulating effect is formed. However, this product has also never been isolated or determined. The peptides produced according to the invention, on the other hand, can be obtained in a pure form suitable for pharmaceutical use and in relatively large quantities.

Det er også rapportert (Exp. Hematol. 12 7 (1981)) at når én av peptidene i vår ovennevnte Europeiske patentsøknad, nemlig pyroGlu-Glu-Asp-Cys-LysOH, utsettes for frysing og opptining, oppviser det en stimulerende virkning som kan reverseres ved behandling med merkaptoetanol. Det stimulerende produkt er imidlertid aldri oppnådd i ren form og strukturen aldri bestemt. It has also been reported (Exp. Hematol. 12 7 (1981)) that when one of the peptides in our above-mentioned European patent application, namely pyroGlu-Glu-Asp-Cys-LysOH, is subjected to freezing and thawing, it exhibits a stimulating effect which can is reversed by treatment with mercaptoethanol. However, the stimulating product has never been obtained in pure form and its structure never determined.

De nye forbindelsene er testet i kjemisk ren form med henblikk på in vitro og in vivo hemoregulerende virkninger. In vitro undersøkelser av margdannende stamceller fra både menneske og mus, har vist økning på opptil 1500% av koloni-dannelse på agar. Den stimulerende effekt inntrer i konsentrasjonsområdet 10~<13> til 10<-5>M. I in vivo undersøkelsene hos mus, har vi registrert at en enkelt injeksjon kan øke antallet margdannende stamceller med 50% i løpet av 48 timer, og ved kontinuerlig infusjon, ble antallet stamceller fordoblet på 13 dager. The new compounds have been tested in chemically pure form with a view to in vitro and in vivo haemoregulatory effects. In vitro studies of marrow-forming stem cells from both humans and mice have shown an increase of up to 1500% in colony formation on agar. The stimulating effect occurs in the concentration range 10~<13> to 10<-5>M. In the in vivo studies in mice, we have recorded that a single injection can increase the number of marrow-forming stem cells by 50% within 48 hours, and with continuous infusion, the number of stem cells was doubled in 13 days.

Forbindelsene er spesielt anvendelig for å stimulere margdannelse i pasienter som lider av nedsatt myelopoietisk aktivitet, innbefattet benmargsskade, agranulocytose og aplastisk anemi. Dette innbefatter behandling av pasienter med nedsatt benmargsfunksjon som følge av immunosuppresiv behandling for å undertrykke vevsreaksjoner, f.eks. ved benmargstrans-plantasjon. The compounds are particularly useful for stimulating myeloid formation in patients suffering from reduced myelopoietic activity, including bone marrow damage, agranulocytosis and aplastic anaemia. This includes treatment of patients with reduced bone marrow function as a result of immunosuppressive treatment to suppress tissue reactions, e.g. in bone marrow transplantation.

Forbindelsene kan også benyttes for å fremme hurtigere regenerering av benmarg etter cytostatisk kjemoterapi og bestrålingsterapi ved neoplastiske og virale sykdommer. The compounds can also be used to promote faster regeneration of bone marrow after cytostatic chemotherapy and radiation therapy in neoplastic and viral diseases.

De nye forbindelsene kan dessuten være av spesiell betydning for pasienter som har alvorlige infeksjoner som følge av manglende immunrespons etter benmargslidelse. The new compounds may also be of particular importance for patients who have serious infections as a result of a lack of immune response after bone marrow disease.

En annen klinisk anvendelse vil være i kombinasjon med de korresponderende monomerer eller beslektede myelopoiese-hemmere som beskrevet i vår ovennevnte Europeiske patentsøknad, for å indusere alternerende topper av høy og lav aktivitet i benmargcellene slik at den naturlige cirkadiske rytme av bloddannelsen forsterkes. På denne måte kan cytostatisk terapi gis i perioder med lav benmargsaktivitet og derved redusere risikoen for benmargsskade, mens regenereringen vil bli påskyndet av den påfølgende aktivitetstopp. Another clinical application would be in combination with the corresponding monomers or related myelopoiesis inhibitors as described in our above-mentioned European patent application, to induce alternating peaks of high and low activity in the bone marrow cells so that the natural circadian rhythm of blood formation is enhanced. In this way, cytostatic therapy can be given during periods of low bone marrow activity and thereby reduce the risk of bone marrow damage, while regeneration will be accelerated by the subsequent peak in activity.

Det skal bemerkes at der ikke er noen stimulerende effekt på celler av annet vev, spesielt tumorceller relatert til ikke-myelopoietisk vev. De nye forbindelsene stimulerer således selektivt det myelopoietiske system. It should be noted that there is no stimulatory effect on cells of other tissues, especially tumor cells related to non-myelopoietic tissues. The new compounds thus selectively stimulate the myelopoietic system.

Peptidene har ingen toksisitet av betydning. Dessuten er alle observerte hemotologiske virkninger reversible, og makroskopiske forandringer ble ikke registrert i de øvrige organer hos dyr som fikk peptidene injisert. The peptides have no significant toxicity. Moreover, all observed haematological effects are reversible, and macroscopic changes were not recorded in the other organs of animals injected with the peptides.

For å utøve en stimulerende virkning kan peptidene fremstilt i henhold til oppfinnelsen generelt gis til mennesker ved injeksjon i doseområdet 0,1-10 mg, for eksempel 1-5 mg, per 70 kg legemsvekt per dag. Ved administrasjon ved infusjon eller lignende teknikk, kan dosen ligge i området 30-300 mg per 70 kg legemsvekt, for eksempel ca. 100 mg, over en 6 dagers periode. Prinsipielt er det ønskelig å oppnå en konsentrasjon av In order to exert a stimulating effect, the peptides produced according to the invention can generally be given to humans by injection in the dose range of 0.1-10 mg, for example 1-5 mg, per 70 kg of body weight per day. When administered by infusion or a similar technique, the dose can be in the range of 30-300 mg per 70 kg body weight, for example approx. 100 mg, over a 6 day period. In principle, it is desirable to achieve a concentration of

peptidet på ca. 10_<13>M til 10-<5>M i pasientens ekstracellulære væske. the peptide of approx. 10_<13>M to 10-<5>M in the patient's extracellular fluid.

Farmasøytiske preparater kan inneholde én eller flere av Pharmaceutical preparations may contain one or more of

de nye forbindelser med formel (I), eller fysiologisk forlikelige salter derav, som virkestoff sammen med et farmasøytisk bære-eller hjelpestoff. Preparatene kan fremstilles i en form egnet for oral, nasal, parenteral eller rektal administrasjon. the new compounds of formula (I), or physiologically compatible salts thereof, as active ingredient together with a pharmaceutical carrier or auxiliary substance. The preparations can be prepared in a form suitable for oral, nasal, parenteral or rectal administration.

Uttrykket "farmasøytisk" innbefatter i denne sammenheng veterinære anvendelser av oppfinnelsen. The term "pharmaceutical" in this context includes veterinary applications of the invention.

Forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan fremstilles i konvensjonelle farmakologiske administrasjonsformer, så som The compounds prepared according to the invention can be prepared in conventional pharmacological administration forms, such as

tabletter, drasjerte tabletter, nasalspray, oppløsninger, emulsjoner, pulvere, kapsler eller retardformer. Konvensjonelle farmasøytiske hjelpestoffer og vanlige produksjonsmetoder kan benyttes for fremstilling av disse formene. Tabletter kan for eksempel fremstilles ved å blande virkestoffet eller virkestoffene med kjente hjelpestoffer, f.eks. med fortynningsmidler, så som kalsiumkarbonat, kalsiumfosfat eller laktose, sprengmidler så som maisstivelse eller alginsyre, bindemidler som stivelse eller gelatin, glattemidler som magnesiumstearat eller talkum, og/eller midler for å oppnå forsinket frigjøring, så som karboksypolymetylen, karboksymetylcellulose, celluloseacetat-ftalat eller polyvinylacetat. Tablettene kan eventuelt bestå av flere lag. Drasjerte tabletter kan fremstilles ved å overtrekke kjerner oppnådd på lignende måte som tablettene, med midler som vanligvis benyttes for tablettovertrekk, for eksempel polyvinylpyrrolidon eller skjell-lakk, gummi arabicum, talkum, titandioksyd eller sukker. For å oppnå forlenget frigjøring eller unngå uforlikelighet, tablets, coated tablets, nasal sprays, solutions, emulsions, powders, capsules or slow release forms. Conventional pharmaceutical excipients and usual production methods can be used for the production of these forms. Tablets can, for example, be prepared by mixing the active substance or substances with known excipients, e.g. with diluents, such as calcium carbonate, calcium phosphate or lactose, disintegrants such as corn starch or alginic acid, binding agents such as starch or gelatin, smoothing agents such as magnesium stearate or talc, and/or agents to achieve delayed release, such as carboxypolymethylene, carboxymethyl cellulose, cellulose acetate phthalate or polyvinyl acetate. The tablets may possibly consist of several layers. Coated tablets can be prepared by coating cores obtained in a similar manner to the tablets, with agents commonly used for tablet coating, for example polyvinylpyrrolidone or shellac, gum arabic, talc, titanium dioxide or sugar. To achieve extended release or avoid incompatibility,

kan også kjernen bestå av flere lag. Tablett-overtrekket kan også bestå av flere lag for å oppnå forsinket frigjøring, hvorunder de ovennevnte tablett-hjelpestoffer, kan benyttes. The core can also consist of several layers. The tablet coating can also consist of several layers to achieve delayed release, under which the above-mentioned tablet excipients can be used.

Organspesifikke bærersystemer kan også anvendes. Organ-specific carrier systems can also be used.

Injeksjonsoppløsninger kan for eksempel fremstilles på konvensjonell måte, så som ved tilsetning av konserveringsmidler, f.eks. p-hydroksybenzoater, eller stabilisatorer så som EDTA. Oppløsningene fylles deretter over i hetteglass eller ampuller. Injection solutions can, for example, be prepared in a conventional way, such as by adding preservatives, e.g. p-hydroxybenzoates, or stabilizers such as EDTA. The solutions are then filled into vials or ampoules.

Spray for nasal anvendelse kan på lignende måte tilberedes Spray for nasal application can be similarly prepared

i vandig oppløsning og anbringes i spray-beholdere enten med et aerosol-drivmiddel eller utstyres med anordninger for manuell komprimering. Kapsler som inneholder én eller flere virkestoffer kan for eksempel fremstilles ved å blande virkestoffene med inerte bæremidler, så som laktose eller sorbitol, og fylle blandingen over i gelatinkapsler. Egnede suppositorier kan for eksempel fremstilles ved å blande virkestoffet eller virkestoff-kombinasjonene med konvensjonelle bærere for dette formål, så som naturlige fett eller polyetylenglykol eller derivater derav. in aqueous solution and placed in spray containers either with an aerosol propellant or equipped with devices for manual compression. Capsules containing one or more active ingredients can, for example, be prepared by mixing the active ingredients with inert carriers, such as lactose or sorbitol, and filling the mixture into gelatin capsules. Suitable suppositories can, for example, be prepared by mixing the active substance or combinations of active substances with conventional carriers for this purpose, such as natural fats or polyethylene glycol or derivatives thereof.

Doseringsenheter som inneholder de nye forbindelsene kan fortrinnsvis inneholde 0,1-10 mg, for eksempel .1-5 mg av peptidet (I) eller salter derav. Dosage units containing the new compounds may preferably contain 0.1-10 mg, for example .1-5 mg of the peptide (I) or salts thereof.

Man kan stimulere benmargsdannelse ved å gi pasienten en effektiv mengde av et farmasøytisk preparat inneholdende de nye forbindelser. One can stimulate bone marrow formation by giving the patient an effective amount of a pharmaceutical preparation containing the new compounds.

De nye peptider kan også anvendes for fremstilling av materiale for immunologisk bestemmelsesteknikk. Peptidene kan da kovalent knyttes til en passende høymolekylær bærer, så som albumin, polylysin eller polyprolin for å injiseres i antistoff-produserende dyr (f.eks. kaniner, marsvin eller geiter). In vitro immuniseringsteknikk kan også benyttes. Antisera av høy spesifisitet oppnås ved å benytte velkjent absorbsjonsteknikk under bruk av høymolekylære bærere. Ved å introdusere radio-aktivitet (3H, 14C, <35>S) i peptidmolekylet, kan radioimmuno-assay lett utvikles og benyttes for å bestemme peptidet i forskjellige biologiske væsker som serum (plasma), urin og cerebrospinalvæske. The new peptides can also be used for the production of material for immunological determination techniques. The peptides can then be covalently linked to a suitable high molecular weight carrier such as albumin, polylysine or polyproline to be injected into antibody producing animals (eg rabbits, guinea pigs or goats). In vitro immunization techniques can also be used. Antisera of high specificity are obtained by using well-known absorption techniques using high molecular weight carriers. By introducing radioactivity (3H, 14C, <35>S) into the peptide molecule, a radioimmunoassay can be easily developed and used to determine the peptide in various biological fluids such as serum (plasma), urine and cerebrospinal fluid.

Peptidene kan i henhold til oppfinnelsen syntetiseres som følger: Generelt, vil forekommende reaktive sidekjede-grupper (amino, tiol og/eller karboksyl) måtte beskyttes under total-syntesens koblingsreaksjoner, og slutt-trinnet vil dermed bestå i å avspalte disse fra et beskyttet derivat med formel (I). Vanligvis vil samtlige -COOH-grupper, samtlige -NH2-grupper og According to the invention, the peptides can be synthesized as follows: In general, occurring reactive side chain groups (amino, thiol and/or carboxyl) will have to be protected during the coupling reactions of the total synthesis, and the final step will thus consist of cleaving these from a protected derivative with formula (I). Generally, all -COOH groups, all -NH2 groups and

-NH-grupper av pyroglutamyl- eller prolinresten bli beskyttet. Slike beskyttede former av peptidene har den generelle formel -NH groups of the pyroglutamyl or proline residue be protected. Such protected forms of the peptides have the general formula

(II) (II)

hvor A utgjør et hydrogenatom eller en amin-beskyttende gruppe; where A constitutes a hydrogen atom or an amine protecting group;

en hydroksygruppe eller en karboksyl-blokkerende gruppe; a hydroxy group or a carboxyl blocking group;

n og m utgjør uavhengig av hverandre heltallene 1 eller 2; n and m are independently the integers 1 or 2;

a og b utgjør uavhengig av hverandre heltallene 0 eller 1; a and b independently constitute the integers 0 or 1;

R1, R<2>, R8 og R<10> er amino, hydroksy, beskyttet amino eller karboksyl-beskyttende grupper; R1, R<2>, R8 and R<10> are amino, hydroxy, protected amino or carboxyl protecting groups;

R3, R4, R5, R6, R<7> og R<9> er hydrogenatomer eller amin-beskyttende grupper; R3, R4, R5, R6, R<7> and R<9> are hydrogen atoms or amine protecting groups;

under den forutsetning at når A utgjør et hydrogenatom eller en amin-beskyttende gruppe og B utgjør en hydroksygruppe eller en karboksyl-blokkerende gruppe, da kan b ikke være 0. under the proviso that when A constitutes a hydrogen atom or an amine-protecting group and B constitutes a hydroxy group or a carboxyl-blocking group, then b cannot be 0.

Generelt, kan de beskyttede derivatene med formel (II) fremstilles ved hjelp av teknikk egnet for peptidsyntese. In general, the protected derivatives of formula (II) can be prepared by techniques suitable for peptide synthesis.

En mulig syntesevei benytter cystin og kobler dette til de øvrige aminosyrerester slik at de to identiske kjedene av dimeret bygges opp og sammenkobles via den disulfid-binding som allerede forefinnes i cystin. En alternativ strategi består i å syntetisere den korresponderende monomere forbindelse i S-beskyttet form, ved å benytte S-beskyttet cystein, fjerne den S-beskyttende gruppe og foreta dimerisering. Det er mulig å benytte S-beskyttende grupper som kan fjernes ved hjelp av oksydasjonsmidler som danner en disulfid-binding direkte i det trinn hvor beskyttelsesgruppen avspaltes. Således kan for eksempel tritylgrupper fjernes selektivt med jod, fortrinnsvis i et egnet oppløsningsmiddel så som dimetylformamid. Slik dimerisering kan foretas på den C- og N-beskyttede monomer, etterfulgt av fjerning av de C- og N-beskyttende grupper, eller kan utføres som det avsluttende syntesetrinn ved å benytte en monomer med formel (III) A possible synthesis route uses cystine and connects this to the other amino acid residues so that the two identical chains of the dimer are built up and connected via the disulphide bond that is already present in cystine. An alternative strategy consists in synthesizing the corresponding monomeric compound in S-protected form, using S-protected cysteine, removing the S-protecting group and performing dimerization. It is possible to use S-protecting groups that can be removed by means of oxidizing agents that form a disulphide bond directly in the step where the protecting group is removed. Thus, for example, trityl groups can be selectively removed with iodine, preferably in a suitable solvent such as dimethylformamide. Such dimerization can be carried out on the C- and N-protected monomer, followed by removal of the C- and N-protecting groups, or can be carried out as the final synthesis step by using a monomer of formula (III)

hvor A, B, n, m, a, b, R og R' er som ovenfor definert og R" er et hydrogenatom eller en tiol-beskyttende gruppe som kan fjernes under oksyderende betingelser. where A, B, n, m, a, b, R and R' are as defined above and R" is a hydrogen atom or a thiol protecting group which can be removed under oxidizing conditions.

Ved oppbygging av peptidkjedene, kan man prinsipielt When building up the peptide chains, one can in principle

starte i C-enden eller N-enden selv om kun metoder hvor det startes i C-enden er i vanlig bruk. start at the C-end or the N-end, although only methods where it starts at the C-end are in common use.

Man kan således starte i C-enden ved å omsette et passende beskyttet derivat av for eksempel lysin med et passende beskyttet derivat av cystein eller cystin. Lysinderivatet vil ha en fri a-aminogruppe mens den andre reaktanten vil ha enten en fri eller aktivert karboksylgruppe og en beskyttet aminogruppe. Etter kobling kan mellomproduktet renses, for eksempel ved kromatografi, og deretter selektivt befris for N-beskyttelsen for å muliggjøre addisjon av ytterligere en aminosyrerest. One can thus start at the C-end by reacting a suitable protected derivative of, for example, lysine with a suitable protected derivative of cysteine or cystine. The lysine derivative will have a free α-amino group while the other reactant will have either a free or activated carboxyl group and a protected amino group. After coupling, the intermediate can be purified, for example by chromatography, and then selectively deprotected to allow the addition of a further amino acid residue.

Denne fremgangsmåte fortsettes inntil den nødvendige aminosyre-sekvens er fullført. This procedure is continued until the required amino acid sequence is completed.

Karboksylsyre-aktiverende substituenter som kan benyttes innbefatter for eksempel symmetriske eller blandede anhydrider eller aktiverte estere så som p-nitrofenylester, 2,4,5-triklor-fenylester, N-hydroksybenzotriazolester (OBt) eller N-hydroksy-succinimidylester (OSu). Carboxylic acid-activating substituents which can be used include, for example, symmetrical or mixed anhydrides or activated esters such as p-nitrophenyl ester, 2,4,5-trichloro-phenyl ester, N-hydroxybenzotriazole ester (OBt) or N-hydroxy-succinimidyl ester (OSu).

Koblingen av frie amino- og karboksylgrupper kan for eksempel utføres ved å benytte dicykloheksylkarbodiimid (DCC). Et annet koblingsmiddel som for eksempel kan benyttes er N-etoksykarbonyl-2-etoksy-l,2-dihydrokinolin. The coupling of free amino and carboxyl groups can be carried out, for example, by using dicyclohexylcarbodiimide (DCC). Another coupling agent that can be used, for example, is N-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroquinoline.

I alminnelighet er det hensiktsmessig å foreta koblings-reaksjonene ved lave temperaturer, for eksempel ved -20°C In general, it is appropriate to carry out the coupling reactions at low temperatures, for example at -20°C

opptil romtemperatur, hensiktsmessig i et egnet oppløsnings-middelsystem, for eksempel i tetrahydrofuran, dioksan, dimetylformamid, metylenklorid eller en blanding av disse oppløsnings-midlene. up to room temperature, suitably in a suitable solvent system, for example in tetrahydrofuran, dioxane, dimethylformamide, methylene chloride or a mixture of these solvents.

Det kan være mer hensiktsmessig å foreta syntesen i fast fase på en resin-bærer. Klormetylert polystyren (kryssbundet med 1% divinylbenzen) er en anvendelig bærertype. I dette tilfelle vil syntesen starte i C-enden, for eksempel ved å It may be more appropriate to carry out the synthesis in solid phase on a resin carrier. Chloromethylated polystyrene (cross-linked with 1% divinylbenzene) is a useful carrier type. In this case, the synthesis will start at the C-end, for example by

koble N-beskyttet lysin til bæreren. link N-protected lysine to the carrier.

En rekke egnede fastfase-teknikker er beskrevet av Eric Atherton, Christopher J. Logan og Robert C. Sheppard, J. Chem. Soc., Perkin I, 538-46 (1981); James P. Tam, Foe S. Tjoeng og A number of suitable solid phase techniques are described by Eric Atherton, Christopher J. Logan and Robert C. Sheppard, J. Chem. Soc., Perkin I, 538-46 (1981); James P. Tam, Foe S. Tjoeng and

R. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 102. 6117-27 (1980); James P. Tam, Richard D. Dimarchi & R. B. Merrifield, Int. J. Peptide R.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 102. 6117-27 (1980); James P. Tam, Richard D. Dimarchi & R.B. Merrifield, Int. J. Peptide

Protein Res 16, 412-2 5 (1980); Manfred Mutter & Dieter Bellof, Helvetica Chimica Acta, 67, 2009-16 (1984). Protein Res 16, 412-25 (1980); Manfred Mutter & Dieter Bellof, Helvetica Chimica Acta, 67, 2009-16 (1984).

Et bredt utvalg av beskyttende grupper for aminosyrer er kjent og eksempler finnes i Schroder E. & Liibke, K. , The Peptides, Vol. 1 og 2, Academic Press, New York og London, 1965 og 1966; Pettit, G.R., Synthetic Peptides, Vol. 1-4, Van Nostrand, Reinhold, New York 1970, 1971, 1975 og 1976; Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Synthese von Peptiden, Bd. 15, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974; Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 4-8, The Chemical Society, London 1972, 1974, 1975 og 1976; Peptides, Synthesis-physical data 1-6, Wolfgang Voelter, Eric Schmidt-Siegman, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, NY. 1983; The Peptides, Analysis, synthesis, biology 1-7, Ed: Erhard Gross, Johannes Meienhofer, Academic Press, NY. San Fransisco, London; Solid phase peptide synthesis 2.utg. John M. Stewart, Janis D. Young, Pierce Chemical Company. A wide variety of protecting groups for amino acids are known and examples are found in Schroder E. & Liibke, K., The Peptides, Vol. 1 and 2, Academic Press, New York and London, 1965 and 1966; Pettit, G.R., Synthetic Peptides, Vol. 1-4, Van Nostrand, Reinhold, New York 1970, 1971, 1975 and 1976; Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Synthese von Peptiden, Vol. 15, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974; Amino Acids, Peptides and Proteins, Vols 4-8, The Chemical Society, London 1972, 1974, 1975 and 1976; Peptides, Synthesis-physical data 1-6, Wolfgang Voelter, Eric Schmidt-Siegman, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, NY. 1983; The Peptides, Analysis, synthesis, biology 1-7, Ed: Erhard Gross, Johannes Meienhofer, Academic Press, NY. San Francisco, London; Solid phase peptide synthesis 2nd ed. John M. Stewart, Janis D. Young, Pierce Chemical Company.

Amin-beskyttende grupper som kan anvendes innbefatter således for eksempel slike beskyttelsesgrupper som karbobenzoksy (heretter også betegnet Z), t-butoksykarbonyl (heretter også betegnet Boe), 4-metoksy-2,3,6-trimetylbenzensulfonyl (heretter også betegnet (Mtr) og 9-fluorenylmetoksykarbonyl (heretter også betegnet Fmoc). Det er klart at når peptidet bygges opp fra C-enden, vil det være en amin-beskyttende gruppe på a-aminogruppen i hver ny rest som tilkobles og som må fjernes selektivt før det neste koblingstrinn. En spesielt egnet gruppe for denne midlertidige amin-beskyttelse er Fmoc-gruppen som kan fjernes selektivt ved behandling med piperidin i et organisk oppløsningsmiddel. Amine-protecting groups that can be used thus include, for example, such protecting groups as carbobenzoxy (hereinafter also designated Z), t-butoxycarbonyl (hereinafter also designated Boe), 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl (hereinafter also designated (Mtr) and 9-fluorenylmethoxycarbonyl (hereafter also referred to as Fmoc). It is clear that when the peptide is built up from the C-terminus, there will be an amine-protecting group on the α-amino group of each new residue that is attached and that must be selectively removed before the next coupling step A particularly suitable group for this temporary amine protection is the Fmoc group which can be selectively removed by treatment with piperidine in an organic solvent.

Karboksyl-beskyttende grupper som for eksempel kan anvendes innbefatter lett avspaltbare estergrupper, så som benzyl (Bzl), p-nitrobenzyl (ONb), pentaklorfenyl (OPC1P), pentafluorfenyl (OPFP) eller t-butyl (OtBu) grupper, samt koblingsgruppene på faste bærere, for eksempel metylgrupper bundet til polystyren. Carboxyl-protecting groups which can for example be used include easily cleavable ester groups, such as benzyl (Bzl), p-nitrobenzyl (ONb), pentachlorophenyl (OPC1P), pentafluorophenyl (OPFP) or t-butyl (OtBu) groups, as well as the linking groups on fixed carriers, for example methyl groups bound to polystyrene.

Tiol-beskyttende grupper innbefatter p-metoksybenzyl (Mob), trityl (Trt) og acetamidometyl (Acm). Thiol protecting groups include p-methoxybenzyl (Mob), trityl (Trt) and acetamidomethyl (Acm).

Dessuten forekommer et bredt område av andre slike grupper, som for eksempel mer utførlig beskrevet i de ovenfor nevnte litteraturreferanser, og bruken av samtlige slike grupper i de beskrevne fremgangsmåter faller innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse. In addition, there is a wide range of other such groups, which, for example, are described in more detail in the above-mentioned literature references, and the use of all such groups in the described methods falls within the scope of the present invention.

Et bredt utvalg av fremgangsmåter for å fjerne amin- og karboksyl-beskyttende grupper foreligger. Disse må imidlertid være i overensstemmelse med den valgte syntetiske strategi. Sidekjede-beskyttende grupper må være stabile overfor de betingelser som benyttes for å fjerne de midlertidge cx-amino-beskyttende grupper før neste koblingstrinn. A wide variety of methods for removing amine and carboxyl protecting groups are available. However, these must be in accordance with the chosen synthetic strategy. Side chain protecting groups must be stable against the conditions used to remove the temporary cx-amino protecting groups before the next coupling step.

Amin-beskyttende grupper så som Boe og karboksyl-beskyttende grupper så som tBu, kan fjernes samtidig ved syrebehandling, for eksempel med trifluoreddiksyre. Tiol-beskyttende grupper så som Trt, kan fjernes selektivt ved bruk av et oksydasjonsmiddel som jod. Amine protecting groups such as Boe and carboxyl protecting groups such as tBu can be removed simultaneously by acid treatment, for example with trifluoroacetic acid. Thiol-protecting groups such as Trt can be selectively removed using an oxidizing agent such as iodine.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen ytterligere. The following examples further illustrate the invention.

Oppløsningsmidler ble redestillert fra handelsprodukter og oppbevart på følgende måte: dimetylformamid (DMF) over molekylar-sikt 4Å, diklormetan (DCM) over CaCl2» trietylamin (TEA) over Na/Pb-legering (Baker) og trifluoreddiksyre (TFA) over molekylar-sikt 4Å. Solvents were redistilled from commercial products and stored as follows: dimethylformamide (DMF) over molecular sieve 4Å, dichloromethane (DCM) over CaCl2» triethylamine (TEA) over Na/Pb alloy (Baker) and trifluoroacetic acid (TFA) over molecular sieve 4 Å.

TLC-systemene var som følger: The TLC systems were as follows:

Sx: silika/CHCl3:MeOH (98:2) Sx: silica/CHCl3:MeOH (98:2)

S2: " " " (95:5) S2: " " " (95:5)

S3: silika RP 8/0,1% TFA i 5% EtOH (aq.). S3: silica RP 8/0.1% TFA in 5% EtOH (aq.).

De rensede sluttproduktene ble analysert ved omvendt-fase høytrykks væskekromatografi (HPLC). HPLC-systemet besto av en HP 1090M kromatograf med innbygget automatisk prøvetaker og en HP 1040 diode-array (Hewlett-Packard, Waldbronn, FRG), og en supelcosil LC-18 kolonne (250 x 4,6 mm, 5 p partikler). Prøver ble oppløst i 0,1% (vol./vol.) TFA (aq.) og eluert med en lineær gradient fra 0 til 30% acetonitril i 0,1% TFA (aq.). Strømningshastigheten var 2 ml/min. Eluenten ble målt ved The purified final products were analyzed by reversed-phase high-pressure liquid chromatography (HPLC). The HPLC system consisted of an HP 1090M chromatograph with built-in autosampler and an HP 1040 diode array (Hewlett-Packard, Waldbronn, FRG), and a supelcosil LC-18 column (250 x 4.6 mm, 5 p particles). Samples were dissolved in 0.1% (vol./vol.) TFA (aq.) and eluted with a linear gradient from 0 to 30% acetonitrile in 0.1% TFA (aq.). The flow rate was 2 ml/min. The eluent was measured at

214 nm med en båndbredde på 4 nm. Kromatogrammet for oppløsnings-midlet ble subtrahert elektronisk, og resultatene ble presentert i form av arealprosent. 214 nm with a bandwidth of 4 nm. The chromatogram for the solvent was subtracted electronically, and the results were presented in the form of area percentage.

Aminosyre-analyse: Amino acid analysis:

De cystin-holdige peptidene ble oksydert med permaursyre for å omdanne det syrelabile cystin-residuet til den syrestabile cysteinsyre, før sur hydrolyse i 6M HC1 ved 110°C i 16 timer. The cystine-containing peptides were oxidized with permauric acid to convert the acid-labile cystine residue to the acid-stable cysteic acid, before acid hydrolysis in 6M HCl at 110°C for 16 hours.

De tørre hydrolysatene ble deretter derivatisert ved bruk av fenylisotiocyanat og analysert som beskrevet av Heinrikson (Anal. Bioch. 136. 65-74, 1984). The dry hydrolysates were then derivatized using phenyl isothiocyanate and analyzed as described by Heinrikson (Anal. Bioch. 136. 65-74, 1984).

Eksempel 1 Example 1

fpGlu- Glu- Asp- Cys- Lys)o fpGlu- Glu- Asp- Cys- Lys)o

( Fmoc- Cys- Lvs( Nc- Boc)- OtBu)2 ^ : (Fmoc-Cys-Lvs(Nc-Boc)-OtBu)2 ^ :

2 g (2,275 mM) (Fmoc-Cys-OSu)2, 2,18 g (5,0 mM) Lys(Nc-Boc)-OtBu.HCl og 0,58 g (5 mM) N-etyl-morfolin ble oppløst i 2 g (2.275 mM) (Fmoc-Cys-OSu)2, 2.18 g (5.0 mM) Lys(Nc-Boc)-OtBu.HCl and 0.58 g (5 mM) N-ethyl-morpholine were dissolved in

7,5 ml DMF og omrørt ved romtemperatur i 3 timer. Reaksjons-blandingen ble inndampet til tørrhet under redusert trykk. Residuet ble oppløst i 50 ml CHCI3 og vasket med 3 x 12 ml 0,1N HC1 og 3 x 12 ml IM NaCl. Det organiske lag ble filtrert 7.5 ml DMF and stirred at room temperature for 3 hours. The reaction mixture was evaporated to dryness under reduced pressure. The residue was dissolved in 50 mL CHCl 3 and washed with 3 x 12 mL 0.1N HCl and 3 x 12 mL 1M NaCl. The organic layer was filtered

gjennom et faseseparasjons-papir (Whatman) og inndampet til tørrhet under redusert trykk. through a phase separation paper (Whatman) and evaporated to dryness under reduced pressure.

Råproduktet (3,32 g) ble omkrystallisert fra 5 ml varm The crude product (3.32 g) was recrystallized from 5 ml of hot

MeOH (15 timer), filtrert, vasket med MeOH og eter og lufttørket. Utbytte: 1,75 g (61%). Det hvite faststoff oppviste en hovedflekk (UV254+, Cl2/dikarboksidin+, ninhydrin-) på TLC (S^ Rf=0,667, S2: Rf=0,829). MeOH (15 h), filtered, washed with MeOH and ether and air dried. Yield: 1.75 g (61%). The white solid showed a major spot (UV254+, Cl2/dicarboxidine+, ninhydrin-) on TLC (S^ Rf=0.667, S2: Rf=0.829).

Cvs- Lys( Nc- Boc)- OtBu)o ( 2): Cvs- Lys( Nc- Boc)- OtBu)o ( 2):

1,5 g (1,19 mM) av forbindelse (1) ble oppløst i 10 ml 20% piperidin i DMF og omrørt ved romtemperatur i 30 minutter. TLC (S2) viste at alt utgangsmateriale var oppbrukt og bare ett nytt produkt (U<V>254~, Cl2/dikarbosidin+, ninhydrin+) var dannet. Oppløsningsmidlet ble inndampet under redusert trykk. Residuet ble oppløst i 20 ml eter og vasket med 2 x 3 ml 0,1N HC1 og 3 ml IM NaHCC^. Det organiske lag ble filtrert gjennom et faseseparasjons-papir og inndampet til tørrhet. 1.5 g (1.19 mM) of compound (1) was dissolved in 10 ml of 20% piperidine in DMF and stirred at room temperature for 30 minutes. TLC (S2) showed that all starting material was consumed and only one new product (U<V>254~, Cl2/dicarbosidin+, ninhydrin+) was formed. The solvent was evaporated under reduced pressure. The residue was dissolved in 20 ml of ether and washed with 2 x 3 ml of 0.1N HCl and 3 ml of 1M NaHCO3. The organic layer was filtered through a phase separation paper and evaporated to dryness.

Utbytte: 1,2 g. TLC oppviste bare én ninhydrin-positiv komponent (S2: Rf=0,216). Yield: 1.2 g. TLC showed only one ninhydrin-positive component (S2: Rf=0.216).

( Fmoc- Asp( P- OtBu)- Cvs- Lvs( Nc- Boc)- OtBu)2 f3^ ; (Fmoc-Asp(P-OtBu)-Cvs-Lvs(Nc-Boc)-OtBu)2 f3^ ;

Ca. 1,19 mM av forbindelsen (2) og 1,32 g (2,6 mM) Fmoc-Asp(P-OtBu)-OSu ble oppløst i 6 ml CH2C12 og omrørt ved romtemperatur i 2 timer. TLC (S^ viste at alt ninhydrin-positivt materiale var oppbrukt og at ett nytt hoved-UV254-positivt produkt var dannet. Etter inndampning ble residuet oppløst i 30 ml EtOAc, vasket med 4 x 10 ml IM NaCl, filtrert og inndampet som beskrevet for (1). Råproduktet ble oppløst i eter (2,5 ml) og utfelt som et halvkrystallinsk faststoff ved tilsetning av 4 ml n-heksan (kjøleskap 16 timer). Oppløsnings-midlet ble fradekantert, produktet vasket med 5 ml n-heksan og tørket under redusert trykk. About. 1.19 mM of compound (2) and 1.32 g (2.6 mM) of Fmoc-Asp(P-OtBu)-OSu were dissolved in 6 mL of CH 2 Cl 2 and stirred at room temperature for 2 hours. TLC (S^) showed that all ninhydrin-positive material was consumed and that one new major UV254-positive product had formed. After evaporation, the residue was dissolved in 30 mL EtOAc, washed with 4 x 10 mL IM NaCl, filtered, and evaporated as described for (1). The crude product was dissolved in ether (2.5 ml) and precipitated as a semi-crystalline solid by the addition of 4 ml n-hexane (refrigerator 16 hours). The solvent was decanted off, the product washed with 5 ml n-hexane and dried under reduced pressure.

Utbytte: 1,272 g (67%). TLC oppviste en hovedflekk (UV254+, Cl2/dikarboksidin+, ninhydrin-, S^ Rf=0,333, S2 :Rf=0 ,658) . Yield: 1.272 g (67%). TLC showed a main spot (UV254+, Cl2/dicarboxidine+, ninhydrin-, S1 Rf=0.333, S2:Rf=0.658).

( Asp( P- OtBu)- Cvs- Lys( Nc- Boc)- OtBu)2 ( 4>; ( Asp( P- OtBu)- Cvs- Lys( Nc- Boc)- OtBu)2 ( 4>;

1,0 g (0,62 mM) av forbindelse (3) ble oppløst i 5 ml 20% piperidin i CH2C12 og behandlet som beskrevet for (2). Utbytte: 0,469 g (65%). TLC oppviste bare en ninhydrin-positiv flekk (S2: Rf<=>0,22). 1.0 g (0.62 mM) of compound (3) was dissolved in 5 ml of 20% piperidine in CH 2 Cl 2 and treated as described for (2). Yield: 0.469 g (65%). TLC showed only one ninhydrin-positive spot (S2: Rf<=>0.22).

( Fmoc- Glu( - OtBu)- Asp( P- OtBu)- Cys- Lvs( Nc- Boc)- OtBu)2 ( 5): 0,469 g (0,407 mM) av forbindelse (4) og 0,47 g (0,90 mM) Fmoc-Glu( -OtBu)-OSu ble oppløst i 5 ml CH2C12 og omrørt ved romtemperatur i 15 timer. Opparbeidningen var som for (3). Utbytte: 0,62 g (77%). TLC oppviste en hovedflekk (UV254+, Cl2/dikarboksidin+, ninhydrin-, (S^ Rf=0,312, S2: Rf=0,536). ( Fmoc- Glu( - OtBu)- Asp( P- OtBu)- Cys- Lvs( Nc- Boc)- OtBu)2 ( 5): 0.469 g (0.407 mM) of compound (4) and 0.47 g (0 .90 mM) Fmoc-Glu(-OtBu)-OSu was dissolved in 5 ml CH 2 Cl 2 and stirred at room temperature for 15 h. Processing was as for (3). Yield: 0.62 g (77%). TLC showed a major spot (UV254+, Cl2/dicarboxidine+, ninhydrin-, (S^ Rf=0.312, S2: Rf=0.536).

( Glu( - OtBu)- Asp( P- OtBu)- Cys- Lvs( Ne- Boe)- OtBu)3 ( 6): ( Glu( - OtBu)- Asp( P- OtBu)- Cys- Lvs( Ne- Boe)- OtBu)3 ( 6):

0,50 g (0,25 mM) av forbindelse (5) ble oppløst i 2,5 ml 2 0% piperidin i CH2C12 og behandlet som beskrevet for (2). 0.50 g (0.25 mM) of compound (5) was dissolved in 2.5 ml of 20% piperidine in CH 2 Cl 2 and treated as described for (2).

TLC oppviste bare en ninhydrin-positiv flekk (S2: Rf=0,154). TLC showed only one ninhydrin-positive spot (S2: Rf=0.154).

( pGlu- Glu( - OtBu)- Asp( P- OtBu)- Cys- Lvs( Nc- Boc)- OtBu)2 ( 7): ( pGlu- Glu( - OtBu)- Asp( P- OtBu)- Cys- Lvs( Nc- Boc)- OtBu)2 ( 7):

Ca. 0,25 mM av forbindelse (6) og 0,206 g (0,546 mM) pGlu-0PC1P ble oppløst i 2,5 ml DMF og omrørt ved romtemperatur i 15 timer. Opparbeidningen var som for (3). About. 0.25 mM of compound (6) and 0.206 g (0.546 mM) of pGlu-0PC1P were dissolved in 2.5 ml of DMF and stirred at room temperature for 15 hours. Processing was as for (3).

Utbytte: 0,259 g (59%). TLC oppviste bare en flekk UV254_, ninhydrin- og Cl2/dikarboksidin+ (S2: Rf=0,117) og kun spor av urenheter. Yield: 0.259 g (59%). TLC showed only one spot UV254_, ninhydrin- and Cl2/dicarboxidine+ (S2: Rf=0.117) and only traces of impurities.

( pGlu- Glu- Asp- Cys- Lys)2 ( 8): ( pGlu- Glu- Asp- Cys- Lys)2 ( 8):

0,110 g (0,063 mM) av forbindelse (7) ble oppløst i 5 ml 80% TFA (CH2C12) og omrørt ved romtemperatur i 30 minutter. Oppløsningsmidlet ble fordampet og residuet oppløst i 4 ml H20 0.110 g (0.063 mM) of compound (7) was dissolved in 5 mL of 80% TFA (CH 2 Cl 2 ) and stirred at room temperature for 30 minutes. The solvent was evaporated and the residue dissolved in 4 mL of H 2 O

+ 2 ml CHCI3. Vannfasen ble vasket med 2 x 3 ml CHCI3 og inndampet til tørrhet under redusert trykk. Råproduktet (0,050 g) ble renset på en Lobar (A) RP 8 kolonne (Merck) under eluering med 0,1% TFA i 7,5 EtOH (aq.). Etter lyofilisering av produktet, ble det rekromatografert på den samme kolonnen under eluering med 0,1% TFA i 5% EtOH (aq.). Produktet ble lyofilisert. Utbytte: 0,016 g. Det ninhydrin*, Cl2/dikarboksidin+ og UV254-produkt var homogent ifølge TLC, (S3: Rf=0,436), og kun spor av urenheter ble påvist ved HPLC. + 2 mL CHCl 3 . The aqueous phase was washed with 2 x 3 ml of CHCl 3 and evaporated to dryness under reduced pressure. The crude product (0.050 g) was purified on a Lobar (A) RP 8 column (Merck) eluting with 0.1% TFA in 7.5 EtOH (aq.). After lyophilization of the product, it was rechromatographed on the same column eluting with 0.1% TFA in 5% EtOH (aq.). The product was lyophilized. Yield: 0.016 g. The ninhydrin*, Cl2/dicarboxidine+ and UV254 product was homogeneous by TLC, (S3: Rf=0.436), and only trace impurities were detected by HPLC.

Aminosyre-analyse: Asp (1,02), Glu (1,91), Cys (1,08), Lys (0,93). Amino acid analysis: Asp (1.02), Glu (1.91), Cys (1.08), Lys (0.93).

Eksempel 2 Example 2

(Cys-Lys)2, (9): (Cys-Lys)2, (9):

Forbindelse (2) fra Eksempel 1 ble oppløst i TFA og omrørt ved romtemperatur i 40 minutter. Oppløsningsmidlet ble fordampet under redusert trykk (30°C), og den vann-oppløselig del av residuet ble kromatografert på en Lobar (B) RP 8 kolonne (Merck) ved bruk av 0,1% TFA (aq.) i 5% EtOH (aq.) som mobil fase med UV220 deteksjon. Fraksjoner inneholdende det rene produkt (TLC) ble samlet og lyofilisert. Produktet var homogent ifølge TLC (S3: Rf=0,57) og ga positiv reaksjon med ninhydrin-og ingen UV254-absorbsjon. HPLC-analyse: 93,5% rent (areal). Aminosyre-analyse: Cys (1,01), Lys (0,99). Compound (2) from Example 1 was dissolved in TFA and stirred at room temperature for 40 minutes. The solvent was evaporated under reduced pressure (30°C), and the water-soluble portion of the residue was chromatographed on a Lobar (B) RP 8 column (Merck) using 0.1% TFA (aq.) in 5% EtOH (aq.) as mobile phase with UV220 detection. Fractions containing the pure product (TLC) were pooled and lyophilized. The product was homogeneous according to TLC (S3: Rf=0.57) and gave a positive reaction with ninhydrin and no UV254 absorption. HPLC analysis: 93.5% pure (area). Amino acid analysis: Cys (1.01), Lys (0.99).

Eksempel 3 Example 3

(Asp-Cys-Lys)2, (10): (Asp-Cys-Lys)2, (10):

Forbindelse (4) behandlet som beskrevet i Eksempel 2 (2% EtOH i mobil fase) ga forbindelse (10). Produktet var homogent ifølge TLC (S3: Rf=0,64) og ga positiv reaksjon med ninhydrin-og ingen UV254-absorbsjon. HPLC-analyse: 97,9% rent (areal). Aminosyre-analyse: Asp (0,99), Cys (1,03), Lys (0,98). Compound (4) treated as described in Example 2 (2% EtOH in mobile phase) gave compound (10). The product was homogeneous according to TLC (S3: Rf=0.64) and gave a positive reaction with ninhydrin and no UV254 absorption. HPLC analysis: 97.9% pure (area). Amino acid analysis: Asp (0.99), Cys (1.03), Lys (0.98).

Eksempel 4 Example 4

(Glu-Asp-Cys-Lys)2, (11) : (Glu-Asp-Cys-Lys)2, (11) :

Forbindelse (6), behandlet som beskrevet i Eksempel 2, ga forbindelse (11). Produktet var homogent ifølge TLC (S3: Rf=0,83) og ga positiv reaksjon med ninhydrin og ingen UV254-absorbsjon. HPLC-analyse: 100% rent (areal). Aminosyre-analyse: Asp (1,08), Cys (0,97), Glu (0,98), Lys (0,98). Compound (6), treated as described in Example 2, gave compound (11). The product was homogeneous according to TLC (S3: Rf=0.83) and gave a positive reaction with ninhydrin and no UV254 absorption. HPLC analysis: 100% pure (area). Amino acid analysis: Asp (1.08), Cys (0.97), Glu (0.98), Lys (0.98).

Eksempel 5 Example 5

(pGlu-Glu-Asp-Cys)2, (12): (pGlu-Glu-Asp-Cys)2, (12):

Forbindelse (12) ble syntetisert som monomer etter den kontinuerlig fastfase-peptidsyntese ved å benytte en Biolynx 4170 automatisk peptidsyntetisator (LKB) og DMF som oppløsnings-middel. Compound (12) was synthesized as monomer following the continuous solid phase peptide synthesis using a Biolynx 4170 automatic peptide synthesizer (LKB) and DMF as solvent.

Reagenser: FMOC-Cys(Trt)-SASRIN-RESIN (Bachem); Fmoc-Asp(P-OtBu)-OPFP; FM0C-Glu( -OtBu)-OPFP; pGlu-OPCLP; HOBT som katalysator. FMOC ble fjernet etter hvert koblingstrinn med 20% piperidin i DMF. Disulfidbroen og dermed dimeren ble dannet ved å behandle det fullstendig beskyttede peptid på den faste bærer med 0,1M jod (2-3 ekv.) i DMF i 15 minutter. Etter vasking med DMF ble peptidet løst fra den faste bærer og gjenværende beskyttelses-grupper fjernet i ett trinn ved behandling med 50% TFA i CH3C1 i 40 minutter. Resinet ble frafiltrert og filtratet inndampet til tørrhet under redusert trykk (30°C). Residuet ble oppløst i 0,1% TFA (aq.) og kromatografert på en Lobar (B) RP 8 kolonne ved bruk av 0,1% Reagents: FMOC-Cys(Trt)-SASRIN-RESIN (Bachem); Fmoc-Asp(P-OtBu)-OPFP; FMOC-Glu(-OtBu)-OPFP; pGlu-OPCLP; COPD as a catalyst. FMOC was removed after each coupling step with 20% piperidine in DMF. The disulfide bridge and thus the dimer was formed by treating the fully protected peptide on the solid support with 0.1 M iodine (2-3 equiv) in DMF for 15 min. After washing with DMF, the peptide was released from the solid support and residual protecting groups were removed in one step by treatment with 50% TFA in CH 3 Cl for 40 minutes. The resin was filtered off and the filtrate evaporated to dryness under reduced pressure (30°C). The residue was dissolved in 0.1% TFA (aq.) and chromatographed on a Lobar (B) RP 8 column using 0.1%

TFA (aq.) i 4% propan-2-ol (aq.) som mobil fase med UV22q deteksjon. Fraksjoner inneholdende rent produkt (HPLC) ble samlet og lyofilisert. Produktet ga ingen reaksjon med ninhydrin og ingen UV254-absorbsjon. HPLC-analyse: 96,9% rent (areal). Aminosyre-analyse: Asp (1,15), Cys (0,99), Glu (1,85). TFA (aq.) in 4% propan-2-ol (aq.) as mobile phase with UV22q detection. Fractions containing pure product (HPLC) were pooled and lyophilized. The product gave no reaction with ninhydrin and no UV254 absorption. HPLC analysis: 96.9% pure (area). Amino acid analysis: Asp (1.15), Cys (0.99), Glu (1.85).

Eksempel 6 Example 6

(pGlu-Glu-Cys-Lys)2 , (13): (pGlu-Glu-Cys-Lys)2 , (13):

Forbindelse (13) ble syntetisert og renset som beskrevet i Eksempel 5 ved bruk av de korresponderende aminosyrederivater. Reagenser ikke beskrevet tidligere: FMOC-Lys(Nc-BOC)-SASRIN-RESIN; FMOC-Cys(S-Trt)-OPFP. Produktet var homogent ifølge TLC (S3: Rf=0,49) og ga positiv reaksjon med ninhydrin og ingen UV254-absorbsjon. Compound (13) was synthesized and purified as described in Example 5 using the corresponding amino acid derivatives. Reagents not previously described: FMOC-Lys(Nc-BOC)-SASRIN-RESIN; FMOC-Cys(S-Trt)-OPFP. The product was homogeneous according to TLC (S3: Rf=0.49) and gave a positive reaction with ninhydrin and no UV254 absorption.

HPLC-analyse: 100% rent (areal). Aminosyre-analyse: Cys (1,01), Glu (1,98), Lys (1,01). HPLC analysis: 100% pure (area). Amino acid analysis: Cys (1.01), Glu (1.98), Lys (1.01).

Eksempel 7 Example 7

(pGlu-Asp-Cys-Lys)2, (14) : (pGlu-Asp-Cys-Lys)2, (14) :

Forbindelse (14) ble syntetisert og renset som beskrevet i Eksempel 5 ved bruk av de korresponderende aminosyrederivater. Produktet var homogent ifølge TLC (S3: Rf=0,55) og ga positiv reaksjon med ninhydrin og ingen UV254-absorbsjon. Compound (14) was synthesized and purified as described in Example 5 using the corresponding amino acid derivatives. The product was homogeneous according to TLC (S3: Rf=0.55) and gave a positive reaction with ninhydrin and no UV254 absorption.

HPLC-analyse: 97,5% rent (areal). Aminosyre-analyse: Asp (1,04), Cys (0,96), Glu (0,97), Lys (1,02). HPLC analysis: 97.5% pure (area). Amino acid analysis: Asp (1.04), Cys (0.96), Glu (0.97), Lys (1.02).

Eksempel 8 Example 8

(pGlu-Asp-Glu-Cys-Lys)2, (15): (pGlu-Asp-Glu-Cys-Lys)2, (15):

Forbindelse (15) ble syntetisert og renset som beskrevet i Eksempel 5 ved bruk av de korresponderende aminosyrederivater. Produktet var homogent ifølge TLC (S3: Rf=0,42) og ga positiv reaksjon med ninhydrin og ingen UV254~absorbsjon. Compound (15) was synthesized and purified as described in Example 5 using the corresponding amino acid derivatives. The product was homogeneous according to TLC (S3: Rf=0.42) and gave a positive reaction with ninhydrin and no UV254 absorption.

HPLC-analyse: Asp (1,03), Cys (0,96), Glu (2,09), Lys (0,94). HPLC analysis: Asp (1.03), Cys (0.96), Glu (2.09), Lys (0.94).

Eksempel 9 Example 9

(pGlu-Asp-Asp-Cys-Lys)2» (16): (pGlu-Asp-Asp-Cys-Lys)2" (16):

Forbindelse (16) ble syntetisert og renset som beskrevet i Eksempel 5 ved bruk av de korresponderende aminosyrederivater. Produktet var homogent ifølge TLC (S3: Rf=0,38) og ga positiv reaksjon med ninhydrin og ingen UV254~absorbsjon. Compound (16) was synthesized and purified as described in Example 5 using the corresponding amino acid derivatives. The product was homogeneous according to TLC (S3: Rf=0.38) and gave a positive reaction with ninhydrin and no UV254 absorption.

HPLC-analyse: 100% rent (areal). HPLC analysis: 100% pure (area).

Aminosyre-analyse: Asp (2,06), Cys (0,98), Glu (0,98), Lys (0,98) . Amino acid analysis: Asp (2.06), Cys (0.98), Glu (0.98), Lys (0.98).

Eksempel 10 Example 10

(pGlu-Glu-Glu-Cys-Lys)2 , (17): (pGlu-Glu-Glu-Cys-Lys)2 , (17):

Forbindelse (17) ble syntetisert og renset som beskrevet i Eksempel 5 ved bruk av de korresponderende aminosyrederivater. Produktet var homogent ifølge TLC (S3: Rf=0,39) og ga positiv reaksjon med ninhydrin og ingen UV254-absorbsjon. Compound (17) was synthesized and purified as described in Example 5 using the corresponding amino acid derivatives. The product was homogeneous according to TLC (S3: Rf=0.39) and gave a positive reaction with ninhydrin and no UV254 absorption.

HPLC-analyse: 99,9% rent (areal). Aminosyre-analyse: Cys (0,95), Glu (2 ,90) , Lys (1,15). HPLC analysis: 99.9% pure (area). Amino acid analysis: Cys (0.95), Glu (2.90), Lys (1.15).

Eksempel 11 Example 11

(pGlu-Glu-Asn-Cys-Lys)2 » (18). (pGlu-Glu-Asn-Cys-Lys)2 » (18).

Forbindelse (18) ble syntetisert og renset som beskrevet i Eksempel 5 ved bruk av de korresponderende aminosyrederivater. Reagenser ikke beskrevet tidligere: FMOC-Asn-OPFP. Produktet var homogent ifølge TLC (S3: Rf=0,42) og ga positiv reaksjon med ninhydrin og ingen UV254-absorbsjon. HPLC-analyse: 98,2% rent (areal). Aminosyre-analyse: Asx (1,1), Cys (1,03), Glu (1,9), Lys (0,96). Compound (18) was synthesized and purified as described in Example 5 using the corresponding amino acid derivatives. Reagents not previously described: FMOC-Asn-OPFP. The product was homogeneous according to TLC (S3: Rf=0.42) and gave a positive reaction with ninhydrin and no UV254 absorption. HPLC analysis: 98.2% pure (area). Amino acid analysis: Asx (1.1), Cys (1.03), Glu (1.9), Lys (0.96).

Eksempel 12 Example 12

(pGlu-Gln-Asp-Cys-Lys)2, (19: (pGlu-Gln-Asp-Cys-Lys)2, (19:

Forbindelse (19) ble syntetisert og renset som beskrevet i Eksempel 5 ved bruk av de korresponderende aminosyrederivater. Reagenser ikke beskrevet tidligere: FMOC-Gln-OPFP. Produktet var homogent ifølge TLC (S3: Rf=0,45) og ga positiv reaksjon med ninhydrin og ingen UV254-absorbsjon. HPLC-analyse: 98,3% rent (areal). Aminosyre-analyse: Asp (1,09), Cys (1,06), Glx (1,89), Lys (0,96). Compound (19) was synthesized and purified as described in Example 5 using the corresponding amino acid derivatives. Reagents not previously described: FMOC-Gln-OPFP. The product was homogeneous according to TLC (S3: Rf=0.45) and gave a positive reaction with ninhydrin and no UV254 absorption. HPLC analysis: 98.3% pure (area). Amino acid analysis: Asp (1.09), Cys (1.06), Glx (1.89), Lys (0.96).

Eksempel 13 Example 13

(pGlu-Glu-Asp-Cys-Arg)2. (20): (pGlu-Glu-Asp-Cys-Arg)2. (20):

Forbindelse (20) ble syntetiset og renset (5% propan-2-ol Compound (20) was synthesized and purified (5% propan-2-ol

i mobil fase) som beskrevet i Eksempel 5 ved bruk av de relevante aminosyrederivater. Den endelige fjerning av beskyttelsesgruppene ble utført i 10% tioanisol i TFA. in mobile phase) as described in Example 5 using the relevant amino acid derivatives. Final deprotection was performed in 10% thioanisole in TFA.

Reagenser ikke beskrevet tidligere: FMOC-Arg(Mtr)-SASRIN-RESIN. Produktet ga ingen reaksjon med ninhydrin og ingen UV254-absorbsjon. Reagents not previously described: FMOC-Arg(Mtr)-SASRIN-RESIN. The product gave no reaction with ninhydrin and no UV254 absorption.

HPLC-analyse: 99,4% rent (areal). Aminosyre-analyse: Arg (0,92), Asp (1,12), Cys (1,00), Glu (1,96). HPLC analysis: 99.4% pure (area). Amino acid analysis: Arg (0.92), Asp (1.12), Cys (1.00), Glu (1.96).

Eksempel 14 Example 14

(Gln-Glu-Asp-Cys-Lys)2 , (21): (Gln-Glu-Asp-Cys-Lys)2 , (21):

Forbindelse (21) ble syntetisert og renset som beskrevet i Eksempel 5 ved bruk av de relevante aminosyrederivater. Produktet var homogent ifølge TLC (S3: Rf=0,57) og ga positiv reaksjon med ninhydrin og ingen UV254-absorbsjon. Compound (21) was synthesized and purified as described in Example 5 using the relevant amino acid derivatives. The product was homogeneous according to TLC (S3: Rf=0.57) and gave a positive reaction with ninhydrin and no UV254 absorption.

HPLC-analyse: 94,7% rent (areal). Aminosyre-analyse: Asp (1,00), Cys (1,01), Glx (2,02), Lys (0,96). HPLC analysis: 94.7% pure (area). Amino acid analysis: Asp (1.00), Cys (1.01), Glx (2.02), Lys (0.96).

Eksempel 15 Example 15

(Pro-Glu-Asp-Cys-Lys)2, (22): (Pro-Glu-Asp-Cys-Lys)2, (22):

Forbindelse (22) ble syntetisert og renset som beskrevet i Eksempel 5 ved bruk av de relevante aminosyrederivater. Produktet var homogent ifølge TLC (S3: Rf=0,57) og ga positiv reaksjon med ninhydrin og ingen UV254-absorbsjon. Compound (22) was synthesized and purified as described in Example 5 using the relevant amino acid derivatives. The product was homogeneous according to TLC (S3: Rf=0.57) and gave a positive reaction with ninhydrin and no UV254 absorption.

HPLC-analyse: 98,2% rent (areal). Aminosyre-analyse: Asp (1,06), Cys (1,01), Glu (0,99), Lys (0,99), Pro (0,96). HPLC analysis: 98.2% pure (area). Amino acid analysis: Asp (1.06), Cys (1.01), Glu (0.99), Lys (0.99), Pro (0.96).

Claims

1. Analogous method for the preparation of therapeutically active compounds of formula (I): where all amino acid units have L configuration, A constitutes or a hydrogen atom; B constitutes or a hydroxy group; n and m are independently the integers 1 or 2; a and b independently constitute the integers 0 or 1; R, R' and R" independently constitutes a hydroxy group or an amino group; and the physiologically acceptable salts thereof, under the condition that when A and B constitute a hydrogen atom and a hydroxy group respectively, B cannot be 0, characterized in that a) the protective groups are removed from a compound of formula (II) where A constitutes a hydrogen atom or an amine protecting group; B constitutes a hydroxy group or a carboxyl blocking group; n and m are independently the integers 1 or 2; a and b independently constitute the integers 0 or 1; R1, R<2>, R<8> and R<10> are amino, hydroxy, protected amino or carboxyl protecting groups; R3, R4, R5, R<6>, R<7> and R<9> are hydrogen atoms or amine protecting groups; under the condition that when A constitutes a hydrogen atom or an amine-protecting group and B constitutes a hydroxy group or a carboxyl-blocking group, then b cannot be 0, as the removal of the protective groups preferably takes place by acid hydrolysis, by hydrogenolysis, ammonolysis or enzymatically hydrolysis, or b) a compound of formula (III) where A, B, n, m, a, b, R and R' are as defined above and R" is a hydrogen atom or a thiol-protecting group which can be removed under oxidizing conditions, dimerized, and optionally the compound produced is converted into a physiologically acceptable salt.

2. Process according to claim 1 for the production of compounds which are characterized by the fact that corresponding starting materials are used.

3. Method according to claim 1 for producing the compound (pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys)2, characterized in that corresponding starting materials are used.