NO139522B - Fremgangsmaate til fremstilling av deoksyamino-glycosid-antibiotika - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår nye fremgangsmåter for fremstilling av deoksyaminoglycosid-antibiotika.

Hittil har aminoglycosid-antibiotika ofte vært anvendt

for behandling av infeksjoner som skyldes mikroorganismer. Ved anvendelsen av disse forbindelser har det imidlertid utviklet seg en rekke mikroorganismer som er resistente overfor nevnte antibiotika.

Det har i den senere tid vært rapporter som angir at deoksyaminoglycosid-antibiotika er effektive overfor disse aminoglycosidantibiotika-resistente mikroorganismer.

Med hensyn til dehydroksylering av aminoglycosid-antibi-

otika så angir Journal of Antibiotics 21, 613-616 (1972) at 3<1>,4'-dideoksyribostamycin kan syntetiseres ved at man tar ut-gangspunkt i ribostamycin og gjennomfører ni trinn, og man får maksimalt 15% totalt utbytte.

Journal of Antibiotics 24, 274-275 (1971) angir at 3'-deoksyanamycin kan fremstilles ved å omsette 6-azido-2,4-di-0-benzyl-3,6-dideoksy-a-D-glucopyranosylklorid med 6-0-(2-0-benzyl-3-deoksy-3-etoksykarbonylamid-4,6-0-isopropyliden-a-D-glucopyranosyl)-N-N'-dietoksykarbonyl-2-deoksystreptamin i et utbytte på ca. 25%.

I norsk patent 134.117 er det beskrevet at 3',4'-dideok-sykanamycin B kan syntetiseres, men denne fremgangsmåte angir at den ønskede forbindelse bare kan fremstilles i et utbytte på

maksimalt 20%.

Det fremgår således fra litteraturen at det totale ut-

bytte av de ovennevnte produkter vanligvis er langt lavere enn 25%.

Man har nå gjennomført omfattende studier for å finne en effektiv fremgangsmåte for dehydroksylering av aminoglycpsid-antibiotika, og dette har resultert i at man har oppdaget nye fremgangsmåter for en dehydroksylering av aminoglycosid-antibiotika.

Hensikten ved foreliggende oppfinnelse er å komme frem til en helt ny fremgangsmåte for fremstilling av deoksyamino-glycosid-antibiotika i høyt utbytte, og hvilke stoffer er meget effektive overfor aminoglycosidantibiotika-resistente mikroorganismer .

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveie-brakt en fremgangsmåte til fremstilling av deoksyaminoglycosid-antibiotika, og denne fremgangsmåte er kjennetegnet ved at man (a) beskytter funksjonelle grupper i et fosforylert aminoglycosid-antibiotikum med silyl- eller acylgrupper, idet det

fosforylerte aminoglycosid-antibiotikum har følgende struktur-elle konfigurasjon:

(i) fosfonoksygruppen er bundet til et sekundært karbonatom, (ii) nevnte karbonatom er bundet til et karbonatom som er bundet til en primær eller sekundær aminogruppe, og (iii) aminogruppen og fosfonoksygruppen har trans-konfigurasjon i forhold til hverandre, eller

det fosforylerte aminoglycosid-antibiotikum har en fosfonoksygruppe bundet til et primært karbonatom;

(b) halogenerer den således oppnådde forbindelse,

(c) reduserer den derved oppnådde forbindelse, mens man fjerner de beskyttende grupper ved å bringe den halogenerte eller hydrogenerte forbindelse i kontakt med et proton-avgivende middel.

Aminoglycosid-antibiotika omfatter antibiotika av neomycintypen som har sukkeret i 4- og/eller 5-stillingen(e) i 2-deoksystreptamin, slik som de såkalte neomyciner (f.eks. neomycin A, neomycin B, neomycin D, neomycin LPb, neomycin LPc), paromomyciner (f.eks. paromomycin I, paromomycin II), butiro-siner (f.eks..butirosin A, butirosin B), ribostamycin, xylostasin, lividomyciner (f.eks. lividomycin A, lividomycin B) eller av streptamin, slik som hybrimyciner (f.eks. hybrimycin A^, hybrimycin A.,, hybrimycin A3, hybrimycin B^ hybrimycin B2, hybrimycin B^) t aminoglycosid-antibiotika av kanamycintypen som har sukkeret i 4- og 6-stillingene i 2-deoksystreptamin, slik som kanamyciner (f.eks. kanamycin A, kanamycin B, kanamycin C), 3',4'-dideoksykanamycin B, gentamyciner (f.eks. gentamycin Cj, _a, gentamycin C^, gentamycin C^, gentamycin A, gentamycin B, gentamycin B^, gentamycin D), tobramycin, sisomycin, aminoglycosidantibiotika av streptomycintypen, slik som streptomyciner (f.eks. streptomycin, streptomycin B, dihydrostreptomycin), hydroksystrepto-mycin, bluensomycin, og andre aminoglycosid-antibiotika, slik som destomyciner (f.eks. destomycin A, destomycin B) og hygro-mycin B.

Begrepet "deoksyaminoglycosid-antibiotikum" innbefatter en forbindelse fremstilt ved å dehydroksylere utgangsforbindelsen, nemlig et aminoglycosid-antibiotikum. Det aminoglycosid-antibiotikum som man således starter med, innbefatter deoksyaminoglycosid-antibiotika som sådanne, f.eks. monodeoksyamino-glycosid-antibiotika, dideoksyaminoglycosid-antibiotika osv.

I foreliggende oppfinnelse blir fosforylerte aminoglycosid-antibiotika anvendt som utgangsmaterialer, og disse fremstilles ved å fosforylere aminoglycosid-antibiotika.

Fosforyleringen av aminoglycosid-antibiotika utføres f.eks. ved å kontakte aminoglycosid-antibiotikumet med et kulturmedium eller et bearbeidet materiale avledet fra et slikt medium, og som inneholder fosfotransferase fra en mikroorganisme som f.eks. hører til arten Pseudomonas aeruginosa eller Escherichia coli i nærvær av en fosfatdonor.

Typiske eksempler på nevnte mikroorganisme er Escherichia coli Ril (FERM-P 2123, ATCC-21990), Escherichia coli K12 Ml 1629 (Journal of Antibiotics, 21, nr. 1, 22-29 (1968)), Escherichia coli ML1401Rmg^+ (Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2, nr.

3, 142-146 (1972)), Escherichia col JR66/W677 (FEBS LETTERS 14, nr. 5, 293 (1971)) og Pseudomonas aeruginosa R34R (FERM-P nr. 2124) .

Den nevnte mikroorganisme blir dyrket i et kulturmedium som inneholder en karbonkilde, slik som glukose, sukrose eller oppløselig stivelse, en nitrogenkilde, slik som kjøttekstrakt, gjærekstrakt, maisekstraktvæske, aminosyrer, ammoniumsulfat, ammoniumnitrat og ammoniumklorid samt uorganiske forbindelser, slik som magnesiumklorid og natriumklorid..Dyrkingen gjennom-føres under statiske eller omrørte aerobe forhold. Temperaturen er i området 20-40°C, fortrinnsvis 28-37°C. pH i det brukte medium er 6-9, fortrinnsvis 6,8-7,8. Dyrkingstiden er 2-72 timer, fortrinnsvis 6-24 timer.

Den kulturmasse man således oppnår eller et bearbeidet materiale fra denne og som inneholder fosfotransferase, kan så brukes for en fosforylering av aminoglycosid-antibiotika. Det bearbeidede materiale vil ha en aktivitet med hensyn til fosforylering av aminoglycosid-antibiotika og kan fremstilles ved at man bearbeider kulturen med f.eks. filtrering, sentrifugering, lydbehandling eller nedbrytning ved såkalt fransk presse eller en enzymatisk behandling av kulturmassen...

Fosforyleringen utføres ved temperaturer på 15-80°C, fortrinnsvis 30-40°C og i pH-området 4-11, mer foretrukket 6-10, vanligvis i tidsrom fra 10 min. til 48 timer, fortrinnsvis i tidsrom på 1-48 timer. Konsentrasjonen av aminoglycosid-antibiotika-utgangsmaterialet i reaksjonssystemet er fortrinnsvis 0,01-100 mg/ml, og kulturmassen eller det bearbeidede materiale kan anvendes i mengder inneholdende 1-50 deler våt mycel/1000 volumdeler av reaksjonssystemet.

Reaksjonssystemet kan eventuelt tilsettes en fosfatdonor, en reaksjonsfremmende forbindelse foruten enzymstabiliserende forbindelser.

I visse tilfeller er det ikke nødvendig å tilsette en fosfatdonor ettersom cellene eller mycelet inneholder fosfor-forbindelser som kan virke som fosfatdonor.

Som fosfatdonor, kan man f.eks. anvende adenosintrifosfat, adenosindifosfat, deoksyadenosintrifosfat, deoksyadenosindifosfat, cytidintrifosfat, guanosintrifosfat og uridintrifosfat. Som reaksjonsfremmende forbindelse, kan eksempelvis nevnes kalium-klorid, natriumklorid, ammoniumklorid, litiumklorid, 2-merkapto-etanol, ditiotreitol, cystein osv. Som enzymstabiliserende forbindelse, kan man bruke mannitol, sorbitol, glycerol, ammoniumsulfat og sukrose.

Hvis det er ønskelig, kan også reaksjonssystemet tilsettes metallsalter, slik som magnesiumklorid, magnesiumsulfat, magnesi.umacetat, manganklorid, koboltklorid, sinkklorid, jern-klorid (FeCl2), nikkelklorid (NiCl2) osv.

Ved denne fosforylering blir en eller flere hydroksyl-grupper i aminoglycosid-antibiotikumet fosforylert. Den fosforylerte hydroksylgruppe vil i det etterfølgende i visse tilfeller bli betegnet "fosfonoksygruppe". Fosfonoksygruppens stillinger vil variere med de typer aminoglycosid-antibiotikum man bruker samt fosforyleringsbetingelsene, da spesielt med hensyn til type av fosfotransferase som anvendes. Fosfonoksygruppen innbefatter usubstituerte fosfonoksygrupper (-OPO^H^)/ substituerte fosfon-oks<y>gru<p>per , slik som nukleotidylfosfonoksygrupper (f.eks. adeno- . sylfosfonoksy, uridylfosfonoksy, 5<1->inosinylfosfonoksy, 5'-guano-sylfosfonoksy), alkylfosfonoksygrupper (f.eks. dimetylfosfonoksy, dietylfosfonoksy, metylfosfonoksy, etylfosfonoksy).

En separasjon av det fosforylerte aminoglycosid-antibiotikum fra reaksjonsblandingen kan utføres på vanlig måte som i seg selv er kjent, f.eks. ved ekstraksjon, utfelling, lyofilisering og kolonnekromatografi, f.eks. pakket med en ione-utbyttingsharpiks, en ione-utbyttingscellulose eller aktivert karbon.

Det således fosforylerte aminoglycosid kan så anvendes

som utgangsforbindelse i foreliggende oppfinnelse hvor det under-kastes en halogenering. Før forbindelsen blir underkastet en halogenering, må alle forbindelsens funksjonelle grupper, slik som hydroksyl eller aminogrupper i det nevnte fosforylerte aminoglycosid-antibiotikum, beskyttes med silylgrupper eller acylgrupper. Denne beskyttelse utføres således ved å omsette det fosforylerte aminoglycosid-antibiotikum med et silyleringsmiddel eller acyleringsmiddel.

Som ovennevnte silyleringsmiddel, kan man f.eks. anvende heksametyldisilazan, trimetylklorsilan, bis-(trimetylsilyl)acetamid, bis-(trimetylsilyl)trifluoracetamid, trimetylsilylacetamid, N-metyl-N-trimetylsilylacetamid, N-trimetylsilylimidazol, N-(trimetylsilyl)dietylamin eller halogensilan (f.eks. dimetyldiklorsilan).

Når man anvender et silyleringsmiddel, trenger reaksjonen ikke nødvendigvis å bli utført i et oppløsningsmiddel, skjønt man kan anvende et ikke-protonavgivende oppløsningsmiddel. Et ikke-protonavgivende oppløsningsmiddel kan f.eks. være benzen, dimetylformamid, tetrahydrofuran, dioksan, acetonitril eller heksametylfosforamid. Hvis det er ønskelig, kan reaksjonen fremmes ved

at man fordelaktig som en katalysator, anvender et tertiært amin, f.eks. trietylamin, pyridin, diisopropylmetylamin, trietylendiamin osv. Denne silyleringsreaksjon utføres ved temperaturer på

fra 50 til 200°C, fortrinnsvis ved 80-150°C, og den kan utføres ved romtemperatur, hvis dette er ønskelig.

Den ønskede og nødvendige mengde av silyleringsmidlet er ikke mer enn den mengde som er nødvendig for å beskytte alle funksjonelle grupper, f.eks. hydroksyl-, amino- og guanidin-grupper i utgangsforbindelsen, skjønt man kan anvende et overskudd av midlet, hvis dette er ønskelig.

Hvis det er ønskelig å beskytte alle funksjonelle grupper med acylgrupper, så kan utgangsforbindelsen f.eks. omsettes med eddiksyreanhydrid, acetylklorid, benzoylklorid, benzyloksykarbonyl-klorid eller lignende. * ~'"~

Skjønt denne reaksjon kan utføres i nærvær eller fravær av et oppløsningsmiddel, så kan man anvende oppløsningsmidler som pyridin, collidin, dimetylformamid, acetonitril, heksametylfosforamid osv. Hvis det er ønskelig, kan reaksjonen fremmes ved å anvende en base som katalysator. Basen kan.f.eks. være trietylamin, trietylendiamin eller pyridin. Reaksjonen utføres ved temperaturer fra -50 til 200°C, fortrinnsvis 80-150°C.

Mengden av acyleringsmiddel trenger ikke å være mer enn det som er nødvendig for å beskytte alle funksjonelle grupper i utgangsforbindelsen, skjønt man kan anvende midlet i overskudd.

Ovennevnte silyleringsmiddel og acyleringsmiddel kan også brukes i kombinasjon eller brukes etter hverandre, slik at man får en blandet beskyttelse av de funksjonelle grupper.

Halogeneringsreaksjonen utføres ved å omsette det fosforylerte og beskyttede aminoglycosid med et halogeneringsmiddel. Som halogeneringsmiddel, kan man anvende halogensilaner, f.eks. trialkylsilylhalogenid (f.eks. trimetylsilylklorid, dimetyl-t-butylsilylklorid, trimetylsilylbromid, dimetyldiklorsilan, trimetylsilyljodid), triarylsilylhalogenid (f.eks. trifenylsilyl-klorid), arylalkylsilylhalogenid (f.eks. fenyldimetylsilylklorid, metyldifenylsilylklorid), trialkoksysilylklorid (f.eks. trimetylsilylklorid, trietoksysilylklorid), tionylklorid, trimetoksy-metylfosfoniumjodid, fosforoksyklorid, fosfortiooksyklorid, fos-forpentaklorid, oksalylklorid, fosforpentabromid osv.

Mengden av halogeneringsmiddel kan være ekvimolar til den forbindelse som fremstilles ved ovennevnte reaksjon, skjønt det er mer vanlig å anvende et overskudd av midlet. En kan bruke blandinger av flere forskjellige midler. Reaksjonen utføres ved temperaturer fra -50 til 200°C, vanligvis oppnår man bedre resultater i temperaturintervallet 80-150°C. Skjønt reaksjonen kan utføres i et fravær av et oppløsningsmiddel, så kan man, hvis det er ønskelig, anvende et ikke-protonavgivende oppløsningsmid-del. Som nevnte oppløsningsmiddel, kan man f.eks. anvende pyridin, benzen, dimetylformamid, tetrahydrofuran, dioksan, heksametylfosforamid eller acetonitril. Hvis det er ønskelig, kan reaksjonen utføres mer fordelaktig ved å tilsette fosfin (f.eks. triarylfosfin (eksempelvis trifenylfosfin), trialkylfos-fin (f.eks. t.ri_n-butylf osf in) ) , metallhalogenid (f.eks. sinkklorid, litiumklorid, aluminiumklorid, bortrifluorid eller titan-klorid).

Hvis man blant disse halogenerihgsmidler anvender halogensilaner, så får man utført en beskyttelse og en halogenering samtidig.

Som nevnte fosforylerte aminoglycosid, kan man typisk nevne et antibiotikum av neomycintypen som har fosfonoksygruppen eller gruppene i 3'- og/eller 5"-stillingene, antibiotika av kanamycintypen med fosfonoksygruppene i 3'- og/eller 2"-stillingene og streptomycinantibiotika med fosfonoksygruppen(e) i 3"-stilling.

Ovnnevnte halogeneringsreaksjon finner sin anvendelse på

alle kjente aminosukkerforbindelser.

De således fremstilte halogendeoksy-aminoglycosider er nye forbindelser som kan brukes som mellomprodukter for fremstilling av deoksyaminoglycosidet så vel som et antibiotikum som sådant, og det er effektiv ikke bare overfor vanlige mikroorganismer, men også overfor mikroorganismer som er resistente overfor aminoglycosid-antibiotika.

Det nevnte halogendeoksy-aminoglycosid blir så underkastet en reduksjon. Denne reduksjon utføres- på kjent måte, f.eks. ved katalytisk reduksjon, elektrolytisk reduksjon, reduksjon med et reduksjonsmiddel eller en reduksjon hvor man anvender en Grignard-reagens.

Når reduksjonen utføres ved katalytisk reduksjon, f.eks. i nærvær av en katalysator, kan følgende fremgangsmåte brukes. Halogendeoksy-aminoglycosidet blir først oppiøst i et vanlig oppløsningsmiddel (f.eks. vann, alkohol (slik som metanol, etanol, isopropanol osv.),.aceton, dioksan, tetrahydrofuran, dimetylformamid eller en blanding av slike oppløsningsmidler)), hvoretter hydrogengass blir boblet gjennom oppløsningen i nærvær av en katalysator (f.eks. Raney-nikkel, palladium-på-karobon, palladium-bariumkarbonat, platinaoksyd, rodiumkompleks, en katalysator av Raney-typen av kobolt, en jernkatalysator av Raney-typen

eller en Raney-katalysator av kobbertypen). Denne reaksjonen, utføres ved temperaturer fra -30 til 150°C, fortrinnsvis fra romtemperatur til 100°C. Skjønt reaksjonen skjer glatt ved atmos-færisk trykk, så kan den utføres ved forhøyede trykk i området 5-100 kg/cm 2. Reaksjonen kan påskyndes alt avhengig av den spesielle type man. har på utgangsforbindelsen, og utbyttet av den ønskede forbindelse kan økes ved at reaksjonssystemet tilsettes en egnet base. Som eksempler på nevnte base, kan nevnes trietylamin, dietylamin eller alkalimetallhydroksyd. Når man anvender elektrolytisk reduksjon, blir utgangsforbindelsen oppløst i et egnet oppløsningsmiddel, og man anvender vanlige kjente fremgangsmåter. Således kan f.eks. halogendeoksy-aminoglycosidet oppløses i et oppløsningsmiddel (f.eks. vann, alkohol (f.eks. metanol, etanol osv), ammoniakk, dimetylformamid osv.)), og reduksjonen utføres ved å bruke en lavspenningselektrode (f.eks. platina, wolfram osv.) eller en høyspenningselektrode (f.eks.

bly, sink, kvikksølv osv.). Man oppnår i visse tilfeller bedre resultater når oppløsningens pH bringes ned på den sure side, f.eks. til pH 2-3.

Når reduksjonen skal utføres ved hjelp av et reduksjonsmiddel, blir nevnte halogendeoksy-aminoglycosid behandlet med et reduksjonsmiddel (f.eks. metallhydrid (f.eks. litiumaluminium-hydrid, natriumborhydrid, tributyltinnhydrid osv.), alkalimetall (f.eks. litium, natrium, osv.), et metallsalt (f.eks. toverdige kromsalter, slik som kromklorid, kromacetat, osv.) eller sink eller amalgert sink)) i et egnet oppløsningsmiddel (f.eks. metanol, etanol, t-buanol, amylalkohol> dimetylformamid, dioksan, tetrahydrofuran, dimetylsulfoksyd, etylenglykol, etylendiamin, dietylentriamin, osv.). Reaksjonen utføres under temperaturer fra -30 til 150°C, vanligvis i intervallet fra romtemperatur til 80°C.

Når man anvender en Grignard-reagens,. kan følgende fremgangsmåte brukes. Det halogenerte antibiotikum enten som sådant eller etter at det er blitt behandlet for å beskytte alle funksjonelle grupper, kan behandles med et magnesiummetall i et opp-løsningsmiddel av en type som rutinemessig brukes i Grignard-reaksjoner, f.eks. tetrahydrofuran, eter eller dioksan, og den resulterende Grignard-reagens dekomponeres med vann, metanol, etanol, n-butanol eller lignende ved romtemperatur, eller, hvis det er ønskelig, under oppvarming, hvorved halogenet erstattes av hydrogen.

De beskyttende grupper kan fjernes før, samtidig eller etter reduksjonen.

En fjerning av silylgruppen kan lett utføres ved at produktet kontaktes med en protondonor, slik som vann, alkohol (f.eks. metanol, etanol, osv.), karboksylsyre (f.eks. eddiksyre, propionsyre, osv.) eller sulfonsyre (f.eks. p-toluensulfonsyre). En fjerning av acylgruppene kan utføres ved at produktet ved hjelp av en katalysator hydrolyseres med en syre (f.eks. saltsyre, svovelsyre, osv.) eller alkali (f.eks. natriumhydroksyd, bariumhydroksyd, kaliumhydroksyd, osv.).

Man får således fremstilt det ønskede deoksyamino-glycosid. Den dehydroksyelerte stilling på deoksyamino-glycosidet vil falle sammen med stillingen på fosfonoksygruppen i utgangsforbindelsen .

Noen av de deoksyamino-glycosid-antibiotika som lar seg fremstille ved foreliggende oppfinnelse er i seg selv kjente forbindelser, men følgende er nye forbindelser: 3'-deoksyneomycin, dvs. 0-[a-2 , 6-diamino-2 , 3,6-trideoksy-D-glukopyranosyl- (l-»4) ] , 0-[0- {a-2 , 6-diamino-2, 6-dideoksy-L-idopyranosyl- (l-»3) }- 3-D-ribo-furanosyl-(l-»5)]-2-deoksystreptamin, 3'-deoksyxylostasin, dvs. 0-3-D-xylof uranosyl- (l-*5) -0- [a-2 , 6-diamino-2 , 3, 6-trideoksy-D-glukopyranosyl-(l-»4) ]-2-deoksystreptamin, 3'-deoksyribostamycin, dvs . 0-3-D-r ibo f uranosyl- (l-»5) -0- [ a- 2 , 6-diamino-2 , 3 , 6-trideoksy-D-glukopyranosyl-(l-»4) ]-2-deoksystreptamin.

Separasjon og rensing av de ønskede deoksyamino-glycosid-antibiotika kan gjennomføres på vanlig kjent måte, f.eks. ved ekstraksjon, utfelling, lyofilisering, ione-utbyttingskolonne-kromatografi ved hjelp av en svakt sur harpiks.

Nevnte halogendeoksyamino-glycosidantibiotika og deoksyaminoglycosid-antibiotika har begge i alt vesentlig den samme antibakterielle aktivitet som den man finner i de tilsvarende aminoglycosid-antibiotika, bg de er dessuten effektive overfor de bakterier som er resistente overfor aminoglycosid-antibiotika. De således fremstilte deoksyaminosukkerforbindelser er således bruk-bare som midler mot tuberkulose, mot dysenteri eller ved behandling av stafylokokk-infeksjoner.

Nevnte deoksyaminoglycosid-antibiotika eller halogende-oksyaminoglycosid-antibiotika kan tilføres i form av tabletter, injeksjoner osv., med vanlige fortynningsmidler i dose på 1-30 mg/kg til forskjellige typer pattedyr, f.eks. mennesker, svin, får eller rotter. Således kan f.eks. 3'-deoksyneomycin brukes i form av tabletter på ca. 4 mg/kg kroppsvekt, 3'-deoksyxylostasin kan.brukes i form av injeksjoner i rutinedose på ca. 20 mg/ kg kroppsvekt og 3'-deoksyribostamycin kan brukes i form av injeksjoner i vanlige rutinedoser på ca. 20 mg/kg kroppsvekt..

Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen. "Deler"

er basert på vekt, hvis intet annet er angitt, og forholdet mellom deler og volumdeler tilsvarer forholdet mellom gram og milliliter. Forkortelsene "M" og "N" betyr henholdsvis molar konsentrasjon og normalitet eller ekvivalent konsentrasjon. Referanseeksempel 1 1 250 volumdeler 0,5N vandig oppløsning av bariumhydroksyd ble det oppløst 5,9 deler butirosin A. Oppløsningen ble kokt under tilbakeløp i 2 timer og så avkjølt. Oppløsningen ble nøy-tralisert med IN svovelsyre. Det resulterende bunnfall av barium-sulfat ble fjernet ved sentrifugering. Den gjenværende væske ble ført over på en kolonne som besto av 300 deler av en kation-utbyttingsharpiks ("Amberlite CG-50" (NH4<+->form)). Kolonnen ble vasket med vann og eluert med 0,2N vandig ammoniakk. Fraksjoner som inneholdt xylostasin ble påvist ved tynnsjiktskromatografi, og disse ble slått sammen og konsentrert under redusert trykk til tørrhet og så lyofilisert, hvorved man fikk fremstilt 3,8 deler xylostasin som et hvitt pulver.

Elementæranalyse for C^H^<H>^<O>^<q>

Funnet: C 44,23%; H 7,53%; N 12,10%

Beregnet: C 44,93%; H 7,54%; N 12,33%

Optisk rotasjon: (a)^<1>=+34° (c=l i vann).

Det kjemiske navn for xylostasin er O-p-D-xylofuranosyl-(l-»5) -0- [ a-2 , 6-diamino-2 ,6-dideoksy-D-glukopyranosyl- (l->4) ]-2-. deoksystreptamin, og forbindelsen har følgende kjemiske struktur:

Referanseeksempel 2

Et væskemedium (pH 7,2) inneholdende 3% polypepton (pankreatisk nedbrutt produkt av kasein), 1% kjøttekstrakt og 0,5% natriumklorid ble inokulert med Bacillus sp. Y-39 som er innlevert under tilvekst nr. ATCC-21932 i American Type Culture Collection i Maryland, USA og har FERM-P nr. 14 79 i Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology i Chiba, Japan.

Dyrkingen ble utført under rysting ved 28°C i 40 timer. Denne frøkultur ble så inokulert til et vandig kluturmedium (30.000 volumdeler, pH 7,5) sammensatt av 1% glukose, 1% polypepton, 0,7% kjøttekstrakt og 0,5% magnesiumklorid i en tank med en kapasitet på 50.000 volumdeler ved en inokulumstørrelse på 10%, hvoretter kultiveringen ble utført ved 28°C, 100 % gjennom-lufting og 200 omdr./min. i 66 timer.

Den resulterende fermenteringsvæske ble justert til

pH 1-2 med en mettet vandig oppløsning av oksalsyre og så filtrert med et filtreringsmiddel (300 deler "Hyflo-Super-Cel"). Filtratet ble justert til pH 7 og ført gjennom en kolonne pakket med 2000 volumdeler av en kationisk utbyttingsharpiks ("Amberlite IRC-50" (NH4+-form)), hvoretter det aktive produkt (aktiv

overfor Bacillus subtilis PCI 219) ble adsorbert på ione-utbytt-ingsharpiksen. Harpiksen ble først vasket med vann og så eluert med en 5% vandig ammoniakalsk oppløsning. De aktive fraksjoner

(2500 volumdeler) ble slått sammen og ført over på en kolonne sammensatt av 600 volumdeler av en kromatografisk kvalitet av aktivert karbon.for adsorpsjon av den aktive forbindelse. Karbon-kolonnen ble vasket med vann og deretter eluert med 0,3N saltsyre. De aktive fraksjoner ble slått sammen, nøytralisert med en anion-isk utbyttingsharpiks ("Amberlite IR 45", OH~-form) og konsentrert under redusert trykk. Til slutt ble konsentratet lyofilisert,

hvorved man fikk fremstilt 5,6 deler av et råpulver inneholdende 30% xylostasin.

Dette råprodukt (5,6 deler) ble oppløst i vann og adsorbert på en kolonne-av 100 volumdeler av en kationisk utbyttingsharpiks ("Amberlite CG-50, NH4<+->form). Etter vasking med vann, ble kolonnen eluert med en 0,2N vandig ammoniakalsk oppløs-ning. De aktive fraksjoner ble oppsamlet og konsentrert under redusert trykk. Ti ganger volumet av aceton (volum/volum) ble tilsatt konsentratet, og det resulterende bunnfall oppsamlet ved filtrering. Denne fremgangsmåte ga 1,8 deler av et blekt gult pulver (xylostasininnhold ca. 90%) . Dette pulver ble oppløst i vann og adsorbert på en kolonne av 200 volumdeler av en katione-utbytter ("CM-Sephadex C-25" (NH4<+->form)). Kolonnen ble så eluert med vandig ammoniakk idet man anvendte en gradienteluering (fra 0-1,7N), og de aktive fraksjoner som bare inneholdt xylostasin, ble slått sammen og konsentrert til tørrhet under redusert trykk, hvorved man fikk fremstilt 1,41 deler av et hvitt xylostasinpulver.

Eksempel 1

En blanding av 1,0 deler xylostasin-3<1->fosfatmonohydrat hvis fremstilling er beskrevet ovenfor, 0,7 deler trifenylfosfin, 9 volumdeler trimetylsilylklorid, 4 volumdeler heksametyldisilazan og 7,5 deler pyridin ble holdt på 110°C i 43,5 timer. 200 volumdeler metanol ble tilsatt reaksjonsblandingen under isav-kjøling, fulgt av en konsentrasjon under redusert trykk til tørr-het. Residuet ble så tilsatt 200 volumdeler destillert vann.

-De uløselige stoffer ble oppsamlet ved filtrering og oppløst i 100 volumdeler etylacetat, fulgt av en vasking med 100 volumdeler vann ved rysting. Det vandige lag ble konsentrert under redusert trykk og slått sammen med filtratet. Blandingen ble ført over på en kolonne av 185 volumdeler av en kationisk utbyttingsharpiks ("Amberlite IRC-50" (NH4<+->form)). Kolonnen ble

vasket med 130 volumdeler vann og eluert med 1000 volumdeler IN NH^OH. Eluatet ble konsentrert til ca. 100 volumdeler under redusert trykk og ble så ført over på en kolonne av 275 volumdeler av en kationisk utbyttingsharpiks ("Amberlite CG-50" (NH4<+->form)) for adsorpsjon.

Denne kolonne ble vasket med vann og så fraksjonert ved en lineær gradientmetode med 1000 volumdeler destillert vann og 1000 volumdeler av en 0,3N vandig ammoniakkoppløsning. De fraksjoner som innehold 3'-klor-3'-deoksyxylostasin ble slått sammen og konsentrert under redusert trykk til tørrhet og deretter, lyofilisert, hvorved man fikk fremstilt 0,505 deler 3'-klor-3'-deoksyxylostasindihydrat.

Elementæranalyse for <C>17<H>33N4OgCl.2H20

Beregnet: C 40,12; H 7,33; N 11,01; Cl 6,97

Funnet : C 40,08; H 7,29; N 10,73; Cl 6,55

24 o

Optisk rotasjon: (a)D =+29,7 (c=0,6 i vann).

Rf-verdi var 0,41 på tynnsjiktskromatografi når man brukte en silisiumdioksydgel-glassplate ("Art. 5721") i et oppløsnings-middelsystem som inneholdt 5 volumdeler av det øvre laget av CHCl^ : CH-jOH : vandig ammoniakk : vann (4:3:2:1) og 3 volumdeler etanol, mens fritt xylostasin som ble anvendt som kontroll, viste en Rf-verdi på 0,23.

Utgangsmaterialet, nemlig xylostasin-3<1->fosfat ble fremstilt ved en fosforylisering idet man anvendte et enzym fra Escherichia coli nr. Ril (FERM-P nr. 2123, ATCC-21990).

200 volumdeler av et vandig frøkulturmedium (pH 7,2) sammensatt av 0,5% gjærekstrakt, 0,5% polypepton og 0,3% kjøtt-ekstrakt ble inokulert med Escherichia col Ril. Dyrkingen ble utført under rysting ved 37°C i 16 timer. Denne frøkultur ble så brukt som inokulum i et vandig medium (1800 volumdeler, pH 7,2) med samme sammensetning som angitt ovenfor, og dyrk-

ingen ble utført under rysting ved 37°C i 4 timer. Kulturvæsken ble så sentrifugert for innyinning av 4,4 deler våte celler. Celle ble suspendert i 17,6 volumdeler 0,05M fosfatbuffer

(pH 7,01.

Suspensjonen ble underkastet én ultralydoscillasjon (Kaijo Denki Co., Ltd. "T-A-4201, type 4280, 2A") for å ned-bryte cellene, hvoretter man fjernet avfall (uløselig materiale)

ved sentrifugering, slik at man til sammen fikk fremstilt 17 volumdeler av en uren enzymoppløsning. 17 volumdeler av den urene enzymoppløsning ble tilsatt 5 deler xylostasin, 50 volumdeler 0,5M fosfatbuffer (pH 7,0),

100 volumdeler IM adenosintrifosfatoppløsning, 50 volumdeler 0,IM magnesiumacetatoppløsning og 50 volumdeler 0,IM 2-merkapto-etanol som ble fylt opp til 500 volumdeler med destillert vann. Blandingen ble underkastet en enzymatisk reaksjon ved 37°C i 20 timer.

Reaksjonsblandingen ble så oppvarmet til 80°C i 5 min. for å avslutte reaksjonen, hvoretter det hele ble sentrifugert. Den overliggende væske ble ført over på en kolonne av 900 volumdeler av en kationisk utbyttingsharpiks ("Amberlite IRC-50"

(NH4+-form)). Kolonnen ble vasket med vann og eluert med IN vandig ammoniakk hvorved man fikk reaksjoner som inneholdt xylostasin-3'-fosfat. Disse fraksjoner ble slått sammen og konsentrert og ført over på en kolonne av 150 volumdeler av en kationisk utbyttingsharpiks ("Amberlite CG-50" (NH4<+->form)).

Kolonnen ble vasket med vann og så fraksjonert ved en lineær gradienteluering med 1200 volumdeler destillert vann og 1200 volumdeler 0,2N vandig ammoniakk. Fraksjoner som innbefat-tet xylostasin-3'-fosfat, ble oppsamlet, konsentrert under redusert trykk og lyofilisert, hvorved man fikk fremstilt 4,4 deler xylostasin-3'-fosfatmonohydrat som et hvitt pulver.

Elementæranalyse for C^7H35N4°^3P-H2°

Beregnet: C 36,96; H 6,75; N 10,14; P 5,61

Funnet : C 37,52; H 6,73; N 9,78; P 5,41

24 o

Optisk rotasjon: (a)D =+40,0 (c=0,60 i vann)

IRÅKB5 cm"1: 968.

maks

Rf-verdi var 0,55 på en tynnsjiktkromatografi hvor man anvendte en silisiumdioksydgel-glassplate (Merck, "Art. 5721") i et oppløsningsmiddelsystem som inneholdt 5 volumdeler av det øvre laget av CHC13 : CH3OH : 28% ammoniakk : H20 .(4:3:2:1) og 3 volumdeler metanol, mens fritt xylostasin som ble anvendt som kontroll, hadde en Rf-verdi på 0,23.

For å oppnå ytterligere nøyaktige analytiske verdier for ovennevnte produkt, ble det acylert for fremstilling av tetra-N-acetylxylostasin-3'-fosfatdihydrat som så ble underkastet en elementæranalyse.

Elementæranalyse for <C>25<H>43<N>4017<P.>2H20

Beregnet: C 40,65; H 6,41; N 7,59; P 4,19

Funnet : C 40,95; H 6,52; N 7,70; P 4,16

I 20 volumdeler vann ble det oppløst 0,2 deler 3'-klor-i 3'.-deoksyxylostasin og som så ble tilsatt 2,5 volumdeler Raney-nikkel og 0,3 volumdeler trietylamin. Blandingen ble rystet i en hydrogenstrøm ved atmosfæriske betingelser. Etter 6 timer, ble katalysatoren frafiltrert. Deretter ble katalysatoren vasket med 150 volumdeler IN vandig ammoniakk, og vaskeoppløs-ningen ble slått sammen med filtratet og det hele konsentrert til et volum på ca. 20 volumdeler. Det resulterende bunnfall ble fjernet ved filtrering, og filtratet ble ført over på en kolonne av 30 volumdeler av en kationisk utbyttingsharpiks ("Amberlite CG-50" (NH4<+->form)). Kolonnen ble vasket med vann og eluert med fra 0-0,5N vandig ammoniakk (gradient). Fraksjonene som inneholdt 3<1->deoksyxylostasin ble slått sammen og konsentrert under redusert trykk til tørrhet, hvorved man fikk fremstilt 0,152 deler 3'-deoksyxylostasintrihydrat.

Elementæranalyse for ci7H34N4°g•3H20

Beregnet: C 41,54; H 8,18; N 11,37

Funnet : C 41,23; H 7,95; N 11,08

24 o

Optisk rotasjon: (a)D +28,0 (C=0,61 i vann).

Rf-verdi var 0,26 ved tynnsjiktskromatografi idet man brukte silisiumdioksydgel-glassplater (Merck, "Art. 5721") i et oppløsningsmiddelsystem som inneholdt 5 volumdeler av det øvre laget av CHCl^ : CH^OH : vandig ammoniakk : vann (4:3:2:1) og 3 volumdeler metanol. Fritt xylostasin som ble brukt som kontroll, hadde en Rf-verdi under samme betingelser på 0,23.

Eksempel 2

En blanding av 0,3 deler neomycin B-3<1->fosfatpentahydrat, 2,7 volumdeler trimetylsilylklorid, 1,2 volumdeler heksametyldisilazan, 2,25 volumdeler tørr pyridin og 0,21 deler trifenylfosfin ble oppvarmet på et oljebad ved 115°C i 44 timer. Etter at reaksjonen var ferdig, ble 30 volumdeler metanol tilsatt reaksjonsblandingen under isavkjøling, fulgt av konsentrasjon under redusert trykk. Konsentratet ble tilsatt 100 volumdeler destillert vann, og de uløselige faste stoffer ble fjernet ved filtrering, som så ble tilsatt 100 volumdeler vann og 100 volumdeler etylacetat, fulgt av rysting. Vannlaget ble konsentrert under redusert, trykk for å fjerne etylacetat. Det vandige lag ble så ført over på en kolonne av 90 volumdeler av en kationisk utbyttingsharpiks ("Amberlite IRC-50" (NH4<+->form)).

Kolonnen ble, vasket med 500 volumdeler destillert vann og så eluert med 300 volumdeler IN vandig ammoniakk. Eluatet ble konsentrert under redusert trykk, og man oppnådde 0,25 deler av et råprodukt. Dette ble oppløst i 50 volumdeler destillert vann og adsorbert på 30 volumdeler. av et kationisk utbyttingsharpiks ("Amberlite CG-50I" (NH4<+->form)). Harpiksen ble vasket med 100 volumdeler destillert vann og fraksjonert ved eluering (gradientmetode) idet man brukte fra 0-0,3N vandig ammoniakk. Det oppnådde råprodukt ble igjen adsorbert på en kationisk utbyttingsharpiks ("Amberlite CG-50" (NH4<+->form)), og harpiksen ble eluert med fra 0-0,3N vandig ammoniakk. Eluatet ble konsentrert under redusert trykk og så lyofilisert. Den ovennevnte fremgangsmåte gir 0,195 deler 3'-klor-3<1->deoksyneomycin B-dihydrat.

Elementæranalyse for C^H^NgO^Cl. 2H20

Beregnet: C 41,28; H 7,38; N 12,55; Cl 5,29

Funnet : C 41,03; H 7,29; N 12,41; Cl 5,35.

Rf-verdi var 0,47 ved tynnsjikstkromatografi idet man brukte en silisiumdioksydgel-glassplate ("Art. 5721", Merck) i et oppløsningsmiddelsystem av en oppløsning av CHCl^ : metanol : vandig ammoniakk : vann (1:4:2:1). Fritt nemoycin B som ble anvendt som en kontroll, hadde en Rf-verdi på 0,29.

Utgangsmaterialet, nemlig neomycin B-3'-fosfatpenta-hydrat, var fremstilt som beskrevet i "The Journal of Antibiotics", 21, 22(1968), idet man lot en råenzymoppløsning av Escherichia coli K 12 ML 1629 virke på neomycin B.

Spesifikk rotasjon (a)^ 24 =+63,3 o (c=l,02 i H20).

Elementæranalyse for <C>23<H>47N6°16<P*>5H2°

Beregnet: C 35,20; H 7,32; N 10,70

Funnet : C 35,26; H 7,05; N 10,17

UV: Ingen.spesifikk absorpsjon

IRAKB£ cm"1: 9 58.

maks

Rf-verdi var 0,35 ved tynnsjiktskromatografi idet man brukte silisiumdioksydgel-glassplater ("Art. 5721", Merck) i et oppløsningsmiddelsystem som inneholdt 5 volumdeler av det øvre laget av CHCl^ : CH^OH : vandig ammoniakk : vann (4:3:2:1) og 3 volumdeler metanol. Fritt neomycin B ble anvendt som kontroll, og hadde en Rf-verdi på 0,11.

I 15 volumdeler vann ble det oppløst 0,1 del 3'-klor-3'-deoksyneomycin B, og denne oppløsning ble tilsatt 0,3 volumdeler Raney-nikkel og 0,5 volumdeler trietylamin. Blandingen ble rystet i hydrogenstrøm ved atmosfæriske betingelser. Etter 4 timer, ble katalysatoren frafiltrert. Katalysatoren ble så vasket med 100 volumdeler av en IN vandig ammoniakkoppløsning, og vaskeoppløsningen ble slått sammen med filtratet. Det hele ble så konsentrert til tørrhet. Fremgangsmåten ga 0,085 deler av et urent pulver. Dette puvlerprodukt ble oppløst i 20 volumdeler destillert vann og så adsorbert på en kolonne pakket med 35 volumdeler av en kationisk utbyttingsharpiks ("Amberlite CG-501" (NH4<+->form)), og kolonnen ble eluert fra 0-0,5M NH^OH (gradient), hvoretter eluatet ble konsentrert under redusert trykk og lyofilisert, hvorved man oppnådde 0,06 deler 3'-deoksyneomycin B-dihydrat.

Elementæranalyse (C„ -.H. ,N,0, ~.2H„0)

J 23 46 6 12 2

Beregnet: C 43,52; H 7,94; N 13,24

Funnet : C 43,67; N 7,75; N 13,05

Rf-verdi var 0,36 ved tynnsjiktkromatografi på en silisiumdioksydgel-glassplate ("Art. 5721", Merck) i et oppløsnings-middelsystem av en blanding av CHCl^ : metanol : vandig ammoniakk : vann (1:4:2:1), mens fritt neomycin B som ble anvendt som en kontroll, hadde en Rf-verdi på 0,29.

Eksempel 3

En blanding av 0,1 deler neomycin A-3<1->fosfattrihydrat,

3 volumdeler trimetylsilylklorid, 3 volumdeler bis(trimetyl-silyl ) acetamid og 3 volumdeler tørr pyridin, ble holdt oppvarmet på et oljebad ved 130°C i 15 timer. Etter at reaksjonen var ferdig, ble reaksjonsblandingen tilsatt metanol under isavkjøl-ing, hvoretter det hele ble konsentrert under redusert trykk. Residuet ble oppløst i 50 volumdeler destillert vann, og oppløs-ningen ført over på en kolonne av 50 volumdeler kationisk utbyttingsharpiks ("Amberlite IRC-50" (NH4<+->form)). Kolonnen ble vasket med 100 volumdeler destillert vann og så eluert med 200 volumdeler 0,5N vandig ammoniakk. Eluatet ble konsentrert under redusert trykk til 20 volumdeler konsentrat. Dette ble justert til pH 7,0 og adsorbert på 20 volumdeler av en kationisk utbyttingsharpiks ( "Amberlite... CG-50 " (NH4+-form) .

Harpiksen ble fraksjonert ved eluering med 0,075N vandig ammoniakk. Det oppnådde råprodukt ble videre adsorbert på en

kolonne pakket med 20 volumdeler kationisk utbyttingsharpiks ("Amberlite CG-50" (NH4<+->form)) og så eluert med 0,075N vandig ammoniakk. Det rensede produkt" bly lyofilisert. Fremgangsmåten ga 0,035 deler 3'-klor-3<*->deoksyneomycin A.

Elementæranalyse: (C^2H25<N>4°5C"'"l^

Beregnet: C 42,29; H 7,39; N 16,44; Cl 10,40

Funnet : C 41,98; H 7,13; N 16,40; Cl 10,12

NMR6<D>2° : 5,47 (lH, d, J 1',2'=3 Hz, C 1'-H),

ppm

3,21 (1H, g, J l',2'=3 Hz, J 2',3'=11 Hz, C 2'-H)

Rf-verdi var 0,4 3 ved tynnsjiktskromatografi idet man anvendte en silisiumdioksydgel-glassplate ("Chromagram 6060")

i et oppløsningsmiddelsystem som inneholdt 1 volumdel av det øvre laget CHCl^ : metanol : vann : vandig ammoniakk (2,0:1,5: 0,5:1,0) og 1 volumdel metanol. Rent neomycin A og neomycin-3<1->fosfat som ble anvendt som krontrollforbindelser, hadde Rf-verdier på 0,20 og 0,21, respektivt.

For å oppnå nøyaktigere analytiske verdier for det ovennevnte produkt, ble det acetylert og silylert, hvorved man fikk fremstilt tetra-N-acetyl-tri-O-trimetylsilylneomycin A-3'-fosfat, som så ble undersøkt i en massepektrograf.

Karakteristiske topper:

711(M<+->CH3)(Cl<37>), 709(M<+->CH3)(Cl<35>), 673(M<+->CH3-HC1), 491, 463, 445, 419, 373, 355, 337, 299.

Utgangsmaterialet, neomycin A-3<1->fosfattrihydrat, var fremstilt som beskrevet i "The Journal of Antibioticts", 21,

nr. 1, 22-29 (19681, idet man lot en råenzymoppløsning av Escherichia coli K 12 ML1629 virke på neomycin A.

Elementæranalyse for <C>^2<H>26°9<N>4<P>"3H2°

Beregnet: C 31,65; H 7,08; N 12,30; P 6,80

Funnet : C 31,78; H 7,22; N 12,09: P 6,81

Ultrafiolett adsorpsjon: Ingen spesifikk absorpsjon.

NMR(D20)6: 3,14(2'-H), 401(3'-H), 5,78(1H,d,J=4Hz,1-H)

IRXKB.r cm-1 : 965

maks

(a)p7=+95,1<7>° (c=l,01 i vann).

I 10 volumdeler vann ble det oppløst 0,15 deler 3'-klor-3<1->deoksyneomycin A, og oppløsningen ble tilsatt 1,8 volumdeler Raney-nikkel og 0,2 deler trietylamin. Blandingen ble så rystet

i hydrogen ved atmosfæriske betingelser. Etter 5 timer ble katalysatoren frafiltrert. Så ble katalysatoren vasket med 200 volumdeler IN NH^OH, og vaskeoppløsningen ble slått sammen med filtratet, og det hele ble konsentrert. De uløselige faste stoffer ble eliminert ved filtrering. Filtratet ble så adsorbert på en kolonne pakket med 30 ml av en kation-utbyttingsharpiks ("Amberlite CG-50I" (NH4<+->form)) og så vasket med vann og eluert med 0,1-0,5N NH^OH (gradient og så renset, hvorved man fikk fremstilt 0,12 deler 3'-deoksymycin A-monohydrat.

Elementærnalyse for <C>^2H26N4°5•<H>2°

Beregnet: C 44,43; H 8,69; N 17,27;

Funnet : C 44,12; H 8,53; N 16,98.

Rf-verdi var 0,35 ved tynnsjiktkromatografi på en silisiumdioksydgel-glassplate ("Chromagram 6060") i et oppløsnings-middelsystem som inneholdt 5 volumdeler av det øvre laget av CHCl-j : metanol : vandig ammoniakk : vann (4:3:2:1) og 3 volumdeler metanol, mens fritt neomycin A som ble anvendt som kontroll, hadde en Rf-verdi på 0,30.

Eksempel 4

En blanding av 0,15 deler kanamycin B-3<1->fosfattrihydrat, 7,5 volumdeler trimetylsilylklorid, 15,0 volumdeler heksametyldi-siliazan og 7,5 volumdeler tørr pyridin ble holdt på et oljebad på 130°C i 62 timer. Etter at reaksjonen var ferdig, ble metanol tilsatt reaksjonsblandingen under isavkjøling, og det hele ble konsentrert under redusert trykk. Residuet ble tilsatt 100 volumdeler destillert vann, og blandingen ble overført på en kolonne av 200 volumdeler kationisk utbyttingsharpiks ("Amberlite IRC-50"

(NH4<+->form)). Kolonnen ble vasket med 1000 volumdeler destillert vann og så eluert med 1000 volumdeler IN vandig ammoniakk. Eluatet ble konsentrert til tørrhet under redusert trykk, og man oppsamlet 0,12 deler råprodukt. Dette ble oppløst i 50 volumdeler destillert vann og. adsorbert på 30 volumdeler kation-utbyttingsharpiks ("Amberlite CG-50" (NH4<+->form)).

Harpiksen ble vasket med 100 volumdeler destillert vann og fraksjonert ved eluering (gradientmetoden) med 0-0,5N vandig ammoniakk. Råproduktet ble så adsorbert på en kation-utbyttingsharpiks-("Amberlite CG-50" (NH4+-form)), og harpiksen ble eluert med 0-0,5N vandig ammoniakk. Det rensede produkt ble lyofilisert. Nevnte fremgangsmåte gir 0,082 deler 3'-klor-3'-deoksykanamycin B-monohydrat.

Elementæranalyse for C^gH-jgNj-O^gCl .H20

Beregnet: C 41,57; H 7,36; N 13,46; Cl 6,81

Funnet : C 41,45; H 7,56; N 12,88; Cl 6,64

Optisk rotasjon: (a)^3+106,5° (c=0,51 i vann).

Rf-verdi var 0,55 ved tynnsjiktkromatografi på en silisiumdioksydgel-glassplate ("art. 5721", Merck) i et oppløsnings-middelsystem som inneholdt 1 volumdel av det øvre laget av CHCl^ : metanol : vann : vandig ammoniakk (2,0:1,5:0,5:1,0) og 1 volumdel metanol, mens fritt kanamycin B og kanamycin B-3'-fosfat som ble anvendt som kontroller, hadde Rf-verdier på 0,39 og 0,25, respektivt.

NMR<5°2° : 5,44 (1H, d, J]_, =3 Hz, C^-H),

3,33 (1H, q, Jlt 2,=3 Hz, H2, 3,=10 Hz, C2,-H).

For å oppnå nøyaktigere anaalytiske verdier for ovennevnte produkt, ble det acylert og silylert, hvorved man fikk fremstilt penta-N-acetyl-penta-O-trimetylsilylkanamycin B-3'-fosfat, som ble undersøkt i en massespektrograf.

Karakteristiske topper:

1056 (M-15), 1035 (M-36), 1020 (M-51), 838, 810, 689, 645, 599, 420, 361, 299..

Utgangsmaterialet, kanamycin B-3'-fosfattrihydrat, ble fremstilt som beskrevet i "Applied Microbiology", 16, nr. 9, 1276 (1968) idet man lot en råenzymoppløsning av Pseudomonas aeruginosa R34R (FERM-P nr. 2124) virke på kanamycin B.

Elementæranalyse for <c>^s<H>38N5^13P*3H2^

Beregnet: C 35,00; H 7,18; N 11,34; P 5,01 , .Funnet : .-C 35,23; H 7,06; N 10,99; P 5,06

23

Optisk rotasjon: (a)D =+108,6 (c=0,53 i vann)

NMR (6 i D20) : 4,36(3'-H, kvartett), 5,18 (1"-H, dublett),

5,78 (l'-H, dublett)

IRXmaks Cm-1 : 970 (fosfat)-

I en blanding av 1 volumdel vann og 1 volumdel etanol ble det oppløst 0,0 3 deler 3'-klor-3'-deoksykanamycin B, og dette ble tilsatt 0,5 volumdeler Raney-nikkel. Blandingen ble rystet i hydrogenstrøm ved atmosfæriske betingelser. Etter 3 timer, ble katalysatoren frafiltrert. Katalysatoren ble så vasket med 50 volumdeler IN vandig ammoniakk, og vaskeoppløsningen ble slått sammen med filtratet og det hele konsentrert. Fremgangsmåten gir 0,025 deler av et urent pulver. Dette råprodukt ble så adsorbert på volumdeler av en kation-utbyttingsharpiks ("Amberlite CG-50"

(NH4<+->form)) og renset ved eluering med 0-0,5N NH^OH (gradientmetode). Dette ga 0,0 2 deler 3<1->deoksykanamycin B. Produktet er identisk med en autentisk prøve.

De følgende Rf-verdier ble f.eks. oppnådd ved tynnsjiktkromatografi .

1) Silisiumdioksydgel-plate ("Art. 5721") (på glass) Oppløsningsmiddel: Det øvre lag av CHC13-metanol-17% NH^OH

(2:1:1) .

3'-klor-3<1->deoksykanamycin B: 0,78

3'-deoksykanamycin B: 0,74

2) Silisiumdioksydgel-plate ("Chromogram 6060")

(på syntetisk harpiks)

Oppløsningsmiddel: Det øvre lag av CHCl^-metanolkonsentrert

NH4OH-vann (20:53:10:5) 3'-klor-3'-deoksykanamycin B: 0,64

3<1->deoksykanamycin B: 0,58

Optisk rotasjon (a)22=+123,2° (c=l,085 i vann)

Elementæranalyse for C^gH37N,-Og . 2H20

Beregnet: C 42,93; H 8,20; N 13,90

Funnet : C 42,11; N 8,04; N 13,05.

Oppholdstiden for det tilsvarende trimetylsilylderivat

i gasskromatografi er fullstendig overensstemmende med det man finner for en autentisk prøve.

Eksempel 5

En blanding av 1,2 deler kanamycin B-3'-fosfattrihydrat, 0,8 deler trifenylfosfin, 10 volumdeler trimetylsilylklorid, 4 volumdeler heksametyldisilazan og 4 volumdeler pyridin ble holdt på 130°C i 48 timer. Reaksjonsblandingen ble tilsatt 200 volumdeler metanol under isavkjøling, og blandingen ble konsentrert under redusert trykk til tørrhet. Residuet ble oppløst i 300 volumdeler destillert vann. Oppløsningen ble underkastet ekstraksjon med 120 volumdeler metylendiklorid. Det vandige lag ble innvunnet og tilstedeværende metylendiklorid fjernet under redusert trykk. Det vandige lag ble fortynnet med destillert vann til 500 volumdeler, og oppløsningen ble kjørt over på en kolonne av 400 volumdeler kation-utbyttingsharpiks ("Amberlite IRC-50"

(NH4<+->form)). Harpiksen ble vasket med vann og eluert med 1400 volumdeler IN vandig ammoniakk. Eluatet ble konsentrert under redusert trykk til ca. 300 volumdeler og ført over på en kolonne av 160 volumdeler av en kationisk utbyttingsharpiks, samme type som nevnt ovenfor.

Kolonnen ble vasket med vann og underkastet fraksjonsvis eluering ved en lineær gradientmetode, og dette ble utført ved hjelp av 1200 volumdeler destillert vann og 1200 volumdeler 0,3N vandig ammoniakk. Eluatet ble konsentrert under redusert trykk og så lyofilisert, og man fikk fremstilt 0,755 deler 3'-klor-3'-deoksykanamycin B-dihydrat.

En oppløsning av 0,0 53 deler 3'-klor-3'-deoksykanamycin

B i 5 volumdeler vann ble tilsatt 0,3 volumdeler Raney-nikkel

og 0,1 volumdel trietylamin, og blandingen ble rystet i hydro-genstrøm. Etter 4 timer ble katalysatoren fjernet ved filtrering og vasket med 50 volumdeler IN vandig ammoniakk. Filtratet og vaskeoppløsningen ble slått sammen og konsentrert. Residuet ble renset ved kromatografi på en kolonne av en kationisk utbyttingsharpiks ("Amberlite CG-50I" (NH4<+->form)). Man oppnådde på denne måte 0,033 deler 3'-deoksykanamycin B.

Eksempel 6

En blanding av 0,63 deler kanamycin B-3•-fosfattrihydrat,

5 volumdeler trimetylsilylklorid, 2 volumdeler heksametyldisilazan, 2 volumdeler pyridin, 0,4 deler trifenylfosfin og 0,1 del sinkklorid ble holdt .på 100°C i 48 timer. Reaksjonsblandingen ble behandlet som angitt i eks. 4, og man fikk fremstilt 0,425 deler 3'-klor-3'-deoksykanamycin B.

En oppløsning av 0,1 deler 3<1->klor-3<1->deoksykanamycin B i 10 volumdeler vann ble tilsatt 0,3 deler palladium-på-karbon (1%). Systemet ble rørt i en hydrogenstrøm. Etter 5 timer ble katalysatoren frafiltrert og vasket med 50 volumdeler 0,5N saltsyre. Vaskeoppløsningen ble slått sammen med filtratet, og den samlede oppløsning ble konsentrert til ca. 1/3 av det opp-rinnelige volum, og så nøytralisert med IN vandig ammoniakk.

Den nøytraliserte oppløsning ble først avsaltet med en kation-utbyttingsharpiks ("Amberlite IRC-50" (NH4<+->form)), og. deretter renset på en kolonne av 15 volumdeler av en kation-utbyttingsharpiks ("Amberlite CG-50I" (NH4<+->form)). Denne fremgangsmåte ga 0,06 4 deler 3'-deoksykanamycin B.

Eksempel 7

En blanding av 0,3 deler paramomycin 1-3'-fosfattetra-hydrat, 2,7 volumdeler trimetylsilylklorid, 1,2 volumdeler heksametyldisilazan, 2,25 volumdeler tørr pyridin, 0,21 deler trifenylfosfin ble holdt på et oljebad på 110°C i 48 timer. Etter at reaksjonen var ferdig, ble reaksjonsblandingen helt over i 30 volumdeler metanol under isavkjøling, og det hele ble konsentrert under redusert trykk. Residuet ble tilsatt 100 volumdeler destillert vann, og det resulterende bunnfall ble oppsamlet og underkastet en ekstraksjon med 100 volumdeler etylacetat. Det vandige lag ble konsentrert under redusert trykk. Det konsen-trerte vandige lag ble så ført over på en kolonne av 90 volumdeler av en kation-utbyttingsharpiks ("Amberlite IRC-50" (NH4 - form)). Kolonnen ble vasket med 500 volumdeler destillert vann og så eluert med 300 volumdeler IN vandig ammoniakk.

Eluatet ble konsentrert under redusert trykk, og residuet oppløst i 50 volumdeler destillert vann og ført over på

en kolonne av 30 volumdeler av en kation-utbyttingsharpiks ("Amberlite CG-50I" (NH4<+->form)).

Kolonnen ble vasket med 100 volumdeler destillert vann

og eluert fraksjonsvis med 0-0,3N vandig ammoniakk (gradient-metbden).

Det oppnådde råprodukt ble ytterligere adsorbert på en kationisk utbyttingsharpiks ("Amberlite CG-50" (NH4<+->form)), og harpiksen ble eluert med 0-0,3N vandig ammoniakk. Fraksjoner som inneholdt 31-klor-3'-deoksyparamomyc in I ble slått sammen og konsentrert under redusert trykk. Konsentratet ble så lyofilisert, og man oppnådde 0,202 deler 3 *-klor-31-deoksyparamo-mycin I-dihydrat.

■ Elementæranalyse for c23H44N50i3C-1- • 2H2°

Beregnet: C 41,22; H 7,22; N 10,45; Cl 5,29

Funnet : C 40,97; H 7,09; N 10,73; Cl 5,03

TLC Rf-verdi: 0,55 (plate: "Art. 5721", Merck)

Paramomycin I: 0,41.

(En oppløsning av CHCl^ : metanol : vandig ammoniakk : vann = 1:4:2:1 ble brukt som elueringsmiddel).

Utgangsmaterialet, paramomycin 1-3'-fosfattetrahydrat, ble fremstilt som angitt i "The Journal of Antibiotics", 21, 22

(1968), idet man lot en uren enzymoppløsning fra Escherichia coli K12ML virke på paramomycin I.

Elementæranalyse for <C>23<H>46N5°17<P*>4H2°

Beregnet: C 35,98; H 7,09; N 9,12

Funnet : C 35,85; H 7,02; N 8,85

24 o

Optisk rotasjon (a)^ =+59,3 (c=l,01 i vann)

Ultrafiolett absorpsjon: Ingen spesifikk absorpsjon

IRAKBf cm-1 : 9 60.

maks

Rf-verdien var 0,46 ved tynnsjiktskromatografi idet man brukte en silisiumdioksydgel-glassplate ("Art. 5721", Merck) i et oppløsningsmiddelsystem som inneholdt 5 volumdeler av det øvre laget av CHCl^ : metanol : vandig ammoniakk : vann (4:3:2:1) og 3 volumdeler metanol. Fritt paramomycin I som ble anvendt som kontroll, hadde en Rf-verdi på 0,19.

I 20 volumdeler vann ble det oppløst 0,1 deler 3'-klor-3<1->deoksyparamomycin I, og oppløsningen ble tilsatt 0,3 volumdeler Raney-nikkel og 0,5 volumdeler trietylamin. Systemet ble så rystet i hydrogenstrøm ved atmosfæriske betingelser. Etter 4 timer ble katalysatoren frafiltrert. Katalysatoren ble så

vasket med 100 volumdeler av IN vandig ammoniakk, og vaskeoppløs-ningen ble slått sammen med filtratet og det hele konsentrert til tørrhet; Fremgangsmåten gir 0,091 deler av e.t råprodukt.

Dette råprodukt ble oppløst i 20 volumdeler destillert vann og

den vandige oppløsning ført over på en kolonne av 35 volumdeler av en kationisk utbyttingsharpiks ("Amberlite CG-50I" (NH4<+->form)). Kolonnen ble eluert med 0-0,5N vandig ammoniakk (gradientmetoden).

De resulterende fraksjoner ble konsentrert under redusert trykk

til tørrhet, og man fikk ialt fremstilt 0,0 7 deler 3'-deoksy-paramomycin I-dihydrat.

Elementæranalyse for C23<H>45<N>5°i3•<2>H2°

Beregnet: C 4 3,45; H 7,76; N 11,01

Funnet : C 43,29; H 7,65; N 10,91

TLC Rf-verdi: 0,47 (plate: "Art. 5721", Merck)

Kontroll, paramomycin I: 0,41.

(Som elueringsmiddel brukte man en blanding av CHCl^ : metanol: vandig ammoniakk : vann = 1:4:2:1).

Eksempel 8

En blanding av 0,6 deler ribostamycin-5"-fosfatdihydrat,

0,6 deler trifenylfosfin, 5 volumdeler trimetylsilylklorid, 2 volumdeler heksametyldisilazan, 2 volumdeler tørr pyridin og 0,3 deler sinkklorid ble holdt på 110°C i 48 timer. Etter at reaksjonen var ferdig, ble det tilsatt 150 volumdeler metanol under isavkjøling, og det hele ble konsentrert til tørrhet under redusert trykk. Residuet ble rystet med 150 volumdeler destillert vann og 150 volumdeler etylacetat. Det vandige lag ble kjørt gjennom en kolonne av 130 volumdeler av en kation-utbyttingsharpiks ("Amberlite IRC-50" (NH4<+->form)). Kolonnen ble vasket med 1500 volumdeler destillert vann og så eluert med 1200 volumdeler IN vandig ammoniakk. Eluatet ble konsen-

trert til ca. 300 volumdeler under redusert trykk, og konsen-

tratet ble kjørt over på en kolonne av 16 5 volumdeler av en kation-utbyttingsharpiks ("Amberlite CG-50" (NH4<+->form)).

Kolonnen ble vasket og eluert med 100 volumdeler destillert

vann og 1000 volumdeler 0-0,3N vandig ammoniakk (gradientmetoden).

De resulterende fraksjoner ble slått sammen og konsentrert til tørrhet og deretter lyofilisert, og dette ga 0,247 deler 5"-klor-5"-deoksyribostamycinmonohydrat.

Elementæranalyse for C-^H^N^OgCl .l^O

Beregnet:- C 41,59; H 7,18; N 11,41; Cl 7,22 Funnet : C 41,43; H 7,35; N 11,25; Cl 7,03.

Rf-verdien var 0,31 ved tynnsjiktskromatografi på en silisiumdioksydgel-glassplate ("Art. 5721", Merck) i et oppløs-ningsmiddelsystem som inneholdt 5 volumdeler av det øvre lag av CHCl^ : metanol : vandig ammoniakk : vann (4:3:2:1) og 3 volumdeler metanol, mens fritt ribostamycin som ble anvendt som kontroll, hadde en Rf-verdi på 0,24.

Utgangsmaterialet, ribostamycin 5"-fosfatdihydrat, ble fremstilt ved den fremgangsmåte, som er beskrevet i "Applied - Microbiology", 16 1276 (1968) idet man lot en uren enzym-oppløsning fra Pseudomonas aeruginosa R34R (FERM-P nr. 2124) virke på ribostamycin.

Elementæranalyse for ci7H35N4°;l3P•2H2°

Beregnet: C 35,79; H 6,89; N 9,82; P 5,43

Funnet : C 35,79; H 6,87; N 9,82; P 5,10

UV: Ingen spesifikk absorpsjon.

24 o

Optisk rotasjon: (c)D =+33,3 (c=0,600 i vann

IRAKBJ cm-1: 962.

maks

Rf-verdi var 0,25 ved tynnsjiktskromatografi idet man brukte silisiumdioksydgel-glassplater ("Art. 5721", Merck) i et oppløsningsmiddelsystem som inneholdt 5 volumdeler av det øvre lag av CHCl^ : metanol : vandig ammoniakk : vann (4:3:2:1) og 3 volumdeler metanol. Fritt ribostamycin som ble anvendt som kontroll, hadde en Rf-verdi på 0,24.

Tetra-N-acetylribostamycin-5"-fosfatdihydrat

Elementæranalyse. for ci7H35N4°^3P•2H2°

Beregnet: C 39,68; H 6,53; N 7,40; P 4,09

Funnet : C 39,20; H 6,52; N 7,29.; P 4,07

I 15 volumdeler vann ble det oppløst 0,15 deler 5"-klor-5"-deoksyribostamycin, og oppløsningen ble tilsatt 2 volumdeler

Raney-nikkel og 0,25 volumdeler trietylamin. Systemet ble så rystet i hydrogenstrøm ved atmosfæriske betingelser. Etter 7 timer ble katalysatoren frafiltrert. Katalysatoren ble så vasket med 150 volumdeler IN vandig ammoniakk, og vaskeoppløsningen ble slått sammen:med filtratet og det hele konsentrert til ca. 15 volumdeler. Det resulterende bunnfall ble frafiltrert. Filtratet ble kjørt over på en kolonne av 30 volumdeler av en kation-utbyttingsharpiks ("Amberlite CG-50" (NH4<+->form)). Kolonnen ble så vasket med vann og eluert med 0-0,3N NH^OH (gradientmetoden.

De .-resulterende fraksjoner ble slått sammen og konsentrert under redusert trykk, og dette ga 0,081 deler 5"-deoksy-ribostamycindihydrat.

Elementæranalyse for C^H-^OgN^ . 2H20

Beregnet: 43,03; H 8,07; N 11,81

Funnet : 43,07; H 7,89; N 11,51

Rf-verdi var 0,32 ved tynnsjiktskromatografi på en silisiumdioksydgel-glassplate ("Art. 5721", Merck) i et oppløs-ningsmiddelsystem som inneholdt 5 volumdeler av det øvre lag av CHCl^ : metanol : vandig ammoniakk : vann (4:3:2:1) og 3 volumdeler metanol. Fritt ribostamycin som ble anvendt som kontroll, hadde en Rf-verdi på 0,24.

NMR(D20) 6 ppm: 1,49(3H,d,J=5Hz, -CH )

Eksempel 9

En blanding av 0,5 deler ribostamycin 3'-fosfattrihydrat, 2,7 volumdeler trimetylsilylklorid, 1,2 volumdeler heksametyldisilazan, 2,25 volumdeler tørr pyridin og 0,21 deler trifenylfosfin ble på et oljebad holdt på en temperatur fra 100-110°C i 44 timer. Etter at reaksjonen var ferdig, ble 30 volumdeler metanol tilsatt reaksjonsblandingen under isavkjøling og det hele konsentrert under redusert trykk. Residuet ble rystet med 100 volum-, deler destillert vann og 100 volumdeler etylacetat. Det vandige lag ble konsentrert og ført over på en kolonne av 90 volumdeler av en kation-utbyttingsharpiks ("Amberlite IRC-50" (NH4<+->form)). Kolonnen ble vasket med 500 volumdeler destillert vann og så eluert med 300 volumdeler IN vandig ammoniakk. Eluatet ble konsentrert til tørrhet under redusert trykk, og man oppnådde ialt 0,239.,deler av.et råprodukt. Dette ble oppløst i 50 volumdeler destillert vann og kjørt over på en kolonne av 30 volumdeler av en kation-utbyttingsharpiks ("Amberlite CG-50I" (NH4<+->form)) .

Kolonnen ble vasket med 100 volumdeler destillert vann og eluert fraksjonsvis (gradientmetoden) med 0-0,3N vandig ammoniakk. Det oppnådde råprodukt ble igjen ført over på en kolonne av 20 volumdeler av en kation-utbyttingsharpiks ("Amber-lite CG-50" (NH4<+->form)). De resulterende fraksjoner ble slått sammen og konsentrert under redusert trykk og så lyofilisert, hvorved man fikk fremstilt 0,191 deler 3'-klor-3<1->deoksyribosta-mycinmonohydrat.

Elementæranalyse for <C>17<H>33N4OgCl.H20

Beregnet: C 41,59; H 7,18; N 11,41; Cl 7,22

Funnet : C 41,63; H 7,10; N 11,35; Cl 7,01

24 o

Optisk rotasjon (a)D =+36,8 (c=0,38 i vann).

Rf-verdi var 0,29 ved tynnsjiktkromatografi på en silisiumdioksydgel-glassplate ("Art. 5721", Merck) i et oppløsnings-middelsystem som inneholdt 5 volumdeler av det øvre lag av CHC13 : metanol : vandig ammoniakk : vann (4:3:2:1) og 3 volumdeler metanol. Fritt ribostamycin som ble anvendt som kontroll, hadde en Rf-verdi på 0,24.

Utgangsmaterialet, nemlig ribostamycin-3'-fosfattrihydrat, ble fremstilt ved den fremgangsmåte som er beskrevet i "The Journal of Antibiotics", 21, 22 (1968), idet man lot en uren enzymoppløsning av Escherichia coli JR66/W677 virke på ribostamycin .

Elementæranalyse for c17<H>35<N>4°i3<P>-3H2°

Beregnet: C 34,69; H 7,02; N 9,52; P 5,26

Funnet : C 34,79; H 6,86; N 9,31; P 5,05

UV: Ingen spesifikk absorbsjon.

24 o

Optisk rotasjon: (a)D 2+46,8 (c=0,635 i vann)

IRX<KB>5 cm"<1>: 9 55.

maks

Rf-verdien var 0,56 ved tynnsjiktkromatografi idet man anvendte en silisiumdioksydgel-glassplate ("Art. 5721", Merck)

i et oppløsningsmiddelsystem som inneholdt .5 volumdeler av det

øvre lag av CHCl^ : metanol : vandig ammoniakk : vann (4:3:2:1) og 3 volumdeler metanol. Fritt ribostamycin som ble anvendt som kontroll, hadde en Rf-verdi på 0,24.

Tetra-N-acetylribostamycin-3'-fosfatdihydrat

Elementæranalyse for C25H43<N>4°i7<P>•2H2°

Beregnet: C 40,65; H 6,41; N 7,59; P 4,19

Funnet : C 40,84; N 6,46; N 7,79; P 4,30

I 15 volumdeler vann ble det oppløst 0,1 del 3'-deoksy-3<1->klorribostamycin, og det ble tilsatt 0,3 volumdeler Rariey-nikkel. Systemet ble så rystet i en hydrogenstrøm ved atmosfæriske betingelser. Etter 4 timer ble katalysatoren frafiltrert. Katalysatoren ble så vasket med 100 volumdeler IN vandig ammoniakk, og vaskeoppløsningen ble slått sammen med filtratet og det hele konsentrert. Denne fremgangsmåte ga 0,09 deler av et urent pulver. Dette råprodukt ble oppløst i 20 volumdeler destillert vann og adsorbert på 35 volumdeler av en kation-utbyttingsharpiks ("Amberlite CG-50I" (NH4<+->form)) og eluert med fra 0-0,5N NH^OH (gradientmetoden).

De resulterende fraksjoner ble konsentrert under redusert trykk'og så lyofilisert, og dette ga 0,068 deler 3<1->deoksyribo-stamycinmonohydrat.

Elementæranalyse for ci- j^ 2A^ 4^ 9 ' H2°

Beregnet: C 44,72; H 7,94; N 12,27

Funnet : C 44,51; H 8,08 ; N 12,19

24 o

Optisk rotasjon: (a)D =+30,2 (c=0,605 i vann)

Rf-verdien var 0,29 ved tynnsjiktkromatografi, idet man anvendte en silisiumdioksydgel-glassplate ("Art. 5721", Merck) i et oppløsningsmiddelsystem som inneholdt 5 volumdeler av det øvre lag av CHCl^ : metanol : vandig ammoniakk : vann (4:3:2:1) og 3 volumdeler metanol. Fritt ribostamycin som ble anvendt som en kontroll, hadde en Rf-verdi på 0,24.

Eksempel 10

I 50 volumdeler metanol ble det oppløst 0,5 deler xylostasin-3'-fosfat og 5 volumdeler eddiksyreanhydrid. Blandingen ble hensatt ved romtemperatur i 40 timer. Reaksjonsopp-løsningen ble filtrert og filtratet konsentrert til omkring 10 volumdeler under redusert trykk. Til konsentratet ble det tilsatt aceton, og tetra-N-acetylxylostasin-3'-fosfat som ble ut-felt, ble innvunnet ved filtrering. Utbytte: 0,4 3 deler.

Elementæranalyse for C25H43<N>4°i7<P>-2H2°

Beregnet: C 40,65; H 6,41; N 7,59; P 4,19

Funnet : C 40,95; N 6,52; N 7,70; P 4,16

Rf-verdi ved tynnsjiktkromatografi var 0,0, mens Rf-verdien for tetra-N-acetyl-xylostasin var 0,75 (en blanding av CHCl^ : metanol = 7:3 ble benyttet som utviklingsmiddel).

En blanding av "1 del tetra-N-acetylxylostasin-3'-fosfat, 0,7 deler trifenylfosfin, 9 volumdeler trimetylsilylklorid, 4 volumdeler heksametyldisilazan og 7,5 volumdeler pyridin, ble oppvarmet ved 110°C i 45 timer. Reaksjonsoppløsningen ble helt i 200 volumdeler metanol under isavkjøling. Blandingen ble Jconsen.trert til tørrhet under redusert trykk. Til resten ble det tilsatt 200 volumdeler rent vann og uoppløselige stoffer ble innvunnet ved filtrering. De innvunnede bunnfall ble opp-løst i 100 volumdeler etylacetat og oppløsningen vasket med vann. Det vandige lag ble kombinert med filtratet og blandingen konsentrert under redusert trykk. Til resten ble det tilsatt eter, hvorved ca. 0,7 deler råprodukt ble oppnådd. Dette råprodukt ble oppløst i 70 volumdeler metanol, og til oppløsningen ble det tilsatt 7 volumdeler eddiksyreanhydrid, og blandingen ble hensatt ved romtemperatur natten over og deretter konsentrert under redusert trykk. Til resten ble det tilsatt eter, hvilket ga en utfelling av urent tetra-N-acetyl-3'-klor-3'-deoksyxylostasin.

Rf-verdi ved tynnsjiktkromatografi (TLC) var 0,17, mens verdien for tetra-N-acetylxylostasin var 0,75 (en blanding av CHClj : metanol = 7:3 ble benyttet som utviklingsmiddel. Silisiumdioksydgel-glassplate ("Art. 5721", Merck), ble benyttet som TLC-plate). De karakteristiske topper i massespektret for penta-O-trimetylsilylforbindelsen var : 949 (M<+->HC1-15), 717, 645, 419, 373, 319, 299, 259, 215.

De således oppnådde 0,5 deler tetra-N-acetyl-3'-klor-3<1->deoksyxylostasin ble oppløst i 50 volumdeler vann, og til oppløsningen ble det tilsatt 0,5 deler Raney-nikkel og 0,2 volumdeler trietylamin. Blandingen ble rystet i en strøm av hydrogen. Når absorpsjonen av hydrogengass opphørte, ble katalysatoren

fjernet ved filtrering. Filtratet ble konsentrert under redusert trykk, og resten ble deretter oppløst i metanol og oppløsningen filtrert. Til filtratet ble det tilsatt eter, hvilket ga 0,45 deler av uren tetra-N-acetyl-3<1->deoksyxylostasin som bunnfall.

Rf-verdi med tynnsjiktskromatografi var 0,13, mens verdien for tetra-N-acetylxylostasin var 0,75 (en blanding av CHCl^ : metanol = 7:3 ble benyttet som utviklingsmiddel). Silisiumdioksydgel-glassplate, "art. 5721", Merck, ble benyttet som TLC-plate). De karakteristiske topper i massespektret for penta-O-trimetylsilylforbindelsen var: 951 (M<+->15), 719, 301, 217, 117, 103.

De således oppnådde 0,4 deler tetra-N-acetyl-3<1->deoksyxylostasin ble oppløst i 20 volumdeler av en blanding av vann og metanol (2:1). Til oppløsningen ble det tilsatt 2 deler bariumhydroksyd, og blandingen ble oppvarmet ved 100°C i 48 timer i en nitrogenstrøm. Etter avkjøling ble det til reaksjonsblandingen tilsatt knust, tørr is for å utfelle overflødig bariumhydroksyd som bariumkarbonat, og bunnfallene ble fjernet ved filtrering. Filtratet ble tilført en kolonne av 50 volumdeler ioneutveksler-harpiks, "Amberlite CG-50" (NH4<+->form) for adsorpsjon. Kolonnen ble vasket med vann og deretter eluert med 0,1-0,5N NH^OH (gradientmetoden). Eluatet ble renset, og dette ga 0,3 deler 3<1->deoksyxylostasin. De fysikalsk-kjemiske egenskaper til den således oppnådde 3'-deoksyxylostasinforbindelse, var identiske med de for 3'-deoksyxylostasinforbindelsen oppnådd i eks. 1.

Claims (5)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av deoksyaminoglycosid-antibiotika, karakterisert ved at man (a) beskytter funksjonelle grupper i et fosforylert amino-r glycosid-antibiotikum med silyl- eller acylgrupper, idet det fosforylerte aminoglycosid-antibiotikum har følgende struktur-elle konfigurasjon: (i) fosfonoksygruppen er bundet til et sekundært karbonatom, (ii) nevnte karbonatom er bundet til et karbonatom som er bundet til en primær eller sekundær aminogruppe, og (iii) aminogruppen og fosfonoksygruppen har trans-konfi gurasjon i forhold til hverandre, eller det fosforylerte aminoglycosid-antibiotikum har en fosfonoksy- ..gruppe bundet til et primært karbonatom; (b) halogenerer den således oppnådde forbindelse, (c) reduserer den derved oppnådde forbindelse, mens man fjerner de beskyttende grupper ved å bringe den halogenerte eller hydrogenerte forbindelse i kontakt med et proton-avgivende middel.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at bskyttelsen av den funksjonelle gruppe og halogener-ingen utføres ved å omsette det fosforylerte aminoglycosid-antibiotikum med et halogensilan.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved at beskyttelsen av den funksjonelle gruppe og halogener-ingen utføres ved å omsette det fosforyliserte aminoglycosid-antibiotikum med trimetylsilylklorid og heksametyldisilazan.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at beskyttelsen av den funksjonelle gruppe og halogen-eringen utføres ved å omsette det fosforylerte aminoglycosid-antibiotikum med trimetylsilylklorid og bis-(trimetylsilyl)-acetamid.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved.. at reduksjonen utføres ved tilføring av hydrogengass ved en temperatur i området fra -30 til 150°C i nærvær av en katalysator i et oppløsningsmiddel.