NL8902301A - Humaan parvovirus b19 eiwitten, hun produktie en hun gebruik in diagnostische assays en vaccins. - Google Patents
Humaan parvovirus b19 eiwitten, hun produktie en hun gebruik in diagnostische assays en vaccins. Download PDFInfo
- Publication number
- NL8902301A NL8902301A NL8902301A NL8902301A NL8902301A NL 8902301 A NL8902301 A NL 8902301A NL 8902301 A NL8902301 A NL 8902301A NL 8902301 A NL8902301 A NL 8902301A NL 8902301 A NL8902301 A NL 8902301A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- protein
- virus
- human parvovirus
- recombinant
- genetic information
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 84
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 81
- 241000702617 Human parvovirus B19 Species 0.000 title claims abstract description 70
- 238000003556 assay Methods 0.000 title claims description 26
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 16
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 10
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims abstract description 62
- 101710081079 Minor spike protein H Proteins 0.000 claims abstract description 60
- 101710197658 Capsid protein VP1 Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 101710108545 Viral protein 1 Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 45
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 claims abstract description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 56
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 47
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 claims description 45
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 claims description 39
- 238000013320 baculovirus expression vector system Methods 0.000 claims description 37
- 241000484121 Human parvovirus Species 0.000 claims description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 10
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 9
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 3
- 230000018883 protein targeting Effects 0.000 claims 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 13
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 54
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 38
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 19
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 11
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 11
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 11
- 238000011997 immunoflourescence assay Methods 0.000 description 9
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000473945 Theria <moth genus> Species 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L (5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP([O-])(=O)[O-])=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 5,5-diethylbarbituric acid Chemical compound CCC1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 2
- 208000007985 Erythema Infectiosum Diseases 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101900151434 Human parvovirus B19 Minor capsid protein VP1 Proteins 0.000 description 2
- 108700020497 Nucleopolyhedrovirus polyhedrin Proteins 0.000 description 2
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 2
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 2
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 108010003087 parvovirus B19 capsid protein VP2 Proteins 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZSYLLSAWYUBPE-UHFFFAOYSA-L Fast green FCF Chemical compound [Na+].[Na+].C=1C=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C(=CC(O)=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=CC=1N(CC)CC1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1 RZSYLLSAWYUBPE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000001951 Fetal Death Diseases 0.000 description 1
- 206010055690 Foetal death Diseases 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 229960002319 barbital Drugs 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 231100000479 fetal death Toxicity 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007030 peptide scission Effects 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 241000701366 unidentified nuclear polyhedrosis viruses Species 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14311—Parvovirus, e.g. minute virus of mice
- C12N2750/14322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14311—Parvovirus, e.g. minute virus of mice
- C12N2750/14323—Virus like particles [VLP]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
BESCHRIJVING
Humaan parvovirus BI9 eiwitten, hun produktie en hun gebruik in diagnostische assays en vaccins
De uitvinding ligt zowel op het gebied van de genetische manipulatie door middel van de recombinant DNA technologie ten behoeve van de produktie van bepaalde eiwitten, als op de gebieden van de diagnostiek en de vaccinbereiding. De uitvinding' betreft bepaalde virale eiwitten, die bijv. gebruikt kunnen worden in assays voor het detecteren van tegen deze eiwitten gerichte antilichamen, of gebruikt kunnen worden om dergelijke antilichamen in handen te krijgen, of gebruikt kunnen worden om protectie tegen het virus te realiseren (derhalve gebruik voor vaccinatiedoeleinden). Meer in het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op de manteleiwitten VP1 en VP2 van het humane parvovirus BI9 en op virus-achtige partikels, die uit deze eiwitten bestaan. De uitvinding betreft tevens genetische informatie in de vorm van recombinante expressievectoren, die de voor deze eiwitten coderende genen bevatten, en organismen die dankzij genetische manipulatie onder toepassing van dergelijke vectoren het vermogen hebben verworven om de desbetreffende eiwitten te produceren.
Het humane parvovirus BI9 werd in 1975 bij toeval ontdekt in serummonsters van enkele gezonde bloeddonoren. Sindsdien is gebleken dat het virus de veroorzaker is van erythema infectiosum - ook wel bekend als "vijfde ziekte" - en van de zogenaamde "aplastische crisis" bij patiënten met chronische hemolytische anemie. Het B19-virus wordt voorts geassocieerd met abortus en vruchtdood, met arthritis en met chronische anemie bij immuundeficiënte patiënten. Infecties kunnen ook onder andere ziektebeelden voorkomen of geheel asymptomatisch verlopen.
Infecties met het over de gehele wereld voorkomende virus treden doorgaans op in epidemieën die ongeveer om de 3-6 jaar plaatsvinden, maar kunnen ook sporadisch optreden in tussenliggende jaren. Thans, veertien jaar na de ontdekking van het B19-virus, wordt de diagnostiek naar infectie met het virus nog steeds slechts in een beperkt aantal laboratoria ter wereld verricht. Omdat het virus op het moment dat de ziekteverschijnselen optreden niet meer bij de patiënten aantoonbaar is (viremie en virusuitscheiding gaan aan de symptomen vooraf), moet de diagnostiek zich richten op het aantonen van B19-specifieke (igM)-antistoffen.
Hiertoe (en bijv. ook voor de bereiding van geschikte vaccins) is het nóodzakelijk dat men kan beschikken over voldoende aanbod van B19-antigeen voor het opzetten van de testen. Een geschikt in-vitro-celkweeksysteem voor het vermenigvuldigen van het virus, waarmee voldoende antigeen kan worden verkregen, is echter niet beschikbaar.
De huidige parvo-B19-diagnostiek wordt uitgevoerd met virusantigeen dat min of meer toevallig ter beschikking komt (screening van bloeddonoren biedt een kans van naar schatting 1 op 50.000 op het aantreffen van viremisch bloed).
Om deze redenen bestaat er grote behoefte aan antigeen dat met behulp van recombinant DNA technieken wordt geproduceerd. Er zijn dan ook reeds verschillende voorstellen in deze richting gedaan, maar geen daarvan is echt bruikbaar gebleken voor het construeren van een diagnostische test.
De onderhavige uitvinding berust op het gebruik van een tamelijk recent ontwikkeld expressievector systeem, nl. het "Baculovirus Expressievector Systeem”. In dit systeem wordt gebruik gemaakt van een helper-onafhankelijke recombinant virusvector van het baculovirus Autographica californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) om de B19 viruseiwitten tot expressie te brengen in insektencellen: Spodoptera frugiperda (Sf9). Dit systeem biedt vele voordelen ten opzichte van de gangbare expressievectorsystemen: a) Met het oog op toepassing voor diagnostische en eventueel therapeutische (vaccinatie) doeleinden is geen kruisreac- tiviteit te verwachten tegen eiwitten van het baculovirus of de insektencellen (bij eiwitten die in E.coli tot expressie gebracht worden, is dit niet altijd uit te sluiten).
b) De viruseiwitten worden in grote hoeveelheden geproduceerd (1-500 mg/1) tot zelfs 50-75% van het totale eiwit, gedetecteerd op SDS-polyacrylamidegel (Summers en Smith, 1986, a manual of methods for baculovirus vector and insect cell culture procedures; Yong Kang, 1988; Adv. in Virus Res. 35, 177-192). Dit zijn aanmerkelijk grotere hoeveelheden dan de produktie in prokaryote expressiesystemen of in Chinese hamster ovarium cellen, zoals beschreven door Kajigaya et al (Blood 72(5), suppl.l, 44a, abstr. 86; 1988).
c) De eiwitten worden als non-fusieeiwitten geproduceerd, in tegenstelling tot bijvoorbeeld het B19-eiwit, dat als fusie-eiwit in E.coli geproduceerd is door Sisk en Berman (Biotechnology 5, 1077-1080, 1987). Dit recombinante β-galactosidase B19 fusieeiwit gaat alleen in oplossing bij aanwezigheid van natriumdodecylsulfaat (SDS). De volgens de uitvinding in insektencellen tot expressie gebrachte eiwitten VPl en VP2 kunnen daarentegen gemakkelijk in oplossing worden gebracht door sonificatie van de cellen in een buffer, die 25 mM NaHC03 en 20 mg/1 NaN3 (pH 9,5) bevat. Bij een dergelijke behandeling gaat 95% van de cellulaire eiwitten over in de oplosbare supernatant fractie.
d) De eiwitten worden geproduceerd in een gemakkelijk kweekbare insektencellijn, in tegenstelling tot de produktie van viruseiwitten in humane erythroide beenmergcellen (Ozawa et al, 1987; Blood 70, 384-391) of humane foetale erythroide levercellen (Yaegashi et al, 1989; J. Virol. 63, 2422-2426).
e) Omdat in het baculovirus expressievector systeem pre- en posttranslatie modificaties optreden, zoals fosforylering, glycosylering, signaalpeptide-afsplitsing en het verwijderen van introns door splicing, is het systeem zeer geschikt voor de produktie van biologisch actieve eiwitten met een (vrijwel) natieve structuur (Yong Kang, 1988; Adv. in Virus Res. 35, 177-192). In dit systeem kunnen VPl en VP2 van B19 zowel afzonderlijk als gezamenlijk tot expressie gebracht worden.
f) Een bijkomend voordeel van het baculovirus is, dat het zich niet vermenigvuldigt in zoogdiercellen en dus niet pathogeen is voor de mens, wat het werken met en het gebruiken van dit systeem veel veiliger maakt.
Volgens de uitvinding is het daadwerkelijk gelukt om de manteleiwitten VP1 en VP2 van het humane parvovirus B19 in een antigenisch werkzame vorm als non-fusieeiwitten in een hoge opbrengst te produceren met behulp van het baculovirus expressie systeem in insektencellen (Spodoptera frugiperda). Voorts is het gelukt om met de BI9 viruseiwitten producerende insektencellen een selectieve en gevoelige immuno-fluorescentie-assay (IFA) te ontwikkelen voor de detectie van tegen de B19 viruseiwitten gerichte antilichamen. Op basis van de conform de uitvinding in insektencellen geproduceerde BI9 viruseiwitten kunnen echter ook andere diagnostische assays worden ontwikkeld, zoals bijv. een Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay (ELISA), een Radio-Immuno-Assay (RIA) of een agglutinatietest.
De uitvinding wordt in de eerste plaats belichaamd in recombinant VP1 en VP2 eiwit van het humane parvovirus BI9, gevormd in Spodoptera frugiperda cellen die door middel van een baculovirus expressievector systeem zijn voorzien van de voor expressie van het B19 viruseiwit benodigde genetische informatie. De uitvinding strekt zich ook uit over recombinante virus-achtige partikels, die bestaan uit VP1 en VP2 eiwit van het humane parvovirus BI9, gevormd in Spodoptera frugiperda cellen die door middel van een baculovirus expressievector systeem zijn voorzien van de voor expressie van deze BI9 viruseiwitten benodigde genetische informatie.
Verder wordt de uitvinding belichaamd in Spodoptera frugiperda cellen die door middel van een baculovirus expressievector systeem zijn voorzien van de genetische informatie, welke voor expressie van VP1 en/of VP2 eiwit van het humane parvovirus BI9 benodigd is.
De uitvinding verschaft voorts een werkwijze voor het produceren van VP1 en/of VP2 eiwit van het humane parvovirus B19 (eventueel in de vorm van virus-achtige partikels, die uit beide eiwitten zijn opgebouwd) door Spodoptera frugiperda cellen te kweken, die door middel van een baculovirus expressievector systeem zijn voorzien van de genetische informatie, welke voor expressie van het B19 viruseiwit benodigd is. Desgewenst en bij voorkeur worden het in de cellen gevormde BI9 viruseiwit en/of de in de cellen gevormde virus-achtige partikels, die uit VP1 en VP2 eiwit bestaan, uit de cellen geïsoleerd. Een daartoe geschikte methode bestaat uit een sonificatie van de cellen in een buffer, die 25 mM NaHCC>3 en 20 mg/1 NaN3 (pH 9,5) bevat. Een dergelijke behandeling heeft tot gevolg, dat de in de cellen aanwezige eiwitten voor een groot gedeelte, bijv. voor 95%, in opgeloste vorm in de supernatant worden verkregen. Door op zichzelf bekende opzuiveringsmethodieken kunnen, de BI9 viruseiwitten in een hogere zuiverheid worden geïsoleerd.
De uitvinding wordt ook belichaamd in recombinante baculovirus expressievectoren, voorzien van de genetische informatie, welke voor expressie van VP1 en/of VP2 eiwit van het humane parvovirus BI9 in Spodoptera frugiperda cellen benodigd is. Voorkeursuitvoeringsvormen van dergelijke recombinante baculovirus expressievectoren zijn de verder te beschrijven plasmiden pAcB19VPl-YMl, pAcB19VP2-YMl en pAcB19VPl/2-YMl.
Tevens wordt de uitvinding belichaamd in recombinante baculovirussen, voorzien van de genetische informatie, welke voor expressie van VPl en/of VP2 eiwit van het humane parvovirus B19 in Spodoptera frugiperda cellen benodigd is. Voorkeursuitvoeringsvormen van dergelijke recombinante baculovirussen zijn de verder te beschrijven virussen AcB19VPlL, AcB19VP2L en ACB19VP1/2L.
De uitvinding strekt zich verder uit tot het gebruik van recombinant VPl en/of VP2 eiwit van het humane parvovirus B19, gevormd in Spodoptera frugiperda cellen die door middel van een baculovirus expressievector systeem zijn voorzien van de voor expressie van het B19 viruseiwit benodigde genetische informatie, in een assay voor het in een te onderzoeken monster detecteren van tegen het BI9 viruseiwit gerichte antilichamen.
De uitvinding omvat het gebruik van recombinante virus-achtige partikels, die bestaan uit VP1 en/of VP2 eiwit van het humane parvovirus B19, gevormd in Spodoptera frugiperda cellen die door middel van een baculovirus expressievector systeem zijn voorzien van de voor expressie van deze BI9 viruseiwitten benodigde genetische informatie, in een assay voor het in een te onderzoeken monster detecteren van tegen het B19 virus gerichte antilichamen. In voorkeursuitvoeringsvormen van de uitvinding gaat het hierbij om het gebruik van Spodoptera frugiperda cellen die door middel van een baculovirus expressievector systeem zijn voorzien van de genetische informatie, welke voor expressie van VP1 en/of VP2 eiwit van het humane parvovirus B19 benodigd is, in een assay voor het in een te onderzoeken monster detecteren van tegen het BI9 viruseiwit gerichte antilichamen, meer in het bijzonder in een immuno-fluorescentie-assay voor het in een te onderzoeken monster detecteren van tegen het B19 viruseiwit gerichte antilichamen.
Ook strekt de uitvinding zich uit over een vaccinpreparaat voor het induceren van een immuunrespons, die bescherming verleent tegen het humane parvovirus BI9, omvattende recombinant VP1 en/of VP2 eiwit van het humane parvovirus B19, gevormd in Spodoptera frugiperda cellen die door middel van een baculovirus expressievector systeem zijn voorzien van de voor expressie van het BI9 viruseiwit benodigde genetische informatie, of een antigeen werkzaam deel van dit recombinante BI9 viruseiwit, in combinatie met een of meerdere, voor vaccinatiedoeleinden geschikte dragers en/of hulpstoffen, alsmede over een vaccinpreparaat voor het induceren van een immuunrespons, die bescherming verleent tegen het humane parvovirus BI9, omvattende recombinante virus-achtige partikels, die bestaan uit VP1 en VP2 eiwit van het humane parvovirus BI9, gevormd in Spodoptera frugiperda cellen die door middel van een baculovirus expressievector systeem zijn voorzien van de voor expressie van deze BI9 viruseiwitten benodigde genetische informatie, in combinatie met een of meerdere, voor vaccinatiedoeleinden geschikte dragers en/of hulpstoffen.
De uitvinding omvat tevens het gebruik van recombinant VP1 en/of VP2 eiwit van het humane parvovirus B19 (of daaruit bestaande virus-achtige partikels), gevormd in Spodoptera frugiperda cellen die door middel van een baculovirus expressievector systeem zijn voorzien van de voor expressie van het B19 viruseiwit benodigde genetische informatie, of van een antigeen werkzaam deel van dit recombinante BI9 viruseiwit, voor het induceren van een immuunrespons, die bescherming verleent tegen het humane parvovirus BI9.
In het hiernavolgende experimentele gedeelte wordt bij wijze van toelichting getoond hoe de uitvinding in praktijk is gebracht en in praktijk kan worden gebracht. Zoals uit de voorbeelden blijkt, werden de DNA sequenties, coderend voor de structurele eiwitten VP1 en VP2 van het humane parvovirus B19, geïsoleerd uit het B19-virus uit het serum van een patient. Vervolgens werd via subcloneringsstappen in pUC19 en pUC7 het B19-DNA gedoneerd in de baculovirusvector pAcYMl achter de promoter voor het polyhedrine-gen van het baculovirus. Door middel van cotransfectie van deze recombinantvector met wildtype baculovirus DNA en daarop volgende recombinatie in de insekten-cellen (Spodoptera .£r.ug:ip.er:da) werd tenslotte recombinant virus geïsoleerd, dat na infectie in de insektencellen leidde tot de produktie van de manteleiwitten VP1 en VP2 van B19. Met behulp van deze B19-eiwitten producerende insektencellen is een diagnostische test ontwikkeld, "de Immuno-Fluorescentie-Assay (IFA) voor B19", die op snelle, eenvoudige en gevoelige wijze de mogelijkheid biedt tot detectie van B19-specifieke antilichamen (IgG zowel als IgM) in sera. De op deze wijze geproduceerde eiwitten kunnen eveneens dienen als eenvoudig te verkrijgen antigeen voor andere diagnostische testen als ELISA, RIA en agglutinatietests en als Bl9-eiwit voor de mogelijke produktie van vaccins en subunit-vaccins.
Flguurbeschrijving
Figuur 1 toont de genetische struktuur van het humane parvovirus BI9, dat een enkelstrengs DNA virus met een DNA van ongeveer 5500 nucleotiden is. Volgens Ozawa et al 1987; J.
Virol. 61, 2395-2406 bevatten de nucleotiden 2444-4787 de voor VP1 (84 kd) coderende sequentie en bevatten de nucleotiden 3125- 4787 de voor VP2 (58 kd) coderende sequentie. Niet weergegeven zijn de 4 splicing donor-sites, gelegen tussen de nucleotiden 2177 en 2195, en de 2 acceptor-sites, gelegen tussen de nucleotiden 3043 en 3050. Voor de produktie van VP2 tijdens de virus-replicatie wordt de tussenliggende sequentie (nucleotiden 2177-3050, waarin zich onder andere het startcodon voor VP1 bevindt) door splicing verwijderd.
Figuur 1 toont verder het cloneringsschema voor de constructie van recombinant baculovirus met humaan parvovirus BI9 genen.
Voorbeeld 1: Expressie van parvovirus B19 VP1.
1. Isolatie van parvovirus B19 DNA uit patientenserum.
Nadat in het serum van een patient B19 DNA was aangetoond door middel van de "polymerase chain reaction" en Dot-Spot-Hybridisatie met B19-specifieke DNA probes (Salimans et al, 1989; J. Virol. Meth. 23, 19-28) werd het B19 DNA hieruit geïsoleerd door incubatie met proteinase K en SDS (1 ml serum werd 2 uur bij 37°C geïncubeerd met 100 μg proteinase K in een buffer, die 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 5 mM EDTA en 0,5% SDS bevatte), phenol-extractie om het eiwit te verwijderen en DNA precipitatie door middel van ethanol. Het DNA werd gecontroleerd op grootte, restrictieenzym patronen en southern blot analyse (Maniatis et al, 1982; Molecular cloning; a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y.) met B19-specifieke DNA probes.
2. Subcloneren in pUC19 (figuur 1).
De technieken voor de manipulaties met B19-DNA en plasmide-DNA werden in essentie uitgevoerd zoals beschreven is door Maniatis et al (1982; Molecular cloning: a laboratory manual). Het B19 DNA werd geknipt met HindlII (bp 2430) en Seal (bp 4920) en in pUC19 (geknipt met HindlII en Smal) geligeerd teneinde een grotere hoeveelheid van de coderende sequentie te verkrijgen. (Door Seal in Smal te ligeren werd deze knipplaats verwijderd). Het verkregen plasmide (pUC19-B19VPl) werd gecontroleerd door restrictieenzym analyse en hybridisatie en getransformeerd naar en vermenigvuldigd in E.coli 0M101.
3. Subcloneren in pUC7 (figuur 1).
Om aan de uiteinden van het BI9 DNA BamHI-sites te creëren, werd het DNA gedoneerd naar pUC7, dat een symmetrische poly-linker bevat met twee BamHI-sites. Het B19 DNA werd uit pUC19 geknipt met HindiII en EcoRI en tevens met Seal om het restant van het vector-DNA te verwijderen. Het B19 DNA fragment met de juiste lengte werd uit agarosegel geïsoleerd, ingevuld met "Klenow large fragment polymerase" en geligeerd met Hindi geknipt pUC7 plasmide (eveneens blunt uiteinden). Het geligeerde DNA (PUC7-B19VP1) werd getransformeerd naar en vermenigvuldigd in E.coli JM101. Afzonderlijke colonies werden getest op de aanwezigheid van BI9 DNA door middel van restrictieenzym analyse en hybridisatie met een B19 specifieke DNA probe (het 700bp Pstl-fraoment van B19, Salimans et al, 1989; J. Virol.Meth. 23, 19-28).
4. Cloneren in de baculovirus-vector pAcYMl (figuur 1).
De technieken voor manipulaties met het baculovirus, de baculovirusvector en de insektencellen werden in essentie uitgevoerd als beschreven door Summers en Smith in 1986 (a manual of methods for baculovirusvector and insect cell culture procedures). De restrictie-site achter de polyhedrinepromoter van het baculovirus is een BamHI-site. Aangezien het B19 DNA ook een interne BamHI-site bevat werd voor de volgende strategie gekozen: het B19 DNA werd uit pUC7 geknipt met EcoRI en het resterende deel van pUC7 werd geknipt met Seal (deze Seal digestie is niet noodzakelijk voor cloneren van VP2 DNA). Het B19 DNA werd uit de gel geïsoleerd, gedefosforyleerd met Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP) en tenslotte werd een partiële digestie uitgevoerd met BamHI. Het BamHI-fragment met de juiste lengte (2,5 kb voor VPl en 1,8 kb voor VP2) werd vervolgens geligeerd met, met BamHI geknipte en CIP behandelde baculovirusvector, pAcYMl (Matsuura et al, 1987; J. Gen. Virol. 68, 1233-1250). Het aldus verkregen plasmide (pAcB19VPl-YMl) werd in E.coli HB101 vermenigvuldigd. Recombinante plasmiden werden gecontroleerd op de aanwezigheid van BI9 DNA (met specifieke B19 DNA probes) en de juiste oriëntatie hiervan ten opzichte van de polyhedrine promotor (door middel van restrictieenzym analyse). Constructen met de juiste oriëntatie werden opgekweekt en geïsoleerd uit de bacteriecellen volgens "the rapid boiling" methode van Holmes en Quigley (1981; Anal. Bioch. 114, 193-197) met een laatste zuivering op een CsCl-gradient.
5. Cotransfectie met wildtype baculovirus DNA:AcNPV (figuur 1). Door middel van een cotransfectie van het pAcB19VPl-YMl construct met wildtype baculovirus DNA (AcNPV) werd het DNA in de insektencellen (Spodoptera frugiperda-Sf9) gebracht (volgens methode II van Summers en Smith, 1986; a manual of methods for baculovirusvector and insect cell culture procedures). In 0,5-3,0% van de infecties recombineert de recombinant vector (pAcB19VPl-YMl) met het wildtype virus DNA tijdens de opname in de cellen, aldus een recombinant virus genererend, dat het B19 DNA bevat: ACB19VP1L. Het polyhedrine-gen is vervangen door het VP1 DNA (in voorbeeld 2, waarin de vorming van een recombinant virus AcB19VP2L wordt beschreven, door het VP2 DNA) .
6. Zuiveren van recombinant-virus (AcB19VPlL, resp. AcB19VP2L). De titer van het virus (wildtype zowel als recombinant) geproduceerd door de Sf9-cellen werd bepaald door middel van een plaque-assay. Twintig plaque-forming units (pfu) werden op een monolaag van Sf9-cellen in een 96-well plaat gebracht (20 pfu/well) en geïncubeerd bij 27°C. Drie dagen na de infectie werden de supernatanten verwijderd en bewaard en de cellen gelyseerd en gespot op nitrocellulose (Pen et al, 1989; Nucl. Acid Res. 17, 451). Met een parvovirus B19 specifieke DNA probe werd gescreend op de aanwezigheid van recombinant virus. De titer van de verzamelde supernatanten van recombinant virus bevattende wells werd door middel van een plaque-assay bepaald en vervolgens uitverdund tot 1 pfu/well op een 96-well plaat. Na een screening als hierboven beschreven met de dot-spot- hybridisatie-assay werd van de positieve supernatanten in een plaque-assay de titer bepaald en bovendien met een microscoop gescreend op de afwezigheid van het polyhedrine eiwit in de plaques, aangevend dat de plaque recombinant virus bevat. Deze plaques werden geënt op een Sf9-monolaag in een 96 well plaat.
Na drie dagen werd weer een dot-spot-hybridisatie uitgevoerd en positieve wells werden in een plaque-assay gecontroleerd. De recombinanten werden als zuiver beschouwd wanneer minder dan 1 op de 500 plaques wildtype virus bevatte.
7. Controle van het recombinant virus (ACB19VP1L).
Uit cellen, geïnfecteerd met recombinant virus, werd totaal DNA geïsoleerd, geknipt met restrictieenzymen en na southern blotting gecontroleerd door hybridisatie met parvovirus B19 specifieke DNA probes.
Zuiver recombinant virus werd gebruikt om insektencellen (Sf9) te infecteren met een m.o.i. (multiplicity of infection) van 1-5 en parvovirus VP1 en VP2 in deze cellen tot expressie te brengen. Vervolgens werden de manteleiwitten VP1 en VP2 van het humane parvovirus BI9, geproduceerd in het baculovirus expressievector systeem, geanalyseerd en gecontroleerd met de hieronder beschreven technieken: 8. Biosynthese van recombinant VPl.
Twee dagen na infectie met recombinant virus (ACB19VP1L, m.o.i. 5) werden insektencellen (106 Sf9-cellen in 35mm-petrischaal) gedurende 4 uren gekweekt bij 27°C in methioninevrij "Grace"-medium waaraan 100 uCi 35S-methionine was toegevoegd, om de "de novo" synthese van eiwitten te bepalen. Nadat de supernatant was verwijderd, werden de cellen opgenomen in PBS (phosphate buffered saline). Zowel supernatant als celfraktie werden opgenomen in lyserende buffer, gedurende 5 minuten gekookt en op een 10% SDS-polyacrylamidegel geanalyseerd. Dezelfde experimenten werden uitgevoerd met ongeïnfecteerde en wildtype baculovirus geïnfecteerde cellen. Na autoradiografie (niet getoond) bleek dat de polyhedrineband (30kd), die bij de wildtype infectie sterk overheerste, verdween bij de recombinant virussen en dat een eiwit ter grootte van het VP1 van B19 (84kd) werd gesynthetiseerd.
9. Analyse op SDS-PAGE.
Spodoptera frugiperda cellen werden na infectie met recombinant virus (m.o.i.5) gedurende vijf dagen geanalyseerd op de produktie van VP1 van Bl9-virus op 10% SDS-polyacrylamidegel. De gels werden gekleurd met "fast green". Uit de (niet getoonde) gelresultaten bleek, dat VPl in grote hoeveelheden vanaf dag 2 werd geproduceerd als een stabiel produkt, dat ook na 5 dagen nog duidelijk aanwezig was. VPl werd in vergelijkbare hoeveelheden geproduceerd als het polyhedrine-eiwit in wildtype baculovirus geïnfecteerde cellen.
10. Antigeniciteit van de geproduceerde eiwitten.
100 ng eiwit van cellysaten van Sf9-cellen 2 dagen na infectie (m.o.i.5) werd geëlectroforeerd op 10% SDS-polyacrylamidegel en geblot naar nitrocellulose (3 uur; 70V in 25mM Tris, 192 mM glycine en 20% methanol). Vervolgens werden 20 humane sera getest op reactiviteit met het recombinant VPl antigeen (15 IgG-positieve sera en 5 IgG negatieve sera). De reacties werden bij kamertemperatuur uitgevoerd: overnacht blokkade door incubatie van het nitrocellulosefilter in PBS/ 5% Foetal Calf Serum (FCS)/ 0.05% Tween 20; incubatie met sera (1:500 verdunning voor de positieve sera en 1:50 verdunning voor de negatieve sera) verdund in PBS/ 5% FCS gedurende 1,5 uur; daarna wassen van de filters gedurende 1 uur met PBS/ 0,05% Tween 20 en vervolgens incuberen met 1:500 verdund alkalisch phosphatase gelabeld geit-anti-mens-totaal Ig (Tago, cat.no.:2493) in PBS/ 0.05% Tween 20/ 5%FCS; na 2x wassen in PBS/ 0,05% Tween 20 en 2x in PBS werden gebonden antilichamen gedetecteerd met 5-bromo-4-chloro-3-indolyl fosfaat (BCIP). De 15 positieve IgG sera reageerden alle met de recombinant-VPl band op de gel en de 5 negatieve IgG sera gaven geen reactie.
11. Testen van sera in een immuno-fluorescentie-assay. Sf9-cellen, geïnfecteerd met recombinant virus (AcB19VPlL, m.o.i.l), werden na 3-4 dagen opgenomen in TC100 medium (Gibco-BRL), met ongeïnfecteerde cellen gemengd tot een percentage van ongeveer 25% B19 recombinant VP1 bevattende cellen en gespot op 18 well-glaasjes (nutacon, cat.no.10-404) met een concentratie van ongeveer 5000 cellen/well (5 ul) en na drogen aan de lucht gefixeerd in 100% aceton gedurende 20 minuten bij -20°C. Vervolgens werden de cellen geïncubeerd met humane sera (positieve en negatieve sera voor B19-Ig) bij verschillende verdunningen in VBS (veronal buffered saline). Deze sera werden voorbehandeld met leverpoeder voor een reductie van mogelijke achtergrondkleuring. Na incubatie gedurende 1-2 uren bij 37°C werden de glaasjes gewassen in PBS en aan de lucht gedroogd voordat geïncubeerd werd met een 1:40 verdunning van FITC-gelabeld geit-anti-mens-IgG (Kallestad, cat.no.:104) in VBS met 1:500 "Evans Blue" (Hoffmann La Roche). Na wassen in PBS en drogen aan de lucht werd Tris/glycerol buffer (Ig Tris in PBS, 80% glycerol, pH 9,9) toegevoegd en geanalyseerd onder de UV-microscoop. In B19-IFA's met positieve patienten-sera waren naast de fluorescerende cellen ook niet-geïnfecteerde cellen waarneembaar (de resultaten worden niet getoond). De bruikbaarheid van de B19-IFA werd in een aantal onderbeschreven experimenten getest: a) "Dubbel-blind" experiment.
30 patiënten sera werden volgens de procedure in 1:50 en 1:500 verdunningen getest, waarbij voor de "onderzoeker" onbekend was welke van de sera positief of negatief waren. Na aflezing door meerdere medewerkers werden de uitslagen vergeleken met de data uit de RIA-test (Cohen et al, 1983; J. Hyg. 91, 113-130): alle 17 IgG-positieve sera werden in de B19-IFA als positief afgelezen en alle 13 IgG-negatieve sera als negatief.
b) Titratie.
Van een aantal bekend positieve patiënten (volgens de testresultaten van de RIA, uitgevoerd met totaal virus uit serum geïsoleerd, Cohen et al, 1983; J. Hyg, 91, 113-130) werd een IFA-titer bepaald. De resultaten zijn weergegeven in tabel 1.
Uit de data blijkt, dat deze B19-IFA overeenkomstige resultaten geeft met de RIA gegevens: sera met hoog positieve waarden in de RIA hebben ook in de B19-IFA hoge titers en sera met laag positieve waarden in de RIA geven lagere titers in de B19-IFA.
c) Screening van donoren.
100 willekeurig geselecteerde bloeddonoren werden gescreend op de aanwezigheid van B19-specifieke IgG antilichamen en uit de resultaten bleek, dat in deze B19-IFA 76% van de donoren positief waren, wat zeer wel overeenstemt met de gegevens zoals die voor het humane parvovirus BI9 beschreven zijn voor deze leeftijdsgroep.
Voorbeeld 2: Expressie van parvovirus B19 VP2.
Subcloneren van VP2 in pUC7.
Voor de clonering van het VP2 van parvovirus BI9 werd uitgegaan van het BI 9 DNA dat in pUC19 is gedoneerd volgens de procedure zoals beschreven in voorbeeld 1 onder punten 1 en 2. Een 1,8 kb fragment, coderend voor VP2, werd met Hpall (bp3083) en EcoRI uit het pUC19 construct (pUC19-B19VPl) geknipt, uit agarosegel geïsoleerd, ingevuld met "Klenow large fragment DNA polymerase" en geligeerd met, met Hindi geknipt pUC7 plasmide. Het nieuwe pUC7 construct (pUC7-Bl9VP2) werd vervolgens vermenigvuldigd in E.coli JM101. Bacteriecolonies werden vervolgens getest op de aanwezigheid van een B19-insertie door middel van restrictie-enzymanalyse en hybridisatie met een B19 specifieke DNA probe (Salimans et al, 1989; J. Virol. Meth. 23, 19-28). Verder werd dezelfde procedure gevolgd zoals beschreven is voor VP1 in voorbeeld 1 onder punten 4-7 om recombinant baculovirus met het DNA coderend voor VP2 van het humane parvovirus te genereren en VP2 te produceren in de insektencellen (AcB19VP2L).
Voorbeeld 3: Expressie van parvovirus B19 VPl en VP2 met behulp van een recombinant baculovirus
Voor de produktie van VPl en VP2 wordt "in vivo" dezelfde parvovirus promoter gebruikt. Dankzij een splicingsmechanisme kunnen beide eiwitten worden geproduceerd. De optredende splicing leidt tot een verwijdering van het VPl startcodon, zodat het aparte startcodon van VP2 gebruikt kan worden voor de produktie van VP2. Omdat een dergelijk splicingsproces ook in het baculovirus expressiesysteem kan plaatsvinden (dit is voor poliovirus aangetoond door Urakawa et al, J. Gen. Virol. 70, 1453-1463, 1989) werd voor de gelijktijdige produktie van VPl en VP2 met een recombinant baculovirus (eventueel leidend tot de vorming van parvovirus-achtige partikels, zoals- ook beschreven is voor poliovirus) een 2,85 kb fragment van B19 DNA gedoneerd, dat de genoemde splicing donor- en acceptor-sites bevat.
Daartoe werd BI9 DNA, geïsoleerd volgens de in voorbeeld 1 onder punt 1 beschreven procedure, geknipt met Aval (bp 2071) en Seal (bp 4920), ingevuld met "Klenow large fragment polymerase" en geligeerd met het met Hindi geknipte pUC7 plasmide. Het nieuwe pUC7 construct (pUC7-B19VPl/2) werd vervolgens in E.. coli JM101 vermenigvuldigd. Daarna werd dezelfde procedure gevolgd als beschreven in voorbeeld 2 om recombinant baculovirus met het DNA, coderend voor VPl inclusief de daaraan voorafgaande splicing sites van het humane parvovirus B19, te genereren en zowel VPl als VP2 in de insektencellen (AcB19VPl/2L) te produceren.
Tabel 1: Vergelijking tussen B19-IFA titers van IgG positieve sera en RIA a.u. (arbitrary units).
Patientensera_RIAfa.u.)_B19-IFA titer 1 >100 >16384 2 100 >16384 3 91 16384 4 70 >16384 5 58 >16384 6 55 >16384 7 42 16384 8 40 16384 9 25 8192 10 15,5 4096 11 11 4096 12 8,4 4096 13 7,6 1024 14 4,2 512 15 4,0 512 16 2,5 17 1,8 256 18 1,2 19 --- 20 21 ---
Claims (39)
1. Recombinant VP1 eiwit van het humane parvovirus B19, gevormd in Spodoptera frugiperda cellen die door middel van een baculovirus expressievector systeem zijn voorzien van de voor expressie van het B19 viruseiwit benodigde genetische informatie.
2. Spodoptera frugiperda cellen die door middel van een baculovirus expressievector systeem zijn voorzien van de genetische informatie, welke voor expressie van VP1 eiwit van het humane parvovirus B19 benodigd is.
3. Werkwijze voor het produceren van VP1 eiwit van het humane parvovirus BI9 door Spodoptera frugiperda cellen te kweken, die door middel van een baculovirus expressievector systeem zijn voorzien van de genetische informatie, welke voor expressie van het B19 viruseiwit benodigd is.
4. Werkwijze volgens conclusie 3, waarbij het in de cellen gevormde BI9 viruseiwit uit de cellen wordt geïsoleerd.
5. Recombinante baculovirus expressievector, voorzien van de genetische informatie, welke voor expressie van VP1 eiwit van het humane parvovirus B19 in Spodoptera frugiperda cellen benodigd is.
6. Recombinante baculovirus expressievector pAcB19VPl-YMl.
7. Recombinant baculovirus, voorzien van de genetische informatie, welke voor expressie van VPl eiwit van het humane parvovirus B19 in Spodoptera frugiperda cellen benodigd is.
8. Recombinant baculovirus ACB19VP1L.
9. Gebruik van recombinant VPl eiwit van het humane parvovirus BI9, gevormd in Spodoptera frugiperda cellen die door middel van een baculovirus expressievector systeem zijn voorzien van de voor expressie van het B19 viruseiwit benodigde genetische informatie, in een assay voor het in een te onderzoeken monster detecteren van tegen het B19 viruseiwit gerichte antilichamen.
10. Gebruik van Spodoptera frugiperda cellen die door middel van een baculovirus expressievector systeem zijn voorzien van de genetische informatie, welke voor expressie van VPl eiwit van 'het humane parvovirus B19 benodigd is, in een assay voor het in een te onderzoeken monster detecteren van tegen het BI9 viruseiwit gerichte antilichamen.
11. Gebruik van Spodoptera frugiperda cellea die door middel van een baculovirus expressievector systeem zijn voorzien van de genetische informatie, welke voor expressie van VPl eiwit van het humane parvovirus B19 benodigd is, in een immuno-fluorescentie-assay voor het in een te onderzoeken monster detecteren van tegen het BI9 viruseiwit gerichte antilichamen.
12. Vaccinpreparaat voor het induceren van een immuunrespons, die bescherming verleent tegen het humane parvovirus B19, omvattende recombinant VPl eiwit van het humane parvovirus B19, gevormd in Spodoptera frugiperda cellen die door middel van een baculovirus expressievector systeem zijn voorzien van de voor expressie van het BI9 viruseiwit benodigde genetische informatie, of een antigeen werkzaam deel van dit recombinante B19 viruseiwit, in combinatie met een of meerdere, voor vaccinatiedoeleinden geschikte dragers en/of hulpstoffen.
13. Gebruik van recombinant VPl eiwit van het humane parvovirus BI9, gevormd in Spodoptera frugiperda cellen die door middel van een baculovirus expressievector systeem zijn voorzien van de voor expressie van het B19 viruseiwit benodigde genetische informatie, of van een antigeen werkzaam deel van dit recombinante BI9 viruseiwit, voor het induceren van een immuunrespons, die bescherming verleent tegen het humane parvovirus BI9.
14. Recombinant VP2 eiwit van het humane parvovirus B19, gevormd in Spodoptera frugiperda cellen die door middel van een baculovirus expressievector systeem zijn voorzien van de voor expressie van het B19 viruseiwit benodigde genetische informatie.
15. Spodoptera frugiperda cellen die door middel van een baculovirus expressievector systeem zijn voorzien van de genetische informatie, welke voor expressie van VP2 eiwit van het humane parvovirus B19 benodigd is.
16. Werkwijze voor het produceren van VP2 eiwit van het humane parvovirus B19 door Spodoptera frugiperda cellen te kweken, die door middel van een baculovirus expressievector systeem zijn voorzien van de genetische informatie, welke voor expressie van het BI9 viruseiwit benodigd is.
17. Werkwijze volgens conclusie 16, waarbij het in de cellen gevormde Bl9 viruseiwit uit de cellen wordt geïsoleerd.
18. Recombinante baculovirus expressievector, voorzien van de genetische informatie, welke voor expressie van VP2 eiwit van het humane parvovirus B19 in Spodoptera frugiperda cellen benodigd is.
19. Recombinante baculovirus expressievector pAcB19VP2-YMl.
20. Recombinant baculovirus, voorzien van de genetische informatie, welke voor expressie van VP2 eiwit van het humane parvovirus B19 in Spodoptera frugiperda cellen benodigd is.
21. Recombinant baculovirus AcB19VP2L.
22. Gebruik van recombinant VP2 eiwit van het humane parvovirus B19, gevormd in Spodoptera frugiperda cellen die door middel van een baculovirus expressievector systeem zijn voorzien van de voor expressie van het B19 viruseiwit benodigde genetische informatie, in een assay voor het in een te onderzoeken monster detecteren van tegen het B19 viruseiwit gerichte antilichamen.
23. Gebruik van Spodoptera frugiperda cellen die door middel van een baculovirus expressievector systeem zijn voorzien van de genetische informatie, welke voor expressie van VP2 eiwit van het humane parvovirus B19 benodigd is, in een assay voor het in een te onderzoeken monster detecteren van tegen het B19 viruseiwit gerichte antilichamen.
24. Gebruik van Spodoptera frugiperda cellen die door middel van een baculovirus expressievector systeem zijn voorzien van de genetische informatie, welke voor expressie van VP2 eiwit van het humane parvovirus B19 benodigd is, in een immuno-fluorescentie-assay voor het in een te onderzoeken monster detecteren van tegen het B19 viruseiwit gerichte antilichamen.
25. Vaccinpreparaat voor het induceren van een immuunrespons, die bescherming verleent tegen het humane parvovirus BI9, omvattende recombinant VP2 eiwit van het humane parvovirus B19, gevormd in Spodoptera frugiperda cellen die door middel van een baculovirus expressievector systeem zijn voorzien van de voor expressie van het B19 viruseiwit benodigde genetische informatie, of een antigeen werkzaam deel van dit recombinante BI9 viruseiwit, in combinatie met een of meerdere, voor vaccinatiedoeleinden geschikte dragers en/of hulpstoffen.
26. Gebruik van recombinant VP2 eiwit van het humane parvovirus BI9, gevormd in Spodoptera frugiperda cellen die door middel van een baculovirus expressievector systeem zijn voorzien van de voor expressie van het B19 viruseiwit benodigde genetische informatie, of van een antigeen werkzaam deel van dit recombinante B19 viruseiwit, voor het induceren van een immuunrespons, die bescherming verleent tegen het humane parvovirus B19.
27. Recombinante virus-achtige partikels, die bestaan uit VP1 en VP2 eiwit van het humane parvovirus B19, gevormd in Spodoptera frugiperda cellen die door middel van een baculovirus expressievector systeem zijn voorzien van de voor expressie van deze B19 viruseiwitten benodigde genetische informatie.
28. Spodoptera frugiperda cellen die door middel van een baculovirus expressievector systeem zijn voorzien van de genetische informatie, welke voor expressie van VP1 en VP2 eiwit van het humane parvovirus BI9 benodigd is.
29. Werkwijze voor het produceren van VP1 en VP2 eiwit van het humane parvovirus B19, en/of van virus-achtige partikels, die bestaan uit VP1 en VP2 eiwit van het humane parvovirus B19, door Spodoptera frugiperda cellen te kweken, die door middel van een baculovirus expressievector systeem zijn voorzien van de genetische informatie, welke voor expressie van deze B19 viruseiwitten benodigd is.
30. Werkwijze volgens conclusie 29, waarbij de in de cellen gevormde B19 viruseiwitten en/of virus-achtige partikels, die uit deze eiwitten bestaan, uit de cellen worden geïsoleerd.
31. Recoinbinante baculovirus expressievector, voorzien van de genetische informatie, welke voor expressie van VP1 en VP2 eiwit van het humane parvovirus BI9 in Spodoptera frugiperda cellen benodigd is.
32. Recombinante baculovirus expressievector pAcBl9VPl/2-YMl.
33. Recombinant baculovirus, voorzien van de genetische informatie, welke voor expressie van VPl en VP2 eiwit van het humane parvovirus BI9 in Spodoptera frugiperda cellen benodigd is.
34. Recombinant baculovirus AcB19VPl/2L.
35. Gebruik van recombinante virus-achtige partikels, die bestaan uit VPl en VP2 eiwit van het humane parvovirus BI9, gevormd in Spodoptera frugiperda cellen die door middel van een baculovirus expressievector systeem zijn voorzien van de voor expressie van deze B19 viruseiwitten benodigde genetische informatie, in een assay voor het in een te onderzoeken monster detecteren van tegen het B19 virus gerichte antilichamen.
36. Gebruik van Spodoptera frugiperda cellen die door middel van een baculovirus expressievector systeem zijn voorzien van de genetische informatie, welke voor expressie van VPl en VP2 eiwit van het humane parvovirus BI9 benodigd is, in een assay voor het in een te onderzoeken monster detecteren van tegen het BI9 virus gerichte antilichamen.
37. Gebruik van Spodoptera frugiperda cellen die door middel van een baculovirus expressievector systeem zijn voorzien van de genetische informatie, welke voor expressie van VPl en VP2 eiwit van het humane parvovirus BI9 benodigd is, in een immuno-fluorescentie-assay voor het in een te onderzoeken monster detecteren van tegen het BI9 virus gerichte antilichamen.
38. Vaccinpreparaat voor het induceren van een immuunrespons, die bescherming verleent tegen het humane parvovirus B19, omvattende recombinante virus-achtige partikels, die bestaan uit VPl en VP2 eiwit van het humane parvovirus BI9, gevormd in Spodoptera frugiperda cellen die door middel van een baculovirus expressievector systeem zijn voorzien van de voor expressie van deze B19 viruseiwitten benodigde genetische informatie, in combinatie met een of meerdere/ voor vaccinatiedoeleinden geschikte dragers en/of hulpstoffen.
39. Gebruik van recombinante virus-achtige partikels, die bestaan uit VP1 en VP2 eiwit van het humane parvovirus B19, gevormd in Spodoptera frugiperda cellen die door middel van een baculovirus expressievector systeem zijn voorzien van de voor expressie van deze B19 viruseiwitten benodigde genetische informatie, voor het induceren van een immuunrespons, die bescherming verleent tegen het humane parvovirus BI9.
Priority Applications (11)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8902301A NL8902301A (nl) | 1989-09-14 | 1989-09-14 | Humaan parvovirus b19 eiwitten, hun produktie en hun gebruik in diagnostische assays en vaccins. |
| ES90914243T ES2073036T5 (es) | 1989-09-14 | 1990-09-11 | Proteinas b19 de parpovirus humano y particulas de tipo virus, su produccion y su utilizacion en pruebas de diagnostico y vacunas. |
| EP90914243A EP0491824B2 (en) | 1989-09-14 | 1990-09-11 | Human parvovirus b19 proteins and virus-like particles, their production and their use in diagnostic assays and vaccines |
| DK90914243T DK0491824T4 (da) | 1989-09-14 | 1990-09-11 | Humane parvovirus B19-proteiner og viruslignende partikler, deres fremstilling og anvendelse til diagnostiske bestemmelser og vacciner |
| DE69019359T DE69019359T3 (de) | 1989-09-14 | 1990-09-11 | Menschliche parvovirus-b19-proteine und virusähnliche partikeln, deren herstellung sowie deren verwendung in diagnostischen tests und in impfstoffen. |
| PCT/NL1990/000130 WO1991004330A1 (en) | 1989-09-14 | 1990-09-11 | Human parvovirus b19 proteins and virus-like particles, their production and their use in diagnostic assays and vaccines |
| AT90914243T ATE122395T1 (de) | 1989-09-14 | 1990-09-11 | Menschliche parvovirus-b19-proteine und virusähnliche partikeln, deren herstellung sowie deren verwendung in diagnostischen tests und in impfstoffen. |
| US08/465,557 US6379885B1 (en) | 1989-09-14 | 1995-06-05 | Human parvovirus B19 proteins and virus-like particles, their production and their use in diagnostic assays and vaccines |
| US08/461,988 US6287815B1 (en) | 1989-09-14 | 1995-06-05 | Human parvovirus B19 proteins and virus-like particles, their production and their use in diagnostic assays and vaccines |
| US08/465,747 US6204044B1 (en) | 1989-09-14 | 1995-06-06 | Human parvovirus B19 proteins and virus-like particles, their production and their use in diagnostic assays and vaccines |
| US09/948,234 US20020119527A1 (en) | 1989-09-14 | 2001-09-07 | Human parvovirus B19 proteins and virus-like particles, their production and their use in diagnostic assays and vaccines |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8902301A NL8902301A (nl) | 1989-09-14 | 1989-09-14 | Humaan parvovirus b19 eiwitten, hun produktie en hun gebruik in diagnostische assays en vaccins. |
| NL8902301 | 1989-09-14 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL8902301A true NL8902301A (nl) | 1991-04-02 |
Family
ID=19855310
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL8902301A NL8902301A (nl) | 1989-09-14 | 1989-09-14 | Humaan parvovirus b19 eiwitten, hun produktie en hun gebruik in diagnostische assays en vaccins. |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0491824B2 (nl) |
| AT (1) | ATE122395T1 (nl) |
| DE (1) | DE69019359T3 (nl) |
| DK (1) | DK0491824T4 (nl) |
| ES (1) | ES2073036T5 (nl) |
| NL (1) | NL8902301A (nl) |
| WO (1) | WO1991004330A1 (nl) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU631159B2 (en) * | 1988-11-14 | 1992-11-19 | United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The | Parvovirus capsids |
| ES2279020T3 (es) * | 1991-07-19 | 2007-08-16 | The University Of Queensland | Vacuna contra el papilomavirus humano. |
| ES2048646B1 (es) * | 1992-04-15 | 1994-10-01 | Ercros Sa | Procedimiento para la obtencion de la proteina vp2 del virus de la peste equina africana (ahsv) |
| US5437951A (en) | 1992-09-03 | 1995-08-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Self-assembling recombinant papillomavirus capsid proteins |
| ATE188746T1 (de) * | 1993-10-28 | 2000-01-15 | Deutsches Krebsforsch | Adeno-assozierter virus - dessen diagnostischen anwendung für frühe abtreibung |
| AU5103396A (en) * | 1995-03-08 | 1996-09-23 | Klaus Hedman | Method for the diagnosis of injections |
| ES2282998T3 (es) * | 1996-01-02 | 2007-10-16 | Institut Pasteur | Pseudo-particularmente viricas recombinadas y aplicaciomnes vacunales y antitumorales. |
| FR2771751B1 (fr) | 1997-12-03 | 2000-05-26 | Assist Publ Hopitaux De Paris | Erythrovirus et ses applications |
| US6238860B1 (en) | 1998-11-05 | 2001-05-29 | Dyax Corp. | Binding moieties for human parvovirus B19 |
| SE520177C2 (sv) * | 1998-11-24 | 2003-06-03 | Kristina Broliden | Användning av tomma, icke-infektiösa, rekombinanta parvoviruskapsidpartiklar, eller P-antigenblockerande delar därav, för framställning av läkemedel för ihibering av hematopoietiska stamceller |
| US6743772B1 (en) | 1998-11-24 | 2004-06-01 | Kristina Broliden | Use of parovirus capsid particles in the inhibition of cell proliferation and migration |
| US6818612B2 (en) | 1998-11-24 | 2004-11-16 | Kristina Broliden | Use of parvovirus capsid particles in the inhibition of cell proliferation and migration |
| CA2779653C (en) | 2001-06-28 | 2014-08-19 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Diagnostic assays for parvovirus b19 |
| US20080131928A1 (en) * | 2004-07-01 | 2008-06-05 | Hiroshi Handa | Viral Particle-Like Construct and Method of Forming the Same Under Physiological Conditions |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4971793A (en) * | 1988-05-09 | 1990-11-20 | Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. | Subunit canine parvovirus vaccine |
-
1989
- 1989-09-14 NL NL8902301A patent/NL8902301A/nl not_active Application Discontinuation
-
1990
- 1990-09-11 DE DE69019359T patent/DE69019359T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-11 DK DK90914243T patent/DK0491824T4/da active
- 1990-09-11 WO PCT/NL1990/000130 patent/WO1991004330A1/en not_active Ceased
- 1990-09-11 AT AT90914243T patent/ATE122395T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-11 ES ES90914243T patent/ES2073036T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-11 EP EP90914243A patent/EP0491824B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2073036T5 (es) | 2006-08-01 |
| DK0491824T4 (da) | 2006-05-08 |
| DE69019359D1 (de) | 1995-06-14 |
| ES2073036T3 (es) | 1995-08-01 |
| EP0491824B2 (en) | 2006-04-12 |
| ATE122395T1 (de) | 1995-05-15 |
| DE69019359T3 (de) | 2006-09-07 |
| EP0491824B1 (en) | 1995-05-10 |
| WO1991004330A1 (en) | 1991-04-04 |
| DK0491824T3 (da) | 1995-07-17 |
| EP0491824A1 (en) | 1992-07-01 |
| DE69019359T2 (de) | 1995-10-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5916563A (en) | Parvovirus protein presenting capsids | |
| US6132732A (en) | Parvovirus capsids | |
| US5905040A (en) | Parvovirus empty capsids | |
| US5316910A (en) | Bioassay for influenza A and B nucleoprotein | |
| Rosenfeld et al. | Unique region of the minor capsid protein of human parvovirus B19 is exposed on the virion surface. | |
| US5882652A (en) | Empty canine parvovirus capsids having CPV recombinant VP2 and vaccines having such capsids | |
| Gall et al. | Adenovirus type 5 and 7 capsid chimera: fiber replacement alters receptor tropism without affecting primary immune neutralization epitopes | |
| CA1331155C (en) | Baculovirus transfer vectors | |
| CA1275625C (en) | Virus vaccine | |
| Urakawa et al. | Bluetongue virus tubules made in insect cells by recombinant baculoviruses: expression of the NS1 gene of bluetongue virus serotype 10 | |
| EP3294329B1 (en) | Novel baculovirus vectors and methods of use | |
| Anderson et al. | Peptides derived from the unique region of B19 parvovirus minor capsid protein elicitneutralizing antibodies in rabbits | |
| Li et al. | Characterization of self-assembled virus-like particles of human polyomavirus BK generated by recombinant baculoviruses | |
| Pensiero et al. | Expression of the Hantaan virus M genome segment by using a vaccinia virus recombinant | |
| Schmaljohn et al. | Preparation of candidate vaccinia-vectored vaccines for haemorrhagic fever with renal syndrome | |
| US5498413A (en) | Recombinant subunit vaccine against porcine parvovirus | |
| NL8902301A (nl) | Humaan parvovirus b19 eiwitten, hun produktie en hun gebruik in diagnostische assays en vaccins. | |
| Loudon et al. | Expression of the outer capsid protein VP5 of two bluetongue viruses, and synthesis of chimeric double-shelled virus-like particles using combinations of recombinant baculoviruses | |
| JP3061196B2 (ja) | パルボウイルスｂ１９の免疫学的に活性なペプチドまたはポリペプチド | |
| US6204044B1 (en) | Human parvovirus B19 proteins and virus-like particles, their production and their use in diagnostic assays and vaccines | |
| US6001371A (en) | Parvovirus capsids | |
| Riley et al. | Expression of recombinant parvovirus NS1 protein by a baculovirus and application to serologic testing of rodents | |
| US6287815B1 (en) | Human parvovirus B19 proteins and virus-like particles, their production and their use in diagnostic assays and vaccines | |
| Kawase et al. | Modest truncation of the major capsid protein abrogates B19 parvovirus capsid formation | |
| US6274307B1 (en) | Immunologically active peptides or polypeptides from the parvovirus B19 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A1B | A search report has been drawn up | ||
| BV | The patent application has lapsed |