NL8900670A - Polynucleotide-probe, werkwijze en kit voor het identificeren en opsporen van gram-negatieve bacterien. - Google Patents

Description

Polynucleotide-probe, werkwijze en kit voor het identificeren en opsporen van Gram-negatieve bacteriën.

De uitvinding heeft betrekking op een polynucleotide-probe die specifiek een geslacht of soort van Gram-negatieve bacteriën herkent.

Een snelle opsporing van micro-organismen is in allerlei sectoren van groot belang. In de voedingsmiddelensector is een snelle detectie van grote economische betekenis omdat het daarmee mogelijk wordt een uitspraak te doen over de microbiologische kwaliteit van grondstoffen, tussen- en eindprodukten. Daarmee wordt bevorderd dat produkten sneller voor consumptie worden vrijgegeven en worden dure en kwaliteits-verlagende opslag- en wachtprocedures vermeden. Ter illustratie van de behoefte aan versnelling van microbiologische bepalingen kan dienen dat het aantonen van bijvoorbeeld een Salmonella-soort in levensmiddelen met de gangbare microbiologische methoden tenminste 5 dagen in beslag neemt.

Vele bacterie-geslachten die in de levensmiddelenmicrobiologie een belangrijke rol spelen behoren tot de familie der Enterobacteriaceae. Zo zijn de geslachten Salmonella, Shigella en Yersinia pathogeen en in hoge mate betrokken bij geregistreerde voedselinfecties, Het specifiek aantonen van pathogene Enterobacteriaceae is in veel gevallen niet alleen een tijdrovende zaak maar bovenal moeilijk, vooral wanneer deze bacteriën tot de minderheids flora behoren en dat is meestal het geval. In de voe-dingsmiddelenmicrobiologie wordt dit probleem veelal omzeild door gebruikmaking van indicator-organismen om de microbiologische kwaliteit te bepalen dan wel preventieve controles uit te voeren. Zo wordt de aanwezigheid van Enterobacteriaceae, zonder specificatie, in een voedingsmiddel als een indicatie gebruikt voor de hygiënische toestand in voedingsmiddelenbedrijven. Dergelijke bepalingen worden zowel door overheidsinstanties. controlerende organen als door bedrijfslaboratoria regelmatig uitgevoerd. Ofschoon het gebruik van indicator-organismen, zoals hierboven genoemd, zijn waarde heeft bewezen, is het toch vaak noodzakelijk om een identificatie voor diverse species uit te voeren.

Ook in de geneeskunde en de gezondheidszorg is een snelle bepaling van micro-organismen van groot belang bijvoorbeeld voor het lokaliseren en bestrijden van infecties. Verder is ook bij het milieubeheer behoefte aan snelle en doeltreffende bepalingsmethoden voor de aanwezigheid van bacteriën.

Voor het opsporen van bacteriën is het tot nu toe meestal nodig uit het te onderzoeken monster een reincultuur te bereiden, waarna op grond van de verschijningsvorm en andere onderzochte eigenschappen van de bacterie tot een bepaalde soort of een bepaalde groep wordt besloten. Zo wordt volgens het veel gebruikte z.g. API-systeem het micro-organisme onderworpen aan een grote reeks proeven waarin telkens het al of niet optreden van een bepaalde enzymactiviteit wordt bepaald. De gevonden combinatie van activiteiten geeft een aanwijzing voor de bacteriesoort of voor het bacteriegeslacht in kwestie. Dergelijke werkwijzen zijn be werkelijk en bovenal niet definitief: er wordt slechts met een bepaalde waarschijnlijkheid (van minder dan 100%) een bacterie of groep bacteriën aangetoond.

Langs verschillende wegen wordt gewerkt aan snellere diagnostische methoden voor het aantonen van bacteriën. De DNA-DNA-hybridisatie wordt als een veelbelovende techniek beschouwd (zie Klausner en Wilson, Bio/-Technology _1, 471-478, 1983). In principe zoekt men daarbij met een DNA-fragment dat specifiek is voor een bacteriesoort of een groep bacteriën als "probe" naar structureel verwant DNA in bacteriën die men wil identificeren. Het grote voordeel van zo'n detectietechniek is dat wordt getoetst op genotype in plaats van zoals gebruikelijk op fenotype. Eigenschappen die niet of moeilijk tot expressie komen en vaak alleen via proefdieronderzoek getest kunnen worden (bijvoorbeeld kerato-conjuctivitis-test voor enteroinvasieve E. coli en Shigella) kunnen via DNA-DNA-hybridisatie in vitro worden getoetst. Bovendien is de gevoeligheid van de techniek zodanig dat een aantal voorbehandelingen die het materiaal in de conventionele techniek moet ondergaan niet nodig is. Een overzicht van het gebruik van DNA-probes is te vinden in J.A.Matthews en L.J. Kricka, Analytical Strategies for the use of DNA-probes: Anal. Bio-chem. 169, 1-25 (1988).

De weg die tot nu toe wordt gevolgd voor het ontwikkelen van DNA-probes voor bacteriën is het fragmenteren van bacterieel DNA op betrekkelijk willekeurige wijze, het kloneren van fragmenten in plasmide-vec-toren en het nagaan met behulp van radioactieve merkers of fragmenten specifiek hybridiseren met bacterieel DNA. Voor toepassing van de veelbelovende PCR-procedure moet vervolgens de sequentie van dergelijke fragmenten worden bepaald, waarna oligonucleotiden worden bereid en weer getest. Nadeel van dergelijke probes is dat zij een langdurige en bewerkelijke bereiding vergen, een bereiding die bovendien voor een volgende te onderzoeken bacteriesoort geheel opnieuw moet worden afgewikkeld, waardoor het samenstellen van een kit voor het bepalen van verschillende bacteriën in monsters op basis van dergelijke probes vrijwel onmogelijk is. Bekend zijn ook probes op basis van een ribosomaal RNA: deze verto nen echter in een aantal gevallen een hinderlijke kruisreactiviteit (onvoldoende in- en exclusiviteit).

Gevonden is dat bepaalde sequenties van genen die coderen voor bui-tenmembraaneiwitten van Gram-negatieve bacteriën en de daaraan complementaire sequenties zeer geschikt zijn als polynucleotide-probe, waarmee micro-organismen van een bepaalde soort of geslacht, bijvoorbeeld in voedingsmiddelen, in klinische specimen of in het milieu, kunnen worden opgespoord.

De polynucleotide-probe volgens de uitvinding bevat derhalve een polynucleotide dat overeenkomt met of complementair is aan een gedeelte van een voor een buitenmembraaneiwit van een Gram-negatieve bacterie coderend gen of boodschapper-RNA.

De polynucleotide-probe volgens de uitvinding heeft als voordeel dat deze slechts een betrekkelijk gering aantal nucleotiden bevat (in de orde van 10-40 baseparen), waardoor deze eenvoudig kan worden bereid en toegepast. Tegelijk blijkt deze; probe specifiek te zijn voor een bepaald geslacht of soort van Gram-negatieve bacteriën.

De polynucleotide-probe kan zowel een polydesoxyribonucleotide (DNA-probe) als een polyribonucleotide (RNA-probe) bevatten. Met de term "polynucleotide" wordt hier geen bepaald minimum aantal nuclexnezuren per molecuul aangeduid, en deze term staat derhalve niet in absolute tegenstelling tot "oligonucleotide".

Een verder voordeel van de polynucleotide-probe volgens de uitvinding is dat de hybridisatie ook met andere methoden waarneembaar kan worden gemaakt, bijvoorbeeld met de z.g. PCR-methode (polymerase chain reaction). Verder zijn de probes betrekkelijk gemakkelijk te combineren tot een kit waarmee een reeks relevante Gram-negatieve bacteriën, bijvoorbeeld in voedingsmiddelen, lichaamsvocht, watermonsters e.d., kan worden geïdentificeerd.

Buitenmembraaneiwitten zijn eiwitten die aanwezig zijn in het buitenmembraan van de celenveloppe van Gram-negatieve bacteriën en daar verschillende functies vervullen zoals het doorlaten van voedingsstoffen (de porievormende buitenmembraaneiwitten of porinen) en van grotere opgeloste stoffen en het bijdragen aan de structuur en de binding van het buitenmembraan. Deze eiwitten worden aangeduid als OmpA, OmpC, OmpF, PhoE, LamB, Tsx, OmpT, FhuA, BtuB, FepA, FecA, enz.

Buitenmembraaneiwitten van E.coli zijn beschreven door J.Tommassen in Membrane Biogenesis van J.A.F. Op den Kamp, NATO ASI Series, Vol. H16, 351-373 (1988), Springer Verlag, Berlijn-Heidelberg.

De buitenmembraaneiwitten van Gram-negatieve bacteriën bevatten ge- deelten die sterk heteroloog zijn, d.w.z. dat er belangrijke verschillen in de aminozuursequentie van die gedeelten van de eiwitten tussen de verschillende micro-organismen bestaan. Door deze sterke heterologie kan met betrekkelijk korte sequenties al onderscheid tussen bacteriesoorten of -geslachten worden gemaakt. Bijgevolg vertonen ook de voor deze eiwitten coderende genen plaatselijk een sterke heterologie. Deze genen worden op overeenkomstige wijze aangeduid? ompA, ompC, ompF, phoE, enz. De phoE-genen van enige enterobacteriën zijn onderzocht door Van der Ley et al., Eur.J.Biochem. .164, 469-475 (1987). De ompA-genen van enige Enterobacteriën zijn beschreven door Braun & Cole, 1984, Mol.Gen.Genet. 195, 321-328.

De heterologe gedeelten van de buitenmembraan-eiwitten komen veelal in de aan het celoppervlak geëxposeerde delen van de buitenmembraan-eiwitten voor, terwijl de membraan-overspannende delen sterk geconserveerd zijn. Derhalve zijn die gedeeltes van de genen die overeenkomen met de geëxposeerde gedeelten van de buitenmembraan-eiwitten bijzonder geschikt als basis voor specifieke polynucleotide-probes volgens de uitvinding.

Een voorbeeld van een geschikte probe voor het aantonen van Salmo-nella-species is er een die het 23-mer oligodesoxynucleotide TTTAGTAGACGGGCCGCCAGGGA omvat, overeenkomend met een geëxposeerd deel van het OmpA—eiwit van S.typhimurium.

De probes volgens de uitvinding kunnen zijn opgebouwd op basis van de buitenmembraan-eiwitten,in principe van alle Gram-negatieve bacteriën, en derhalve worden gebruikt voor het opsporen van dezelfde Gram-negatieve bacteriesoorten of -geslachten. Bijzonder van belang zijn probes voor Enterobacteriaceae, omdat deze bacteriën een grote rol spelen bij infecties, voedselvergiftigingen, biologische verontreinigingen e.d. Genoemd kunnen worden bacteriën van de geslachten Enterobacter. Klebsiella. Salmonella, Yersinia. Edwardsiella. Erwinia. Serratia. Citrobacter. Proteus en Providencia. De uitvinding is ook van toepassing op andere Gram-negatieve bacteriën dan Enterobacteriaceae. zoals Pseudomonas.

De polynucleotide-probes volgens de uitvinding herkennen specifiek bacterie-geslachten en eventueel bacterie-soorten. Zo blijkt een van een buitenmembraan-eiwit van Salmonella typhimurium afgeleide probe alle Salmonella-soorten te herkennen en geen vals-positieve reaktie met andere soorten te vertonen. Hierbij dient echter te worden opgemerkt dat de gangbare indeling van bacteriën in geslachten en soorten geenszins volmaakt is, waardoor het kan voorkomen dat een probe afgeleid van een tot een bepaald geslacht behorende soort of stam een soort met dezelfde ge- slachtsnaam niet herkent.

De genus-begrenzing van de probes volgens de uitvinding is echter zo sterk, dat het optreden van een dergelijke "vals-negatieve" reaktie een aanwijzing is, dat de soort die deze negatieve reaktie geeft niet tot het geslacht in kwestie behoort. Omgekeerd herkent een bijvoorbeeld van een Escherichia coli afgeleide probe ook Shigella sp., hetgeen bevestigt dat E.coli en Shigella-sp. tot hetzelfde geslacht en wellicht zelfs tot één soort behoren (zie W.J, Brenner, in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol. I, blz. 410-411, Williams & Williams Co. Baltimore (1984)).

Dat de polynucleotide-probes volgens de uitvinding een zo hoge exclusiviteit en inclusiviteit hebben is bijzonder verrassend, gezien de resultaten met DNA-probes volgens de stand van de techniek.

De polynucleotide-probe volgens de uitvinding kan op basis van een geschikt gedeelte van een gen of boodschapper-RNA coderend voor een bui-tenmembraan-eiwit van de gekozen bacterie worden bereid door aaneenrijgen van de desbetreffende nucleotiden volgens op zichzelf bekende wijze. De bereiding kan met voordeel geautomatiseerd geschieden met een DNA-synthese-inrichting.

Het vermogen van de aldus verkregen probe om selektief bacteriën op te sporen wordt aangetoond, bijvoorbeeld door middel van hybridisatie in een z.g. slot-blot-procedure (P.J. Carter et al., Cell J58^ 835-840 (1984)). Het DNA van de te onderzoeken bacterie(n) wordt daarbij uit de cellen vrijgemaakt en op een filter gehecht en vervolgens in contact gebracht met een probe volgens de uitvinding, voorzien van bijvoorbeeld een radioactief label. Na hybridiseren wordt bijvoorbeeld door middel van een autoradiogram nagegaan of de probe met een nucleotidesequentie heeft gereageerd, met andere woorden deze nucleotidesequentie heeft herkend .

Anderzijds kan voor de detectie van hybridisatie met voordeel gebruik worden gemaakt van de z.g. polymerase-ketenreactie ofwel "Polymerase chain reaction" (PCR)-procedure, zie R.K. Saiki et al, Science 239, 487 (1988) en EP-A-200362. Bij deze werkwijze wordt met behulp van twee korte oligodesoxynucleotiden, z.g. primers, voorkomend in een langer polydesoxynucleotide, een polydesoxynucleotide-fragment efficient enzymatisch vermeerderd in cycli van kopiëren en denatureren bij verschillende temperaturen. Op deze wijze kan met twee probes in korte tijd van een herkend DNA-fragment een zo grote hoeveelheid worden verkregen dat detectie zonder radioaktieve merking mogelijk is.

Een andere recent ontwikkelde wijze die kan worden toegepast om hy- bridisatie waar te nemen is de koppeling aan viraal RNA, waarna de probe wordt gehybridiseerd met het te bepalen DNA-monster. Eventuele hybridisatie kan vervolgens worden aangetoond door in vitro vermenigvuldiging van het gehybridiseerde RNA met behulp van viraal replicase. Op deze wijze kan van het gehybridiseerde RNA in korte tijd een zo grote hoeveelheid verkregen worden dat detectie zonder radioactieve merking mogelijk is. Zie ook P.M. Lizardi et al. Biotechnology 6, 1197-1102 (1988).

De polynucleotide-probe kan worden gebruikt om een bacteriesoort of -geslacht selectief binnen een veelheid aan bacteriën op te sporen, bijvoorbeeld in levensmiddelen. Ook is de polynucleotide-probe volgens de uitvinding zeer geschikt voor het identificeren van geïsoleerde bacteriën, eventueel van een reincultuur,voor medische toepassing (infecties) .

De uitvinding heeft derhalve ook betrekking op een werkwijze voor het opsporen en identificeren van Gram-negatieve bacteriën, in het bijzonder van Enterobacteriaceae, waarbij men de polynucleotide-probe zoals hierboven omschreven gebruikt.

De werkwijze bestaat bijvoorbeeld daaruit dat men het polynucleotide materiaal van het te onderzoeken monster op bekende wijze isoleert of hecht aan een drager en vervolgens in contact brengt met een probe volgens de uitvinding. De hybridisatie kan vervolgens volgens verschillende methoden worden gedetecteerd, bijvoorbeeld door toepassing van 32P-ATP, viraal replicase enz. Bijzonder voordeel heeft de werkwijze volgens de uitvinding bij toepassing van de PCR-methode zoals hierboven aangegeven, waarbij het vermenigvuldigde polynucleotidefragment op verschillende wijze kan worden gedetecteerd.

De uitvinding heeft tevens betrekking op een samenstel ("kit'1) voor het selektief opsporen/identificeren van Gram-negatieve bacteriën, welk samenstel een of meer van de hierboven beschreven polynucleotide-probes bevat. In het bijzonder bevat deze kit een combinatie van DNA-probes voor het testen op de aanwezigheid van een reeks Enterobacteriaceae.

De kit volgens de uitvinding kan naast de polynucleotide-probe tevens middelen bevatten voor het isoleren van het (gehybridiseerde) polynucleotide, zoals filters, voor het detecteren van het hybridisatie-signaal, zoals merkstoffen, en voor het in vitro vermenigvuldigen van gehybridiseerde polynucleotidefragmenten zoals een DNA-polymerase of een viraal polymerase alsmede andere middelen voor het uitvoeren van een identificatie van bacteriën, en eventueel een voorschrift daarvoor.

De onderstaande voorbeelden illustreren dat polvnucleotide-sequen-ties die coderen voor aan het celoppervlak geëxposeerde delen van bui tenmembraan-eiwitten of de daaraan complementaire sequenties kunnen worden gebruikt als genus-specifieke probes voor het identificeren van Gram-negatieve bacteriën.

Voorbeeld I

Synthese en merking van oligo-nucleotiden

De oligodesoxynucleotiden werden automatisch bereid met behulp van een Biosearch 8600 DNA-synthesizer en werden vervolgens gezuiverd door middel van hoge-drukvloeistofchromatografie. De oligomeren werden aan het 5'-uiteinde gemerkt door enzymatisch gekatalyseerde overdracht van 32p-fosfaat uit [y-^^P]ATP (3000 Ci/mmol, Amersham Int. plc Amersham, Engeland) met T4 polynucleotide-kinase (Pharmacia, Uppsala, Zweden) volgens de werkwijze van Maniatis et al., Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982).

Bacteriestammen en plasmiden

De onderstaande bacteriestammen werden gedurende een nacht bij 37°C onder schudden in L-medium (J.Tommassen et al., EMBO.J.2^ 1275-1279 (1983)) gekweekt. Escherichia coli K-12 stam CE1194 met een chromosomale phoE-deletie, alsmede het phoE+ derivaat CE1195 (J.Tommassen et al., J.Bacteriol. 149, 668-672 (1982)). E.coli B (instituut voor Moleculaire Biologie en Medische Biotechnologie, Rijksuniversiteit Utrecht). Stam EIEC, een entero-invasieve E.coli uit menselijke faeces alsmede Shigella dysenteriae, Shigella boydii serovar 2 en een onbekende serovar, Shigella flexneri serovars I,II,III,IV,VI,X en een onbekende serovar. Shigella sonnei serovars I,II en een onbekende serovar uit menselijke faeces waren afkomstig van het Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieuhygiëne, Bilthoven. Andere gebruikte enterobacteriële stammen waren Edwardsiella tarda, Enterobacter aerogenes, Citrobacter freundii. Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Providencia stuartii. Salmonella braenderup, Salmonella derby, Salmonella panama, Serratia mar-cescens. Shigella flexneri, Shigella sonnei (H.Hofstra, J.Dankert. J.Gen.Microbiol. 119, 123-131 (1980), Salmonella typhimurium SJ2353 (T. Sato, T.Yura, J.Bacteriol. 139, 468-477 (1979)), Salmonella typhimurium LT2, Salmonella typhimurium B7121-2 pro“ (instituut voor Moleculaire Biologie en Medische Biotechnologie, Rijksuniversiteit Utrecht) en Salmonella typhimurium KB1711 (K.Bauer et al., J. Bacterol. 161: 813-816 (1985)). Voor de "polymerase chain reaction" procedure werden gebruikt: E. coli K-12 stam CGSC4234 (E. coli Genetic Stock Center, Department of Human Genetics, Yale University School of Medicine, New Haven,Conn.), Salmonella panama en Salmonella typhimurium SJ2353. Voor de DNA-spot-testen werden de volgende plasmiden gebruikt: pACYCl84 (A. Chang, S. Co hen, J. Bacteriol. _134 = Π41-1156 (1978)) en zijn derivaten pJP29 (bevat het phoE-gen van E. coli, D. Bosch et al., J. Mol. Biol. J89_: 449-455 (1986), pKP2 (bevat het phoE-gen van Klebsiella pneumoniae, P. van der Ley et el., Eur. J. Biochem. 164:469-475 (1987) en PEC17 (bevat het phoE-gen van Enterobacter cloacae, C. Verhoef et al., Gene 32: 107-115 (1984)). Plasmide pBR322 (F. Bolivar et al., Gene 2: 95-113 (1977)) en zijn derivaat pSTl (bevat een deel van het phoE-gen van Salmonella typhjmurium, G. Spierings, niet gepubliceerd).

Slot-blot Hybridisatieprocedure:

Nadat de optische dichtheid bij 600 nm van de verkregen celcultures op OD = 1,1 voor het testen van de Shigella-probe en op OD = 0,7 voor het testen van de Salmonella-probe was ingesteld, werden hoeveelheden van 100/ul langzaam door nitrocellulose (NC)filters (BA 85-Schleicher en Shuell, Kassei, BR Duitsland) gefiltreerd in een slot-blot-apparaat (Minifold II, Schleicher & Shuell). De filters werden bereid volgens de werkwijze van P.J.Carter et al., Cell 38, 835-840 (1984). Het DNA werd op het NC-filter gehecht door 4 minuten UV-bestraling ( λ 320 nm, L2723, Ankersmit). De filters werden 45 minuten bij 60 C voorgehybridi-seerd in 0,25 % Protifar (Nutricia NV, Zoetermeer), 6 x SSC (90 mM na-triumchloride, 90 mM natriumcitraat pH 7,0). Na toevoegen van de probe (10 pmol DNA) werd het filter 1,5 uur bij 60°C gehybridiseerd. De filters werden tweemaal met 6 x SSC bij 60°C gewassen en er werden auto-radiogrammen van de filters gemaakt door blootstelling aan een Fuji X-ray-film gedurende 3 dagen.

DNA-spot-procedure: Van de plasmide-oplossingen (j_ 0.5/ug//ul) werd 1/ul op NC gespot. De filters werden vervolgens behandeld en gehybridiseerd als beschreven in de slot-blot hybridisatieprocedure.

Polymerase Chain Reaction (PCR)-procedure: Het Taq_ DNA-polymerase (Perkin Elmer CETUS, Norwalk, USA) werd gebruikt volgens voorschrift van de fabrikant met uitzondering van het gebruik van 10 mM Tris HCl. pH 8,8 in plaats van pH 8,4, 1 eenheid T£g_ DNA-polymerase in plaats van 2 eenheden en het eindvolume werd van 50/ul teruggebracht naar 25/ul. Als substraat in de reactie werd gebruik gemaakt van chromosomaal DNA (£ 10 ng) geïsoleerd volgens Marmur (Marmur, J. et al., J.Mol. Biol, 3_* 208-218 (1961) uit de E. coli K-12 stam CGSC4234, S. panama en S. typhi-murium SJ 2353). Als primer-koppels werden gebruikt STl/ST3c en ST2/ST3c resulterend in de vermeerdering van fragmenten van respectievelijk 285 en 156 baseparen. Er werden 40 cycli gedraaid van 1 minuut 92°C, 2 minuten 42°C, 2 minuten 65°C met behulp van een programmeerbaar incubator-blok (PHC-1, New Brunswick Scientific B.V., Soest, Holland). Van het re- actiemengsel werd 10/ul op een 1,3% agarosegel geanalyseerd.

Salmonella-probes: Er werden drie Salmonella-probes gesyntheti seerd, gebaseerd op het eerste, het tweede en het derde aan het cel- oppervlak geexposeerde fragment van het OmpA eiwit van S. typhimurium. De DNA-sequenties van deze fragmenten zijn als resp. STl, ST2 en ST3c weergegeven in Figuur 1. De in- en exclusiviteit van ST3c werd getest in een slot-blot hybridisatieprocedure. Figuur 4 geeft het autoradiogram van het filter na hybridisatie met de probe weer. Op het filter zijn de volgende stammen aangebracht: IA, P. mirabilis; IB, S, panama: 1C, S. typhimurium; 2A, S. marcescens; 2B, C, freundii, 2C, K. pneumoniae; 3A, E. tarda; 3B, E. aerogenes; 3C, P. stuartii; 4A, E. coli B; 4B, S. typhimurium KB1711; 4C, S. braenderup; 5A, S. derby; 5B, S. typhimurium LT2; 5C, S. typhimurium B pro; 6A, P. vulgaris; ÖB, S. flexneri: 6C, S. sonnei. Strepen in het autoradiogram geven aan dat de probe aan een complementaire nucleotide-sequentie in de gelyseerde cellen was gebonden. De figuur toont aan dat de probe reageert met S. braenderup, S. derby en S. typhimurium. De probe reageert niet met de andere Enterobacteriaceae. Onder de gebruikte testcondities reageert de probe echter niet met S. panama. Onder de omstandigheden gebruikt in de PCR-reactie (Figuur 5) bleek echter zowel het chromosomaal DNA geïsoleerd uit S. panama (Slot 5 en 6) als het chromosomaal DNA geïsoleerd uit S. typhimurium (Slot 3 en 4) als substraat gebruikt te worden. Wanneer het chromosomaal DNA geïsoleerd uit E. coli als substraat werd aangeboden vond noch amplificatie van het fragment van 285 baseparen (Slot 1) plaats bij gebruik van de probes STl en ST3c, noch van het fragment van 156 baseparen (Slot 2) bij gebruik van de probes ST2 en ST3c. De resultaten tonen aan dat de drie probes specifiek zijn voor Salmonella.

Voorbeeld II

Shigella-probe: Voor het ontwikkelen van de Shigella-probe werd gebruik gemaakt van de zeer nauwe verwantschap die bestaat tussen Shigella en E.coli (zie W.J. Brenner, Family I Enterobacteriaceae. in: Bergey's

Manual of Systematic Bacteriology, vol. I, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, blz. 410-411 (1984). Daarom werd verondersteld dat de sequenties van de phoE genen van Shigella species vrijwel identiek zijn aan de bekende sequentie van het E, coli K-12 phoE gen. De Shigella probe waarvan de sequentie met de overeenkomstige sequenties van K.pneumoniae en E.cloacae (P.van der Ley et.al, Eur. J.Biochem.]64: 469-475 (1987)) zijn weergegeven in Figuur 2, is gebaseerd op het vijfde aan het cel-oppervlak geexposeerde deel van het PhoE-eiwit van E. coli. Met behulp van een slot-blot hybridisatieprocedure werd de specificiteit van de probe getest. Het autoradiogram is weergegeven in fxg. 6. Op het filter werden de volgende stammen aangebracht: IA, P. mirabilis: IB, S. panama; 1C, ji. typhimurium; 2A, Si. marcescens: 2B, C. freundii; 2C, K. pneumoniae; 3A, E. tarda; 3B, E. aerogenes; 3C, P. stuartii; 4A, CE1195; 4B, CE1194; 4C, EIEC; 5A, Sh. sonnei I; SB, Sh. sonnei IX: 5C, Sh. sonnei· 6A, Sh. dvsenteriae; 6B, Sh. boydii: 6C, Sh. flexneri: 7A, Sh. flexneri I; TB, Sh. flexneri II; 7C, Sh. flexneri III; 8A, Sh. flexneri IV; 8B, Sh. flexneri X; 8C, L-medium; 9A, Sh. sonnei; 9B, Sh. boydii 2; 9C, Stu flexneri VI. De probe reageerde met alle geteste Shigella-stammen en met E. coli K12 CE1195 en de entero-invasieve E. coli-stam (EIEC).

De resultaten tonen aan, dat de probe specifiek is voor de soort Shigella/E. coli.

Voorbeeld III

Enterobacter- en Klebsiella-probe:

De Enterobacter-probe en de Klebsiella-probe, waarvan de sequenties met de overeenkomstige sequentie van E.coli zijn weergegeven in Figuur 3, zijn gebaseerd op het achtste aan het celoppervlak geëxposeerde fragment van het PhoE-eiwit van respectievelijk E, cloacae en K. pneumoniae. De specificiteit van de probes werd onderzocht in DNA-spot-tests. Het auto radiogram van het filter gehybridiseerd met de Enterobacter-probe en gehybridiseerd met de Klebsiella-probe is weergegeven in figuur 7, respectievelijk foto links en foto rechts. Op de filters waren de volgende plasmiden aangebracht: IA, PEC17; IB, PBR322; PJP29: 2B. PACYC184: 3A. pKP2; 3B, pSTl. Figuur 7 links laat zien dat de Enterobacter-probe alleen reageert met pECl7 en niet met de andere plasmiden. Figuur 7 rechts laat zien dat de Klebsiella-probe alleen met pKP2 reageert.

Hieruit kan geconcludeerd worden dat de Enterobacter-probe en de Klebsiella-probe niet kruisreageren met de phoE-genen van de andere geteste Enterobacteriaceae.

Claims (8)

1. Polynucleotide-probe die specifiek een geslacht of soort van Gram-negatieve bacteriën herkent, welke probe een polynucleotide bevat dat overeenkomt met of complementair is aan een gedeelte van een voor een buitenmembraaneiwit van de Gram-negatieve bacterie coderend gen of boodschapper-RNA.

2. Probe volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het gedeelte van het gen of boodschapper-RNA codeert voor een hoofdzakelijk aan het cel-oppervlak geëxposeerd deel van het buitenmembraaneiwit.

3. Probe volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de Gram-negatieve bacterie behoort tot de Enterobacteriaceae.

4. Werkwijze voor het opsporen en/of identificeren van Gram-negatieve bacteriën, met het kenmerk, dat men daarbij een of meer probes volgens een der conclusies 1-3 gebruikt.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat men Enterobacteriaceae opspoort en/of identificeert onder gebruikmaking van probes volgens conclusie 3.

6. Werkwijze volgens conclusie 4 of 5, met het kenmerk, dat men een fragment van het gen of boodschapper-RNA dat door de probes wordt herkend vervolgens vermeerdert door toepassing van een polymerase-keten-reactie.

7. Kit voor het opsporen en/of identificeren van Gram-negatieve bacteriën welke een of meer polynucleotide-probes volgens conclusies 1-3 bevat.

8. Kit voor het opsporen en/of identificeren van Enterobacteriaceae, welke een of meer polynucleotide-probes volgens conclusie 3 bevat.