NL8802007A

NL8802007A - Vaccin, geschikt voor de profylaxe respectievelijk de bestrijding van de door haemophilus pleuropneumoniae teweeggebrachte ziekte bij varkens alsmede werkwijze voor het winnen van extracellulair eiwitachtig materiaal van haemophilus pleuropneumonie, geschikt voor toepassing in dergelijke vaccins.

Info

Publication number: NL8802007A
Application number: NL8802007A
Authority: NL
Original assignee: Centraal Diergeneeskundig Inst
Priority date: 1988-08-12
Filing date: 1988-08-12
Publication date: 1990-03-01
Also published as: AR243385A1; CA1334388C; ATE103816T1; JPH02152930A; JPH0725697B2; ES2055010T3; US5254340A; EP0354628A1; EP0354628B1; DE68914362T2; DE68914362D1; DK394889D0; DK394889A

Description

Vaccin» geschikt voor de profylaxe respectievelijk de bestrijding van dedoor Haemophilus pleuropneumoniae teweeggebrachte ziekte bij varkensalsmede werkwijze voor het winnen van extracellulair eiwitachtigmateriaal van Haemophilus pleuropneumonie, geschikt voor toepassing in> dergelijke vaccins.

De uitvinding heeft betrekking op vaccins, geschikt voor de profy¬laxe respectievelijk de bestrijding van de door Haemophilus pleuropneu¬moniae teweeggebrachte ziekte bij varkens alsmede werkwijze voor hetwinnen van een extracellulair eiwitachtig materiaal van Haemophiluspleuropneumoniae, geschikt voor toepassing in dergelijke vaccins.

H.pleuropneumoniae is de verwekker van de Haemophilus-pleuropneumo-nie bij varkens, wat tegenwoordig als een der belangrijkste aandoeningenvan de luchtwegen van deze dieren wordt beschouwd (zie o.a. MaudsleyJ.R. et al·, Can. J. Microbiol. 32, (1986), blz. 801- 805). De voornaam¬ste verschijnselen bij het acute stadium van deze ziekte zijn het optre¬den van hoge koorts en een extensieve fibrineus hemorrhagisch necrotise-rende lobaire pneumonie, welke vergezeld gaat van een fïbrineuze pleuri¬tis. Aangenomen wordt» dat er een of meer door H.pleuropneumoniae gepro¬duceerde toxinen een belangrijke rol bij de bovenvermelde pathogenesisspelen. Meer in het bijzonder is waargenomen» dat bij een endobronchialetoediening aan varkens van zowel gesonificeerde niet-levensvatbareH.pleuropneumoniae-cellen als van een celvrij supernatant, verkregen uiteen kweekmedium voor H.pleuropneumoniae een plaatselijke pneumonie op¬treedt, welke overeenkomt met de pneumonie, die bij experimenteel geïn¬fecteerde varkens optreedt. Het artikel van Maudsley J.R. et al. (Can.J. Microbiol. 32, 801-805 (1986)) spitst zich vooral toe op het verkrij¬gen van een door H.pleuropneumoniae geproduceerd hemolysine-produkt metbehulp van een chemisch gedefinieerd medium (CDM), dat geen proteinenbevat, zodat het extracellulaire hemolysine-produkt, verkregen metbehulp van de H.pleuropneumoniae-stam 12864 (serotype 3), op een rela¬tief eenvoudige wijze kan worden afgescheiden; het volgens Maudsley etal. gevonden produkt blijkt proefondervindelijk een warmte-labiel pro-teine te zijn, dat echter vooralsnog in generlei vorm voor vaccinatie-doeleinden kan worden toegepast· Genoemd hemolysineprodukt induceert eenhemorrhagische pneumonie bij muizen.

Ondanks de noodzaak van een afdoende therapie voor de H.pleuropneu¬monie bij varkens, aangezien deze bacteriële infectie-ziekte een ende¬misch verloop en een hoog sterftecijfer kent, worden er tot nu toe slechts een tweetal mogelijkheden toegepast om deze infectie-ziekte tebestrijden, namelijk: a) een therapie met antibiotica; deze methode is echter vanwege het kostenaspect en uit het oogpuntvan residu- en resistentie-problematiek minder gewenst; en b) een profylaxe door middel van vaccinatie; deze methode vereist een vaccin dat effectief is tegen H.pleuropneu-moniae van de betreffende serotypen, welke in het toepassingsgebiedvoorkomen. De tot nu toe bekende vaccins zijn gebaseerd op geïnacti¬veerde cellen van H.pleuropneumoniae en daarbij beperkt tot het des¬betreffende serotype resp. serotypen van H.pleuropneumoniae.

In verband met het bovenstaande wordt naar voren gebracht, dat erthans twaalf serotypen van H.pleuropneumoniae bekend zijn, waarbij hetvoorkomen van deze serotypen per landstreek kan verschillen. Met het oogop de gewenste universele toepassingsmogelijkheid van een enkel vaccintegen H.pleuropneumonie bij varkens is derhalve gezocht naar een vaccin,dat tegen het overgrote deel van de bekende serotypen en met voordeeltegen alle serotypen werkzaam is.

De uitvinding heeft derhalve betrekking op het ontwikkelen van eenvaccin, dat voor de profylaxe resp. het bestrijden van een groot aantalserotypen van H.pleuropneumoniae en met voordeel alle serotypen vanH.pleuropneumoniae geschikt is.

Gevonden werd, dat het bovenstaande doel kan worden bereikt metbehulp van een vaccin, dat gekenmerkt wordt door een werkzaam gehaltevan een extracellulaire eiwitachtige materiaal, afkomstig uit hetcultuurmedium van Haemophilus pleuropneumoniae. Met voordeel wordt hetextracellulaire eiwitachtige materiaal in kwestie verkregen door hetsteriel filtreren van het cultuurmedium van Haemophilus pleuro¬pneumoniae .

In het bijzonder kan het extracellulaire eiwitachtige materiaal inkwestie gewonnen worden door a) het kweken van een H.pleuropneumoniae-stam op een kweekmedium, waar¬aan nicotine adeninamide dinucleotide (NAD) is toegevoegd; b) het overbrengen van de onder (a) verkregen kiemen van H. pleuropneu¬moniae op een met serum of serumprodukten verrijkt kweekmedium, datgeen NAD bevat; en c) het steriel filtreren van dit medium onder verkrijging van een fil-traat.

Het op bovenvermelde wijze verkregen filtraat kan eventueel verder opgewerkt worden door 1) het mengen van het betreffende filtraat met een ammoniumsulfaatoplos-sing (met voordeel een meer dan 50 procents verzadigde oplossing)onder verkrijging van een neerslag; 2) het oplossen van het onder (1) verkregen neerslag in een fosfaat-ge-bufferde fysiologische zoutoplossing (PBS); en 3) het dialyseren van het onder (2) verkregen produkt tegen PBS onderverkrijging van een gedialyseerd eiwitachtig materiaal.

Het op bovenstaande wijze verkregen filtraat resp. eiwitachtigemateriaal is in staat gebleken bij varkens antilichamen op te wekken,waardoor verrassenderwijs op deze wijze gevaccineerde varkens immuunworden voor een besmetting met H.pleuropneumoniae.

Meer in het bijzonder wordt Haemophilus pleuropneumoniae in debovenstaande trap (a) gekweekt op bijvoorbeeld schapebloedagar, waaraan0,1% nicotinamide adeninamide dinucleotide (NAD, Flucka) is toegevoegd.Na een incubatie van bijv. 6-8 uur bij ongeveer 37°C en + 5-10% CO2worden de bloedagar-platen afgewassen. Met de aldus verkregen kiemenwordt overeenkomstig de bovenstaande trap (b) een vloeibaar mediumbeSnt, dat serum of serumprodukten en geen NAD bevat. Het geheel wordtbij een temperatuur van ongeveer 37°C geincubeerd. Vervolgens wordt hetbeè'nte medium gesteriliseerd door middel van bijvoorbeeld filtratie.

Voor het uitvoeren van de in trap (c) volgens de uitvinding uitge¬voerde filtratie kunnen in de handel verkrijgbare filters worden toege¬past. Voorbeelden hiervan zijn het Millex-GV-membraanfilter met eenporiegrootte van 0,2/um (Millipore Corp.), het Gelman filter met eenporiegrootte van 0,2/um en het Gelman Mini Capsule filter met eenporiegrootte van 0,45/um (Gelman Sciences Ine·).

Het verkregen filtraat kan eventueel verder opgewerkt worden dooraan 1 vol. deel filtraat druppelsgewijs 1 vol.deel verzadigde ammonium-sulfaatoplossing toe te voegen. Het neerslag wordt vervolgens doormiddel van centrifugeren verzameld. Daarna wordt het verkregen neerslagin PBS opgelost en tegen PBS gedialyseerd. Het gedialyseerde materiaalkan dan worden gebruikt voor de vaccin-bereiding. Voorts kan dit gedia¬lyseerde materiaal worden gebruikt om daarin aanwezige specifieketoxines zoals het cytotoxische toxine (CT) en het hemolyserende toxine(HT) te karakteriseren.

Het produktieverloop van de bovengenoemde toxines CT en, indienaanwezig, HT kan worden bepaald of gevolgd door monsters van het beèntemedium van trap (b) te incuberen met longmacrophagen resp. met erythro-cyten. Hierbij kunnen bijvoorbeeld varkenslong-macrophagen en erythrocy- ten van schapen gebruikt. De verdunning van het monster, welke nog juistresulteert in een celdood van de macrophagen resp. lysis van de rodebloedcellen, is een maat voor de toxineconcentratie in het medium. Onderde biologische activiteit van CT resp. HT wordt de door CT veroorzaakteceldood resp. de door HT veroorzaakte lysis van de erythrocytenverstaan.

Het op bovenstaande wijze verkregen produkt kan als volgt wordengekarakteriseerd: 1) Biologische eigenschappen: het tegen PBS gedialyseerde produkt heefteen cytotoxische activiteit en, in afhankelijkheid van het gekweekteserotype, een hemolyserende activiteit. Bovendien veroorzaakt hetgedialyseerde produkt, wanneer het endobronchiaal toegediend wordtaan varkens, een pleuropneumonie, die histologisch identiek is aan depleuropneumonie, welke door H. pleuropneumoniae- kiemen wordt veroor¬zaakt .

2) Temperatuur: het invriezen van het gedialyseerde produkt op -20°C ofop -70°C gedurende 48 uur heeft geen invloed op de CT- en mogelijkaanwezige HT-activiteit. Na verhitten van het produkt gedurende 1 uurop 120°C is de biologische activiteit van CT in longmacrophagen vanvarkens en de mogelijk aanwezige aktiviteit van HT in erythrocytenvan schapen niet meer waarneembaar.

3) pH: pH-veranderingen met NaOH en HC1 gedurende 2 uur bij kamertempe¬ ratuur leveren geen inactivatie van CT en het mogelijk aanwezige HTvan het gedialyseerde produkt op.

4) Proteolytische enzymen: een incubatie van het gedialyseerde produktgedurende 1 uur op 37°C met Dyspase II, een protease, inaktiveert deCT en mogelijk aanwezige HT-activiteit.

5) Houdbaarheid: de CT- en mogelijk aanwezige HT-activiteit van ongedia-lyseerd produkt blijft gedurende enkele weken aanwezig.

6) Molecuulgewicht van CT en HT: dit molecuulgewicht bevindt zich tussen90.000 en 130.000 dalton, bepaald met behulp van een SDS-page. Hetmolecuulgewicht is groter dan dat van catalase (242.000 dalton),wanneer het molecuulgewicht op een FPLC met een Superrose 6-kolombepaald wordt· Het CT/HT loopt niet door een Pm30.000 amicon filter.

7) Protectie: varkens, welke met het gedialyseerde produkt zijn gevacci¬neerd ontwikkelen antistoffen, welke de activiteit van CT en HT neu¬traliseren· Varkens met deze neutraliserende antilichamen ontwikkelengeen acute pleuropneumonie na infectie met een H.pleuropneumoniae-cultuur.

Zoals in het bovenstaande is vernield, zijn er tot nu een twaalf>-talserotypen van H.pleuropneumoniae bekend. Uit onderzoek van veldstammenvan H.pleuropneumoniae is gebleken, dat de verschillen in toxine-produc-tie (CT en eventueel HT) serotype-afhankelijk en niet stam-afhankelijkzijn. In de onderstaande Tabel A wordt de CT-productie van elf serotypenvan H.pleuropneumoniae resp. de neutralisatie-titers met behulp van eenantiserum, opgewekt in SPF-varkens met behulp van het op bovenbeschrevenwijze gedialyseerde produkt weergegeven.

TABEL A

Neutralisatie—titers

Uit de bovenstaande Tabel A blijkt duidelijk een kruisneutralisatietussen de serotypen 1, 5» 9, 10 en 11 op te treden. Het serotype 6, datzelf geen CT vormt, levert wèl een antiserum met antiliehamen, welke bijde stammen van de genoemde serotypen 1, 5, 9, 10 en 11 behoren. Alstweede groep van onderling verwante serotypen wordt de groep met deserotypen 2, 3, 4 en 8 genoemd.

Tenslotte neemt de stam van het serotype 7 een aparte plaats in.Deze stam wordt namelijk geneutraliseerd door antisera uit de beidebovenaangeduide groepen nl. 1, 2, 4, 5, 6, 9 en 11 maar niet met de seravan de serotypen 3, 8 en 10. Voorts neutraliseert het van de stam vanhet serotype 7 afgeleide antiserum alleen de stam van het serotype 7.

Resumerend kan uit de bovenstaande Tabel A worden afgeleid, datvaccins, opgebouwd uit de beide bovenvermelde groepen, namelijk ener¬zijds van de serotypen 1, 5, 6, 9, 10 en 11 en anderzijds van de sero¬typen 2, 3, 4 en 8 een neutralisatie-effekt teweeg brengen, dat vooralle serotypen van toepassing is. Derhalve heeft de uitvinding in hetbijzonder betrekking op vaccins, welke gebaseerd zijn op een kombinatievan het op bovenbeschreven wijze verkregen extracellulaire eiwitachtigemateriaal van H.pleuropneumoniae-stammen, waarvan ten minste de ene stamtot de eerstgenoemde groep van serotypen 1, 5, 6, 9, 10 en 11, bijvoor¬beeld serotype 9 en de andere stam tot de laatstgenoemde groep van sero¬typen 2, 3, 4 en 8, bijvoorbeeld serotype 8 behoren.

Uit het bovenstaande volgt derhalve, dat met behulp van de boven¬aangeduide kombinatie het mogelijk is een vaccin te ontwikkelen, dat eenwerking bezit tegen alle tot nu toe onderzochte serotypen, t.w. de sero¬typen 1-11, zodat de uitvinding een nagenoeg universeel toepasbaarvaccin verschaft.

Bij het uitvoeren van de bereidingsmethode volgens de uitvindingzijn de op dit gebied van de stand der techniek bekende methoden enmaterialen geschikt. Meer in het bijzonder kan in trap (a) van de boven¬vermelde werkwijze volgens de uitvinding als groeimedium een "chemischgedefinieerd medium" (CDM) worden toegepast, waarvan de samenstelling inde bovenvermelde literatuurplaats Can. J. Microbiol. vol. 32, (1986),blz. 802 wordt vermeld. Andere groeimedia zijn trypticase-soja-agar met0,6% gistextract (TSSYE) en hartinfusie-agar (Difco) dat met 5% gedefi-brineerd schapebloed is aangevuld (HIS).

Voorts kunnen bij de werkwijze volgens de uitvinding de uit deliteratuur bekende stammen zoals ATCC 27088 (serotype 1) worden toege¬past. De bij het onderhavige onderzoek toegepaste H.pleuropneumoniae-stammen zijn hetzij zelf getraceerd hetzij afkomstig van op dit gebied werkzame onderzoeksinstituten. Meer in het bijzonder zijn de stammenShope 4074, 4226, 1421 (ATCC 27090), M62 (ATCC 33378) en K17 (ATCC33377), welke referentie-stammen voor de serotypen 1-5 voorstellen,afkomstig van J.Nicolet (Universiteit van Bern, Zwitserland), is de stamFem0, welke de refentiestam voor het serotype 6 voorstelt, afkomstig vanR.Nielsen, State Veterinary Serum Laboratory, Kopenhagen, Denemarken(ATCC 33590)), is de stam WF83, welke de referentie-stam voor het sero¬type 7 voorstelt, afkomstig van S. Rosendal (Dept. Vet. Microbiol.,Univ. of Guelph, Guelph, Ontario) zijn de stammen 405 en D13039, welkede referentie-stammen voor de serotypen 8 en 10 voorstellen, afkomstigvan R. Nielsen (State Veterinary Serum Laboratory, Kopenhagen, Denemar¬ken) en zijn de stammen 13261 en 56153, welke de referentie-stam voor deserotypen 9 en 11 voorstellen, afkomstig van Aanvraagster zelve. Hetindelen van de stammen in de betreffende serotypen is algemeen uit destand der techniek bekend. Een indicatie hiervan wordt weergegeven inVeterinary Microbiology 13 (1987), blz. 249-257.

De uitvinding wordt aan de hand van de onderstaande voorbeeldennader toegelicht.

Voorbeeld ITrap (a);

Bereiding van de inocula

De H. pleuropneumoniae-stam 13261 werd op schapebloed-agar, aange¬vuld met 0,1% nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) (SBV) gekweekt. DeSBV-platen werden 6 uren bij 5% CO2 en 37 °C geïncubeerd· Daarna werdende platen met 5 ml Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) met Earle'ssalts gespoeld en de resulterende bacteriesuspensie werd gedurende denacht bij 4°C opgeslagen, waarna deze de volgende dag werd gebruikt. Hetaantal kolonie-vormende eenheden (CFU) werd bepaald door het inoculerenvan tienvoudige verdunningen van de bacteriè'le suspensie op SBV.

Trap (b)

De produktie-trap voor het cytotoxine en hemolysine (HT) werd alsvolgt uitgevoerd.

Een twaalftal media, zoals weergegeven in Tabel B, werden geinocu-leerd met 2x10** CFU H. pleuropneumonlae 13261 per ml· De cultureswerden 6 uren bij 37°C in een schudincubator geïncubeerd.

Trap (c)

Steriel filtreren van het bacteriële medium.

Na centrifugeren (10 min bij 800 x g) van de bacteriële suspensieswerden de supernatanten met behulp van een filter (0.2 /umj Gelman)gesteriliseerd, waarna de CT- en HT-titers werden bepaald. De CT-titerwerd uitgedrukt als de reciproke waarde van de grootste verdunning vande supernatant, welke alle alveolaire macrofraag-verdunningen met nigro-sine kleurde en de HT-titer werd uitgedrukt als de reciproke waarde vande grootste verdunning, welke 50% SRBC (sheep red blood cells) hemoly-seerde.

TABEL B

*) PBS: 0,123 M NaCl + 0,01 M Na2HP04 + 0,0032 M KH2P04;pH = 7,2

De bij de CT- en HT-produktietrap (trap b) toegepaste 2 x 10^CFU/ml H. pleuropneumoniae 13261 hangt samen met het in Fig. 1 geïllus¬treerde optimum voor de CT- en HT-produktie. Zoals uit deze figuurblijkt resulteert een inoculatie met een bacterie-suspensie van meer dan1θ9 CFU/ml niet in een hogere toxineproduktie.

Zoals uit de bovenstaande Tabel B kan worden afgeleid worden met demet serum of serumprodukten verrijkte kweekmedia die geen NAD bevatten,veruit de hoogste CT- en HT-titers verkregen; deze titers zijn van eenzodanige waarde, dat uit de verkregen supernatanten, al dan niet na eenverdere opwerking zoals een dialyse tegen PBS, werkzame vaccins tegen

Haemophilus pleuropneumoniae kunnen worden bereid.

De bovenstaande methode volgens de uitvinding werd met de resteren¬de in Tabel A weergegeven stammen van de serotypen 1-11 herhaald. Uitdeze proeven bleek echter, dat alle volgens de werkwijze volgens de uit¬vinding gekweekte stammen (uitgezonderd stam Fem0 van het serotype 6)het cytotoxine produceren, terwijl de hemolysine-produktie slechts bijde stammen van het serotype 1, 5, 9, 10 en 11 kon worden waargenomen.

Voorbeeld II

Met dit voorbeeld wordt de immuniteit van SPF-varkens tegenH.pleuropneumoniae, welke met het vaccin volgens de uitvinding zijngevaccineerd, aangetoond.

Trap (a)

Bereiding van de inocula.

De H. Pleuropneumoniae-stam 13261 werd op schapebloed, aangevuldmet 0,1% nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) (SBV) gekweekt. De SBV-platen werden 6 uren bij 5% CO2 en 37°C geïncubeerd. Daarna werd elkeplaat met 5 ml Eagle's Minimum Essential Medium met Earle’s salts (EMEM)gespoeld· De resulterende bacteriesuspensie werd gedurende de nacht bij4°C opgeslagen, waarna deze de volgende dag werd gebruikt.

Trap (b)

De toxine-productietrap.

EMEM werd tegen Serum Plus (Hazleton Research Products Ine·, LenexaKansas, USA) (v/v 9:1) onder continu roeren gedurende 24 uren gedialy-seerd. Aan het gedialyseerde EMEM werd 2,5% Serum Plus toegevoegd en met2.10^ CFU/ml van de volgens Trap (a) bereide bacteriesuspensie geïn-oculeerd. De cultuur werd 6 uren bij 37°C geïncubeerd. Vervolgens werdde cultuur (15 min x 4000 g) gecentrifugeerd waarna een gelijk volumevan een verzadigde ammoniumsulfaatoplossing langzaam aan de supernatantwerd toegevoegd. De supernatant werd gedurende de nacht bij 4°C ondercontinu roeren opgeslagen en de volgende dag (60 min x 8000 g) gecentri¬fugeerd. Het neerslag werd in een fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS;0,123 M NaCl, 0,01 M Na2HP04, 0,0032 Μ KH2PO4; pH 7,2) opgelosten tegen PBS gedurende 24 uren gedialyseerd, tot een steriel produktgefiltreerd (Gelman 0,2 /urn) en tenslotte in olie (ν/v 1 ï 1) geëmul¬geerd.

Trap (c)

Vaccinatie van varkens»

Bij de vaccinatieproef werden specifiek-pathogeen-vrije (SPF)varkens (gekruist Great Yorkshire x Nederlands Landras) van de leeftijdvan 6 weken toegepast. Hierbij werden 6 varkens intramusculair bij zesen tien weken gevaccineerd, terwijl een viertal varkens als controle-dieren werden gebruikt. Vier dagen voor de infektie, in de twaalfdeweek, werden de varkens in de oorader gecatheteriseerd om een frequentebloedmonstering mogelijk te maken. De bloedmonsters werden uit de oor-adercatheter in geëvacueerd EDTA, Li-heparine en serumbuisjes verzameld·De varkens werden voor de vaccinatie en twee maal daags gedurende devier dagen voor de inoculatie en op de post-inoculatie-uren (PIH) 0, 2,4, 6, 9, 12, 18, 24, 30, 36, 42 en 48 bemonsterd. Wanneer bloedmonstersvan de varkens werden genomen, werd de lichaamstemperatuur ervan vastge¬steld en werden de varkens geobserveerd voor klinische tekenen. Devarkens werden 48 uren na de inoculatie door middel van een intraveneuzeinjectie van een barbituraat gedood en onmiddellijk aan een autopsieonderworpen.

De infectie vond plaats door middel van een endobronchiale inocula¬tie· Hierbij werden de varkens verdoofd met diazepam (Hoffman-La Roche)en werden met hun koppen in een verticale positie gebracht. Vervolgenswerd een catheter (Cordis Europa N.V., Nederland) door de larynx diep inde bronchi gebracht, waarna 10 ml van de inoculatievloeistof, welke

O

10 CFÜ van H.pleuropneumoniae-stam 13261 bevatte langzaam werd geïn¬jecteerd. Daarna werd de catheter snel verwijderd en werden de kelen vande varkens gemasseerd ter voorkoming van hoesten.

RESULTAAT

3

Na de endobronchiale inoculatie van 10 CFU H.pleuropneumoniae-stam 13261 waren alle niet-gevaccineerde varkens aangeslagen en ademdenzwaar vanaf de PIH 9, terwijl de gevaccineerde varkens geen tekenen vaneen klinische ziekte vertoonden.

In tegenstelling tot de gevaccineerde varkens welke geen koortsontwikkelden, bereikten de niet-gevaccineerde varkens een koortspiek bijPIH 12 (zie fig. 2).

Varkens, welke gevaccineerd waren, ontwikkelden neutraliserendeantilichamen tegen hemolysine en cytotoxine van de H.pleuropneumoniae-stam 13261 (zie de fig· 3 en 4).

Bij de autopsie hadden alle niet-gevaccineerde varkens een acutefibrineuse hemorrhargische necrotiserende pleuropneumonia van de rechter diafragmaticale longkwab, die ongeveer 75 g woog. Geen van de gevacci¬neerde varkens ontwikkelde een pneumonie, behalve één varken, welke eenlocale catarrale pneumonie met focale hemorrhages op de inoculatieplaatsontwikkelde. Er werd geen induratie of andere abnormaliteit in de nek¬spieren bij de vaccinatieplaatsen waargenomen.

Uit het bovenstaande volgt, dat de varkens, welke met cytotoxine en hemolysine waren gevaccineerd, beschermd waren tegen een infectie met3 10 CFU H.pleuropneumoniae-stam 13261. In tegenstelling hiermee leverteen immunisatie van varkens met hele-cel-vaccins of met vaccins metcapsulaire extracten van H.pleuropneumoniae geen volledige beschermingtegen een homologe infectie (Rosendal, S., et al, 1986, Protectiveefficacy of capsule extracts of Haemophilus pleuropneumoniae in pigs.Vet· Microbiol·, 12, blz. 229-240).

Resumerend kan worden geconcludeerd, dat de werkzaamheid van deH.pleuropneumoniae-vaccins volgens de uitvinding gebaseerd is op hetvermogen ervan neutraliserende antilichamen tegen H. pleuropneumoniae-toxines op te wekken en niet tegen hun serotype-specifieke antigeneeigenschappen.

LEGENDA

Fig· 1 : Grafische voorstelling van de CT- en HT-produktie bij een inoculatie met een bacterie-suspensie van de H.pleuro- pneumoniae-stam 13261 van 10^-10^ CFU/ml.

Fig. 2 : Grafische voorstelling van de rectale temperaturen (+ SEM) van gevaccineerde en niet-gevaccineerde varkens o na de endobronchiale infectie met 10 CFU H.pleuropneu-moniae-stam 13261.

Fig. 3 : Grafische voorstelling van de neutraliserende antilicha- men tegen hemolysine van de H.pleuropneumoniae-stam 13261in gevaccineerde en niet-gevaccineerde varkens.

Fig· 4 : Grafische voorstelling van de hoeveelheid neutraliserende antilichamen tegen het cytotoxine van de H.pleuropneumo-niae- stam 13261 in gevaccineerde en niet-gevaccineerdevarkens·

Claims

1. Vaccin, geschikt voor de profylaxe en/of het bestrijden van Haemophilus pleuropneumonie bij varkens, gekenmerkt dooreen werkzaam gehalte van een extracellulair eiwitachtig materiaal, afkomstig uit het cultuurmedium van Haemophilus pleuropneumoniae.

2. Vaccin volgens conclusie 1, gekenmerkt door eenwerkzaam gehalte van een extracellulair eiwitachtig materiaal, verkregendoor het steriel filtreren van het cultuurmedium van Haemophilus pleuro-pneumoniae.

3. Vaccin volgens conclusie 1 of 2, gekenmerkt door een werkzaam gehalte van een extracellulair eiwitachtig materiaal, afkomstig uit het cultuurmedium van een H. pleuropneumoniae-stam van hetserotype 1, 5, 6, 9 of 11.

4. Vaccin volgens conclusie 1 of 2, gekenmerkt door een werkzaam gehalte van een extracellulair eiwitachtig materiaal, afkomstig uit het cultuurmedium van een H.pleuropneumoniae-stam van hetserotype 2, 3, 4 of 8.

5. Vaccin volgens conclusies 3 en 4, gekenmerkt dooreen werkzaam gehalte van een mengsel van extracellulaire eiwitachtigematerialen, afkomstig uit de cultuurmedia van een of meer van de zowelin conclusie 3 als conclusie 4 vermelde serotypen van H.pleuropneu¬moniae .

6. Werkwijze voor het winnen van een extracellulair eiwitachtigmateriaal van Haemophilus pleuropneumoniae, gekenmerktdoor a) het kweken van een H. pleuropneumoniae-stam op een kweekmedium waar¬aan nicotine adeninamide dinucleotide (NAD) is toegevoegd; b) het overbrengen en kweken van de onder (a) verkregen kiemen vanH♦pleuropneumoniae op een met serum en/of serumprodukten verrijktkweekmedium, dat geen NAD bevat; en c) het steriel filtreren van dit medium onder verkrijging van eenfiltraat.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk,dat men als de onder trap (a) toegepaste H.pleuropneumoniae-stam eenstam van het serotype 1, 5, 6, 9 of 11 toepast.

8· Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk,dat men als de onder trap (a) toegepaste H. pleuropneumoniae-stam eenstam van het serotype 2, 3, 4 of 8 toepast.

9. Werkwijze volgens een of meer der conclusies 6-8, met het kenmerk, dat men de in trap (a) en/of (b) uitgevoerde incubatiebij een temperatuur in het trajekt van 30-40°C, bij voorkeur 37°C uit¬voert .

10. Werkwijze voor het opwerken van het filtraat, verkregen volgensde werkwijze van een of meer der conclusies 6-9, met het ken¬merk, dat men (1) het betreffende filtraat mengt met een ten minste 50 gew.%1sammoniumsulfaatoplossing onder verkrijging van een neerslag; (2) het onder (1) verkregen neerslag oplost in een fosfaat-gebufferdezoutoplossing (PBS); en (3) het onder (2) verkregen produkt dialyseert tegen PBS onder verkrij¬ging van een gedialyseerd eiwitachtig materiaal.

11. Werkwijze volgens conclusie 10, met het kenmerk,dat men in trap (1) een verzadigde ammoniumsulfaatoplossing toepast.

12. Vaccin, geschikt voor de profylaxe of het bestrijden vanH.pleuropneumonie bij varkens, gekenmerkt door een werk¬zaam gehalte aan eiwitachtig materiaal, verkregen volgens een of meerder conclusies 6-11.

13. Vaccin volgens conclusie 12, gekenmerkt door eengehalte aan een mengsel van eiwitachtige materialen, verkregen van eenof meer van de zowel in conclusie 7 als conclusie 8 vermelde serotypenvan H.pleuropneumoniae.