NL8700767A

NL8700767A - Dipeptidase, isolering daarvan uit melkzuurbacterien, antilichamen tegen het dipeptidase, gebruik van het dipeptidase en van de antilichamen daartegen.

Info

Publication number: NL8700767A
Application number: NL8700767A
Authority: NL
Original assignee: Groningen Science Park
Priority date: 1987-04-01
Filing date: 1987-04-01
Publication date: 1988-11-01
Also published as: ES2067463T3; CA1311203C; EP0286171B1; DK171888D0; ATE87652T1; IE880969L; US4888284A; DK171888A; DE3879740D1; JPS6420085A; EP0286171A1; DE3879740T2; IE63958B1

Description

i

A

VO9102

Titel: Dipeptidase, isolering daarvan uit melkzuurbacte riën, antilichamen tegen het dipeptidase, gebruik van het dipeptidase en van de antilichamen daartegen.

De uitvinding heeft betrekking op een dipeptidase van melkzuurbacteriën in geïsoleerde vorm, d.w.z, in een overwegend zuivere toestand in verhouding tot de toestand waarin het in vivo in melkzuurbacteriën aanwezig 5 is.

Melkzuurbacteriën, in het bijzonder melkzuur-streptococcen zoals Streptococcus cremoris, Streptococcus lactis en Streptococcus diacetylactis, alsmede andere melkzuurbacteriën zoals Leuconostoc species worden 10 op grote schaal gebruikt in de levensmiddelenindustrie, in het bijzonder in de zuivelindustrie voor het bereiden van gefermenteerde melkprodukten zoals kaas. Door de produktie van melkzuur uit lactose wordt het voedingspro-dukt verzuurd waardoor bederf van het voedingsprodukt 15 wordt tegengegaan. Bovendien zijn de bacteriën betrokken bij de ontwikkeling van geur en smaak van het voedingsprodukt. Een belangrijk proces daarbij is de afbraak van eiwitten.

De bacteriën hebben voor groei en voor melkzuur-20 produktie een voedingsmedium nodig, dat essentiële groeifactoren zoals vitaminen en aminozuren levert.

Melk is een geschikt voedingsmedium en maakt groei tot hoge celdichtheden mogelijk. Het gehalte aan vrije aminozuren is hiervoor in melk echter onvoldoende, 25 zodat de bacteriën voor hun behoefte aan aminozuren aangewezen zijn op hun proteolytisch systeem voor het afbreken van melkeiwitten, in het bijzonder caseïne.

Het proteolytisch systeem van melkzuurbacteriën blijft ook na het einde van de groei actief, bijv. in de kaas-30 rijpingsfase waarbij de afbraak van caseïne tot peptiden en vervolgens aminozuren bijdraagt aan de aroma- en smaak- 8 ? C 0 7 6 7 -2- / ontwikkeling van de kaas.

Het proteolytisch systeem van melkzuurstreptococcen omvat verschillende proteasen en verschillende peptidasen. De proteasen zijn gelocaliseerd in de celwand van de 5 bacteriën, terwijl de peptidasen zich in de celwand, in het cytoplasmamembraan en binnen de cel kunnen bevinden.

Totnogtoe zijn slechts enkele peptidasen van streptococcen geïsoleerd en gekarakteriseerd. Door Hwang et al, Agric. Biol. Chem. 45 (1981) 159 - 165 10 en 46 (1982) 3049 - 3053 is een dipeptidase met brede substraatspecificiteit uit Streptococcus cremoris H61 geïsoleerd. Door Geis et al, Appl. Microbiol. Biotechnol.

23 (1985) 79 - 84 is een celwandgebonden aminopeptidase van J5. cremoris AC1 geëxtraheerd en gezuiverd. Door 15 Desmazeaud en Zevaco, Milchwissenschaft 34 (1979) 606 - 610 zijn twee intracellulaire aminopeptidasen van _S. diacetylactis geïsoleerd.

In de Nederlandse kaasindustrie is S^. cremoris de belangrijkste melkzuurbacteriesoort. Een goed inzicht 20 in het proteolytisch systeem van melkzuurstreptococcen zoals j3. cremoris kan bijdragen aan een verbetering van de zuursels (starter cultures) en aan een betere regeling van het rijpingsproces, waardoor bijvoorbeeld een versnelde kaasrijping kan worden gerealiseerd of 25 het ontstaan van een bittere smaak kan worden verhinderd. Veel basisinformatie wordt gegeven in het proefschrift van R. Otto: "An ecophysiological study of starter streptococci", Rijksuniversiteit te Groningen (1981) en in het proefschrift van J. Hugenholtz; "Population 30 dynamics of mixed starter cultures", Rijksuniversiteit te Groningen (1986). In laatstgenoemde proefschrift wordt een nader onderzoek naar de proteasen van S>. cremoris Wg 2 beschreven.

De onderhavige uitvinding is gebaseerd op een 35 nader onderzoek naar de peptidasen van IS. cremoris Wg2, waarbij een bepaald dipeptidase werd geïsoleerd / i- i> : h t *w* . f ·_- .*· i -3-

A

en gekarakteriseerd dat nog niet eerder is beschreven.

Het dipeptidase werd uit een ruw celvrij extract van _S. cremoris Wg2 gezuiverd door DEAE-Sephacel kolomchroma-tografie gevolgd door preparatieve electroforese. Het 5 dipeptidase vertoont hydrolyse activiteit ten aanzien van verscheidene dipeptiden en is, gezien zijn gevoeligheid voor de metaalchelaten vormende verbinding EDTA, een metalio-enzym dat een pH optimum bij ca. 8 en een temperatuuroptimum bij ca. 50°C vertoont. Bij SDS-PAA 10 gel electroforese van het gezuiverde enzym wordt één enkele eiwit band gevonden met een molgewicht van ca.

49 kD. Het enzym ondervindt sterke inhibitie van verbindingen zoals mercaptoethanol en dithiotreitol, die disulfide-bindingen kunnen reduceren, en is ongevoelig 15 voor sulfhydrylgroep reagentia zoals naftylmaleimide, jodoazijnzuur en 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoëzuur).

Een kinetiek-onderzoek van de leucyl-leucine en alanyl-ala-nine hydrolyse laat zien dat het enzym een relatief lage affiniteit voor deze substraten bezit (Km respectie-20 velijk 1,6 en 7,9 mM), maar zeer hoge hydrolysesnelheids-maxima heeft (Vmax respectievelijk 3700 en 13000 /umol/min. mg eiwit). Deze waarden corresponderen met turnover getallen van respectievelijk ca. 3000 en ca. 10000 sec”1. De pi (isoelektrisch punt) van het enzym is 25 betrekkelijk laag (ca. 4,4) hetgeen verklaart dat het enzym met behulp van preparatieve PAA gel electroforese kan worden gezuiverd.

Het nieuwe dipeptidase volgens de uitvinding verschilt van het door Hwang et al uit £. cremoris 30 H61 geïsoleerde dipeptidase in molgewicht, substraatspeci-ficiteit en peptidehydrolysesnelheden, en verschilt ten minste in substraatspecificiteit van de eerder beschreven aminopeptidasen. Het nieuwe dipeptidase hydrolyseert verscheidene dipeptiden, waaronder leu-leu, 35 leu-met, leu-val, leu-gly, val-leu, phe-leu en ala-ala.

C 7 Γ·' Λ *? f.

? ƒ t * -4- % -»Γ Η.

Daarentegen blijkt het nieuwe dipeptidase niet in staat tot significante hydrolyse van dipeptiden, zoals his-leu, γ-glu-leu, gly-leu, α-glu-ala, en pro-leu, die proline, histidine, glycine of glutamaat als N-terminaal aminozuur 5 bevatten, evenmin als hydrolyse van tripeptiden, tetra-peptiden en hogere polypeptiden.

Het nieuwe dipeptidase volgens de uitvinding heeft met de eerder beschreven bekende peptidasen van melkzuurstreptococcen gemeen, dat de metaalchelatenvormer 10 EDTA een sterke inhibitie van de hydrolyse activiteit geeft, welke activiteit vervolgens kan worden hersteld door toevoeging van bepaalde tweewaardige kationen zoals Co++ en Mn++. Verrassenderwijze blijken hogere concentraties van Co++ echter weer inhiberend te werken.

15 De hydrolysesnelheid van het nieuwe dipeptidase is veel hoger dan de snelheid waarmee de cellen peptiden opnemen, zodat de peptide-opname een snelheidsbeperkende stap in de afbraak van de peptiden door de streptococcen is. Dit impliceert bijv. dat een versnelde kaasrijping 20 kan worden gerealiseerd indien de bacteriën peptidasen uit de cel exporteren of indien gezuiverd peptidase aan het medium wordt toegevoegd.

Het nieuwe dipeptidase zou ook gebruikt kunnen worden om de vorming van een ongewenste bittere smaak 25 tijdens de kaasrijping te voorkomen. Sommige jS. cremoris stammen blijken immers na afbraak van caseïne verschillende graden van bitterheid te produceren, kennelijk als gevolg van het ophopen van peptiden met een hoog gehalte aan hydrofobe aminozuren die door de peptidasen 30 van de in het zuursel aanwezige bacteriën maar langzaam worden afgebroken. Gebruik van het onderhavige dipeptidase zou dit probleem kunnen mitigeren.

Verder kan gedacht worden aan gebruik van het dipeptidase voor andere doeleinden, zoals de klaring van bier en 35 frisdranken, en natuurlijk ook aan gebruik in de DNA-tech-nologie in ruime zin.

De uitvinding wordt op de eerste plaats belichaamd in het dipeptidase zelf, d.w.z. een dipeptidase van

£ ft 7 f- T

V .* υ i, „·· “j / ί -5- V 4 ' melkzuurbacteriën in geïsoleerde vorm dat gekenmerkt wordt door een molgewicht van 49 kD + 5 kD? een isoelek-trisch punt van 4 ,4 + 0 ,4; een substraat bereik dat de dipeptiden leu-leu, leu-met, leu-val, leu-gly, val-leu, 5 phe-leu en ala-ala, maar niet de dipeptiden his-leu, γ-glu-leu, gly-leu, “-glu-ala en peptiden uit 3 of meer aminozuurresten omvat? en een hydrolyse activiteit met een temperatuuroptimum bij 50°C + 10°C, een pH optimum bij 8+1, en gevoeligheid voor het metaalchelaten 10 vormende EDTA en voor de reductiemiddelen dithiotreitol en mercaptoethanol.

Hoewel het dipeptidase, dat volgens het experimentele gedeelte feitelijk is geïsoleerd en gekarakteriseerd, afkomstig is van één bepaald organisme, nl. een proteinase 15 negatieve variant van _S. cremoris Wg2, omvat de uitvinding ook de overeenkomstige dipeptidasen van andere melkzuurbacteriën aangezien deze overeenkomstige eigenschappen bezitten en op overeenkomstige wijze uit de bacteriën kunnen worden geïsoleerd en gezuiverd. Met "overeenkom-20 stige dipeptidasen" wordt niet bedoeld dat de peptidasen exact gelijk zijn, d.w.z. dezelfde aminozurensequentie hebben, maar wordt veeleer bedoeld dat ze aan de bovenstaand vermelde karakterisering van het dipeptidase voldoen.

25 Een meer specifieke uitvoeringsvorm van de uitvinding betreft het dipeptidase dat afkomstig is van melkzuurstreptococcen, in het bijzonder S. cremoris, lief st jS. cremoris Wg2.

Met de woorden "in geïsoleerde vorm" en "afkomstig 30 van" wordt niet beoogd de uitvinding te beperken tot dipeptidase, dat uit zijn natuurlijke omgeving is geïsoleerd. De uitvinding creëert nl. de mogelijkheid om het dipeptidase-gen op te sporen en vervolgens met behulp van recombinant DNA technologie produktie van 35 het dipeptidase in getransformeerde cellen of organismen te realiseren. Daartoe zou men bijv. eerst de aminozuur- * f- '\ λ -7 ‘ K V / 0 / -6- sequentie van het dipeptidase, of van een deel daarvan, kunnen bepalen. Op basis daarvan kunnen met behulp van de genetische code corresponderende DNA sequenties worden afgeleid, waarna geschikte DNA probes kunnen 5 worden gesynthetiseerd waarmee dipeptidase boodschapper RNA (mRNA) van de cellen kan worden gedetecteerd en geïsoleerd. Dit mRNA kan volgens op zichzelf bekende technieken worden gebruikt voor het bereiden van kopie DNA (cDNA) onder toepassing van enzymen zoals reverse 10 transcriptase en DNA polymerase. Dit cDNA kan dan met behulp van geschikte vectoren (meestal plasmiden) worden gekloneerd en tot expressie worden gebracht in geschikte gastheercellen, waaruit het geproduceerde dipeptidase gemakkelijk kan worden gewonnen.

15 Ook creëert de uitvinding de mogelijkheid om antilichamen tegen het dipeptidase te produceren en vervolgens te gebruiken om het dipeptidase uit zijn natuurlijke omgeving of uit de bovenstaand bedoelde getransformeerde cellen of organismen te verwijderen 20 of te isoleren.

De uitvinding wordt dan ook mede belichaamd in het gebruik van het nieuwe dipeptidase voor het bereiden van polyclonale of monoclonale antilichamen met affiniteit en/of specificiteit voor het dipeptidase, 25 in deze polyclonale en monoclonale antilichamen zelf, en in hun gebruik om het dipeptidase te detecteren in, dan wel te verwijderen of isoleren uit een mengsel dat het dipeptidase bevat.

Vanzelfsprekend wordt de uitvinding verder 30 belichaamd in het gebruik van het nieuwe dipeptidase bij de bereiding van levensmiddelen, zoals kaas, opklopbare produkten en vleeswaren, waarbij gebruik gemaakt wordt van de hydrolyse eigenschappen van het dipeptidase, bijv. om een versnelde kaasrijping te realiseren of 35 om de vorming van een bitter aroma tegen te gaan. Ook %n oin i' * V ‘ i Μ.

-7- de aldus verkregen levensmiddelen worden door de uitvinding omvat.

De uitvinding wordt verder belichaamd in een werkwijze voor het isoleren van het nieuwe dipeptidase 5 uit melkzuurbacteriën, waarbij een ruw celvrij extract van de melkzuurbacteriën aan ionenuitwisselaarkolomchromato-grafie wordt onderworpen, een of meerdere fracties met leucyl-leucine hydrolyse activiteit aan electroforese worden onderworpen en een of meer fracties met leucyl-leu-10 cine hydrolyse activiteit worden gewonnen.

In een voorkeursuitvoeringsvorm van deze werkwijze wordt als ionenuitwisselaarkolom een DEAE-Sephacel kolom toegepast en wordt fractionering gerealiseerd door gradiënt-elutie. De electroforese is bij voorkeur 15 een in een kolom uitgevoerde preparatieve polyacrylamide-gel electroforese, waarbij het effluent van de kolom in fracties wordt opgevangen.

De uitvinding zal hierna aan de hand van het experimentele gedeelte en de tekening nader worden 20 toegelicht.

Fiquurbeschrijvinq

Fig. 1 toont schematisch de experimentele opstel-25 ling die voor de preparatieve electroforese is toegepast.

De PAA kolom is met verwijzingscijfer 1 aangegeven, de buffer stroom met verwijzingscijfer 2, de elutiekamer met verwijzingscijfer 3, de agarose met verwijzingscijfer 4, de rubber stop met verwijzingscijfer 5, de negatieve 30 zijde van het bufferreservoir met verwijzingscijfer 6, de positieve zijde van het bufferreservoir met verwij-zingscijfer 7, en het dialysemembraan met verwijzingscijfer 8.

Fig. 2 laat de resultaten zien van DEAE-Sephacel 35 kolomchromatografie van een ruw celvrij extract van r Λ /·· »'r f b ' u / ·* / 6 -8- Η S^. cremoris Wg2. φ_0 : eiwitgehalte (A280) 0 Q : leucyl-leucine peptidase activiteit, gemeten 5 met de Cd/ninhydrine methode x_K : NaCl-concentratie.

De fracties 148 - 175 werden verenigd.

Fig. 3 toont het effect van de temperatuur 10 op de leucyl-leucine activiteit in 20 mM HEPES pH 7,8, bepaald volgens de Cd/ninhydrine methode.

Fig. 4 toont het effect van de pH op de peptidase activiteit, gemeten in 20 mM appelzuur, 20 mM MES, 20 mM HEPES en 20 mM boorzuur, met KOH op verschillende 15 pH waarden ingesteld. De peptidase activiteit werd bepaald met leucyl-leucine volgens de Cd/ninhydrine methode.

Fig. 5 toont de reactivering van het met EDTA behandelde dipeptidase met tweewaardige kationen: (φ)Μη++; 20 (·)Co++; (0)Zn++; (f)Ca++; ($)Cu++.

Materialen en methoden

Organisme en bereiding van een celvrij extract.

25

In de experimenten werd een proteïnase-negatieve variant van _S. cremoris Wg2 gebruikt. Het organisme werd routinematig bewaard in 10% (gew./vol.) steriele gereconstitueerde taptemelk welke 0,1% (gew./vol.) trypton 30 bevatte, bij een temperatuur van -20°C. Voor het kweken van £3. cremoris Wg2 werd MRS medium (De Man et al, J. Appl. Bacteriol. 23 (1960), 130 - 135) gebruikt, waarbij de groei plaats vond bij een gecontroleerde pH van 6,3 in een 5 liter fermentor. Membraan blaasjes 35 van _S. cremoris Wg2 werden geïsoleerd zoals beschreven door Otto et al, J. Bacteriol. 149 (1982), 733 - 738.

8 7 v v Ί i Η «i -9-

Het supernatant, dat verkregen werd door de membraan blaasjes en hele cellen te verwijderen van de met lysozyme behandelde celsuspensie, werd als het ruwe celvrije extract gebruikt.

5

Enzymbepalingen (i) Leucyl-leucine hydrolyse activiteiten werden bepaald door het vrijkomen van leucine te meten met ^0 behulp van de gemodificeerde Cd-ninhydrine methode, die beschreven is door Van Boven en Konings, Appl.

Environ. Microbiol. 51 (1986), 95-100.

(ii) Hydrolyse van alanine bevattende peptiden werd bepaald door het vrijkomen van alanine te meten met ._ behulp van een gekoppelde enzymreactie volgens Grassi i.5 (1974) L-alanine determination with GPT and LDH, p.

1682-1685 (in H.ü. Bergmeyer (ed), Methods in enzymatic analysis. Academie Press, Inc., New York, San Francisco en London). Het reactiemengsel bevatte in een totaal 2q volume van 1 ml 0,1 M Tris-HCl pH 7,6, 50 /ul van een geschikte hoeveelheid enzym, 100 /ul 0,2 M oxo-glutaarzuur, 50 /ul 12 mM NADH, 10 /ul lactaat-dehydrogenase (1 mg/ml in 3,2 Μ (NH4)28()4) en 25 /ul glutamaat pyruvaat transaminase (8 mg/ml in 3,2 Μ (NH4)2004). De reactie 25 werd gestart door toevoeging van 20 /ul peptide oplossing en hydrolyse van peptiden werd continu gevolgd met behulp van een dubbele bundelspectrofotometer als de NADH afname bij 340 nm. De enzym activiteiten werden berekend onder toepassing van een molaire absorptie coëfficiënt 20 voor NADH van 6,22 x 10^ M-lcm~l· (iii) Hydrolyse van leucine bevattende peptiden werd bepaald door het vrijkomen van leucine te meten. De hoeveelheid leucine kan worden gedetecteerd in een gekoppelde enzymreactie waarin o-dianisidine (gereduceerd) wordt geoxydeerd. Het reactiemengsel bevat in een totaal 35 volume van 1 ml, 0,2 M tri-ethanolamine pH 7,6, 50 /ul 87,0 0 7 6 7 -10-

«I

van een geschikte hoeveelheid enzym, 5 /ul 23,2 mM

o-dianisidine (in 0,5 N HC1), 5 /ul horseradish peroxidase (10 mg/ml in 3,2 Μ (NH4)2004) en 30 /ul L-aminozuur oxidase. De reactie werd gestart door de toevoeging 5 van 20 /ul peptide oplossing en hydrolyse werd spectrofotometrisch continu gevolgd als de gevormde hoeveelheid geoxydeerd o-dianisidine bij 436 nm. De enzym activiteiten werden berekend onder toepassing van een molaire absorptie-coëfficiënt voor geoxydeerd o-dianisidine van 8,1 x 103 M”lcm”l.

10 (iv) Hydrolyse van leucyl-p-nitroanilide werd bepaald volgens de methode van Exterkate, Neth. Milk Diary J. 29 (1975), 303-318. Leucyl-p-nitroanilide (200 /ul 2 mM) werd gedurende 40 minuten geïncubeerd met een geschikte hoeveelheid enzym. De reactie werd gestopt 15 na toevoeging van 200 /ul 30% azijnzuur en de hoeveelheid nitroanilide werd gemeten bij 410 nm.

Alle metingen van enzym activiteiten werden uitgevoerd bij 30°C, tenzij anders is vermeld.

20 DEAE-Sephacel kolom chromatografie

Een DEAE-Sephacel kolom (3,2 x 20 cm) werd geëquilibreerd met 10 mM K2HPO4/KH2PO4 pH 7,0 met 0,12 M NaCl. Het celvrije extract dat na isolatie van membraan 25 blaasjes van cremoris Wg2 werd verkregen, werd met gedestilleerd water verdund tot dezelfde sterkte als de buffer die gebruikt was voor het equilibreren van de DEAE-Sephacel kolom, en werd vervolgens op de kolom aangebracht. Na wassen van de kolom met 2 volume-hoevee1-30 heden equilibratie buffer, werd het enzym geëlueerd met een lineaire gradiënt van 0,12 - 0,3 M NaCl in dezelfde buffer. Fracties van 2,5 ml werden verzameld en getest voor leucyl-leucine hydrolyse activiteit volgens de Cd-ninhydrine methode. De fracties met de ü) 0 ü V / * -11- hoogste enzym activiteit werden gecombineerd.

Preparatieve electroforese 5 De experimentele opstelling die gebruikt werd voor de preparatieve PAA-gel electroforese (onder toepassing van een 7,5% PAA kolom, 1,5 x 14 cm) is schematisch in Pig. 1 getoond. Door electroforese worden de eiwitten op de PAA kolom gescheiden. Deze eiwitten worden uit 10 de kolom geëlueerd en opgevangen door een konstante bufferstroom aan het uiteinde van de kolom, dwars op de electroforese richting. Peptidase bevattende fracties die uit de DEAE-Sephacel kolom worden verkregen, werden geconcentreerd tot 0,2 ml (19,8 mg eiwit) gemengd 1 15 : 1 met monster buffer (25 mM Tris-boraat pH 8,0, 18% glycerol en 0,01% broomfenol blauw) en aangebracht op de PAA kolom. De electroforese werd gestart met een konstante stroomsterkte van 4 mA. Het broomfenol blauw bereikte het uiteinde van de kolom na 15 uur 20 electroforese. Een konstante stroom (0,2 ml/min) buffer (25 mM Tris-boraat pH 8,0) werd door de met de PAA-kolom verbonden elutiekamer gepompt en electroforese werd nog eens 10 uur voortgezet bij een konstante stroomsterkte van 40 mA. Er werden fracties van 5 ml verzameld van 25 het eluaat van de elutiekamer en getest voor leucyl-leucine hydrolyse activiteit volgens de Cd-ninhydrine methode.

Fracties met de hoogste enzym activiteiten werden gecombineerd .

30 SDS-PAA qelelectroforese

Natriumdodecylsulfaat (SDS)-polyacrylamide (PAA) gelelectroforese werd uitgevoerd zoals beschreven door Laemmli en Faure, J. Mol. Biol. 80 (1973), 575 35 - 599. De eiwit monsters werden 1 i 1 gemengd met monster 8700767 w s -12- buffer (0,18 M Tris-HCl pH 6,8, 0,3% SDS, 8,6% glycerol, 10% mercaptoethanol en 0,07% broomfenol blauw) en op de gels aangebracht.

Het molecuulgewicht van de enzymen werd geschat 5 met behulp van de volgende referentie-eiwitten: fosforylase B (92,5 kD), runderserum albumine (66,2 kD), ovalbumine (45,0 kD), koolzuuranhydrase (31,0 kD), sojabonentrypsine (21,5 kD) en lysozyme (14,4 kD).

De zilverkleuring van de gels werd uitgevoerd 10 volgens Wray et al, Anal. Biochem. 118 (1981), 197-203.

- 20 CIE

Crossedimmunoelectroforese (CIE) werd uitgevoerd 15 als beschreven door Van der Plas et al, J. Bacteriol.

153 (1983), 1027 - 1037. De tweede dimensie werd bij 2,5 V/cm uitgevoerd gedurende 10 - 15 uur. De CIE gels werden gekleurd met 0,5% Coomassie brilliant blue of met de zymogram kleuringstechniek voor peptidase activi-20 teiten zoals beschreven door Van Boven en Konings, loc. cit.

PAA/CIE

25 De PAA gelelectroforese werd uitgevoerd met een 7,5% PAA-gel. Van de gecombineerde DEAE fracties werd 0,75 mg eiwit verdund 1 : 1 met monster buffer (zonder SDS) en op de gel aangebracht. Na 8 uur electro-forese werd een laan met zilver gekleurd. De tweede 30 laan werd als de eerste CIE dimensie gebruikt, op een glasplaat (5 x 10 cm) gebracht en ingebed in 6 ml 1% agarose welke antilichamen tegen een celvrij extract van j3. cremoris Wg2 bevatte. De tweede dimensie werd uitgevoerd op de voor CIE beschreven wijze en de gel 35 werd gekleurd met de zymogram techniek voor peptidase t / h ƒ h t -13- activiteit.

Isoelektrisch focusseren 5 Voor het isoelektrisch focusseren (IEF) op slab gels werd kant en klaar Servalyt Precotes pH 3 - 10 (Serva Heidelberg, West Germany) gebruikt* Het isoelektrisch punt van het enzym werd bepaald onder toepassing van de volgende referenties: glucoseoxidase lö (pi « 4,15), runderserum albumine (pi = 4,7), carboxyan-hydrase (pi - 6,5) en cytochroom c (pi =10,65).

Aminozuur analyse 15 De aminozuuranalyse van het gezuiverde enzym werd uitgevoerd met behulp van een Kontron Liquimat III aminozuur analyse inrichting.

Effect van tweewaardige cationen en chemische stoffen 20 op de enzym activiteit

Gezuiverd enzym (116 /ug) werd gedurende 10 minuten bij 20°C geïncubeerd met 0,25 mM EDTA. Overmaat EDTA werd door dialyse tegen 20 mM N-2-hydroxyethyl 25 piperazine-N,-2-morfolinoethaansulfonzuur (HEPES) pH

7,8 gedurende 30 uur met twee buffer wijzigingen verwijderd. Het met EDTA behandelde enzym werd gedurende 10 minuten bij 20°C voor-geïncubeerd met verschillende concentraties van verschillende tweewaardige cationen in 200 /ul 30 20 mM HEPES pH 7,8. De enzym activiteiten werden bepaald met leucyl-leucine als substraat onder toepassing van de Cd-ninhydrine methode.

De effecten van chemische stoffen werden bepaald door 200 /ul van een geschikte enzym oplossing gedurende 35 10 minuten bij 20°C te incuberen met verschillende m ·" ' ; ;.· -14- * Ί chemische stoffen. Na toevoeging van leucyl-leucine werd de enzym activiteit bepaald onder toepassing van de Cd-ninhydrine methode.

5 Effect van oxyderende en reducerende reagentia op de enzym activiteiten

Gezuiverd enzym werd voor-geïncubeerd gedurende 5 minuten met ferricyanide of geoxydeerd glutathion 10 om geoxydeerde omstandigheden te verkrijgen en met dithiotreitol (DTT) of gereduceerd glutathion om reducerende omstandigheden te krijgen. Er werd 2 mM leucyl-leucine toegevoegd en de peptide hydrolyse werd na 45 minuten gestopt door toevoeging van 3,5 mM mercaptoethanol. 15 Het reactiemengsel werd 40-voudig verdund in 40 mM Na2C03 pH 9,5 en de peptiden werden gedansyleerd door de monsters te mengen met een gelijke volume-hoeveelheid van 1,5 mg/ml dansylchloride in acetonitrile. De hoeveelheid gedansyleerde peptiden werd bepaald door reversed-phase 20 HPLC op een C^8 kolom.

Eiwi t-bepa1ing

De eiwit-concentraties werden, tenzij anders 25 is aangegeven, bepaald volgens de methode van Lowry et al, J. Mol. Chem. 193 (1951), 265 - 275, waarbij runderserum albumine als standaard werd toegepast.

Chemicaliën 30

Alle toegepaste chemicaliën waren in de handel verkrijgbare stoffen.

b * cj : «i -15- RESULTATBN Enzym-zuivering 5 Stap a.

Het ruwe celvrije extract werd aangebracht op een DEAE-Sephacel kolom. Na elutie met een NaCl gradiënt werden de hoogste leucyl-leucine hydrolyse activiteiten verkregen in de fracties met de nummers 10 150 - 175 (Pig. 2) overeenkomend met 0,18 - 0,19 M NaCl. Deze fracties werden gecombineerd en na dialyse van de fracties tegen 10 mM KH2PO4/K2HPO4 pH 7,0, om het NaCl te verwijderen, nog een keer op een DEAE-Sephacel kolom aangebracht. Fracties met leu-leu hydrolyse activi-15 teiten werden gecombineerd en geconcentreerd in een

Amicon filtratie-eenheid met een PM-10 membraan (molecuul-gewicht grens van 10.000).

Stap b.

20 Na electroforese van dit geconcentreerde monster op een niet-denaturerende PAA-gel werd het leucyl-leucine hydrolyserende enzym met PAA/CIE experimenten aan de positieve zijde van de gel gevonden. Het en2ym werd daarom verder gezuiverd door preparatieve electroforese.

25 Fracties die leu-leu hydrolyse activiteiten bevatten, werden gecombineerd en geconcentreerd tot 7,5 ml.

Tabel A geeft een samenvatting van de enzym opzuivering. Deze tabel laat zien dat het enzym 1240-voudig werd opge2uiverd met een opbrengst van 21,5% uit het 30 ruwe celvrije extract.

De na preparatieve electroforese verkregen gezuiverde enzym fractie vertoonde in SDS/PAA-gelelectroforese een enkele band wanneer de gel met zilver werd gekleurd, hetgeen een aanwijzing is voor een sterk gezuiverd 35 enzym (de verontreinigingen in de SDS/PAA-gel zijn

f· ~f Λ ··' Λ -V

*.· i V v ; v.1 / 8 % -16- te wijten aan de monster buffer). Dit werd bevestigd met CIE experimenten van het gezuiverde enzym. In het hele gebied van precipitatie-lijnen in een CIE patroon van een celvrij extract tegen antilichamen welke met 5 een celvrij extract als antigeen waren opgewekt, vertoonde slechts één precipitatie-lijn leucyl-leucine hydrolyse activiteit. Wanneer het gezuiverde enzym als antigeen werd gebruikt, werd één precipitatie-lijn waargenomen met leucyl-leucine hydrolyse activiteit.

10

Molecuulgewicht en isoelektrisch punt

Het molecuulgewicht werd met SDS/PAA-gelelectro-forese en met gelfiltratie op een Sephadex G-100 kolom 15 geschat op 49.000. De identieke resultaten die onder denaturerende en onder natuurlijke condities werden verkregen, vormen een aanwijzing dat het enzym een monomeer is dat uit één enkele sub-eenheid bestaat.

Het isoelektrisch punt van het enzym werd met 20 isoelektrisch focusseren op slab gels met pH 3 - 10 op 4,4 geschat.

Temperatuur-afhankeliikheid en effekt van de pH op de enzym activiteit 25

De temperatuur-afhankelijkheid werd bepaald door de leucyl-leucine hydrolyse activiteit in een bereik van 5 - 70°C te meten met behulp van de Cd-ninhy-drine methode. Het enzym mengsel werd geëquilibreerd 30 bij test-temperaturen voordat leucyl-leucine werd toegevoegd. De optimale temperatuur voor leucyl-leucine hydrolyse activiteit bleek ongeveer 50°C te bedragen (zie Fig. 3). Bij 70°C werd nog 15% van de optimale activiteit gevonden.

U ï V V - ij ί -17-

Het effekt van de pH werd bepaald in een bereik van pH 4 - 10 in een buffer die bestond uit 20 mM elk van appelzuur, 2-N-morfolinoethaansulfonzuur (MES), HEPES en boorzuur, ingesteld op de gekozen pH-waarden 5 (zie Fig. 4). De optimale pH voor hydrolyse van leucyl-leu-cine, zoals bepaald met de Cd-ninhydrine methode, bleek een pH van ongeveer 8 te zijn. Bij pH-waarden beneden een pH van 5, kon geen hydrolyse activiteit van het enzym worden gedetecteerd, terwijl bij een pH van 10 ongeveer 10 50% van de activiteit werd gevonden.

Aminozuur analyse

De aminozuur samenstelling van het enzym is 15 weergegeven in Tabel B. In het enzym is een zeer geringe hoeveelheid tyrosine en tryptofaan aanwezig, hetgeen de moeilijkheden bij het bepalen van de hoeveelheid gezuiverd enzym met behulp van een Lowry eiwit-bepaling verklaart.

20

Substraat specificiteit

De hydrolytische werking van het enzym op verscheidene peptiden werd onderzocht. De aktiviteiten werden 25 bepaald door het vrijkomen van leucine of alanine volgens een gekoppelde enzym reactie te meten. Tabel C toont de relatieve hydrolyse snelheid van verschillende peptiden. Het enzym was aktief ten opzichte van verschillende dipeptiden met relatief hydrofobe en neutrale amino-termi-30 nale aminozuren, hetgeen suggereert dat het N-terminale aminozuur van een peptide een belangrijke rol in de specificiteit speelt. Peptiden met verschillende samenstellingen welke drie of meer aminozuren bevatten, werden niet gehydrolyseerd. Anderszijds werden de meeste 35 van de geteste peptiden door het celvrije extract wel fs 7 Λ r 7 7, ! · ; ' - : > ’ -18- gehydrolyseerd. De C-terminale aminozuren bleken eveneens voor de enzym-substraat interactie van belang te zijn.

De hydrolyse activiteit werd bepaald met leucyl-p-nitro-anilide als substraat. Tabel D vergelijkt de activiteit van de leucyl-p-nitroanilide hydrolyse van de verschillende 5 stadia in de enzym zuivering. Het celvrije extract en de fracties die na de tweede DEAE-Sephacel kolom waren verkregen, hydrolyseren leucyl-p-nitroanilide wel, maar het gezuiverde enzym bleek niet in staat om dit substraat te hydrolyseren, hetgeen erop wijst 10 dat de C-terminale aminozuren van een dipeptide eveneens voor de specificiteit van het enzym bepalend zijn.

Peptiden met gemodificeerde peptide-bindingen konden niet worden gehydrolyseerd, noch door het celvrije extract, noch door het gezuiverde enzym.

15 Uit deze waarnemingen werd afgeleid dat het enzym een voorkeur voor bepaalde dipeptiden heeft, die het kan hydrolyseren, en dus om deze reden als een dipeptidase kan worden aangeduid.

20 Effecten van metaalionen op de enzym activiteit

Na behandeling van het enzym met het metaalchela-tenvormende middel EDTA werd de activiteit volledig verstoord. Toevoeging van 100 /uM C0CI2 of MnCl2 leidde 25 tot herstel van de activiteit (zie Fig. 5). Het meest effectieve metaalion bleek Co++ te zijn, maar bij concentraties boven 200 /uM werd Co++ inhibitoir. Anderzijds was de stimulering met MnCl2 maximaal bij concentraties boven 200 /uM en tot aan 750 /uM werd geen inhibitoire 30 werking op de enzym activiteit waargenomen. ZnCl2 of

CaCl2 gaven eveneens een stimulering van de enzym activiteit te zien, zij het in geringere mate. CUCI2 was niet in staat om de enzym activiteit te herstellen.

Alle metaalionen werden als chloridezouten toegevoegd £. -7 r Λ t A 7 V :· V t / i * -19- om invloed van de anionen te verhinderen. De resultaten tonen dat de dipeptidase activiteit afhankelijk is van tweewaardige metaalionen.

5 Effect van andere mogelijke inhibitors

Er werden verschillende sulfhydrylgroep en disulfidegroep reagentia getest voor inhibitie van de dipeptidase activiteit. De dipeptidase activiteit 10 werd sterk geremd door DTT of mercaptoethanol die disulfide bindingen in het enzym kunnen reduceren (zie Tabel E). Toevoeging van sulfhydrylgroep reagentia zoals naftylmaleïmide, joodazijnzuur en 5,5-dithio-bis(2-nitroben-zoêzuur) had geen inhibitoire werking op de dipeptidase 15 activiteit. Phenylarseenoxyde, een sulfhydryl reagens, had eveneens geen inhibitoire werking. Daarentegen vertoont p-chloromercuribenzoaat een inhibitie van de dipeptidase activiteit, waarschijnlijk vanwege een zeer aspecifieke inhibitie. Deze resultaten suggereren 20 dat de hydrolyse activiteit van het dipeptidase afhangt van de geoxydeerde/gereduceerde toestand van het enzym.

Dit werd bevestigd met experimenten waarin de dipeptidase activiteit werd verlaagd door toevoeging van DTT, waarna opnieuw geoxydeerd werd met ferricyanide (Tabel F).

25 Oxydatie van het dipeptidase had geen effect op de activiteit, maar reductie met DTT gaf een sterke inhibitie van de activiteit te zien en de activiteit kon daarna worden hersteld door ferricyanide. Beïnvloeding van de redox toestand van het enzym met geoxydeerd en gereduceerd 30 glutathion wees er ook op dat optimale leucyl-leucine hydrolyse plaatsvindt wanneer het dipeptidase in de geoxydeerde vorm verkeert.

•f 7 r· r : n .

* V.' ·. * η

S

-20-

Tabel A

Zuivering van een leu-leu dipeptidase van S. cremoris Wg2.

. totaal totale , , spec.

Zuiveringsstap V°. eiwit activiteit3 ,f?ngS activiteit 0PZU1- (ml) One,) (X10-5) (%) (xlO-5) Ver“g celvrij extract 1120 2508 15,37 100 0,006 1 I DEAE Sephacel 70 118,3 4,28 27,8 0,036 6 II DEAE Sephacel 33 59,4 3,56 23,1 0,059 10 buis-stroom 0,44* 3,30 21,5 7,60 1239 electroforese a de totale activiteit is uitgedrukt als nmol leucy1-leucine dat per minuut wordt gehydrolyseerd.

b de spec, activiteit is uitgedrukt als nmol leucyl-leucine dat per mg eiwit per minuut wordt gehydrolyseerd.

* de eiwitconcentratie werd geschat uit de aminozuursamenstelling van het enzym, het molgewicht en de hoeveelheid monster die in de aminozuuranalyse-inrichting was geïnjecteerd.

£.· / ' i t; ƒ :¾ .ƒ f -J .

-21- * *

Tabel B

Aminozuursamenstelling van een dipeptidase van S. cremoris Wg2.

. . , Aantal aminozuurresten

Aminozuur Percentage ___Λ___„,a per enzym molecuul0

Aspartaat 10.42 38

Threonine 3.84 15

Serine 5.16 24

Glutaminezuur 12.51 41

Proline 6.19 26

Glycine 13.84 90

Alanine 8.86 93

Cysteine 0.96 4

Valine 5.49 23 πττΙτια 3.14 10

Isoleucine 3.71 14

Leucine 9.86 37

Tyrosine 2.50 7

Phenyl alanine 2.55 7

Lysine 5.94 20

Histidine 2.27 7

Arginine 2.64 7

Tryptofaan N.D. N.D.

a het molgewicht van het enzym werd geschat op 49,000 N.D. = niet detecteerbaar e7fr;V7 -22-

Tabel C

Substraat specificiteit van een dipeptidase van £3. cremoris Wg2

Substraat Peptidase celvrij extract (2 mM) hydrolyse (%) hydrolyse <%) leu-leu 100 100 leu-met 440 240 leu-val 25 120 leu-gly 83 132 val-leu 33 140 phe-leu 170 178 ptro-leu 2 10

Ms-leu 0 10 J'-glu-leu 0 0 gly-leu 0 12 ala-ala 140 43 o(-glu-ala 0 28 leu-leu-leu 0 88 leu-gly-gly 0 38 ala-ala-ala 0 18 (ala)4 0 11 (ala)g 0 0 fii **·’' jfK vr·*· ·Τ. <*ι·; - ^ li ·/ / V .

t *r -23-

Tabel D

Hydrolyse van leucyl-p-nitroanilide en leucyl-leucine in verschillende stadia van de zuiveringsprocedure van een dipeptidase van S. cremoris Wg2.

Zuiveringsstap Leucyl-p-nitroanilide Leucyl-leucine hydrolyse hydrolyse celvrij extract ++ ++ tweede DEAE ++

Sephacel kolom preparatieve electroforese

Tabel E

Inhibitie van dipeptidase activiteit

Inhibitor (1 mM) Relatieve activiteit geen toevoeging 100 DTT 20

Mercaptoethanol 15

Phenylarseenoxyde 100

Joodazijnzuur 105

Naftylmaleimide 90 5,5-dithio-bis(-2-nitrobenzoëzuur) 100 p-chloromercuribenzoaat 20 £ »,· Λ f' /* *’k * % -24-

Tabel F

Dipeptidase activiteit onder geoxydeerde en gereduceerde omstandigheden . Leucyl-leucine Relatieve hoeveel-

Toevoegmg (mM) * heid gehydrolyseerd leucyl-leucine (%) geen 2.7 0 dipeptidase 1.2 100 dipeptidase + 1 mM Fe^CCN)^ 1.4 85 dipeptidase + 5 mM FegCOOe 1.2 100 dipeptidase + 2 mM EOT 2.7 0 dipeptidase + 2 mM DIT + 1 mM Feg(CN)g 2.2 35 dipeptidase + 2 mM DCT + 5 m FosCOOg 1.4 85 dipeptidase + 2 mM GSSG 1.1 105 dipeptidase + 2 mM GSH 1.8 60 * mM leucyl-leucine dat na de hydrolyse in het incubatie-mengsel achterbleef

r, “? λ a «» !" '•V

r: ; H : «Λ· s -•V- * £ V* *

Claims

1. Dipeptidase van melkzuurbacteriën in geïsoleerde vorm, gekenmerkt door een molgewicht van 49 kD +_ 5 kD; een isoelektrisch punt van 4,4 +_ 0,4? een substraat-bereik dat de dipeptiden leu-leu, leu-met, leu-val, 5 leu-gly, val-leu, phe-leu en ala-ala, maar niet de dipeptiden his-leu, γ-glu-leu, gly-leu, a-glu-ala en peptiden uit 3 of meer aminozuurresten omvat? en een hydrolyse activiteit met een temperatuuroptimum bij 50°C + 10°C, een pH optimum bij 8 + 1, en gevoeligheid 10 voor het metaalchelaten vormende EDTA en voor de reductie-middelen dithiotreitol en mercaptoethanol.

2. Dipeptidase volgens conclusie 1, afkomstig van melkzuur streptococcen.

3. Dipeptidase volgens conclusie 1, afkomstig 15 van Streptococcus cremoris.

4. Dipeptidase volgens conclusie 1, afkomstig van Streptococcus cremoris Wg2.

5. Werkwijze voor het isoleren van een dipeptidase volgens conclusie 1 uit melkzuurbacteriën, waarbij 20 een ruw celvrij extract van de melkzuurbacteriën aan ionenuitwisselaarkolomchromatografie wordt onderworpen, een of meerdere fracties met leucyl-leucine hydrolyse activiteit aan electroforese worden onderworpen en een of meer fracties met leucyl-leucine hydrolyse activi-25 teit worden gewonnen.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, waarbij als ionenuitwisselaarkolom een DEAE-Sephacel kolom wordt toegepast en fractionering wordt gerealiseerd door gradiënt-elutie.

7. Werkwijze volgens conclusies 5 of 6, waarbij een preparatieve polyacrylamide-gel electroforese wordt uitgevoerd in een kolom en het effluent van de kolom 6700707 -26- 's in fracties wordt opgevangen.

8. Gebruik van het dipeptidase volgens een van de conclusies 1-4 voor het bereiden van polyclonale of monoclonale antilichamen met affiniteit en/of specifi-5 citeit voor het dipeptidase.

9. Polyclonale en monoclonale antilichamen met affiniteit en/of specificiteit voor het dipeptidase volgens een van de conclusies 1 - 4.

9 * -25- CONCLÜSIES

10. Gebruik van polyclonale of monoclonale antilichamen 10 volgens conclusie 9 om het dipeptidase te detecteren in, dan wel te verwijderen of isoleren uit een mengsel dat het dipeptidase bevat.

11. Gebruik van het dipeptidase volgens een van de conclusies 1 - 4 bij de bereiding van levensmiddelen, 15 zoals kaas, opklopbare produkten en vleeswaren.

12. Levensmiddelen, zoals kaas, opklopbare produkten en vleeswaren, verkregen onder toepassing van het dipeptidase volgens een van de conclusies 1-4. β / vi 't'