NL8700581A - Antibioticum, preparaat dat dat bevat, werkwijze voor de bereiding daarvan, werkwijze voor het bestrijden van plagen en nieuwe streptomyces-mutant. - Google Patents

Description

* 7 - 1 -

Antibioticum, preparaat dat dat bevat, werkwijze voor de bereiding daarvan, werkwijze voor het bestrijden van plagen en nieuwe Streptomyces-mutant.

Deze uitvinding betreft een nieuw antibioticum en werkwijzen voor de bereiding daarvan. Meer in het bijzonder gaat het om een nieuw antibioticum dat verkregen kan worden door fermentatie van een soort Streptomyces.

5 Het Britse octrooischrift 2.166.436 en de Europese octrooipublikatie 170.006 beschrijven de bereiding van een groep stoffen die antibiotica van de S541-reeks genoemd zijn, welke geïsoleerd kunnen worden uit de fermentatie-produkten van Steptomyces-stammen. Nu werd nog een andere verbinding met 10 antibioticum-werking die geïsoleerd kan worden uit een kweek van microorganismen van het geslacht Streptomyces of door chemische modificatie van een antibioticum van de S541-reeks, zoals hierin beschreven.

Deze uitvinding betreft de verbinding volgens for-15 mule 1. Een bijzonder voordelig aspect van de verbinding vol gens de uitvinding is zijn vermogen tot kristalliseren en de uitvinding betreft ook de verbinding volgens formule 1 in zijn kristallijne vorm.

Het vermogen van de verbinding tot kristalliseren 20 kan benut worden bij de zuivering» en hiermee heeft men de ver binding volgens formule 1 in eên zuiverheid van meer dan 90 % kunnen verkrijgen, meer in het bijzonder van meer dan 95 %.

Gezien zijn vermogen tot vorming van kristallen van zeer hoge zuiverheid is de verbinding volgens formule 1 vooral 25 nuttig als tussenprodukt bij de bereiding van andere verbindin gen met antibioticum-werking.

De verbinding volgens formule 1 heeft zelf ook antibioticum-werking, te weten anthelmintische werking, bijvoorbeeld tegen nematoden en in het bijzonder tegen endo- en ecto-30 parasieten.

De antibioticum-werking van de verbinding volgens for- g 7 0 n ^ · ® ' V v w'j.i ' ΐ - 'i - 2 - mule 1 kan bijvoorbeeld in vitro aangetoond worden tegen vrij levende nematoden, bijv. Caenorhabditis elegans.

Ecto- en endoparasieten infecteren mensen en uiteenlopende dieren en komen vooral veel voor in huisdieren zoals 5 varkens, schapen, runderen, geiten en pluimvee (kippen en kal koenen), paarden, konijnen, jachtvogels, kooivogels en binnenhuisdieren zoals honden, katten, cavia’s en hamsters. Infectie van vee door parasieten, wat tot bloedarmoede, ondervoeding en gewichtsverlies leidt, is in de hele wereld een hoofdoorzaak 10 van economische verliezen.

Voorbeelden van geslachten van endoparasieten die mens en dier infecteren zijn Ancylostoma, Ascaridia, Ascaris, Aspicularis, Brugia, Bunostomum, Capillaria, Chabertia, Cooperia, Dictyocaulus, Dirofilaria, Dracunculus, Enterobius, Haemonchus, 15 Heterakis, Loa, Necator, Nematodirus, Nematospiroides (Heligo- moroides), Nippostrongylus, Oesophagostomum, Onchocerca, Ostertagia, Oxyuris, Parascaris, Strongylus, Strongyloides, Syphacia, Toxascaris, Toxocara, Trichonema, Trichostrongylus, Trichinella, Trichuris, Triodontophorus, Uncinaria en 20 Wuchereria.

Voorbeelden van ectoparasieten die mens en dier infecteren zijn geleedpotige ectoparasieten zoals bijtende insecten, blaasvliegen, vlooien, luizen, mijten, zuigende insecten, teken en andere tweevleugelige pesten.

25 Voorbeelden van geslachten van zulke ectoparasieten die mens en dier infecteren zijn Ambylomma, Boophilus,

Chorioptes, Culliphore, Demodex, Damalinia, Dermatobia, Gastrophilus» Haematobia, Haematopinus, Haemophysalis, Hyaloma, Hypoderma, Ixodes, Linognathus, Lucilia, Melophagus, Oestrus, 30 Otobius, Otodectes, Psorergates, Psoroptes, Rhipicephalus,

Sarcoptes, Stomoxys en Tabanus.

Verder is de verbinding volgens formule 1 ook nuttig voor het bestrijden van insecten-, spinten- en nematoden-plagen in land-, tuin- en bosbouw, in de volksgezondheid en 35 in opgeslagen produkten. Tot de gewassen die door plagen be laagd worden behoren granen (bijv. tarwe, gerst, mais en rijst), 870 0 58 1 * » - 3 - peulgewassen (bijv. soja), vruchtbomen (bijv. appels, druiven en citroenen) en wortelgewassen (bijv. suikerbieten en aardappelen). en deze kunnen met vrucht behandeld worden. Specifieke voorbeelden van zulke plagen zijn vruchtemijten en blad-5 luizen zoals Aphis fabae, Aulacorthum circumflexum, Myzus persicae, Nephotettix cincticeps, Nilparvata lugens, Panonychus ulmi, Phorodon humuli, Phyllocoptruta oleivora en Tetranychus ureticae en leden van het geslacht Trialeuroides, nematoden zoals leden van de geslachten Aphelencoides, Globodera, Hetero-10 dera, Meloidogyne en Panagrellus; Lepidoptera zoals

Heliothis, Plutella en Spodoptera, kalanders zoals Anthonomus grandis en Sitophilus granarius, meeltorretjes zoals Tribolium castaneum, vliegen zoals Musea domestica, brandmieren, bladboorders; Peren-psylla; Thrips tabaci; kakker-15 lakken zoals Blatella germanica en Periplaneta americana en muskieten zoals Aedes aegypti.

Deze uitvinding verschaft dus de verbinding volgens formule 1, zoals hierboven omschreven, welke als antibioticum gebruikt kan worden. In het bijzonder kan hij gebruikt worden 20 bij de behandeling van mensen en dieren met infecties door endo- of ectoparasieten en/of schimmels en in land-, tuinof bosbouw als pesticide voor het bestrijden van insecten-, mijten- en nematoden-plagen. Ook kan hij in het algemeen als pesticide gebruikt worden om in andere omstandigheden plagen 25 te bestrijden of onder bedwang te houden, bijv. in loodsen, gebouwen of andere publieken gelegenheden. In het algemeen kan de verbinding of op de gastheer (mens, dier of plant) of op de plaag zelf aangebracht worden, of op een woonplaats daarvan.

De verbinding volgens de uitvinding kan op elke ge-3Q schikte wijze voor toediening geformuleerd worden, voor toe passing in menselijke of veterinaire geneeskunde» en de uitvinding betreft dan ook tevens farmaceutische preparaten die de verbinding volgens de uitvinding bevatten in een vorm geschikt voor menselijke of veterinaire geneeskunde. Dergelijke 35 preparaten kunnen op gebruikelijke wijze aangeboden worden met behulp van ëën of meer geschikte dragers of hulpstoffen. De 870 0 58 1 i ï - 4 - preparaten volgens de uitvinding omvatten die voor parenteraal (waaronder in de uiers), oraal, rectaal of plaatselijk gebruik of als implantaten, in oog- of neusdruppels of in de urinewegen.

5 De verbinding volgens formule 1 kan voor toepassing in menselijke of veterinaire geneeskunde geformuleerd worden volgens de algemene methoden die in het Britse octrooischrift 2.166.436 beschreven zijn.

De totale dagelijkse dosering zal zowel in de veteri-10 naire als in de menselijke geneeskunde variëren tussen 1 en 2000 yug/kg lichaamsgewicht, bij voorkeur tussen 50 en 1000 yug/kg, en dat kan over meerdere doses verdeeld zijn, bijv. over 1 tot 4 maal per dag.

De verbinding volgens de uitvinding kan op iedere 15 geschikte wijze geformuleerd worden om in land- en tuinbouw gebruikt te kunnen worden, en de uitvinding betreft dan ook tevens zulke preparaten die de verbinding volgens de uitvinding bevatten in een vorm geschikt voor toepassing in land- en tuinbouw. Tot dergelijke formuleringen behoren concentraten, 20 stuifpoeders, oplosbare en bevochtigbare poeders, korrelpre- paraten, pellets, strooibare preparaten, emulsies (zowel verdunde als geconcentreerde), dompelvloeistoffen (voor wortels of voor zaden), zaadpellets, olie-concentraten en -oplossingen, injectie-oplossingen, sproeivloeistoffen en nevelpreparaten.

25 In het algemeen zullen dergelijke formuleringen de verbinding in combinatie met een geschikte drager of verdun-ningsmiddel bevatten. Zulke dragers en verdunningsmiddelen zijn in het Britse octrooischrift 2.166.436 beschreven.

In de formuleringen ligt de concentratie aan werk-30 zaam materiaal in het algemeen tussen 0,01 en 99 %, meer in het bijzonder tussen 0,01 en 40 gew.%.

Handelsprodukten worden veelal verstrekt als geconcentreerde preparaten die voor gebruik tot een geëigende concentratie verdund moeten worden, bijv. tot tussen 0,001 en 0,0001 gew.%. 35 De dosis waarin de verbinding toegediend wordt is van een aantal factoren afhankelijk, waaronder de soort plaag 67 0 0 58 1 --5- * * en de mate van Infectie. Maar in het algemeen zal een dosering tussen 10 g en 10 kg per hectare geschikt zijn, bij voorkeur tussen 10 g en 1 kg per hectare voor de bestrijding van mijten en insecten en tussen 50 g en 10 kg per hectare voor de be-5 strijding van nematoden.

Bij toepassing in diergeneeskunde of in land- en tuinbouw kan het wenselijk zijn de hele fermentatievloeistof als bron van de werkzame stof te gebruiken. Ook kan het geschikt zijn gedroogde fermentatievloeistof (met het mycelium) of uit 10 de vloeistof afgescheiden mycelium te gebruiken, dat dan ge pasteuriseerd of nog beter gedroogd is, bijv. voor sproeidrogen, vriesdrogen of opwalsen. Desgewenst kan vloeistof of mycelium tot preparaten geformuleerd worden die ook inerte dragers, hulpstoffen of verdunningsmiddelen bevatten, zoals hierboven 15 reeds beschreven.

Het antibioticum volgens de uitvinding kan in combinatie met andere werkzame bestanddelen toegediend of gebruikt worden.

In het bijzonder kan het antibioticum volgens de 20 uitvinding samen gebruikt worden met antibiotica van de S541- reeks of met andere antibiotica. Dit kan bijvoorbeeld gebeuren waar een complete fermentatie vloeistof gebruikt wordt zonder dat de verbinding volgens de uitvinding er uit afgescheiden is of waar men ruwe fermentatieprodukten op een wijze volgens de 25 .uitvinding laat reageren zonder dat ze vooraf afgescheiden warén; dit kan bijvoorbeeld de voorkeur verdienen bij gebruik van de verbinding In de landbouw, waar het belangrijk is de kostprijs laag te houden.

De verbinding volgens de uitvinding kan met de hier-30 na te beschrijven werkwijzen bereid worden.

Een ander aspect van deze uitvinding betreft dus een werkwijze voor de bereiding van de verbinding volgens formule 1, welke bestaat uit het kweken van een microorganisme van het geslacht Streptomyces dat de verbinding volgens formule 1 kan 35 produceren, en uit het desgewenst daaruit isoleren van die ver binding.

8700581 t 4' - 6 -

Microorganismen die de verbinding volgens de uitvinding kunnen produceren kunnen gemakkelijk geïdentificeerd worden met een proef op kleine schaal waarbij men een monster van de kweekvloeistof met hoog scheidende vloeistofchromatografie 5 analyseert.

In het algemeen zullen de volgens de uitvinding te gebruiken microorganismen stammen van het geslacht Streptomyces zijn die tot vorming van de verbinding volgens formule 1 in staat zijn, en dus bijvoorbeeld stammen van de soort Strepto-10 myces thermoarchaensis of van de soort Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus. Specifieke voorbeelden van geschikte stammen zijn NCIB 12015 van Streptomyces thermoarchaensis (op 10 september 1984 gedeponeerd) en stammen NCIB 12111, NCIB 12112, NCIB 12113 en NCIB 12114 van dezelfde 15 soort (alle op 26 juni 1985 gedeponeerd) en stam NRRL 15773 van Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus (gedeponeerd op 3 mei 1984), alsmede mutanten van al deze stammen.

Mutanten van de bovengenoemde stammen kunnen spontaan optreden of met uiteenlopende methoden gemaakt worden, 20 zoals beschreven in "Techniques for the Development of Micro organisms" van H.l. Adler in "Radiation and Radioisotopes for Industrial Microorganisms", Proceedings van het Symposium te Wenen, 1973, biz. 241 van de International Atomic Energy Authority. Tot die methoden behoren ioniserende straling, 25 behandeling met chemicaliën zoals N-methyl-N'-nitro-N-nitroso- guanidine (NTG), verhitten, genetische technieken zoals re-combinatie, transductie, transformatie, lysogenese en lyso-gene omzettingen, en selectieve technieken voor spontane mutanten.

30 Mutanten die bijzonder geschikt zijn bij de werkwijze volgens de uitvinding zijn die mutanten die geen noemenswaardige hoeveelheden van de 58-hydroxy- of 58-methoxy-antibioti-ca van de S541-reeks vormen, welke in het Britse octrooischrift 2.166.436 beschreven zijn. Mutanten met verminderd vermogen 35 tot vorming van antibiotica van de S541-reeks vormen nog een aspect van deze uitvinding.

8700581 - 7 -

Mutanten die tot produktie van de verbinding volgens formule 1 in staat zijn maar met een verminderd vermogen tot vorming van antibiotica van de S541-reeks welke in het Britse octrooischrift 2.166.436 beschreven zijn, kunnen gemakkelijk 5 met een proef op kleine schaal geïdentificeerd worden door een proefmonster van de kweekvloeistof van dat microorganisme met hoog scheidende vloeistofchromatografie te analyseren.

Nog een ander aspect van de uitvinding betreft genetisch materiaal en mutanten met verminderd vermogen tot vor-10 ming van antibiotica van de S541-reeks welke bijdragen aan de synthese van de verbinding volgens formule 1. Dergelijk materiaal kan verkregen worden met gebruikelijke genetische technieken, welke nu meteen beschreven worden.

Een bijzonder bevoorkeurde stam die tot produktie 15 van de verbinding volgens formule 1 in staat is maar met ver minderd vermogen tot vorming van antibiotica van de S541-reeks is Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12334 (op 15 september 1986 gedeponeerd bij de permanente stammenverzameling van de National Collection of Industrial and Marine Bacteria, 20 Torry Research Station, Aberdeen, Verenigd Koninkrijk, en mutanten daarvan. Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12334 en mutanten daarvan vormen nog een aspect van de uitvinding. Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12334 heeft in hoofdzaak dezelfde wezenlijke kenmerken als Streptomyces thermoarchaensis 25 NCIB 12015 die in het Britse octrooischrift 2.166.436 be schreven is. Maar NCIB 12334 kan van NCIB 12015 onderscheiden worden doordat het onder de in octrooischrift 2.166.436 beschreven omstandigheden geen of weinig antibiotica van de S541-reeks vormt. Mutanten van Streptomyces thermoarchaensis 30 NCIB 12334 kunnen spontaan optreden of met de zo juist beschre ven methoden gemaakt worden.

Nog een ander aspect van deze uitvinding betreft het genetische materiaal van Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12334 en mutanten daarvan dat meedoet aan de synthese van de ver-35 binding volgens formule 1. Dergelijk materiaal kan verkregen worden met de inmiddels bekende genetische technieken, waaronder £< 7 λ ,Λ 7? Λ <·ƒ

*3 / y u 3 0 I

- 8 - die beschreven door D. A. Hopwood in "Cloning genes for Antibiotic Biosynthesis in Streptomyces Spp.: Production of a hybrid antibiotic", biz. 409-413 in "Microbiology 1985", onder redactie van L. Lieve, American Society of Microbiology, 5 Washington D.C., 1985. Dergelijke technieken kunnen op eenzelf de wijze toegepast worden als die die eerder beschreven zijn voor het klonen van genen voor de antibioticum-vorming, waaronder de genen voor actinorhodine, (F. Malpartida en D.A.

Hopwood, Nature 309 (1984), 462-464), erythromycine (R. Stanzak 10 c.s., Biotechnology 4 (1986) 229-232) en een belangrijk enzym dat meedoet aan de penicilline- en cefalosporine-produktie in Acremonium chrysogenum (S.M. Sansom c.s., Nature 318 (1985), 191-194). Het aldus verkregen genetische materiaal van Streptomyces thermoarchaensis kan bijvoorbeeld gebruikt worden voor het 15 verbeteren van stammen, voor de vorming van biosynthetische en zymen voor toepassing in vitro, of voor het doen ontstaan van nieuwe antibiotica door dergelijk materiaal in te voeren in andere organismen dan Streptomyces thermoarchaensis.

De vorming van de verbinding volgens de uitvinding 20 door fermentatie van een geschikte Streptomyces-stam kan met gebruikelijke methoden gebeuren, d.i. door het kweken van de Streptomyces-stam in aanwezigheid van geschikte assimileerbare bronnen van koolstof en stikstof en van mineralen.

Assimileerbare bronnen van koolstof en stikstof en 25 van mineralen kunnen zowel enkelvoudig als samengesteld zijn.

Koolstof-bronnen zijn onder meer glucose, maltose, zetmeel, glycerol, melasse, dextrine, lactose, saccharose, fructose, carbonzuren, aminozuren, glyceriden, alkoholen, alkanen en plantaardige oliën. Koolstof-bronnen zullen in het algemeen 30 tussen 0,5 en 10 gew.% van het fermentatiemedium uitmaken.

Stikstof-bronnen zijn onder meer sojabonenmee1, maisweekwater, oplosbaar destillatie-residuën, gistextract, katoenzaadmeel, peptonen, vermalen aardnoten, moutextract, melasse, caseïne, aminozuur-mengsels, ammoniak (gas of oplos-35 sing), ammonium-zouten en nitraten. Ureum en andere amiden kun nen ook gebruikt worden. Stikstof-bronnen zullen in het alge- 8700581 * * - 9 - meen tussen 0,1 en 10 gew.% van het fermentatiemedium uitmaken.

Voedingsmineralen die aan het kweekmedium toegevoegd moeten worden omvatten in het algemeen zouten die natrium, kalium, ammonium, ijzer, magnesium, zink, nikkel, kobalt, 5 mangaan, vanadium, chroom, calcium, koper, molybdeen, boor, fosfaat, sulfaat, chloride en carbonaat verschaffen.

Een anti-schuimmiddel kan aanwezig zijn om overmatig schuimen tegen te gaan; dit moet men zo nu en dan toevoegen.

Het kweken van de Streptomyces-stam gebeurt in het 10 algemeen bij temperaturen tussen 20° en 50°C, bij voorkeur tus sen 25° en 40°C, vooral omstreeks 34°C, en het is wenselijk dat onder beluchten en roeren te doen plaatsvinden. Het medium kan aanvankelijk beënt worden met een kleine hoeveelheid suspensie van het gesporuleerde microorganisme, maar om een groeistil-15 stand te voorkomen kan een vegetatieve ent van het organisme aan gemaakt worden door een kleine hoeveelheid van het kweekmedium te beënten met de spore-vorm van het organisme en kan de vegetatieve ent aan het fermentatiemedium toegevoegd worden of, en dat is nog béter, aan één of meer kiemfasen waar verdere 20 groei plaats vindt voordat men dit in het hoofdfermentatie- medium overbrengt. De fermentatie gebeurt in het algemeen bij een pH tussen 5,5 en 8,5, bij voorkeur tussen 5,5 en 7,5. Het kan nodig zijn zuur aan het medium toe te voegen om de pH binnen het gewenste traject te houden. Geschikte zuren hiervoor zijn 25 waterige zuren zoals zwavelzuur en vetzuren, zoals valeriaan- zuur en isoboterzuur, of mengsels daarvan.

De fermentatie kan 2 tot 10 dagen duren, bijv. ongeveer 5 dagen.

Als het wenselijk is de verbinding volgens de uit-30 vinding van de fermentatie te scheiden kan dat met gebruike lijke technieken voor isoleren en afscheiden gebeuren. De verbinding volgens de uitvinding zit voornamelijk in het mycelium, maar kan ook in het kweekfiltraat gevonden worden en isolerings-technieken kunnen op de fermentatievloeistof toegepast worden, 35 zowel voor als na opklaren. Men zal inzien dat de keuze van isoleringstechnieken zeer ruim kan variëren.

$ 7 η λ π ^ i - 10 -

De verbinding volgens de uitvinding kan met een verscheidenheid van fractioneringstechnieken geïsoleerd en afgescheiden worden, bijv. door adsorptie en elutie, door neerslaan, gefractioneerde kristallisatie, extractie of met een vloeistof-5 vloeistof-verdeling, welke op diverse manieren met elkaar ge combineerd kunnen worden. Extractie en verdeling over twee oplosmiddelen die niet of slechts gedeeltelijk met elkaar mengbaar zijn en chromatografie zijn bijzonder geschikt gebleken voor het isoleren en afscheiden van de verbinding volgens de 10 uitvinding.

Na de fermentatie kan het mycelium geoogst worden (eventueel na behandeling met een uitvlokmiddel of een zuur totdat de pH van de kweekvloeistof beneden 6 is, of na verhitten of, en bij voorkeur, na verhitten en toevoegen van zuur), 15 met behulp van gebruikelijke technieken zoals filtreren en centrifugeren. Daarna kan de verbinding volgens de uitvinding bijvoorbeeld uit het mycelium geëxtraheerd worden met een geschikt oplosmiddel zoals een keton (bijvoorbeeld aceton, butanon of 4-methylpentanon-2), een koolwaterstof (bijv. hexaan), 20 een halogeenkoolwaterstof (bijv. chloroform, tetrachloorkool- stof of methyleenchloride), een alkohol (bijv. methanol of isopropanol), een diol (bijv. propaandiol-1,2 of butaandiol-1,3), een ester (bijv. methylacetaat of ethylacetaat) of een mengsel daarvan. Men zal inzien dat als het mycelium merkbare 25 hoeveelheden water bevat het de voorkeur verdient een met water mengbaar oplosmiddel zoals methanol of aceton te gebruiken.

In het algemeen is meer dan één extractie van het mycelium nodig om een optimale afscheiding te bereiken. De verbinding volgens de uitvinding kan uit de extracten als ruw preparaat 30 bereid worden door het oplosmiddel te verwijderen, bijv. door verdamping van of door neerslaan, bijvoorbeeld door het extract in water te gieten. Ook kan het aanvankelijke extract na vermindering van het volume (bijv. door verdampen) zelf met een tweede oplosmiddel uitgetrokken worden, dat met het eerste 35 niet of slechts gedeeltelijk mengbaar is. Als de eerste extrac tie van mycelium gebeurt met een met water mengbaar oplosmiddel 8 7 0 0 5 8 f • * -11-- zoals methanol of propaandiol-1,2 kan het tweede oplosmiddel geschikt een niet met water mengbare vloeistof zoals hexaan, chloroform, dichloormethaan, ethylacetaat of petroleumether zijn, of een mengsel daarvan, waarbij men genoeg water aan het 5 eerste extract toevoegt om onmengbaarheid met het tweede op losmiddel te verzekeren en om de verdeling van het antibioticum over de beide fasen in de hand te hebben. Door een geschikte keuze van met water niet en wel mengbare oplosmiddelen en door schuiven met het water-gehalte van het met water mengbare op-10 losmiddel is een aantal overgangen van het antibioticum uit met water mengbaar naar met water niet mengbaar oplosmiddel en omgekeerd mogelijk. Ook kan bet eerste extract over een bed ionenwisselaar zoals IRA 68 of een hars zonder functionele groepen zoals XAD-1180 (van Rohm & Haas) geleid worden om dat 15 extract verder te zuiveren.

Het antibioticum kan uit het uiteindelijke extract gewonnen worden door het oplosmiddel te verdampen, door neerslaan of door adsorptie aan een geschikte drager, afhankelijk van de aard van het uiteindelijke oplosmiddel. ’ 20 Zuivering en/of afscheiding van de verbinding vol gens de uitvinding kan verder met gebruikelijke technieken gebeuren, zoals bijvoorbeele chromatografie (waaronder ook de hoog scheidende vloeistofchromatografie) over een geschikte drager zoals silicagel, over een macroreticulair adsorptie-25 hars zonder functionele groepen zoals met divinylbenzeen verknoopt polystyreen (Amberlite XAD-2, XAD-4, XAD-16 of XAD-1180 van Rohm & Haas, of Kastell SI12 van Montedison), eventueel een met divinylbenzeen verknoopt polystyreen met functionele groepen (zoals Diaion SP207 van Mitsubishi); een 30 voor organische oplosmiddelen ongevoelig verknoopt dextran zoals Sephadex LH20 (van Pharmacia) of aan een "omgekeerde fase-drager" zoals een met koolwaterstoffen verknoopt silicagel, bijv. C^g-verknoopt silicagel. De drager kan de vorm van een bed hebben of (en bij voorkeur) van een gepakte kolom.

35 Een oplossing van de verbinding volgens formule 1 in een geschikte vloeistof, bijv. dichloormethaan, tetrahydro- 8700581 - 12 - furan, petroleumether, acetonitril, chloroform, ethylacetaat of een mengsel daarvan, wordt in het algemeen op de kolom gebracht, bijv. een kolom silicagel of Sephadex, desgewenst nadat eerst het volume van de oplossing verkleind is. De kolom kan even-5 tueel eerst gewassen en dan met een oplosmiddel van geschikte polariteit geëlueerd worden, bijv. met een alkohol met methanol, koolwaterstoffe, zoals hexaan of petroleumether, een ester zoals ethylacetaat, een keton, zoals aceton, een ether zoals di-ethylether, acetonitril of met een halogeenwaterstof zoals 10 dichloormethaan of chloroform. Combinaties van zulke oplos middelen of met een polair oplosmiddel zoals water kunnen ook gebruikt worden.

De aanwezigheid van de verbinding volgens de uitvinding kan tijdens het extraheren en isoleren met gebruikelijke 15 technieken gevolgd worden, zoals hoog scheidende vloeistof- chromatografie en UV-spectroscopie, of door de eigenschappen van de hierna te beschrijven verbindingen te benutten.

Als de verbinding volgens de uitvinding in de vorm van een oplossing verkregen wordt, bijvöorbeeld na zuivering 20 door chromatografie, kan het oplosmiddel met gebruikelijke technieken zoals verdamping verwijderd worden, wat de verbinding in vaste of kristallijne vorm oplevert.

Door een geschikte combinatie van de bovengenoemde methodieken kan de verbinding volgens de uitvinding als vaste 25 stof afgescheiden worden. Men zal inzien dat de volgorde waar in de bovengenoemde zuiveringen toegepast worden en welke men kiest op ruime schaal gevarieerd kan worden.

Volgens nog een ander aspect van de uitvinding kan de verbinding volgens formule 1 bereid worden door oxydatie van 30 de verbinding volgens formule 2. De reactie kan gebeuren met een oxydatiemiddel dat gewoonlijk dient voor het omzetten van een secundaire allylalkohol in een enon, waardoor de verbinding volgens formule 1 ontstaat.

Geschikte oxydatiemiddelen zijn bijvoorbeeld oxy-35 den van overgangsmetalen zoals mangaandioxyde, en zuurstof uit de lucht in aanwezigheid van een geschikte katalysator zoals 8700581 - 13 - een fijnverdeeld metaal, bijv. platina. Van het oxydatiemiddel gebruikt men in het algemeen meer dan de stoechiometrische hoeveelheid.

De reactie kan geschikt gebeuren in een geschikt 5 oplosmiddel, bijv. een keton zoals aceton, een ether zoals di-

ethylether, dioxaan of tetrahydrofuran, een koolwaterstof zoals hexaan, een halogeenkoolwaterstaf zoals chloroform of methy-leenchloride of een ester zoals ethylacetaat. Combinaties van zulke oplosmiddelen met elkaar of met water kan men ook gebrui-10 ken. De reactie kan bij een temperatuur tussen -50°C en +50°C

gebeuren, bij voorkeur tussen 0° en 30°C.

Het tussenprodukt volgens formule 2 kan bereid worden zoals in het Britse octrooischrift 2.166.436 beschreven is.

Dé verbinding volgens formule 1, of die nu door 15 fermentatie dan wel door oxydatie van de verbinding volgens formule 2 bereid werd, kan met gebruikelijke methoden in kris-tallijne vorm verkregen worden. Bijvoorbeeld kan kristallisatie gerealiseerd worden uit een oplossing van de verbinding in een alkohol zoals methanol of isopropanol, uit acetonitril, uit een 20 koolwaterstof zoals hexaan, uit een ether zoals diëthylether, isopropylether of petroleumether» of uit een combinatie daar-van met water.

De volgende voorbeelden dienen alleen ter toelichting. Factor A is de verbinding volgens formule 2 en kan be-25 reid worden zoals in het Britse octrooischrift 2.166.436 be schreven is.

Voorbeeld I

Een oplossing van 250 mg factor A in 30 ml ether werd 2,75 uur met 1,0 g actief mangaandioxyde geroerd. Het 30 mengsel werd door een laagje kiezelgoer gefiltreerd en het filtraat werd drooggedampt, wat 240 mg verbinding volgens de uitvinding als schuim gaf. Een deel werd uit petroleumether gekristalliseerd, wat microkristallen gaf met λ dn EtOH) 1 max bij 240,5 nm (E^ » 495; δ (in CDCl^) bij 6,58 (s, 1Ή), 2,60 35 (m, 1H), 1,89 (s, 3H), 1,62 (s, 3H), 1,53 (s, 3H), 1,05 (d 6, 3H) , 1,00 (d 6, 3H), 0,96 (d 6, 3H) en 0,80 (d 6, 3H); m/z van 870 0-’0 1 - 14 - o.m. 610, 592, 574, 441, 265, 247, 237, 219 en 151.

Voorbeeld II

Steekcultures van de volgende samenstelling Gist-extract (Oxoid L21) 0,5 g/1 5 Mout-extract (Oxoid L39) 30,0

Mycologisch pepton (Oxoid L40) 5,0

Agar No. 3 (Oxoid L13) 15,0

Gedestilleerd water tot 1 liter pH ~ 5,4 10 werden beent met sporen van Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 en 10 dagen bij 28°C geïncubeerd.

De "rijpe" steekculture werd toen met 6 ml 10 % glycerol-oplossing bedekt en met een steriele staaf geschrapt 15 om de sporen en het mycelium los te maken. Van deze sporen suspensie werden porties van 0,4 ml overgebracht in steriele "strootjes" van polypropeen, die toen dichtgesmolten en boven vloeibare stikstof bewaard werden totdat men ze nodig had.

TWee Erlenmeyers van 250 ml kregen elk 50 ml kiem-20 medium met de volgende samenstelling: D-glucose 15,0 g/1

Glycerol 15,0

Soja-pepton 15,0

NaCl 3,0 25 CaC03 1,0

Gedestilleerd water tot 1 liter (Zonder bijstellen was de pH van het medium 6,7; deze werd met NaOH op 7,0 gebracht. Na autoclaveren was de pH van het medium 7,3).

30 Ze werden beide beënt met 0,2 ml sporensuspensie uit één strootje.

Daarna werden de kolven 2 dagen bij 28°C geïncubeerd in een schudkast die 250 rpm maakte met een planeet-beweging van 50 mm uitslag.

De inhoud van beide kolven werd gebruikt om een fermentatie-35 vat van 70 liter te beënten, waarin 40 liter van hetzelfde kiemmedium zat, waaraan nu 0,06 % polypropyleenglycol 2000 toe- 8700501 ^ * - 15 - gevoegd was. Polypropyleenglycol 2000 werd naar behoefte tijdens de gehele fermentatie toegevoegd om schuimen onder de duim te houden. Het kweken gebeurde bij 28°C onder genoeg roeren en beluchten om de opgeloste zuurstof boven 30 % van de 5 verzadigingswaarde te houden. Na 24 uur fermentatie werd een portie van 9 liter overgebracht aan een fermëntatievat van 700 liter dat 450 liter médium van de volgende samenstelling bevatte: D-glucose 2,8 g/1 10 Mout-dextrine (MD30E) 27,8

Arkasoy 50 13,9

Melasse 1,7 K2HP04 0,14

CaC03 1,39 15 Silicon 525 (Dow Corning) 0,06 % (v/v) pH voor steriliseren op 6,5 gesteld.

De fermentatie gebeurde bij 28° onder roeren en beluchten. Naar behoefte werd polypropyleenglycol 2000 als anti-schuimmiddel toegevoegd en de pH werd met beneden 7,2 20 gehouden tot aan het oogsten toe. Dit oogsten gebeurde na 5 dagen.

De 450 liter vloeistof werd geklaard met een Westfalia KA 25 centrifuge en de bovenstaande vloeistof werd vervangen door 20 liter water. Aan de 25,5 kg verkregen cel-25 len werd genoeg methanol toegevoegd om een eindvolume van 75 liter te verkrijgen. Dit werd in een Silverson-menger Model BX 1 uur geroerd en toen afgefiltreerd. Het vaste residu werd nog eens met 35 liter methanol uitgetrokken en weer gefiltreerd. Het gecombineerde filtraat (87 liter) werd met 40 liter 30 water verdund en met 30 liter petroleumether van 60-80° uitge- trokken. Na 30 minuten werden de fasen in een Westfalia MEM 1256 centrifuge gescheiden en de methanol-fase (de onderste) werd na toevoegen van 40 liter water nog eens met 30 liter petroleumether 60-80° uitgetrokken. Na afscheiden werd de onder-35 fase nog eens met 30 liter petroleumether van 60-80° geëxtra heerd. De gecombineerde petroleumether-extracten (bij elkaar 8700531 - 16 - 85 liter) werden in drie stappen in een Pfaudler-filmverdamper 8,8-12v-27 geconcentreerd (dampdruk 0,1 bar, damptemperatuur 20°, stoomtemperatuur 127°). De 9 liter concentraat werden met 2 kg natriumsulfaat gedroogd en in een draaiverdamper bij 40° 5 onder verlaagde druk verder geconcentreerd.

De 130 g olieresidu werd in chloroform opgelost, eindvolume 190 ml. Dit werd boven op een in chloroform gepakte kolom silicagel 60 (Merck 7734) van 200 x 4 cm gebracht. De kolom werd met 500 ml chloroform gewassen en geëlueerd met chloroform/ 10 ethylacetaat 3:1, en na een voorloop van 1400 ml werden frac ties van ongeveer 40 ml opgevangen.

Fracties 32-46 werden gecombineerd en drooggedampt wat 21,2 g olie gaf. Fracties 47-93 werden samen drooggedampt wat 20,1 g olie gaf, die in chloroform/ethylacetaat 3:1 opge-15 lost werd, na aanvullen tot 50 ml werd dit bovenop een in chloroform/ethylacetaat 3:1 gepakte kolom silicagel 60 (Merck 7734) van 200 x 4 cm gebracht en na een voorloop van 1400 ml werden fracties van ongeveer 40 ml opgevangen. Fracties 22-36 werden gecombineerd en drooggedampt, wat 3,1 g olie gaf, welke 20 toegevoegd werd aan de olie die uit fracties 32-46 van de eer ste kolom verkregen was. Deze gecombineerde olie werd in 4 ml kokende methanol opgelost en dat werd aan 20 ml heet isopropanol toegevoegd, waarna men liet kristalliseren.

De na kristallisatie overgehouden moederloog werd 25 verdampt wat een olie gaf die in een zelfde volume dichloor- methaan opgelost en op een in dichloormethaan gepakte kolom kiezelgel 60 (van Merck) van 30 x 2,2 cm gebracht werd. De kolom werd met 2 bedvolumina dichloormethaan uitgewassen en daarna met 2 volumina chloroform/ethylacetaat 3:1 geëlueerd. Droog-30 dampen van het eluaat gaf een olie die in methanol opgelost en aan preparatieve HPLC over Spherisorb S5 ODS-2 (Phase Sep. Ltd.) onderworpen werd; daartoe werden 5 ml-porties over telkens 1 minuut op de kolom gepompt en werd de kolom onder de volgende omstandigheden met acetonitril/water 7:3 geëlueerd: 35 8700531 - 17 -

Tijd (min.) Doorloop (ml/min.) 0,00 0,00 ) Injectietijd 1,00 0,00 ) 1,10 30,00 5 39,90 30,00 40.00 35,00 75.00 35,00

Het uit de HPLC-kolom komende materiaal werd met spectroscopie bij 238 nm gevolgd. Droogdampen van de omstreeks 33,4 10 minuut vrijkomende fracties met pieken gaf 34 mg verbinding volgens de uitvinding.

Massaspectroscopie liet een molecuulion met m/e van 610 zien, en met karakteristieke fragmenten bij m/e van 592, 574, 556, 422, 259, en 241.

15 Voorbeeld III

Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12334 werd bij -70°C als sporensuspensies in 20 % glycerol bewaard, op een zelfde wijze als in voorbeeld II beschreven voor Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015. Porties van 1 ml sporen werden 20 ontdooid en gebruikt voor het beënten van 250 ml Erlenmeyers die elk 50 ml medium A bevatten:

Medium A

D-glucose . 2,5 g/1

Mout-dextrine MD30E 25,0 25 Arkasoy 50 12,5

Bietsuikermelasse 1,5 K2HP04 0,125

CaC03 1,25 MOPS C3-(N-morfolino)propaansulfonzuur] 21,0 30 Gedestilleerd water tot 1 liter

De pH was voor het autoclaveren (15 minuten op 1219C) 6,5.

Deze voorkweek werd 2 dagen bij 28°C geïncubeerd, waarna 1 ml aseptisch overgebracht werd in vier van net zulke kolven met elk 50 ml medium A. Elke kolf werd twee dagen bij 35 28°C in een schudkast (250 rpm, 50 mm uitslag) geïncubeerd.

Toen werden twee fermentatievaten van 7 liter elk beent met on- *7 Λ Λ "· --. ’ ; i r 1 I < , ^ ' V. V -J \j 1-

m V

- 18 - geveer 80 ml (d.i. 2 %) van de bij elkaar gevoegde voorkweken. Elk fermentatievat van 7 liter bevatte 4 liter medium B met de volgende samenstelling:

Medium B

5 Meritose 45,0 g/1

Arkasoy 50 18,0

Bietsuikermelasse 2,2 K2HP04 0,18

CaCOg (Analar) 1,8 10 Silion 1520 (Dow Corning) 2,5 ml in 4 liter

Gedestilleerd water tot 4 liter, pHvoor autocLaveren (45 min. op 124°) op 6,5 gesteld. De fermentatie gebeurde onder roeren en beluchten bij 28°.

Een fermentatievat van 700 liter werd beent met 5,4 liter 15 aseptisch overgebrachte porties uit 24 uur oude voorkweken.

Deze fermentatieketel bevatte 450 liter medium B waarin het CaCOg door Sturcal-kalk vervangen was en waaraan ook 250 ml Silicon 1520 toegevoegd werd. De pH werd voor het steriliseren (30 minuten op 121°) met E^SO^ op 6,5 gebracht. Bovendien wer-20 den drie fermentatievaten van 70 liter beënt met 800 ml (d.i.

2 7a) aseptisch overgebrachte porties voorkweek van 24 uur oud. Elk bevatte 35 liter medium B (zoals hierboven aangegeven) met daaraan voor het steriliseren nog 25 ml silicon 1520 toegevoegd.

25 De hierop volgende fermentaties gebeurden bij 34° onder roeren en beluchten. Als anti-schuimmiddel werd tijdens de gehele fermentatie propyleenglycol 2000 toegevoegd en de pH werd tot aan het oogsten toe met valeriaanzuur/isoboterzuur 75:25 beneden 7,4 gehouden.

30 Na 120 uur werden de inhouden van de fermentatieketels bij elkaar gedaan (600 liter), met 3 kg Dicalite gemengd en op een draaiend vacuumfilter door 24 kg cellulose (Rettenmaier ΒΕ00) gefiltreerd. De 45 kg verkregen natte cellen werden bij -20°C bewaard.

35 De bevroren cellen werden in 45 liter methanol gesuspen deerd en men liet ze ontdooien. Na 30 minuten op 50° werd de 87005gt - 19 - suspensie door een laag cellulose gefiltreerd. Het residu werd weer in 50 liter methanol gesuspendeerd, door de laag cellulose gefiltreerd en dat werd met 10 liter methanol gewassen.

De filtraten en wasvloeistoffen (samen 116 liter) 5 werden met 22 liter water verdund en met 100 liter petroleum-ether 60-80° uitgetrokken. Dat extract werd in een filmverdam-per hij lage druk (ongeveer 0,15 bar) tot 8,4 liter geconcentreerd. Dit concentraat werd met 3 x 4,2 liter propaandiol-1,2 uitgetrokken. De gecombineerde extracten (13,5 liter) werden 10 met 12 liter water en 22 liter ethylacetaat geroerd, en na be zinken werden de fasen gescheiden. De bovenfase van 17,5 liter werd met 12 liter en 10 liter water gewassen en het gewassen organische extract werd tot 112 g olie drooggedampt.

Deze olie werd in 500 ml dichloormethaan opgelost 15 en gebracht op een kolom kiezelzuurgel 60 (type 7734) van 425 x 45 mm, die in dezelfde vloeistof gepakt was. De kolom werd toen met 500 ml dichloormethaan gewassen en daarna geëlueerd met 400 ml dichloormethaan/diëthylether 9:1. Het eluaat werd drooggedampt tot 54 g bleekgele teer.

20 (a) Van deze teer werd 1,2 g in 5 ml acetonitril opgelost en dat werd gebracht op een kolom Sephadex LH20 van 340 mm x 25 mm die in acetonitril gepakt was en daarmee ook geëlueerd werd. De tussen 110 ml en 130 ml eluaat doorkomende fractie werd drooggedampt en weer in 2,5 ml acetonitril opge-25 nomen. Van deze oplossing werd 2 ml met acetonitril/water 7:3 verdund. Van die oplossing werden twee gelijke delen op een kolom Spherisorb S5 0DS2 van 250 x 25 mm gebracht en dat werd met acetonitril/water 7:3 geëlueerd. De tussen 800 ml en 950 ml doorkomende fractie werd opgevangen en met water ver-30 dund (tot ongeveer 0,9 liter). Deze oplossing werd weer terug gebracht op dezelfde kolom S5 0DS2 en die werd weer met acetonitril geëlueerd. Het acetonitril werd verdampt en het monster werd azeotroop met een mengsel van aceton en cyclohexaan gedroogd, wat 33 mg verbinding volgens de uitvinding gaf, een 35 vaste stof. NMR-, DV- en massaspectra van deze stof waren vergelijkbaar met die van het produkt van voorbeeld I.

8700331 r v - 20 - (b) Een 4,32 g portie van de teer, opgelost in diethylether, werd tot een vaste stof gedroogd en weer in acetonitril opgelost tot een concentratie van 300 mg/ml.

Deze 8,5 ml oplossing werd met evenveel acetonitril/water 5 75:25 gemengd en in negen porties gechromatografeerd over een kolom Spherisorb ODS-2 van 250 mm x 20 mm. Met 75 % acetonitril werden verschillende componenten geëlueerd. Bij elke kolom werd het tussen 510 ml en 610 ml doorkomende deel opgevangen, en die porties werden samen geconcentreerd. Het concentraat 10 werd met een zelfde volume water gemengd en toen op dezelfde kolom Spherisorb gebracht. Die kolom werd acetonitril ge-elueerd. Het eluaat werd tot 45°C opgewarmd en water werd toegevoegd totdat het eluaat net troebel werd. Dit werd toen tot 4°C afgekoeld en dat liet men kristalliseren. De kristallen 15 werden afgefiltreerd en gedroogd, wat 260 mg verbinding vol gens de uitvinding gaf. Analyse van deze stof door hoog scheidende vloeistofchromatografie met omgekeerde fase toonde, op basis van de absorptie bij 238 nm, de aanwezigheid van 4 % verontreinigingen aan.

20 ^H-NMR-Spectrum

Een bij 200 MHz opgenomen ^H-NMR-spectrum van een oplossing in deuterochloroform vertoonde signalen bij de volgende plaatsen: δ 6,55 (verbrede s, 1H) 1,88 (verbrede s, 3H) 25 5,86 (d 15, 1H) 1,60 (s, 3H) 5,72 (dd, 15, 11, 1H) 1,52 (s, 3H) 1,03 (d 7, 3H) 1,00 (d 7, 3H) 0,95 (d 7, 3H> 30 0,79 (d 6, 3H) 13 C-NMR-Spectrum 13

Een bij 25,05 MHz opgenomen C-NMR-spectrum van een oplossing in deuterochloroform vertoonde signalen op de volgende plaatsen: 35 δ 192,2 (s) 130,7 (s) 171,9 (s) 123,4 (d) 8700581 - 21 - 143,9 (d) 121 »9 (d) 138.4 (d) 120,4 (d) 137.7 (s) 99,8 (s) 137.4 (s) 82,0 (s) 5 137,3 (d) 81,0 (d) 136.7 (s) 76,8 (d) 69,9 (t) 34,8 (t) 69,3 (d) 26,9 (d) 68.6 (d) 22,9 (q) 10 48,4 (C) 22,2 (q) 46.6 (d) 15,6 (q) 41.1 (t) 14,0 (q) 40,8 (t) 11,0 (q) 36.1 (?) 15 De piek bij 36,1 bestond uit meerdere, elkaar overlappende signalen en zijn structuur is daardoor onduidelijk.

U.V.-spectrum

Een II.V.-spectrum in methanol (c * 0,001 %) had 11 20 een λ van 240,4 nm; E. 509. max ’ Icm I.R.-spectrum

Een IR-spectrum van een oplossing in bromoform . (c * 1 Z) liet banden bij 3500 (OH), 1710 (ester), 1678 (geconjugeerd keton) en 996 cm * (C-0) zien.

25 Massaspectrum

Een massaspectrum met lage oplossing liet een molecuulion bij m/z = 610 zien, en fragmenten bij m/z = 592, 574, 480, 441, 440, 423, 422, 265, 259, 247, 241, 237, 219 en 151.

30 Element-analyse

Gevonden werd C = 70,95 % en H = 8,33 Z

(verwacht C * 70,82 Z en H * 8,20 Z).

Voorbeeld IV

Van een sporensuspensie van Streptomyces thermo-35 archaensis NGIB 12334 (overeenkomstig voorbeeld III aange maakt) werd 1 ml gebruikt om een 250 ml schudkolf met 50 ml 870 0 30 1

V· V

- 22 - medium Α te beënten (pH voor het autoclaveren op 6,5 gesteld). De kolf werd 2 dagen onder schudden (250 rpm met een uitslag van 50 mm) bij 28° gexncubeerd. Na 2 dagen werden porties van 1 ml overgebracht in 6 net zulke kolven met elk 50 ml medium 5 A, die op een zelfde wijze twee dagen gekweekt werden. Een fer- mentatievat van 20 liter met 12 liter medium B (pH voor het steriliseren van 30 minuten op 121°C op 6,5 gesteld) werd met ongeveer 300 ml van de samengevoegde voorkweken beent. De fermentatie gebeurde 24 uur onder schudden en beluchten bij 28°.

10 Een fermentatieketel van 700 liter die 450 liter medium B bevatte (pH voor het steriliseren op 6,5 gesteld) werd beent met 12 liter van het 24 uur oude tweede voormedium. De fermentatie gebeurde onder roeren en beluchting bij 34°, en de pH werd met 10 % ^SO^ beneden 7,4 gehouden.

15 Na 90 uur werd de 400 liter kweekvloeistof met 2 kg Dicalite en 2 kg cellulose als filtreerhulpstof gemengd en dat werd door cellulose (Rettenmaier BEOO) gefiltreerd. De verkregen celmassa werd in ongeveer 100 liter methanol gesuspendeerd en na ongeveer 45 minuten gefiltreerd. De cellen wer- 15 den nogeens met ongeveer 50 liter methanol uitgetrokken. De ge combineerde extracten (145 liter) werden met 35 liter water verdund en in een Robatel LX204 met hexaan uitgetrokken, waarbij in de derde fase van de extractie water toegevoegd werd.

De 145 liter hexaan-extract werden tot 2 liter geconcentreerd. 20 Dit concentraat werd met 3x1 liter propaandiol- 1,2 uitgetrokken. Deze extracten werden bij elkaar gedaan en die 3,16 liter werd met 3,34 liter ethylacetaat en 3,0 liter water gemengd. De bovenlaag van ethylacetaat werd gewonnen en met water uitgewassen. He ethylacetaat werd verwijderd en de 25 overgehouden olie azeotroop met aceton gedroogd, wat 71 g droog schuim gaf.

Dit schuim werd in 300 ml methanol en 32 ml water opgelost en op een kolom van omgekeerde fase-silicagel (Whatman 0DS3 Prep 40) van 12,8 x 36 cm (4,6 liter) gebracht. Deze 30 kolom werd met methanol/water 9:1 geëlueerd en de tussen 8,6 liter en 10,2 liter doorkomende fracties werden samen gecon- 8700581 'f -¾ - 23 - • centreerd totdat een neerslag begon te ontstaan. Na een nacht staan op 4eC werd de vaste stof afgefiltreerd en onder vacuum gedroogd.

Hiervan werd 8,5 g opgelost in een mengsel van 5 140 ml acetonitril, 17 ml tetrahydrofuran en 13 ml water. Van deze oplossing werden porties van 5,0 ml met acetonitril/water 4:1 over een kolom Spherisorb 0DS2 (5 ji) van 25 x 2,1 cm ge-chromatografeerd; debiet 25 ml/min. De tussen 9,8 min. en 13,6 min. doorkomende fracties werden bij elkaar gedaan en die 10 2,75 liter werd met 1,5 liter water verdund en in drie porties verdeeld. Elke portie werd terug op de kolom gebracht en met acetonitril geëlueerd. De drie monsters die men toen kreeg werden bij elkaar gedaan en drooggedampt, en de vaste stof werd uit acetonitril herkristalliseerd, wat 4,8 g verbinding vol-15 gens de uitvinding gaf. Analyse van deze stof met gewone en omgekeerde fase-chromatografie liet de aanwezigheid van <2% verontreinigingen zien.

Voorbeeld V

25 liter overeenkomstig voorbeeld III verkregen 20 kweekvloeistof werd met 15 % zwavelzuur tot pH = 3 aangezuurd en toen 15 minuten op 90 °C verwarmd voordat men het door een bed Hyflo filtreerde. De 1556 g celpasta werd 30 minuten met 3,9 liter methanol geroerd en toen afgefiltreerd, en het vaste residu werd opnieuw in 3,9 liter methanol gesuspendeerd en 25 daarna weer gefiltreerd. In de gecombineerde filtraten werd de pH met 15 % zwavelzuur op 4 ingesteld en toen ging de vloeistof met een debiet van 3750 ml/uur over een bed van 750 ml IRA 68 (een hars in de acetaat-vorm). De kolom werd met methanol uitgewassen en de methanol-percolaten werden samen tot 30 3,5 liter geconcentreerd en samen met 50 ml 0,1 % zwavelzuur in 10,5 liter tot 5° afgekoeld 0,1 % zwavelzuur geschonken. De suspensie werd 10 minuten geroerd en toen gefiltreerd en het residu werd met koud water gewassen en gedroogd. Aldus verkreeg men 12,9 g verbinding volgens de uitvinding die zich door 35 hoog scheidende vloeistofchromatografie goed met een authentiek monster liet vergelijken.

870 0 58 1

i- V

- 24 -

J Voorbeeld VI

25 liter overeenkomstig voorbeeld III verkregen kweekvloeistof werd met 15 % zwavelzuur tot pH =3 aangezuurd en toen 15 minuten op 90°C verwarmd waarna men het door een 5 bed hyflo filtreerde. Van de celpasta werd 500 g 30 minuten met 750 ml methanol geroerd en na filtreren werd de vaste stof nog eens in 750 ml methanol gesuspendeerd en weer gefiltreerd. De 1,5 liter gecombineerd filtraat werd met 617 ml water verdund en met 3 x 706 ml hexaan uitgetrokken. De hexaan-extrac-10 ten werden bij elkaar gedaan en de helft daarvan (1390 ml) werd tot 250 ml geconcentreerd en toen met een debiet van 50 ml/uur over een bed van 10 ml XAD 1180 geleid. Elk hars werd met 10 ml hexaan gewassen en van de 20 ml hexaan werd 10,2 ml op een in hexaan aangemaakte kolom van 100 ml silicagel Crossfield SD 15 210 gebracht. Het bed werd met 700 ml 5 % aceton in hexaan gewassen en met 10 % aceton in hexaan geëlueerd, beide in een debiet van 100 ml/uur. Het eluaat werd met hoog scheidende vloeistofchromatografie gevolgd en de fracties met de verbinding volgens de uitvinding werden bij elkaar gedaan en samen 20 tot een olie. drooggedampt.

De olie werd in een mengsel van 150 ml methanol en 70 ml water opgelost, waarna men het methanol onder vacuum droogdampte, wat een vaste stof gaf die afgefiltreerd en gedroogd werd. Aldus verkreeg men 0,21 g verbinding volgens de 25 uitvinding, die zich door hoog scheidende vloeistofchromatografie met een authentiek monster liet vergelijken.

Hierna komen enige voorbeelden van formuleringen volgens de uitvinding. Met "werkzame stof" wordt de verbinding volgens de uitvinding bedoeld.

30 Voorbeeld VII

Inj ectiepreparaat

Traj eet

Werkzame stof 4,0 % 0,1-7,5 %

Benzylalkohol 2,0 35 Glyceryl-triacetaat 30,0

Propyleenglycol tot 100 % $700581 „» Λ - 25 -

Los de werkzame stof in benzylalkohol en glyceryl-tristearaat op. Vul met propaandiol aan. Steriliseer op gebruikelijke wijze, bijvoorbeeld door steriliseren of door verhitten in een autoclaaf, en vul aseptisch af.

5 Voorbeeld VIII Aerosol

Traj eet

Werkzame stof 0,1 % 0,01-2,0 %

Trichloorethaan 29,9 10 Trichloorfluormethaan 35,0

Dichloordifluormethaan35,0

Meng de werkzame stof met trichloorethaan en doe dat in de spuitbus. Spoel de kopruimte met drijfgas uit en klink het ventiel op zijn plaats. Breng via het ventiel onder 15 druk de benodigde hoeveelheid drijfgas in. Zet er de drukknop en de stofkap op.

Voorbeeld IX

Tabletten (Nat granulaat)

Werkzame stof 250,0 mg 20 Magnesiumstearaat 4,5

Maïszetmeel 22,5

Natriumzetmeelglycolaat 9,0

Natriumlaurylsulfaat 4,5

Microkristallijn cellulose tot een kerngewicht van 450mg 25 Voeg genoeg 10 % stijfsel aan de werkzame stof toe om een voor granulering geschikte natte massa te krijgen.

Maak het granulaat en droog het op een schaal of in een wervel-beddroger. Zeef, voeg de overige bestanddelen toe en sla er tabletten uit.

30 Bekleedt desgewenst de tabletkernen met hydroxy- propylmethylcellulose of met een ander dergelijk filmvormend materiaal, hetzij uit een waterig hetzij uit een niet-waterig oplosmiddelsysteem. Een weekmaker en een geschikte kleur kunnen in deze drageeroplossing opgenomen worden.

35 Voorbeeld X

Veterinaire tablet voor kleine huisdieren (proog granulaat) 8700581 * - 26 - • Werkzame stof 50 mg

Magnesiumstearaat 7,5 mg

Microkristallijne cellulose tot tabletgewicht van 75,0 mg 5 Mengde werkzame stof met het magnesiumstearaat en het microkristallijne cellulose. Pers het mengsel tot brokken samen. Vergruizel die brokken door ze door een draaiende granulator te leiden en maak er strooibare korrels van. Sla daar tabletten uit. Desgewenst kunnen deze tabletkernen, 10 net als in het vorige voorbeeld, een bekleding krijgen.

Voorbeeld XX

Veterinair injectiepreparaat

Traject

Werkzame stof 150 mg 0,05 - 1,0 g 15 Polysorbaat 60 3,0 % w/w) )

Witte bijenwas 6,0 % w/w) tot 3 g) tot 3 of 15 g

Arachis-olie 91,0 % w/w) )

Verhit het mengsel van arachisolie, witte bijenwas en polysorbaat 60 onder roeren tot 160°C, houdt het 2 uur 20 op 160°C en koel onder roeren tot kamertemperatuur af. Voeg aseptisch de werkzame stof aan de drager toe en dispergeer met behulp van een snellopende menger. Homogeniseer dat door het door een kolloldmolen te leiden. Vul het produkt aseptisch in steriele plastic injectiespuiten.

25 Voorbeeld XII

Veterinair drankje

Traj eet

Werkzame stof 0,35 % 0,01-2 %

Polysorbaat 85 5,0 30 Benzylalkohol 3,0

Propyleenglycol 30,0

Fosfaat-buffer tot een pH 6,0-6,5 Water tot 100 %

Los de werkzame stof in het mengsel van poly-35 sorbaat 85, benzylalkohol en propyleenglycol op. Voeg een deel van het water toe en stel de pH indien nodig met fosfaat- 1700581 -27- : buffer tussen 6,0 en 6,5 in. Vul met water tot het eind- volume aan. Breng het produkt in een geschikte verpakking. Voorbeeld XIII Veterinaire likpasta 5 Traject

Werkzame stof 7,5 % 1 - 30 %

Saccharine 25,0

Polysorbaat 85 3,0

Aluminiumdi s t e araat 5,0 10 Gefractioneerde kokosolie tot 100 %

Dispergeer het aluminiumdistearaat onder verwarming in de gefractioneerde kokosolie en het polysorbaat 85. Koel tot kamertemperatuur af en dispergeer het saccharine in de olie-drager. Verdeel de werkzame stof over deze basis en 15 vul in plastic spuiten af.

Voorbeeld XIV

Korrels voor toevoegen aan diervoer.

Traject

Werkzame stof 2,5 gew.% 0,05-5 % 20 Calciumsulfaat-hemihydraat tot 100 %

Meigde werkzame stof met het calciumsulfaat. Maak er door nat granuleren korrels van. Gebruik een schaal of een wervelbeddroger. Vul in geschikte verpakking af.

Voorbeeld XV

25 Emulgeerbaar concentraat

Werkzame stof 50 g

Anionogene emulgator (bijv. fenylsulfonaat CALX) 40 g

Niet-ionogene emulgator (bijv.

Syperonic NP13) 60 g 30

Aromatisch oplosmiddel (bijv. Solvesso 100) tot 1 liter.

Meng alle bestanddelen en roer totdat het in oplossing gegaan is.

Voorbeeld XVI Korrels 35 (a) Werkzame stof 50 g

Houthars 40 g 97Q0581 -sr - 28 - * Gipskorrels (0,25-0,84 mm) (bijv.

Agsorb 100A) tot 1 kg (b) Werkzame stof 50 g

Superonic NP13 40 g 5 Gipskorrels (0,25-0,84 mm) tot 1 kg

Mengalle bestanddelen in een vluchtig oplosmiddel, bijv. methyleenchloride, en voeg dat toe aan korrels die in een menger omhoog en omlaag gaan. Verwijder het oplosmiddel.

10 8700581

Claims (13)

1. Verbinding volgens formule 1.

2. De verbinding volgens conclusie 1 in kristal- 5 lijne vorm.

3. De verbinding volgens conclusie 1 in kristal-lijne vorm met een zuiverheid beter dan 90 %.

4. Preparaat voor menselijke geneeskunde, dat een doeltreffende hoeveelheid verbinding volgens conclusie 1 samen 10 met één of meer dragers en/of hulpstoffen bevat.

5. Preparaat voor veterinaire geneeskunde dat een doeltreffende hoeveelheid van de verbinding volgens conclusie 1 samen met één of meer dragers en/of hulpstoffen bevat.

6. Preparaat voor het bestrijden van plagen dat 15 een doeltreffende hoeveelheid van de verbinding volgens con clusie 1 samen met één of meer dragers en/of hulpstoffen bevat.

7. Werkwijze voor het bestrijden van plagen in land-, tuin- of bosbouw of in gebouwen, loodsen of andere openbare plaatsen of daar daar de plagen thuishoren, waarbij 20 men op de planten of andere gewassen of op de plagen zelf of op een plaats waar ze thuishoren een doeltreffende hoeveelheid van de verbinding volgens conclusie 1 brengt.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, waarbij de plagen insecten, mijten of nematoden zijn.

9. Werkwijze voor de bereiding van de verbinding volgens conclusie 1, waartoe a) een microorganisme van het geslacht Streptomyces gekweekt wordt en die verbinding desgewenst daaruit geïsoleerd wordt, waarbij het gebruikte microorganisme een mutant van een stam 30 is die tot produktie van die verbinding volgens formule 1 in staat is maar geen noemenswaardige hoeveelheden van de 5g-hydroxy- of 5β-methoxy-verbindingen van de S541-reeks maakt, of b) men de overeenkomstige 5β-hydroxy-verbinding oxydeert.

10. Werkwijze volgens conclusie 9, waarbij het organisme een mutant van een stam van Streptomyces thermo- 8700531 r V' -* archaensis of van Streptomyces cyaneogrseus noncyanogenus is, die tot produktie van de verbinding volgens formule 1 in staat is, maar geen noemenswaardige hoeveelheden 56-hydroxy-of 53-methoxy-verbindingen van de S541-reeks maakt.

11. Werkwijze volgens conclusie 10, waarbij die mutant Steptomyces thermoarchaensis NCIB 12334 of een mutant daarvan is.

12. Mutant van een stam van een microorganisme van het geslacht Streptomyces dat tot produktie van de verbin- 10 ding volgens conclusie 1 in staat is maar geen noemenswaardige hoeveelheden 53-hydroxy- of 53-methoxy-verbindingen van de S541-reeks maakt, en het genetische materiaal daarvan dat aan de synthese van de verbinding volgens conclusie 1 meedoet.

13. Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12334 en 15 de mutanten daarvan, en het genetische materiaal daarvan dat aan de synthese van de verbinding volgens conclusie 1 meedoet. "O—O—O—o- δ 7 o 0 5 a i