NL8700483A - Kwantificering van nucleinezuur moleculen en de daarbij gebruikte reagens set. - Google Patents
Kwantificering van nucleinezuur moleculen en de daarbij gebruikte reagens set. Download PDFInfo
- Publication number
- NL8700483A NL8700483A NL8700483A NL8700483A NL8700483A NL 8700483 A NL8700483 A NL 8700483A NL 8700483 A NL8700483 A NL 8700483A NL 8700483 A NL8700483 A NL 8700483A NL 8700483 A NL8700483 A NL 8700483A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- fragment
- sniffing
- molecules
- nucleic acid
- gene
- Prior art date
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 82
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 81
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 81
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 20
- 238000011002 quantification Methods 0.000 title claims description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 71
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 62
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 43
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 39
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 37
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 33
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 31
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 20
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 claims description 19
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 18
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 claims description 16
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 11
- 108700024542 myc Genes Proteins 0.000 claims description 11
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 11
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 claims description 9
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 claims description 8
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 6
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 claims description 6
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 claims description 6
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 claims description 6
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 claims description 6
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 claims description 4
- 101100237844 Mus musculus Mmp19 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 claims description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims 2
- 241000724762 Salmonella phage 5 Species 0.000 claims 1
- 101150011281 mpl1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 51
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 30
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 101150026150 mt gene Proteins 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical group N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 2'‐deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N Deoxycytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1OC(CO)C(O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 2
- 102000052708 Recessive Genes Human genes 0.000 description 2
- 108700005079 Recessive Genes Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 239000003518 caustics Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- -1 nucleoside triphosphates Chemical class 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 2
- 108010051423 streptavidin-agarose Proteins 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- DEXFNLNNUZKHNO-UHFFFAOYSA-N 6-[3-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperidin-1-yl]-3-oxopropyl]-3H-1,3-benzoxazol-2-one Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C1CCN(CC1)C(CCC1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1)=O DEXFNLNNUZKHNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 206010008805 Chromosomal abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 201000010374 Down Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102100030708 GTPase KRas Human genes 0.000 description 1
- 101710113436 GTPase KRas Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 1
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 235000021403 cultural food Nutrition 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 229940094991 herring sperm dna Drugs 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000003793 prenatal diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 1
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
87302
ORION PHARMACEUTICAL
KWANTIFICERING VAN NUCLEINEZUUR MOLECULEN EN DE DAARBIJ GEBRUIKTE REAGENS SET
De uitvinding heeft betrekking op de kwantificering van bepaalde nucleinezuur moleculen, meer in het bijzonder de mate van 5 versterking van genen en/'cf overeenkomstige boodschapper RNA moleculen waarbij de sandwich of oplossings hybridisatie methode wordt gebruikt, en op de gebruikte reagens set.
Het aantal kopieën van de individuele genen in het genoom is meestal 10 konstant. In enkele gevallen is er slechts een gen per haploid genoom en in andere gevallen meerdere, Onder bepaalde omstandigheden kan het aantal kopieën veranderen. De versterking van bepaalde genen is bijvoorbeeld gevonden verbonden te zijn met de ontwikkeling van kanker. Het is ook bekend dat externe factoren zoals pharmaceutics 15 en metalen enz. de versterking van bepaalde genen kunnen veroorzaken. Voor de ontwikkeling van een ziekte is het foutieve of vergrote expressleniveau van een gen, zoals een oncogen, d.w.z. de hoeveelheid boodschapper RNA en een cel, van grote betekenis.
Toegenomen aantallen van enkele chromosomen is de oorzaak van bepaalde 20 erfelijke ziekten of andere verstoringen, terwijl enkele erfelijke ziekten slechts duplicering vereisen van een recessief gen. In al zulke gevallen is het belangrijk om het aantal aanwezige chromosomen of genen te bepalen.
25 Het aantal van bepaalde DNA moleculen, bijvoorbeeld de mate van versterking van bepaalde genen,wordt thans bepaald door het geëxtraheerde, te bestuderen DNA door middel van restrictie enzymen te knippen en door middel van het scheiden van de nucleotide fragmenten naar lengte door middel van agarose gel elektro-30 forese. Daarna wordt de enkelstrengs DNA overgebracht en gefixeerd aan een nitrocellulose filter, waarbij hybridisatie plaatsvindt door gebruik te maken van het te bestuderen gen of een deel van het gen als een snuffelmolecuul.
8700483 -2- 87302 1 ï'
De resultaten worden verkregen door middel van autoradiografie (Southern, J. Mol. BIOL. 98, p. 503-517, 1975). Bij elke parallels analyse is de hoeveelheid cellulair DNA het zelfde.
5 De intensiteiten van de hybridisatie banden , d.w.z. de signalen, worden vergeleken en de verhoudingen tussen de kopie aantallen· van de te bestuderen genen in de testmonsters worden bepaald.
De methode levert slechts bij benadering aangegeven resultaten.
Analoog wordt RNA gemeten volgens de Northern-overbrengings of 10 stip-averbrengings methode.. Deze methoden zijn kwantitatief zeer onnauwkeurig (Thomas, methods in Enzymol., 100, pp. 255-266, 1983).
Bekende methoden zoals de Southern en Northern overbrengingsmethoden zijn langzaam en moeilijk uit te voeren. Aangezien ze slechts benaderde 15 resultaten leveren is hun diagnostische waarde twijfelachtig in gevallen waarin het belangrijk is om het aantal van bepaalde nucleine-zuur moleculen per gegeven eenheid , zoals een cel, te weten.
•
De sandwich of oplossings hybridisatie methoden, beschreven in 20 US octrooi no. 4,486,539 en in de Britse octrooiaanvrage no.
GB 2 169 403 zijn kwantitatief (Virtanen et al., Lancet JL, pp. 381-383, 1983). Bovendien vereist de methode volgens de onderhavige uitvinding een standaard nucleinezuur, waarvan het kopie aantal konstant is en de bepaling van het aantal van de relevante 25 nucleinezuur moleculen per gegeven eenheid, zoals een cel, kern, ribosoom of chromosoom, mogelijk maakt.
Het doel van de onderhavige uitvinding is een nauwkeurige en snelle kwantitatieve methode voor nucleinezuur molecuul bepaling te 30 produceren, die ook sneller en eenvoudiger kan worden uitgevoerd dan de thans gebruikte. Het kan worden gebruikt voor kanker en prenatale diagnostieken, voor het detecteren van stoffen die gen versterking veroorzaken of voor het aantonen van de ontwikkeling van bijvoorbeeld geneesmiddelresistentie als mede voor de bepaling 35 van het expressie niveau van boodschapper RNA·.
870048¾ * ί .-3- 87302
Tenminste twee bepalingen zijn nodig volgens de onderhavige uitvinding. Een bepaalt het nucleinezuur molecuul, dat aanwezig kan zijn in verscheiden kopieën, het test nucleinezuur. De andere bepaalt het essentiële nucleinezuur molecuul dat op gunstige wijze aanwezig is 5 in een konstent aantal, het standaard nucleinezuur. Bij de methode volgens de uitvinding duidt een nucleinezuur molecuul een bepaalde nucleotide volgorde van 10 - 12 nucleotiden aan of een gen dat enkele duizenden nucleotiden bevat. Het kan ook een boodschapper RNA of een nucleotide volgorde die aanzienlijk langer is dan een enkel gen, 10 d.w.z. een amplicon, betekenen.
De bepaling van de test en standaard nucleinezuren wordt uitgevoerd onder gebruikmaking van een anderzijds normale sandwich hybridisatie methode, die bijvoorbeeld is beschreven in het US octrooi no. 4,486,539 15 of een oplossings hybridisatie methode beschreven in de Britse octrooiaanvrage no. GB 2 169 403. De uitvinding heeft ook betrekking op een reagens set die nucleinezuur reagentia bevat die tenminste bestaan uit een test snuffelmolecuul paar en tenminste een standaard snuffelmolecuul paar.
20
De reagentia of snuffelmoleculen die worden gebruikt bij deze methode, worden bereid door gebruik te maken van recombinant-DNA technieken, uit nucleinezuren die voldoende homoloog zijn ten opzichte van de test en standaard nucleinezuren. Voldoende homologe nucleinezuren kunnen 25 ook synthetisch en semi-synthetisch worden bereid.
De test en standaard nucleinezuren kunnen direkt uit.cellen worden geïsoleerd en geïdentificeerd door middel van verscheidene hybridisatie technieken. Zulke test en standaard nucleinezuren zijn 30 echter ook commercieel verkrijgbaar en uit verscheidene gen banken.
Test en standaard nucleinezuren kunnen ofwel DNA of RNA zijn.
Snuffelmolecuul paren , geschikt voor de sandwich of oplossings hybridisatie methode worden bereid uit nucleinezuren die voldoende 35 homoloog zijn ten opzichte van de test en standaard nucleinezuren 8700483 ί » -4- 87302 door middel van recombinant-DNA technieken.De relevante nucleinezuren worden geknipt door middel van geschikte restrictie enzymen; tenminste twee van de resulterende restrictie segmenten die relatief dicht bij elkaar zijn gelegen worden gedoneerd via tenminste twee geschikte 5 vectoren. Een van de fragmenten, het detector snuffelmolecuul,wordt gemerkt met een geschikt detecteerbaar indentificatiemiddel en het andere, het vangend snuffelmolecuul,'wordt of gefixeerd aan een geschikte drager of een stof wordt hieraan gehecht, welke stof de scheiding van het resulterende hybride uit het hybridisatiemengsel 10 door middel van een andere stof mogelijk maakt, zoals de complementaire component van een affiniteits paar.
De test en standaaard snuffelmolecuul paren kunnen worden samengesteld tot geschikte reagens sets, waarin de test en standaard 15 snuf felmolecuul paren zowel DNA of RNA zijn, of het test snuf fel molecuul paar is DNA en het standaard snuffelmolecuul paar RNA of vice versa. De voorbehandeling en de verdere behandeling van monsters voorafgaande aan de hybridisatie en de hybridisatie omstandigheden dienen daarom te passen bij de snuffelmolecuul paren die in de test 20 worden gebruikt.
De methode volgens de onderhavige uitvinding is in het bijzonder geschikt voor het direkt bepalen van het aantal nucleinezuur moleculen uit cellulaire homogenaten. De methode kan natuurlijk ook worden 25 gebruikt voor de bepaling van gezuiverde of zuivere nucleinezuren. Echter voor het uitvoeren van de methode volgens de uitvinding dient de meest geschikte voorbehandeling van het nucleinezuur monster te worden gekozen.
30 Het is mogelijk om zowel DNA als RNA bepalingen uit te voeren onder toepassing van de methode volgens de uitvinding. Deoxyribonucleine zuren worden gedenatureerd om enkelvoudige strengen te verkrijgen indien nodig. Enkel-strengige boodschapper RNA moleculen die potentieel de hybridisatie test verstoren, kunnen worden gehydrolyseerd 35 bij voorbeeld door het koken met loog. Het monster wordt niet 8700483 87302 -5- gegedenatureerd met betrekking tot ribonucleinezuur bepalingen aangezien het dubbelstrengs deoxyribonucleinezuur niet interfereert met de RNA bepaling. Het is natuurlijk mogelijk om het DNA uiteen te doen vallen met deoxyribonuclease of het ofwel chemisch of mechanisch 5 te wijzigen, zodat het niet aan de hybridisatie reactie kan participeren. Derhalve dient in verband met de DNA en RNA bepalingen een geschikte methode voor de verdere behandeling van het monster te worden gekozen , of volgens een alternatieve wijze kan deze verdere behandeling worden weggelaten. De keuze van een geschikte methode 10 voor de verdere behandeling is natuurlijk afhankelijk van de methode die wordt gebruikt voor de voorbereidende behandeling van het nucleinezuur monster. Talrijke voorbehandelings- en verdere behandelingsmethoden van nucleinezuur monsters zijn beschreven in de literatuur, die een keuze van de meest geschikte methoden voor 15 ieder geval mogelijk maakt.
Bepalingen waarbij zowel de test als standaard nucleinezuren ofwel DNA of RNA zijl kunnen worden uitgevoerd door gebruik van een onverdeeld monster. Bepalingen waarin de test nucleinezuren DNA zijn 20 en de standaard nucleinezuren RNA of vice versa, kunnen worden uitgevoerd bij gebruik van een verdeeld monster, aangezien verschillende methoden voor de verdere behandeling noodzakelijk zijn. Het monster kan natuurlijk worden verdeeld zelfs indien de test en standaard nucleinezuren van hetzelfde nucleinezuur type zijn.
25
De hybridisatie test zelf wordt uitgevoerd door de onverdeelde monster oplossing gelijktijdig in kontakt te brengen met tenminste een test snuffelmolecuul paar en een standaard snuffelmolecuul paar. Indien de monster oplossing verdeeld is, wordt deze afzonderlijk 30 in kontakt gebracht met tenminste een test snuffelmolecuul paar en een standaard snuffelmolecuul paar. In zulke gevallen wordt de hoeveelheid test nucleinezuur bepaald in het ene reaktievat en de hoeveelheid standaard nucleinezuur in het andere.
8700483 s % -6- 87302
Ongeacht of het monster gedeeld is of niet kan men in ieder geval de hybridisatie onder de meest voordelige omstandigheden en tijd laten plaats vinden. Indien de reaktie(s) eenmaal heeft/hebben plaats gevonden, worden de resulterende test en standaard hybriden 5 gescheiden uit het hybridisatiemengsel(s) d.m.v. de drager en gewassen, of door middel van een isolatie reagens zoals het complementaire deel van een affiniteitspaar. Het aangehecht identificatiemiddel aan de test en standaard hybriden wordt gemeten en het resultaat wordt vergeleken met standaard curven. Op deze 10 manier kan het aantal te bestuderen nucleinezuur moleculen worden bepaald per gekozen eenheid.
De methode volgens de uitvinding is van praktische diagnostische waarde, in het bijzonder voor de detectie van enkele typen kanker.
15 In kleincellige longcarcinomen, wordt het c-myc gen dikwijls versterkt en het expressieniveau erven is aanzienlijk hoger dan in normaal weefsel. In gevallen van neuroblastomen wordt het N-myc gen versterkt.
De methode volgens de onderhavige uitvinding kan ook worden gebruikt 20 voor het aantonen van de mutagene of-carcinogene effecten van bepaalde stoffen of de ontwikkeling van geneesmiddelresistentie.
Het is bekend dat externe selectiedruk kan resulteren in een verhoogde expressie van een bepaald gen. Bij de behandeling van kanker ontwikkelen cellen resistentie ten opzichte van een bepaald geneesmiddel door 25 middel van versterking van het gen, waarvan het expressieprodukt het geneesmiddel inaktiveert. Een zo'n geval is methotrexaat, dat versterking van het gen voor de dihydrofolaat reductase (DHFR) induceert. Een verder voorbeeld is de versterking van het gen voor metallothionine onder invloed van cadmium.
30
Het expressieniveau van een gen is belangrijk uit het oogpunt van het fenotype en funktie van de cel. Dit kan worden onderzocht door de hoeveelheid boodschapper RNA te meten die correleert aan de hoeveelheid proteïne waarvoor het codeert. Het transcriptieprodukt van een 35 oncogen bepaalt de wijze waarop het uiteindelijk tot expressie zal worden gebracht.
8700483 # a -7- 87302
De expressieniveaus van een oncogen variëren afhankelijk van het celtype, differentatieniveau en ontwikkelingsfase van de cel.
Bijvoorbeeld, in een bepaald stadium van foetale ontwikkeling wordt het c-myc oncogen snel gekopieerd, terwijl in een ander stadium dit 5 heel langzaam gebeurd. De mate van versterking is dikwijls gecorreleerd met het expressieniveau van het gen,hoewel laatstgenoemde significant kan toenemen zonder de eerstgenoemde. In zulke gevallen wordt de rol van een oncogen het best bepaald door eerder het expressieniveau ervan dan het aantal kopieën te meten. In enkele gevallen kan de 10 kwantitatieve bepaling van het boodschapper RNA eenvoudiger en handiger zijn dan de kwantificering van het gen produkt zelf. Als voorbeeld kan het c-myc oncogen, een labiel proteïne dat gemakkelijk door middel van warmte kan worden gecoaguleerd,worden genoemd.
15 De methode volgens de uitvinding kan ook worden gebruikt voor het identificeren van numerieke chromosomale afwijkingen zoals het Down syndroom. Bij de prenatale diagnostiek is het ook mogelijk om te bepalen of de foetus afwijkingen vertoont, d.w.z. homozygoot voor een of ander recessief gen.is.
20
De methode volgens de uitvinding en de nucleinezuur reagentia die bij deze methode worden gebruikt worden hieronder uitvoeriger beschreven.
Voorbeeld 1 25
Kwantificering van een versterkt oncogén (a) Nucleinezuur reagentia en hun bereiding 30 STANDAARD SNUFFELMOLECULEN ·
Cel standaard nucleinezuur. Het c-Ki-rasI gen is aanwezig in alle menselijke cellen. De snuffelmolecuul paren voor sandwich hybridisatie werden bereid door subcloneren van het HindiII fragment van het 35 c-Ki-rasI gen, dat een lengte van 3.8 kb meet, en waarvan de 8700483
tl W
873Q2 -8- restrictiekaart beschreven is door Chang et al., PNAS 79, pp. 4848-52, 1982. Het fragment is beschikbaar b.v. gedoneerd in het pBR322 plasmide (ATCC 41032) en kan b.v. worden verkregen uit de ATCC cultuur collectie.
5
Verdere behandeling van het cel standaard nucleinezuur. De hiervoor beschreven pBR322 cloon werd behandeld met BglII en HindlII restrictie enzymen en de resulterende fragmenten werden geïsoleerd uit de agarose gel; dicht bij elkaar gelegen gezuiverde fragmenten werden gesub-10 cloneerd in twee geschikte vectoren voor de bereiding van de detector en de vangende snuffelmoleculen.
Standaard detector snuffelmolecuul. Een BglII-BglII fragment waarvan de gemeten lengte ongeveer 1,1 kb was, werd gesubcloneerd in de 15 BamHI restrictie enzymplaats van het pBR322 plasmide en gemerkt door 125 middel van een markeringstranslatie jnet I gemerkt dCTP.
Standaard vangend snuffelmolecuul. Het BglII-HindlII fragment van ongeveer 0,5 kb werd in de M13 mplO en mpll faag vectoren gevoegd 20 tussen de restrictieplaatsen van de BamHI en HindlII restrictie enzymen en gefixeerd aan een nitrocellulose filter (150 ng DNA/dia 1 cm).
TEST SNUFFELMOLECULEN 25
Test nucleinezuur. Een snuffelmolecuul paar voor de sandwich hybridisatie werd bereid uit een gedoneerd c-myc gen dat bij voorbeeld verkregen kan worden uit de ATCC cultuur collectie (ATCC 41010).
De restrictiekaart van het gen is beschreven door Watt et al., 30 PNAS 80. pp, 6307-6311, 1983.
Verdere behandeling van het test nucleinezuur. Het c-myc gen werd behandeld met HindlII, Xbal en PstI restrictie enzymen en de fragmenten werden geïsoleerd uit de agarose gel, gezuiverd en gesubcloneerd in 35 geschikte vectoren teneinde dê detector en vanger snuffelmoleculen te bereiden.
8700483 Μ -9- 87302
Tesfc detector snuffelmolecuul. De enkelstrengs staarten van het HindlII-Xbal restrictie fragment van het e-myc gen, waarvan de gemeten lengte 3,7 kb was, werden dubbelstrengs gemaakt door middel van DNA polymerase. De Hind III koppelaars werden ingevoegd door 5 middel van T4-DNA-ligase in de resulterende recht afgesneden DNA fragmenten; na phenol extractie werd het DNA behandeld met het HindlII restrictie enzym. Het DNA fragment werd vervolgens gedoneerd in het pBR322 plasmide op de restrictieplaats van het HindlII * restrictie enzym en gemerkt door middel van markeringstranslatie met 10 125I gelabeld dCTP.
Test vanger snuffelmolecuul. Het 1,1 kb Xbal-PstI fragment van het c-myc gen werd gedoneerd in de M13 mplO en mpll faag clonerings vectoren tussen de restrictieplaatsen van de Xbal en PstI restrictie 15 enzymen en gefixeerd aan het nitrocellulose filter (150 ng DNA/dia 1 cm).
(b) Bepaling van de standaard curve 20 Het monster dat werd gebruikt voor de bepaling van de standaard curve bestond uit een alkalisch gedenatureerde pBR322 cloon van het c-myc gen. De sandwich hybridisatie oplossing waaraan de hiervoor vermelde test snuffelmoleculen werden taegevoegd, bestond uit 4 x SSC, 1 x Denhardt oplossing, 200 ug/ml haring sperma DNA en 0,2 % SDS.
25 De hybridisatie vond plaats bij 65°C gedurende 17 - 19 uren, waarna de filters werden gewassen in de wasoplossing (0,1 x SSC 0,2 % SDS) bij 50°C. Het identificatiemiddel dat bevestigd was aan de sandwich hybriden werd daarna in de gammateller geteld.
30 - 8700433 » » 87302 -10-
Tabel 1
Monster tpm_ moleculen/test c-myc-filter 5 ___ 0 40 106 75 5 x 106 190 107 340 10 108 2200 (c) Bepaling van het aantal genen 15 De monsters bevatten 1) cellen van een menselijke placenta en 2)
Cola 320 cellen, die b.v. verkregen kunnen worden van de ATCC cultuur collectie (ATCC-CCC220). DNA werd geïsoleerd uit beide monsters, en dezelfde hoeveelheid cel DNA, gedenatureerd door koken met loog, werd aan beide tests toegevoegd. Alkalische denaturering hydroly-20' seerde ieder in het monster aanwezige RNA.
De test werd uitgevoerd door het toevoegen aan elk monster van zowel het c-myc al het c-Ki-rasI filter en de twee gelabelde reagentia, waardoor zowel de standaard als de test DNA voor elk monster kon 25 worden gemeten. Op basis van de c-Ki-rasI bepalingen werd iedere test bevonden dezelfde hoeveelheid DNA te bevatten waaruit kan worden afgeleid dat het c-myc gen in Colo 320 cellen in ongeveer 16 - 20 hoger kopie aantal aanwezig is dan in de normale situatie.
De resultaten zijn weergegeven in Tabel 2.
30
Tabel 2 ___
Monster c-Ki-rasI filter _c-myc filter _tpm*_tpm*_aantal
Menselijke placentacellen 486 340 107 35 Colo 320 cellen_432_3205_1.6 x 10° 8700483 φ. ·+ -11- 87502 * de verkregen waarneming uit het blanke filter werd van de waarnemingen afgetrokken.
VOORBEELD 2 5
Kwantificering van versterkt gen
(a) Nucleinezuur reagentia en hun bereiding 10 STANDAARD SNUFFELMOLECULEN
Cel standaard nucleinezuur. Het controle nucleinezuur werd genomen uit het promotor gebied van het matallothionine gen in de muis, d.w.z. het MT'gen, en het DNA dat zich in de onmiddelijke nabijheid in de 15 afleesvolgorde bevond. De struktuur van het MT gen is beschreven door Pavlakis en Hamer,PNAS 80, pp. 397-401, 1983. Het referentie nucleinezuur fragment is beschikbaar b.v. gedoneerd in de pBPV-MN.Tneo(432-12)vector (ATCC 37224) en kan b.v. worden verkregen uit de ATCC cultuur collectie.
20
Verdere behandeling van het cel standaard nucleinezuur. Het hiervoor beschreven MT gen werd behandeld met Kpnl, BglII en EcoRI restrictie enzymen voor het subcloneren in het pAT153 plasmide. De Kpnl staart werd omgezet in een HindlII staart met een brugvormer.
25
Standaard detector snuffelmolecuul. Het EcoRI-Kpnl-(HindlII) fragment met een lengte van ongeveer 1,2 kb, en gelokaliseerd in de aflees- richting van het promotor gebied van het metallothionine gen werd gedoneerd aan het pAT 153 plasmide tussen de restrictieplaatsen 30 van de EcoRI en HindlII restrictie enzymen en gemerkt door middel van 32 een markeringstranslatie met P-gemerkte nucleoside trifosfaten.
Standaard vanger snuffelmolecuul. Het 0,8 kb Kpnl-BglII fragment dat het promotor gebied van het metallothionine gen en het gebied in 35 de afleesrichting hiernaar gelegen, bevat, werd gedoneerd in de 9700483 -12- 87302 M13 mpl8 en M13 mpl9 faag vectoren tussen de restrictieplaatsen van de Kpnl en BamHI restrictie enzymen en gefixeerd aan het nitrocellulose filter.
5 TEST SNUFFELMOLECULEN-
Test nucleinezuur. Het snuffelmolecuul paar voor de sandwich hybridisatie test werd bereid door toepassing van het commercieel beschikbare pMTVdhfr plasmide (Bethesda Research Laboratories; 10 product No. 5369SS), waarvan de struktuur beschreven is door Lee et al., Nature 294, pp. 228-232, 1981.
Verdere behandeling van test nucleinezuur. Het pMTVdhfr plasmide dat cDNA van het dihydrofolaat reductase (DHFR) gen bevatte, werd 15 behandeld met HindlII en BglII restrictie enzymen.
Test detector snuffelmolecuul. Het HindlII-BglII fragment met een lengte van 0,75 kb en corresponderend met het gebied coderend voor het DHFR gen van het pMTVdhfr plasmide, werd in de plasmide pAT153 20 vector ingevoegd tussen de restrictieplaatsen van de HindlII en
BamHI restrictie enzymen en gemerkt door middel van een markerings-32 translatie met P-gemerkte nucleoside trifosfaten.
Test vanger snuffelmolecuul. Een HindlII fragment van 1,4 kb, 25* gehaald uit het MMTV gen gebied van het pMTVdhfr plasmide, werd gedoneerd in de M13 mpl8 en M13 mpl9 faag vectoren.
(b) Bepaling van de standaard curve 30 Het voor de test gebruikte monster was gezuiverd DNA uit het pMTVdhfr plasmide. De test zelf werd uitgevoerd zoals beschreven in voorbeeld lb met als uitzondering dat een vloeistof scintillatieteller werd gebruikt voor het tellen. De resulterende standaard curve is weergegeven in Tabel 3.
670 0483 87302 -13-
Tabel 3
Monster_ tpm_~ moleculen/test DFRH filter 5____;__ 0 17 106 45 3 x 106 79 10 107 210 (c) Bepaling van het aantal genen 15 Cellijnen die waren getransfecteerd met verschillende hoeveelheden cDNA corresponderend met het mRNA van het DHFR gen werden gekweekt op eetcultuur platen en als monster gebruikt. De cellen werden gelyseerd onder toepassing van natrium dodecyl sulfaat en hun DNA werd afgeschoven door het door een fijne hypodermische naald van een 20 infectiespuit te persen. Een 250 x/1 monster overeenkomende met ongeveer 10^ cellen werd uit homogenaat genomen en 50 iA NaOH werd toegevoegd. Het monster werd gekookt en geneutraliseerd met azijnzuur en het hybridisatiemengsel. Het totale volume was 0,5 ml. Alle hiervoor beschreven snuffelmoleculen werden gelijktijdig toegevoegd en 25 een zogenaamd blancofilter werd toegevoegd als achtergrond controle. Hybridisatie, wassen en het tellen van de merken werden uitgevoerd zoals in Voorbeeld lb met als uitzondering dat een vloeistof scintillatieteller werd gebruikt voor de telling. De resultaten zijn weergegeven in Tabel 4.
8700433 -14- 87302
Tabel 4
Cel MT Aantal cellen _OHFR__ tpm* in het monster tpm* Aantal moleculen Aantal 5 in het monster kopieën
Controle cel (geen DHFR-cDNA) 182 1,05 x 106 21 < 106 10 Lijn I 138 0,9 x 106 80 3 x 10ó 3
Lijn II 210 1,25 x 106 732 5 x 107 40 * tpm: de afgelezen waarde verkregen bij het blanke filter is 15 afgetrokken
Het MT gen is een intern identificatiemiddel dat het aantal cellen, aanwezig in een monster meet. De resultaten tonen aan dat in deze test 10^ cellen een MT-specifiek signaal van 165 + 20 tpm gaven. De DHFR 20 reagentia meten de hoeveelheid DHFR-cDNA. Het aantal cellen werd bepaald uit het MT-specifieke signaal. Het was derhalve mogelijk om het aantal DHFR-cDNA kopieën in verschillende cellijnen te bepalen zoals weergegeven in Tabel 4.
25 VOORBEELD 3
Kwantificering van het boodschapper DNA
(a) Nucleinezuur reagentia en hun bereiding 30
Door toepassing van de test snuffelmoleculen, beschreven in Voorbeeld 2, is het ook mogelijk de hoeveelheid mRNA, afgeleid uit DHFR-cDNA, te meten. De struktuur van het pMTVdhfr plasmide is zodanig dat de transcriptie van het DHFR gen begint bij de MMTV promotor.De 35 resulterende boodschappers zijn ongeveer 1,0 kb lang. Hiervan zijn 8 7 0 ö 4 S 3 87302 -15- ongeveer 0,25 kb afkomstig van het MMTV promotor gebied en de rest' van DHFR-cDNA (Lee et al., Nature 294, pp. 228-232, 1981).
STANDAARD SNUFFELMOLECULEN 5
Het cel standaard nucleinezuur, de standaard detector en het standaard vanger snuffelmolecuul waren zoals beschreven in Voorbeeld 2.
TEST SNUFFELMOLECULEN
10
Het test nucleinezuur, de test detector en het test vanger snuffelmolecuul waren zoals beschreven in Voorbeeld 2.
(b) Bepaling van de standaard curve 15 .
Het voor de standaard curve bepaling gebruikte monster bestond uit boodschapper RNA overeenkomend met het dihydrofolaat reductase gen geproduceerd door middel van in vitro transcriptie. Het voor de transcriptie benodigde DNA werd bereid door middel van subclonering 2Q van het 1,4 kb Hind III fragment van de MMTV promotor van het p MTVdhfr plasmide en het 0,75 kb HindïII-BglII fragment (DHFR-cDNA) naast elkaar gelegen in het pSP64 plasmide (Promega Biotec) tussen de restrictieplaatsen van de HindiII en BamHI restrictie enzymen.
Het RNA monster werd bewaard in 0,2 % SDS waterige oplossing.
25
De sandwich hybridisatie test werd uitgevoerd zoals beschreven in de Voorbeelden lb en 2b maar de denaturatie werd weggelaten.
8700483 i > -16- 87302
Tabel 5
Monster_ tpm
Moleculen/test DHFR filter 5 ____ 0 20 5 x 106 65 107 130 5 x 107 390 10 108 653 (c) Bepaling van het aantal boodschapper RNA moleculen 15 Het aantal boodschapper RNA moleculen overeenkomend met het DHFR gen werd bepaald uit de in Voorbeeld 2 beschreven cellijnen.
De cellen werden gelyseerd onder toepassing van natrium dadecyl sulfaat en hun DNA licht af geschoven door het persen door een fijne 20 hypodermische naald van een injectiespuit. Een 250 ul monster van het homogenaat werd genomen overeenkomende met ongeveer 5 x 10^ cellen. Het homogenaat werd daarna toegevoegd aan de sandwich hybridisatie test zonder denaturatie. De sandwich hybridisatie vond plaats zoals gegeven in de Voorbeelden 2c en lb, met als uitzondering 25 dat alleen de DHFR snuffelmoleculen werden toegevoegd aan de hybridisatie oplossing. In een parallel monster van 250 ajI homogenaat werd het cel aantal bepaald onder toepassing van het MT snuffel-molecuul zoals beschreven in Voorbeeld 2c.
30 De resultaten zijn weergegeven in Tabel 6.
8700403 -17- 87302
Tabel 6
Cel MT Cel aantal in _ DHFR__ tpm* het monster tpm* Aantal moleculen Aantal per 5 in het monster cel
Lijn I 380 3,5 x 106 1465 3,45 x 108 100
Lijn II 430 4,2 x 106 4800 2 x 109 500 10 *tpm: dé aflezing verkregen bij het blanco filter is afgetrokken.
De resultaten toonden aan dat de cellijn I per cel ongeveer 100 boodschapper RNA moleculen uit de DHFR genen produceerde en cellijn II 15 ongeveer 500 boodschapper RNA moleculen uit de DHFR genen produceerde.
VOORBEELD 4
Kwantificering van versterkt gen door middel van oplossing -hybridisatie 20 (a) Nuclêinezuur reagentia en hun bereiding STANDAARD SNUFFELMOLECULEN ' 25 Het cel standaard nucleinezuur, de standaard detector en het standaard vanger snuffelmolecuul waren zoals beschreven in Voorbeeld 2.
Het 1,2 kb EcoRI-Kpnl-(HindlII) fragment in pAT153 werd gemerkt door 125 middel van markeringstranslatie met I-gemerkte deoxycytidine.
De 0,8 kb Kpnl-BglII fragmenten in M13 mpl8 en M13 mpl9 werden
30 TM
gemodificeerd met biotin onder gebruik making van het Photoprobe réagens (Vector Laboratories, CA, USA, produkt No SP-1000); 8700433 .
87302 -18-
TEST SNUFFELMOLECULEN
Het test nucleinezuur, de test detector en het test vangend snuffelmolecuul waren zoals beschreven in Voorbeeld 2. Het 5 0,75 kb HindlII-BglII fragment in pAT153 werd gemerkt met 125 I-gemerkt deoxycytidine. De 1,4 kb HindlII fragmenten in
M13 mpl8 en M13 mpl9 werdem gebiotinyleerd onder gebruik making TM
van Photoprobe zoals hiervoor.
10 (b) Bepaling van de standaard curve
Een cel standaard curve werd bereid onder toepassing van een bekende hoeveelheid cellen, waarvan het hybridisatie signaal gemeten werd onder toepassing van de standaard snuffelmoleculen 15 die het MT-gen herkennen. Een test nucleinezuur standaard curve werd bereid met het pMTVdhfr plasmide en de test snuffelmoleculen die dit plasmide herkennen. Hybridisaties worden uitgevoerd in 200 1 van een oplossing die bestond uit 0,6 M NaCl, 20 mM
fosfaatbuffer, pH 7,5, ImM EDTA, 4 % polyethyleen glycol (PEG 6000) 20 gedurende 1,5 uur bij 70°C. Na de reaktie werden 50 1 streptavidin- agarose (Bethesda Research Laboratories, Maryland, USA, produkt No. 5943SA), en 1 M NaCl, 10 mM natriumfosfaat, pH 7,5, 1 mM EDTA toegevoegd tot een eindvolume van 500 1.. De hybriden werden verzameld op de streptavidin - agarose bij 37°C gedurende 15 min.
25 De agarose werd eenmaal gewassen gedurende 5 min. met de gebuf.ferde 1 M NaCl oplossing bij 37°C en tweemaal gedurende 2 min. met 15 mM NaCl, 1,5 mM natriumcitraat bij 55°C. De hoeveelheid gebonden hybriden werd bepaald door de agarose te meten in een gamma teller (Syvanen et al., Nucleic Acids Res. 14, 5037-5048, 1966).
30 De resultaten zijn weergegeven in de tabellen 7 en 8.
8700483 -19- 87302
Tabel 7
Monster_ tpm_ _ cellen/test MT snuffelmoleculen 5 _^_____ 0,8 x IQ6 162 1,6 x 106 216 3 x 106 298 10
Tabel 8
Monster_ tpm_ moleculen/test DHFR snuffelmoleculen 15 __:_;___ IQ6 148 5 x 106 .394 5 x 107 2240 20 (c) Bepaling van het aantal genen
Monsters van de in Voorbeeld 2 beschreven cellijnen werden op analoge wijze behandeld, met uitzondering dat het volume per monster dat 6 25 met ongeveer 2 x 10 cellen overeenkomt, 125 1 was. De bepalingen van het cellen aantal en het aantal test nucleinezuur moleculen werden uitgevoerd in afzonderlijke buizen door middel, van het toevoegen van het celmonster, de geschikte detector en vanger snuffelmoleculen, en de componenten van het hybridisatiemengsel tot een 30 eindvolume van 200 1. Controlebepalingen zonder cel standaard of test DNA werden opgenomen. Hybridisatie, verzameling van hybriden, wassen en het meten werd uitgevoerd zoals beschreven in voorbeeld 4b.
De resultaten werden afgelezen uit standaard curven die parallel werden bereid zoals beschreven in Voorbeeld 4b. De resultaten zijn 35 vermeld in Tabel 9.
8700433 5 v -20- 87302
Tabel 9
Cel _MT_;_ DHFR_ tpm* Aantal cellen in tpm* Aantal moleculen Aantal het monster in het monster kopieën
Controle cel 253 2,3 x 10^ 73 < 10^
Lijn I 210 1,5 x 106 233 3,8 x 106 3
Lijn II 237 2,1 x 106 3059 8,8 x 107 42 *tpm: waarden van de controlebepalingen zonder cel standaard of test nucleinezuur zijn afgetrokken.
Claims (13)
1. Een kwantitatieve methode voor de bepaling van nucleinezuur 5 moleculen door een sandwich of oplossing hybridisatie methode, met het kenmerk dat het aantal bepaalde nucleinezuur moleculen per gegeven eenheid wordt bepaald door vergelijking van het aantal van de test nucleinezuur moleculen die potentieel aanwezig zijn in verschillende kopieën in eenheid IQ ten opzichte van het aantal gekozen standaard nucleinezuur moleculen dat op gunstige wijze aanwezig is in een constant aantal per zelfde eenheid.
2. Bepalingsmethode volgens Conclusie 1, met het kenmerk 15. a t de in het monster aanwezige nucleinezuren (a) indien nodig worden omgezet in een vorm waarbij ze aan de hybridiseringsreaktie kunnen deelnemen, (b) alle nucleinezuren die potentieel de hybridiseringsreaktie kunnen verstoren, indien nodig,worden omgezet in een vorm 20 waarbij ze niet met de hybridisatietest kunnen interfereren, (c) in contact worden gebracht, ofwel ongedeeld of indien nodig gedeeld, met tenminste een test snuffelmolecuul paar dat voldoende homoloog is met het nucleinezuur dat potentieel aanwezig is in verschillende kopieën en met tenminste een 25 gekozen en geschikt standaard snuffelmolecuul paar dat voldoende homoloog is met het nucleinezuur molecuul dat op gunstige wijze aanwezig is in een constant aantal; de detector snuffelmoleculen van het genoemde test snuffelmolecuul paar en genoemd standaard snuffelmolecuul paar worden gemerkt met een geschikt, detec-30 teerbaar identificatiemiddel en de vanger snuffelmoleculen zijn gefixeerd aan een geschikte drager of waarbij een stof bevestigd is aan de genoemde vanger snuffelmoleculen, hetgeen isolatie van de resulterende hybriden mogelijk maakt; (d) nadat de hybridisatie reaktie of reakties hebben plaats 35 gevonden het test hybride en het standaard hybride worden 8700483 $ « · 87302 -22- ' gescheiden indien noodzakelijk, en het genoemde aangehecht identificatiemiddel wordt gemeten; waarbij het aantal nucleinezuur moleculen per gegeven eenheid wordt verkregen door vergelijking van de test en standaard nucleinezuur- aantallen. 5
3. De methode volgens Conclusies 1 en 2, met het kenmerk dat de test en standaard nucleinezuren deoxyribonucleinezuren zijn.
4. De methode volgens Conclusies 1 en 2, met het kenmerk dat het test nucleinezuur ribonucleinezuur is en het standaard nucleinezuur deoxyribonucleinezuur is.
5. De methode volgens Conclusies 1 en 2,met het kenmerk 15. a t de test en standaard nucleinezuren ribonucleinezuren zijn.
6. De methode volgens Conclusies 1 en 2, met het kenmerk dat het test nucleinezuur deoxyribonucleinezuur is en het standaard nucleinezuur ribonucleinezuur is. 20
7. De methode volgens Conclusies 1, 2, 3 en 4, m e t h e t kenmerk dat het detector snuffelmolecuul van het standaard snuffelmolecuul paar - een recombinant plasmide dat een 1,1 kb BglII-BglII fragment van het HindiII fragment van het 25 menselijke c-Ki-rasI gen bevat, waarbij het voornoemde HindlII fragment gedoneerd is in het pBR322 plasmide en genoemd BglII-BglII fragment gesubcloneerd is op de restrictieplaats van het BamHI restrictie enzym van het pBR322 plasmide - en de vanger snuffelmoleculen - recombinant fagen die een 0,5 kb 30 BglII-HindlII fragment van het HindlII fragment van het menselijke' c-Ki-rasI gen bevatten, waarbij het genoemd HindlII fragment gedoneerd is in het pBR322 plasmide en genoemd BglII-HindlII fragment gesubcloneerd is in de M13 mplO en M13 mpll faag vectoren tussen de restrictieplaatsen van de BamHI en HindlII 35 restrictie enzymen - ofwel individueel ofwel samen met het test 8700483 87302 -23- . snuffelmolecuul paar in contact worden gebracht met een onverdeeld of indien nodig verdeeld nucleinezuur monster.
8. De methode volgens Conclusies 1,2,3 en 4,met het 5 kenmerk dat het detector snuffelmolecuul van het standaard snuffelmolecuul paar - een recombinant plasmide omvattend een 1,2 kb EcoRI-KpnI(HindIII} fragment, bepaald door de afleesvolgorde, uit de het promotor gebied van het muis metallothionine gen, welk fragment gesubcloneerd is in het pAT153 10 plasmide tussen de restrictieplaatsen van de EcoRI en HindiII restrictie enzymen - en de vanger snuffel moleculen - recombinant fagen die een 0,8 kb Kpnl-BglII fragment bevatten uit het promotor gebied van het metallothionine gen en het erna in de aflees-volgorde gelegen gebied daarvan, welk fragment gesubcloneerd is 15 in de M13 mpl8 en M13 mpl9 faag vectoren tussen de restrictie plaatsen van de Kpnl en BamHI restrictie enzymen - ofwel individueel ofwel samen met het test snuffel molecuul paar, in contact worden gebracht met een onverdeeld of indien nodig verdeeld nucleinezuur monster. 20
9. De methode volgens Conclusies 1, 2, 3,ó, 7 en 8, m e t het kenmerk dat, om de mate van versterking van het c-myc oncogen en/of het aantal boodschapper RNA moleculen overeenkomende met dit gen te bepalen, het detector snuffelmolecuul 25 van het test snuffelmolecuul paar - recombinant plasmide omvattende een 3,7 kb HindlII-Xbal fragment van het c-myc gen, waarbij genoerd fragment gesubcloneerd wordt in het pBR322 plasmide op de restrictieplaats van het HindiII restrictie enzym - en de vanger snuffel moleculen - recombinant fagen 30 omvattende een 1,1 kb Xbal-PstI fragment van het c-myc gen, welk fragment is gesubcloneerd in de M13 mplO en M13 mpll vectoren tussen de restrictieplaatsen van de Xbal en PstI restrictie enzymen - ofwel individueel of samen met het standaard snuffelmolecuul paar, in contact werden gebracht met een 35 onverdeeld of indien nodig verdeeld nucleinezuur monster. §700483 .w -24- 87302
10. De methode volgens Conclusies 1, 2, 3, 6, 7 en 8, met het kenmerk dat om de mate van versterking van het dihydro-foliaat reductase of DHFR gen en/of het aantal boodschapper RNA moleculen overeenkomend met dit gen te bepalen, het detector 5 snuffelmolecuul van het test snuffelmolecuul paar - een recom binant plasmide omvattende een 0,75 kb HindlII-BglII fragment coderend voor het DHFR gen van het pMTVdhfr plasmide, welk fragment is gesubcloneerd in de pAT153 plasmide vector tussen de * restrictieplaatsen van de HindlII en BamHI restrictie enzymen -10 en de vanger snuffelmoleculen - recombinant fagen bevattende een 1,4 kb HindlII fragment van het MMTV gen gebied van het pMTVdhfr plasmide, welk fragment gesubcloneerd is in de M13 mpl8 en M13 mpl9 faag vectoren op de restrictieplaatsen van het HindlII restrictie enzym - ofwel individueel of samen met het standaard 15 snuffel molecuul paar in contact worden gebracht met een onverdeeld of indien nodig verdeeld nucleinezuur monster.
11. Een reagens set voor de kwantitatieve bepaling van nucleinezuur moleculen met het kenmerk dat de set tenminste 20 een test snuffelmolecuul paar en tenminste een standaard snuffelmolecuul paar bevat, waarbij de detector snuffelmoleculen van zowel het test snuffelmolecuul paar als het standaard -snuffelmolecuul paar gemerkt zijn met een geschikt identificatiemiddel en de vanger snuffelmoleculen gefixeerd zijn aan een 25 geschikte drager of waarbij een stof bevestigd is aan de genoemde vanger snuffelmoleculen, hetgeen isolatie van de sandwich hybriden mogelijk maakt.
12. Een reagens set volgens Conclusie 11, met het kenmerk 30 dat het detector snuffelmolecuul van het test snuffelmolecuul paar dat voor de bepaling van de mate van versterking van het c-myc oncogen en/of het aantal boodschapper RNA moleculen corresponderend met dit gen wordt gebruikt, een recombinant plasmide is dat een 3,7 kb HindlII-Xbal restrictie fragment van 35 c-myc gen bevat, welk fragment is gesubcloneerd in het pBR322 S70 0 483 '-Y- f -25- 87302 plasraide op de restrictieplaats van het HindiII restrictie enzym, en de vanger snuffelmoleculen recombinant fagen zijn, omvattend een 1,1 kb Xbal-PstI fragment van het c-myc gen, welk fragmentgesubcloneerd is in de M13 mplO en M13 mpll faag 5 vectoren tussen de restrictieplaatsen van de Xbal en PstI restrictie enzymen, en het detector snuffelmolecuul van het standaard snuffel molecuul paar een 1,1 kb BglII-BglII fragment is van het HindlII fragment van het menselijke c-Ki-rasI gen, waarbij genoemd HindlII fragment is gedoneerd is in het pBr322 ig plasmide en genoemd BglII-BglII fragment gesubcloneerd is in het pBR322 plasmide op de restrictieplaatsvan het BamHI restrictie enzym, en de vanger snuffelmoleculen recombinant fagen zijn die omvatten een 0,5 kb BglII-HindlII fragment van het HindlII fragment van het c-Ki-rasI gen, waarbij genoemd 15 HindiI fragment gesubcloneerd is in het pBR322 plasmide van het c-Ki-rasI gen, en genoemd BglII-HindlII fragment gesubcloneerd is in de M13 mplO en M13 mpll faag vectoren tussen de restrictieplaatsen van de BamHI en HindlII restrictie enzymen.
13. De reagens set volgens Conclusie 11,met het kenmerk dat het detector snuffelmolecuul van het test snuffelmolecuul paar dat wordt gebruikt voor de bepaling van de mate van versterking van het dihydrofoliaat reductase of DHFR gen en/of het aantal boodschapper DNA moleculen overeenkomend met dit gen 25 een recombinant plasmide is, omvattend een 0,75 kb HindlII- BglII fragment coderend voor het DHFR gen van het pMTVdhfr plasmide, welk fragment gesubcloneerd is in de pAT153 plasmide vector tussen de restrictieplaatsen van de HindlII enBamHI restrictie enzymen, en waarbij de vanger snuffelmoleculen 30 recombinant fagen zijn omvattende een 1,4 kb HindlII fragment van het MMTV gen gebied van het pMTVdhfr plasmide, welk fragment is gesubcloneerd in de M13 mpl8 en M13 mpl9 faag vectoren op de restrictieplaats van het HindlII restrictie enzym, en waarbij het detector snuffelmolecuul van het standaard snuffelmolecuul paar 35 een recombinant plasmide is bevattende een 1,2 kb EcoRI-Kpnl S7Q 0 483 -i- V· -26- 87302 fragment gelegen in de afleesvolgorde vanaf het promotor gebied van het muis metallothionine gen, welk fragment is gesubcloneerd in het pAT153 plasmide tussen de restrictieplaatsen van de EcoRI en HindlII restrictie enzymen, en waarbij de vanger snuffel-5 moleculen recombinant fagen zijn, omvattend een 0,8 kn Kpnl- BglII· fragment van het metallothionine gen gevormd door het promotor gebied en het gebied in de afleesrichting hierna gelegen, welk fragment is gesubcloneerd in de M13 mpl8 en M13 mpl9 faag vectoren tussen de restrictieplaatsen van de 10 Kpnl en BamHI restrictie enzymen. §700483 * f 87302 . -27- ABSTRACT De uitvinding heeft betrekking op de kwantificering van bepaalde 5 nucleinezuur moleculen, in het bijzonder de mate van versterking van genen en/of overeenkomstige boodschapper RNA moleculen onder toepassing van de sandwich of de oplossings hybridisatie methode, en op de reagens set die hiervoor gebruikt wordt. De bepaling wordt uitgevoerd door vergelijking van het aantal test nucleinezuur 10 moleculen die potentieel aanwezig zijn in verschillende kopieën in gegeven eenheid ten opzichte van het aantal gekozen standaard nucleinezuur moleculen dat gunstigerwijze aanwezig is in een constant aantal per zelfde eenheid. 8700433
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI860836 | 1986-02-27 | ||
| FI860836A FI76119C (fi) | 1986-02-27 | 1986-02-27 | Kvantitativ bestaemning av nukleinsyramolekyler och reagensfoerpackning som anvaends vid foerfarandet. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL8700483A true NL8700483A (nl) | 1987-09-16 |
| NL195097C NL195097C (nl) | 2004-03-17 |
Family
ID=8522222
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL8700483A NL195097C (nl) | 1986-02-27 | 1987-02-26 | Kwantificering van nucleinezuur moleculen en de daarbij gebruikte reagens set. |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62205800A (nl) |
| KR (1) | KR870008033A (nl) |
| AT (1) | AT393511B (nl) |
| AU (1) | AU603562B2 (nl) |
| BE (1) | BE1001168A4 (nl) |
| CA (1) | CA1287558C (nl) |
| CH (1) | CH675593A5 (nl) |
| DD (1) | DD270383A5 (nl) |
| DE (1) | DE3706285A1 (nl) |
| DK (1) | DK174784B1 (nl) |
| ES (1) | ES2061411A6 (nl) |
| FI (1) | FI76119C (nl) |
| FR (1) | FR2594849B1 (nl) |
| GB (1) | GB2187283B (nl) |
| HU (1) | HU201808B (nl) |
| IE (1) | IE66904B1 (nl) |
| IL (1) | IL81695A (nl) |
| IS (1) | IS3197A7 (nl) |
| IT (1) | IT1202581B (nl) |
| LU (1) | LU86792A1 (nl) |
| NL (1) | NL195097C (nl) |
| NO (1) | NO175380C (nl) |
| NZ (1) | NZ219421A (nl) |
| PT (1) | PT84368B (nl) |
| SE (1) | SE468816B (nl) |
| ZA (1) | ZA871401B (nl) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5714380A (en) | 1986-10-23 | 1998-02-03 | Amoco Corporation | Closed vessel for isolating target molecules and for performing amplification |
| IL86724A (en) | 1987-06-19 | 1995-01-24 | Siska Diagnostics Inc | Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences |
| EP0304845A3 (en) * | 1987-08-28 | 1991-03-06 | Profile Diagnostic Sciences Inc. | Method and kit for assaying gene expressions |
| EP0341904B1 (en) * | 1988-05-09 | 1995-03-29 | Temple University of the Commonwealth System of Higher Education | Method for predicting the effectiveness of antineoplastic therapy in individual patients |
| AU629845B2 (en) * | 1988-08-30 | 1992-10-15 | Abbott Laboratories | Detection and amplification of target nucleic acid sequences |
| WO1990014440A1 (en) * | 1989-05-18 | 1990-11-29 | The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce | RNA PROBE FOR DETECTING c-fes mRNA |
| US5232829A (en) * | 1989-09-29 | 1993-08-03 | Hoffmann-La Roche Inc. | Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes |
| DK138090D0 (da) * | 1990-06-06 | 1990-06-06 | Novo Nordisk As | Diagnostisk analysemetode |
| DE69214243T2 (de) * | 1991-09-23 | 1997-02-06 | Pfizer | Verfahren für die Detektion von spezifische mRNS und DNS in Zellen |
| US6300058B1 (en) | 1992-01-29 | 2001-10-09 | Hitachi Chemical Research Center, Inc. | Method for measuring messenger RNA |
| GB9210916D0 (en) * | 1992-05-21 | 1992-07-08 | Isis Innovation | Nucleic acid quantification |
| EP0652971A4 (en) * | 1992-07-28 | 1998-12-02 | Hitachi Chemical Co Ltd | GENE DETECTION SYSTEM. |
| US5580971A (en) * | 1992-07-28 | 1996-12-03 | Hitachi Chemical Company, Ltd. | Fungal detection system based on rRNA probes |
| ES2055661B1 (es) * | 1993-01-20 | 1995-03-01 | Univ Malaga | Determinacion de la expresion genica por captura especifica de arn y su cuantificacion directa por electroforesis capilar en zona libre. |
| GB9309966D0 (en) * | 1993-05-14 | 1993-06-30 | Nordion Int Inc | Detection of prostrate-specific antigen in breast tumors |
| GB9415489D0 (en) * | 1994-08-01 | 1994-09-21 | Nordion Int Inc | Detection of prostate-specific antigen in amniotic fluid |
| AT401062B (de) * | 1994-09-26 | 1996-06-25 | Immuno Ag | Verfahren zur quantifizierung von nukleinsäuren |
| WO2011122034A1 (ja) * | 2010-03-31 | 2011-10-06 | 有限会社山口ティー・エル・オー | 核酸クロマトグラフ法を利用した肺炎原因菌の検出方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4442203A (en) * | 1981-06-30 | 1984-04-10 | Massachusetts Institute Of Technology | Gene amplification assay for detecting tumor promoters |
| FI63596C (fi) * | 1981-10-16 | 1983-07-11 | Orion Yhtymae Oy | Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser |
| EP0103632B1 (en) * | 1982-03-15 | 1990-12-19 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method for introducing cloned, amplifiable genes into eucaryotic cells and for producing proteinaceous products |
| CA1252046A (en) * | 1982-11-04 | 1989-04-04 | Martin J. Cline | Methods for oncogenic detection |
| FI71768C (fi) * | 1984-02-17 | 1987-02-09 | Orion Yhtymae Oy | Foerbaettrade nykleinsyrareagenser och foerfarande foer deras framstaellning. |
| US4675283A (en) * | 1984-07-19 | 1987-06-23 | Massachusetts Institute Of Technology | Detection and isolation of homologous, repeated and amplified nucleic acid sequences |
| FI72146C (fi) * | 1985-01-02 | 1987-04-13 | Orion Yhtymae Oy | Foerfarande foer identifiering av nukleinsyror. |
| FR2583771B1 (fr) * | 1985-06-21 | 1988-12-09 | Centre Nat Rech Scient | Sequences d'adn d'archaebacteries homologues a l'oncogene v-myc, proteines codees par ces sequences, leurs procedes d'obtention et leurs applications immunologiques |
-
1986
- 1986-02-27 FI FI860836A patent/FI76119C/fi not_active IP Right Cessation
-
1987
- 1987-02-25 JP JP62042442A patent/JPS62205800A/ja active Granted
- 1987-02-26 IE IE49687A patent/IE66904B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-02-26 SE SE8700821A patent/SE468816B/sv not_active IP Right Cessation
- 1987-02-26 KR KR870001680A patent/KR870008033A/ko not_active Withdrawn
- 1987-02-26 ZA ZA871401A patent/ZA871401B/xx unknown
- 1987-02-26 DE DE19873706285 patent/DE3706285A1/de active Granted
- 1987-02-26 AT AT431/87A patent/AT393511B/de not_active IP Right Cessation
- 1987-02-26 NO NO870794A patent/NO175380C/no unknown
- 1987-02-26 IT IT19501/87A patent/IT1202581B/it active
- 1987-02-26 NL NL8700483A patent/NL195097C/nl not_active IP Right Cessation
- 1987-02-26 AU AU69275/87A patent/AU603562B2/en not_active Expired
- 1987-02-26 NZ NZ219421A patent/NZ219421A/xx unknown
- 1987-02-26 HU HU87750A patent/HU201808B/hu unknown
- 1987-02-26 PT PT84368A patent/PT84368B/pt unknown
- 1987-02-26 GB GB8704517A patent/GB2187283B/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-02-26 FR FR878702541A patent/FR2594849B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1987-02-26 DK DK198700993A patent/DK174784B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-02-26 BE BE8700177A patent/BE1001168A4/fr not_active IP Right Cessation
- 1987-02-26 CA CA000530691A patent/CA1287558C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-02-26 CH CH756/87A patent/CH675593A5/de not_active IP Right Cessation
- 1987-02-26 LU LU86792A patent/LU86792A1/fr unknown
- 1987-02-26 IS IS3197A patent/IS3197A7/is unknown
- 1987-02-26 ES ES08700776A patent/ES2061411A6/es not_active Expired - Fee Related
- 1987-02-27 DD DD87300286A patent/DD270383A5/de unknown
- 1987-02-27 IL IL81695A patent/IL81695A/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NL8700483A (nl) | Kwantificering van nucleinezuur moleculen en de daarbij gebruikte reagens set. | |
| US5741677A (en) | Methods for measuring telomere length | |
| Hendrix et al. | High prevalence of latently present cytomegalovirus in arterial walls of patients suffering from grade III atherosclerosis | |
| Zipeto et al. | Human cytomegalovirus (CMV) DNA in plasma reflects quantity of CMV DNA present in leukocytes | |
| Nagai et al. | Semiquantitative analysis of telomerase activity in cervical cancer and precancerous lesions. | |
| EA020795B1 (ru) | Генетические маркеры, ассоциированные с ответом на интерферон-альфа | |
| CN112795625B (zh) | 基于crispr技术进行多重核酸检测的方法 | |
| WO2008018305A1 (fr) | Procédé de détection d'une variation et kit à utiliser avec celui-ci | |
| Gan et al. | Telomere amount and length assay | |
| Nakamura et al. | Telomere lengths at birth in trisomies 18 and 21 measured by Q-FISH | |
| KR20110004918A (ko) | 비만 유전자 증폭용 프라이머 세트, 그것을 포함하는 비만 유전자 증폭용 시약 및 그 용도 | |
| US20160090627A1 (en) | Compositions for detecting human interferon-alpha subtypes and methods of use | |
| CN113913498A (zh) | 一种基于crispr技术检测目标突变的方法 | |
| Kalkuhl et al. | p21Ras downstream effectors are increased in activity or expression in mouse liver tumors but do not differ betweenRas-mutated andRas-wild-type lesions | |
| Minkley Jr | Transcription of the early region of bacteriophage T7: specificity and selectivity in the in vitro initiation of RNA synthesis | |
| CN113930501A (zh) | 人egfr基因突变的数字pcr检测方法及应用 | |
| KR101068605B1 (ko) | Ｎａｔ2 유전자 증폭용 프라이머 셋트, 그것을 포함하는 ｎａｔ2 유전자 증폭용 시약 및 그 용도 | |
| Cui et al. | FISH—in Routine Diagnostic Settings | |
| RU2843693C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфизма rs2074238 в гене KCNQ1 и набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для его реализации | |
| Chen et al. | Diagnosis of human cytomegalovirus intrauterine infection using fetal cells from maternal blood | |
| Merzouki et al. | Accurate and differential quantitation of HIV-1 tat, rev and nef mRNAs by competitive PCR | |
| KR100675403B1 (ko) | 시험관내 임신성 당뇨의 측정방법 및 측정용 키트 | |
| KR100705746B1 (ko) | 사람파필로마바이러스의 검출을 위한 프라이머 | |
| CN120924724A (zh) | 用于评估受试者隐匿性hbv感染风险的模型构建方法及设备和应用 | |
| Crockford | Partial characterisation of pilchard herpesvirus and the associated disease in pilchards |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BA | A request for search or an international-type search has been filed | ||
| BB | A search report has been drawn up | ||
| BC | A request for examination has been filed | ||
| CNR | Transfer of rights (patent application after its laying open for public inspection) |
Free format text: SANGTEC MEDICAL AB |
|
| CNR | Transfer of rights (patent application after its laying open for public inspection) |
Owner name: SANGTEC MOLECULAR DIAGNOSTICS AB |
|
| NP1 | Patent granted (not automatically) | ||
| V4 | Discontinued because of reaching the maximum lifetime of a patent |
Effective date: 20070226 |