NL8303978A

NL8303978A - Enzymatische synthese van l-serine.

Info

Publication number: NL8303978A
Application number: NL8303978A
Authority: NL
Original assignee: Genex Corp
Priority date: 1982-11-19
Filing date: 1983-11-18
Publication date: 1984-06-18
Also published as: IT8368213A0; FI834231A7; DK529583A; SE8306351L; LU85096A1; AU2149383A; SE8306351D0; GB2130216B; GB2130216A; IL70271A0; FR2536415B1; FR2536415A1; BR8306301A; GB8330859D0; DE3341763A1; ES527388A0; PL244608A1; FI834231L; DK529583D0; ZA838642B

Description

- -1- * VO 5235

Enzymatische synthese van L-serine.

De uitvinding betreft een werkwijze voor het synthetiseren van het aminozuur L-serine. Het aminozuur L-serine is een waardevol handelsprodukt dat wordt gebruikt in hyperalimentatie en voedings-preparaten en tevens wordt gebruikt als tussenprodukt of uitgangs-5 materiaal voor diverse synthetische werkwijzen. Er bestaat dus vraag naar L-serine en diverse werkwijzen zijn ontwikkeld voor de produktie daarvan. Een aantal van deze werkwijzen omvat de produktie vein L-serine door een fermentatie. Zie bijvoorbeeld Agric. Biol. Chem. 45(6)1419-24 (1981); ibidem 45(6) 1425 - 1430 (1981) en Amerikaans octrooischrift 10 3.616.224; deze literatuurplaatsen beschrijven alle een werkwijze voor het bereiden van diverse aminozuren met inbegrip van serine, door fermentatie van diverse bacteriestammen, welke worden gekweekt op voedingsbodems die methanol als koolstofbron bevatten; zie eveneens Amerikaanse octrooischrift 3.943.038, dat een werkwijze beschrijft voor het berei-15 den van serine en andere aminozuren door het kweken van specifieke stammen van diverse bacteriën in een waterig medium en wel bij aanwezigheid van zuurstof, waterstof en kooldioxyde.

Een algemeen gebrek bij de fermentatiemethoden volgens de stand van de techniek is dat de concentratie van het in de voedingsbodem ge-20 produceerde L-serine laag is en dus relatief weinig serine kan worden gewonnen, zelfs na een betrekkelijk lange fermentatie.

Serine kan tevens langs chemische weg worden bereid, zie bijvoorbeeld Kanedo: Synthetic Production and Utilization of Amino Acids, Halsted Press Books (1974). vaak leveren deze chemische methoden serine 25 als een racemisch mengsel van de optische D-en L-isomeren of in de vorm van het minder gewenste D-isomeer. DL-mengsels moeten worden gescheiden met behulp van D-serine verbruikende bacteriën, serine-racemase, door L-aminozuur-acylase, fractionele kristallisatie van serine derivaten of overeenkomstige methoden, waardoor het produkt duurder wordt.

30 Het is bekend, dat L-serine uit glycine kan worden verkregen.Een biologische produktie van L-serine uit glycine is bereikt met diverse micro-organismen, zie bijvoorbeeld J. Ferment. Technol. 59_ 447 (1981). Evenals bij de fermentatie-methoden is het nadeel van deze bekende methode , dat de opbrengst aan L-serine niet erg hoog is.

35 Er bestaat dus behoefte aan een methode voor het synthetiseren 8303378

* - V

-2- van L-serine in hoge opbrengsten. De uitvinding betreft een werkwijze voor het synthetiseren van L-serine waarbij dit serine in hoge concentraties en in oplossing wordt gevormd, waaruit het op een effectieve wijze kan worden gewonnen.

5 Tevens betreft de uitvinding enzymmiddelen voor het produceren van L-serine, waarbij de reactie kan worden uitgevoerd als charge-gewijze werkend of geïmmobiliseerd systeem.

Gevonden werd, dat L-serine effectief uit. glycine en formaldehyde kan worden gesynthetiseerd bij aanwezigheid van bio-katalytische 10 hoeveelheden van hetenzym serine-hydroxymethyltransferase en de co-factor tetrahydrofolaat onder serine-producerende voorwaarden. Het enzym kan aanwezig zijn in gehele cellen, als ruw extract of als gezuiverd enzym en kan al of niet in geïmmobiliseerde vorm optreden.

Het is bekend, dat het enzym serine-hydroxymethyltransferase 15 (hieronder aangeduid als SHMT)de splitsing van serine tot glycine katalyseert in een reactie die afhankelijk is van de co-factoren pyridoxal-5'-fosfaat en tetrahydrofolaat. Deze reactie levert glycine en methyleen-tetrahydrofolaat op. (zie Advances in Enzymology 53_, 83 (1982). Er werd nu gevonden,dat het SHMT enzym effectief kan worden 20 gebruikt als een bio-katalysator voor de praduktie van L-serine uit glycine en formaldehyde. De reactie vindt plaats bij aanwezigheid van de co-factor tetrahydrofolaat (THF). De THF-bron kan dezelfde bron zijn als die voor het SHMT, omdat THF ook in micro-organismen wordt gevonden die SHMT bevatten, maar het THF kan ook uit andere bron af-25 komstig zijn. Een voordeel van deze methode is dat slechts het optische L-serine isomeer wordt geproduceerd. Een verder voordeel is, dat na afloop van de reactie de afvoer van de reactor slechts glycine en L-serine bevat en geen complex mengsel zoals men mag verwachten bij een · fermentatie-vloeistof of als gevolg van een chemische synthese.

30 Het was verrassend, dat L-serine uit glycine en formaldehyde kon worden gesynthetiseerd want van formaldehyde is bekend, dat het chemisch met eiwitten reageert en enzymen inactiveert, Advances in Protein Chemistry .2,277-335 (1945) . In werkelijkheid wordt SHMT ook snel door formaldehyde geïnactiveerd, maar gevonden werd, dat het enzym kan 35 worden beschermd door toevoeging van een overmaat tetrahydrofolaat aan het reactiemengsel. Dit THF reageert met het formaldehyde, waardoor het enzym wordt beschermd.

< 83 0 3 9 7 8 f. ƒ 1^* -3-

Chemische modificatie van SHMT levert eveneens stabiliteit en bescherming tegen formaldehyde -inactivering op. Bijvoorbeeld werd gevonden, dat een reactie van imidoësters met amino-groepen (Chemical Modification of Proteins, Holden-Day, Ine., 1971) op het enzymoppervlak 5 het mogelijk maakt dat het enzym bij aanwezigheid van hogere concentraties aan formaldehyde kan functioneren, dan een niet-gemodificeerd enzym.

De enzymatische weg die naar alle waarschijnlijkheid leidt tot het onderhavige L-serine luidt aldus:

10 formaldehyde + THF ^ ^ methyleen-THF

SHMT -Λ

methyleen THF + glycine ^- L-serine + THF

Bij voorkeur wordt de reactie uitgevoerd onder anaerobe voor-15 waarden, bij voorbeeld een stikstofatmosfeer om een oxydatie van THF tegen te gaan.

De substr'aten, het SHMT, en de co-factor, THF, kunnen op verschillende wijze tezamen reageren. Hoewel de volgorde waarin reactanten . . en katalysatoren worden toegevoerd niet kritisch is, worden bij voor-

20. keur glycine en formaldehyde langzaam aan SHMT bij aanwezigheid van THF toegevoegd. De reactie wordt uitgevoerd onder L-serine producerende voorwaarden. Wanneer het E.coli SHMT gen (glyA) als bron voor SHMT wordt gebruikt, omvatten deze voorwaarden gewoonlijk een reactietemperatuur tussen 4 en 60°C en een pH tussen 4 en 11. De voorkeursreactie-voor-25 waarden omvatten een uitvoering van de reactie bij 20 - 45°C en een pH

van 6 - 8,5. Indien de temperatuur beneden 4°C is gelegen, verloopt de o re’actie zeer langzaam en indien de temperatuur boven 60 C komt kan het enzym worden gedenatureerd. Zo ook zal een pH beneden 4 of boven 11 het enzym inactiveren. SHMT is een enzym dat centraal staat in het metabo-30 lisme van micro en hogere organismen; er bestaan dus diverse mogelijke bronnen voor dit enzym. De voorwaarden-trajecten waaronder de reactie L-serine produceert, hangen van de enzymbron af. Bij voorbeeld kunnen enzymen uit thermofiele micro-organismen bij hogere temperaturen worden gebruikt dan indien de bron E.coli is.

35 Het serine-hvdroxymethyltransferase kan de vorm hebben van gehele cellen, ruw extract of een gezuiverd enzym. Het enzym kan worden toege- 8303378 . -4- ♦ % past in een geïmmobiliseerde of niet-geimmobiliseerde vorm. Het enzym wordt toegepast in hoeveelheden die voldoende zijn voor een goede katalyse van de reactie.

Het enzym kan worden verkregen uit micro-organismen die op ge-5 bruikelijke wijze wat betreft genetisch behandelen zijn gemodificeerd voor het produceren van hoge opbrengsten; zie Gene 15,63-72 (1981).

Het SHMT gen (glyA) kan worden geïsoleerd en gekloond in een plasmide dat vervolgens kan worden gebruikt voor een passende transformatie van gastheercellen resulterend in een hoog niveau aan SHMT. Mutant 10 micro-organismen die zijn gemodificeerd wat betreft hun methionine metabolisme zullen eveneens het SHMT overproduceren(Genetics 88, 221 (1978) en J. Bacteriol. 129 , 740 (1977)) Onder toepassing van de gen-kloon technieken is de enzymactiviteit tot twintig-voudig verhoogd en deze activiteit kan overeenkomen met meer dan tien procent van 15 het oplosbare eiwit in de cellen. Een E,coli-stam (Gxl703) getransformeerd met een dergelijk plasmide, m.n. een derivaat van pBR322 waarin het glyA-gen was gekloond, pGxl22, is gedeponeerd bij het NREL te Peoria, Illinois onder No. B-15215. Een Klebsiella aerogenes-stam (Gxl704) getransformeerd met een overeenkomstig maar kleiner plasmide met een 20 verandering die een hoog copie-nuramer veroorzaakt, pGXl39, is gedepo- . neerd bij het ATCC in Rockville, Maryland onder No. 39214 en een Salmonella typhimurium-stam (Gxl682) getransformeerd met pGxl39 is gedeponeerd als ATCC 39215.

Wanneer voorts - het gen wordt genomen uit een monster zoals i 25 E.coli kan het 'worden gemodificeerd door een willekeurige of plaats- gerichte mutagenese ter produktie van een enzym met verbeterde stabiliteit. Ook kan het gen volledig chemisch worden gesynthetiseerd met diverse wijzigingen ter verbetering van de enzymstabiliteit tijdens het onderhavige procédé.

30 Bij toepassing van gehele cellen kunnen deze tevens een bron vormen voor THF. Desgewenst kan extra THF worden toegevoegd voor het bereiken van verzadigingsniveaus, die afhankelijk zijn van pH en temperatuur. Bijvoorbeeld bij een pH van 7,5 en een reactietemperatuur van circa 37°C kan in een waterige oplossing THF worden toegevoegd tot 35 een concentratie die duidelijk hoger is dan 50 mM. De pH moet worden geregeld terwijl het THF in oplossing gaat. Indien het SHMT als ruw extract of als gezuiverd enzym wordt toegevoegd is een onafhankelijke 8303978 . * -* -5- THF bron nodig. De hoeveelheid THF die kan worden toegevoegd varieert met de temperatuur, oplosvoorwaarden en de pE waarbij de reactie verloopt.

Tevens is ontdekt, dat THF zijn activiteit jegens SHMT bij 5 immobilisatie behoudt. Immobilisatie van THF door het te hechten op een drager, die in een bioreactor voor het uitvoeren van de reactie % wordt aangebracht is gunstig, want hierdoor kan de co-factor vele malen herhaald worden gebruikt nadat de synthese van L-serine volledig is. Bijvoorbeeld kan THF worden geïmmobiliseerd met oplosbare polymeren, 10 zoals dextran, polyethyleen glycol of polyethyleenimine. Immobilisatie vindt plaats met behulp van een covalente hechting in de eerste twee gevallen en door een ionische interactie in het derde geval. Covalente aanhechting geschiedt gewoonlijk via de carboxylgroepen van het THF met een aminogroep van de drager. Ook kan onder toepassing van overeen-15 komstige aanhechtingsmethoden het THF op een onoplosbare drager worden gehecht. Ook is het mogelijk, indien serine chargegewijs wordt bereid het THF te recirculeren. Bijvoorbeeld kan na vorming van het L-serine de reactie-oplossing door geactiveerde kool worden geleid of door een ionen-uitwisselaar, die het THF vasthoudt en scheidt van de 20 L-serine-produkt-oplossing. Het THF kan vervolgens weer worden vrijgesteld en geneutraliseerd. OOk kan het THF door covalente aanhechting aan een klein molecule, zoals een glucosamine worden gemodificeerd om het terugwinnen van de co-f actor te vergemakkelijken. Nadat het L-serine is gevormd wordt de reactie-oplossing over een boraatkolom ge-25 leid- Dit boraat bindt slechts het THF-glucosamine, en het gemodificeerde THF kan worden vrijgesteld en gerecirculeerd.

Glycine en formaldehyde worden bij voorkeur aan het tetrahydro-folaat-SHMT mengsel toegevoegd. De hoeveelheid glycine die kan worden toegevoegd varieert met de pH, de temperatuur , de oplosvoorwaarden 30 bij de reactie maar over het algemeen kan het worden toegevoegd tot het verzadigingsniveau is bereikt.

Als eerder gezegd kan formaldehyde zeer giftig zijn voor SHMT.

Het formaldehyde wordt daarom gewoonlijk langzaam aan de andere compo-< nenten toegevoegd en deze toevoeging geregeld. Het formaldehyde wordt 35 toegevoegd in een hoeveelheid die voldoende is om de enzymatische activiteit te behouden, gewoonlijk tot het handhaven van een concentratie van ten hoogste 10 mM hoger dan de gebruikte THF-concentratie, S3C3978 -6- hoewel het formaldehyde kan worden toegevoegd tot een concentratie die 50 mM hoger is dan de gebruikte THF concentratie. Hoe groter de THF-concentratie in het systeem, des te hoger kan de formaldehyde-concentratie worden gehouden, want het THF reageert in gunstige zin 5 met het formaldehyde, waardoor het SHMI-enzym wordt beschermd. Het mechanisme van de reactie van THF met formaldehyde is beschreven in J. Biol. Chem. 241 (24), 5851-63 (1966). Hoe hoger de enzym-activiteit in de reactor, des te sneller kan het formaldehyde worden toegevoegd voor het handhaven van de gewenste concentratie.

10 Tevens is ontdekt dat het gunstig kan zijn een tweede SEMI! co- factor toe te voegen, te weten pyridoxal-5'-fosfaat. Dit pyridoxal-51' fosfaat wordt hecht aan het enzym gebonden. Indien L-serine in een reactor gedurende een lange tijd wordt gevormd, kan het pyridoxalfosfaat te loor gaan of worden geïnactiveerd, in welk geval verder pyridoxal-15 fosfaat kan worden toegevoegd. Verlies aan co-factor tijdens de synthese wordt aangegeven door het verloren gaan van de gele kleur van de reactie-oplossing en verlies aan activiteit door het serine-hydroxy-methyltransferase. De concentratie aan pyridoxalfosfaat toegevoegd aan de reactie kan variëren van 0 tot circa 20 mM, naar behoefte en ligt 20 bij voorkeur tussen 0,1 mM en 1 mM.

De toevoeging van overmaat pyridoxalfosfaat kan nog een verdere functie hebben. Gevonden is namelijk, dat in sommige micro-organismen die door plasmiden met glyA-gen zijn getransformeerd en hogeae niveaus aan SHMT bezitten, de toevoeging van pyridoxal-51-fosfaat nodig is om 25 het aanwezige SHMT te verzadigen en de waargenomen enzymactiviteit te verhogen. Een dergelijk micro-organisme is Klebsiella aerogenes met het plasmide pGxl39 dat hierboven reeds is genoemd.

De vormingsreactie kan worden uitgevoerd bij aanwezigheid van ieder niet-schadelijk oplosmiddel. Voorbeelden van dit soort op-30 losmiddelen zijn ethanol, methanol, isopropanol en dioxan.

De volgende voorbeelden lichten de uitvinding nader toe.

Voorbeeld I.

Bacteriestammen met en zonder plasmide pGxl39 werden gekweekt in een LB-medium (10 g/liter bacto _trvpton, 5 g/liter gistextract, 5 g/liter 35 NaCl) of een minimum medium (10,5 g/liter K^HPO^, 4,5 g/liter KH^PO^, 1,0 g/liter ammoniumsulfaat en 0,5 g/liter natriumcitraat. 2Η^Ο), 8303978 ^ Λ -7- aangevuld met 0,4 % glucose of lactose. Aminozuren werden toegevoegd tot 3 3 20 ug/cm en vitaminen tot 1 ug/cm waar aangegeven. De specifieke activiteit van de serine hydroxymethyltransferase is uitgedrukt in nmol g.-rfenylserine omgezet in benzaldehyde en glycine per minuut per 5 mg extraheefbaar eiwit na een sonificatie van de cellen. De analyses werden uitgevoerd in 50 mM fosfaatbuffer met pH 7,3 met 0,1 mM pyridoxalfosfaat en bij 35 mM 6-fenylserine bij 20eC. Het verschijnen van benzaldehyde werd met een spectrofotometer met recorder bij 279 nM nagegaan.

8303978 -8-

SHMT

Specifieke Activiteit (nmol/min/mg)

Minimum

St-am Plasmide LB-medium Medium Toeslagstoffen 5 EoCOli GX1698 - 39 N.D.* GX1671 pGxl39 221 N.D.

GX1703 pGxl39 141 533 glucose, 10 fenylalanine, thiamine GX1703 pGxl22 218 682 glucose, f-enylalanine, thiamine 15 Salmonella typhimurium LT2 GX1682 - 28 10 glucose trypto fan 17 lactose, tryptc.fan 20 GX1682 pGxl39 152 133 glucose, trypto fan 306 lactose, tryptofan >

Klebsiella aerogenes 25 GX1704 - 36 N.D.

GX1704 pGxl39 590 114 glucose 223 108 lactose - a*™ . Genotype 30 E .coli GX1698 trpEA , tna2, serB , laclq ts 402 GX1671 thi, ara, strR, glyA, [serB trpR] , laclql, lacZ:: tn5

35 GX1703 ^ glyA, pheA, thi, lac , ara, strR

8303978 -9-

Salmonella typhimurium LT 2 <3X1682 trpBEDC43 F" laclq ts 420 pro

Klebsiella aerogenes GX1704 lsd (L-serine deaminase mutant) 5 * niet bepaald.

E.coli stam GX1671 met daarin het plasmide pGxl39, is een representatieve verdere stam die gebruikt is als SHMT-bron bij de uitvinding. Voorbeeld II.

Een kolonie van Escherichia coli stam GX 1703 (met pGxl22), 10 gedeponeerd bij het NRRL onder B.15215 werd geënt op 100 cm^ voedingsbodem I , die hieronder is beschreven en vervolgens een nacht bij 37°C geschud.

Voedingsbodem I: 15 K2EP04 10,5 g/1 KH2P04 4,5 g/1 (nh4)2so4 1 g/1 natriumcitraat - 2H20 0,5 g/1 fenylalanine 20 ug/ml 20 vitamine B^ 1 ug/ml ampicilline 100 ug/ml

MgS04 2 mM

FeS04 5 mg/ml 25 De cellen werden door centrifugeren gewonnen en als enzym bron gebruikt. Glycine (12mM, uiteindelijke concentratie) werd gemengd met tetrahydrofolaat (5 mM, uiteindelijke concentratie), pyridoxalfosfaat vimM), en formaldenyde (10 mM, uiteindelijke concentratie) onder een stikstof afdekking. De pH werd met 0,1 M kaliumfosfaatbuffer op pH 7,6 30 gehouden en het uiteindelijke volume van het reactiemengsel bedroeg 100 cm^. De reactie werd op gang gebracht door de bovengenoemde reactie- o oplossing en de cellen bij 37 C te mengen en vervolgens te schudden.

Na 8 uren was 5 mM serine geproduceerd (de opbrengst bedroeg 45 % berekend cp het glycine) .Alle enzymactiviteit was behouden gebleven.

35 Glycine en serine-concentraties werden bepaald onder toepassing van vloeistof chromatografie.

§303978 -10-

Voorbeeld III.

Een kolonie van Klebsiella aerogenes stam GX1704 (met pGxl39), gedeponeerd bij het ATCC onder No, 39214, werd geënt in 100 cm^ voedingsbodem II die hieronder is beschreven en een nacht bij 30°C geschud.

5

Voedingsbodem II.

Trypton 10 g/1

NaCl 10 g/1

Gistextract 5 g/1 10 Glucose 10 g/1

De cellen werden door centrifugeren gewonnen en als enzymbron gebruikt.

De procedure van voorbeeld I voor het produceren van het serine 15 werd gevolgd met dit verschil dat Klebsielle aerogenes in plaats van E. coli werd gebruikt. Na 8 uren bleek 7 mM serine te zijn geproduceerd (deze opbrengst bedroeg 64 % berekend op glycine). Alle enzymactiviteit bleef behouden.

Voorbeeld IV.

20 Voorbeeld I werd herhaald met dit verschil, dat een gedeeltelijk gezuiverde serine—hydroxymethyltransferase uit E.coli (stam GX1703) werd toegepast. De cellen werden verbroken door sonificeren bij 4°C. De bovenstaande vloeistof na centrifugeren werd gemengd met ammonium-sulfaat (50 % verzadiging) bij 4°C en pH 7,5. Na verwijdering van het vaste mate-25 riaal door centrifugeren werd het enzym uit de oplossing gehaald door het ammonium-sulfaat-gehalte tot 100 % verzadiging te verhogen. Het enzym werd hierna opgevangen door centrifugeren en vervolgens gedialyseerd.

10 mM serine werd na 4 uur reageren hiermee geproduceerd. De opbrengst bedroeg 90 % berekend op glycine. Alle enzymactiviteit bleef behouden.

30 Voorbeeld V.

Voorbeeld III werd herhaald met dit verschil, dat de aanvankelijke glycine concentratie 340 mM bedroeg en het formaldehyde (oorspronkelijke 3 concentratie 2M) met een snelheid van 1 cm per uur werd ingeleid. Na 12 uren was 119 mM serine geproduceerd.

35 Voorbeeld VI.

Voorbeeld III werd herhaald met dit verschil, dat het glycine (oorspronkelijke concentratie 2M) en het formaldehyde (oorspronkelijke 8303978 -11- concentratie 2M) met dezelfde snelheid van 1 cm^ per uur werden toegeleid. Na 5 uren was 57 mM serine bereid.

Voorbeeld VII.

Voorbeeld III werd herhaald met dit verschil, dat de THF werd 5 gemodificeerd. 5 g dextran, Pharmacia T40 werd opgelost in water tot een uiteindelijke concentratie van 5 %. Deze dextran-oplossing werd geoxydeerd met 0,1 M NalO^ en wel gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Het geoxideerde dextran werd neergeslagen door ethanol toe te voegen tot 60 volume %. Deze trap werd tweemaal herhaald. Het geoxydeerde 10 dextran werd opgelost in 110 cm^ 0,2 Μ 1,6-hexaandiamine (HMD) bij pH 9,0. 0,2 g natrium-boorhydride werd respectievelijk na 30 en 60 minuten toegevoegd. HMD-dextran werd een nacht tegen water gedialyseerd en vervolgens gelyofiliseerd. 5 mM THF werd gemengd met 10 mM l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyD-carbodiimide en 0,5 % HMD-dextran bij pH 7,0 onder 15 stikstof atmosfeer. Het gevormde neef slag werd af gecentrifugeerd en twee maal .met 0,5 M NaCl-oplossing gewassen. Het vaste THF werd met het reactiemengsel gemengd, zoals is beschreven in voorbeeld III. Na 3 uren reageren was 7 mM serine geproduceerd.

8303978

Claims

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de tempera tuur wordt gehouden tussen 4° en 60°C en de pH tussen 4 en 11.
3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de temperatuur tussen 20° en 45°C is gelegen en de pH tussen 6 en 8,5.
4. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het serine- 10 hydroxymethyltransferase zich in gehele cellen bevindt. • 5. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het serine-hydroxymethyltransferase de vorm heeft van een ruw extract.
6. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het serine-hydroxymethyltransferase de vorm heeft van een gezuiverd enzym.
7. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het serine- hydroxymethyltransferase is geïmmobiliseerd.
8. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de reactie chargegewijs wordt uitgevoerd.
9. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de reactie 20 als continu systeem wordt uitgevoerd.
10. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de tetra-hydrofolaat-bron wordt gevormd door gehele microbecellen met daarin serine-hydroxymethyltransferase. II. Werkwijze volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat extra 25 tetrahydrofolaat wordt toegevoegd aan het reactiesysteem ter verhoging van de tetrahydrofolaat-concentratie tot een maximum van het verzadigings-niveau.
12. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de concentratie aan tetrahydrofolaat is gelegen tussen 0,15 en 50 mM.
13. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het tetra hydrofolaat is geïmmobiliseerd.
14. Werkwijze volgens conclusie 13, met het kenmerk, dat het tetrahydrofolaat is geïmmobiliseerd met een oplosbaar polymeer. 8305978 -13-
15. Werkwijze volgens conclusie 13, met het kenmerk, dat het tetra-hydrofolaat is geïmmobiliseerd door hechting op een vaste drager.
16. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het tetra-hydrafolaat aldus is gemodificeerd, dat het kan worden gerecirculeerd.
17. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het glycine kan worden toegevoegd tot de reactie-oplossing met glycine is verzadigd.
18. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat formaldehyde wordt toegevoegd tot een maximum concentratie van circa 30 mM tot 50 mM hoger dan de jgp-concentratie.
19. Werkwijze volgens conclusie 18, met het kenmerk, dat de concen tratie aan formaldehyde op een vast niveau wordt gebracht van circa 10 mM hoger dan de THF-concentratie.
20. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat pyridoxal fosfaat aan de reactanten wordt toegevoegd en wel in een concentratie 15 van 0 tot circa 20 mM.
21. Werkwijze volgens conclusie 20, met het kenmerk, dat de pyridoxal fosfaat-concentratie is gelegen tussen 0,1 en 1,0 mM.
22. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de SHMT-bron wordt gevormd door Escherichia coli-stam GX1703, met daarin plasmide 20 pGx 122, gedeponeerd bij het NEEL onder No. B-15215.
23. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de SHMT-bron wordt gevormd door Salmonella typhimurium-stam Gx 1682 met daarin plasmide pGx 139, gedeponeerd bij de ATCC onder No. 39215.
24. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de SHMT-bron 25 wordt gevormd door Klebsiella aerogenes-stam GX1704, met daarin plasmide pGx 139, gedeponeerd bij de ATCC onder No. 39214.
25. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de serine -hydroxymethyltransferase-activiteit in de cellen verhoogd is door genetisch manipuleren.
26. Werkwijze volgens conclusie 1,- met het kenmerk, dat de serine- hydroxyraethyltransferase-activiteit in de cellen verhoogd is door klonen van het serine-hydroxymethy1transferase gen in een plasmide en transformatie van een gastheercel met dit plasmide tot een overproduk-tie van serine-hydroxymethyltransferase.
27. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het serine- hydroxymethyltransferase wordt verkregen uit een willekeurige biologische bron. 8303973 * -14-
28. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het serine -hydroxymethyl transferase gen werd gewijzigd door een willekeurige mutagenese of een plaatsgerichte mutagenese ter verhoging van de enzym-stabiliteit.
29. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het serine hydroxymethyltransferase enzym, chemisch is gemodificeerd ter verhoging van de enzymstabiliteit.
30. Werkwijze volgens conclusie 29, met het kenmerk, dat het enzym is gemodificeerd door een behandeling met imidoësters.
31. Een nagenoeg biologisch zuivere cultuur van Escherichia coll-stam GX1703 met daarin plasmide pGx 122.
32. Een nagenoeg biologisch zuivere cultuur van Salmonella typhimu-rium-stam GX1682 met daarin plasmide pGx 139.
33. Een nagenoeg biologisch zuivere cultuur van Klebsiella aerogenes-15 stam GX1704 met daarin pGx 139. 8303978