NL8202881A

NL8202881A - Gamma-globulin mfr. for intravenous injection to treat infections - involves treatment with pepsin or uropepsin enzymes at neutral ph to reduce anti-complement side-effects

Info

Publication number: NL8202881A
Application number: NL8202881A
Authority: NL
Original assignee: Mochida Pharm Co Ltd
Priority date: 1982-07-15
Filing date: 1982-07-15
Publication date: 1984-02-01

Abstract

Prodn. of gamma-globulin, suitable for intravenous injection, comprises treating the gamma-globulin with the enzyme pepsin or uropepsin, at a pH of 6.0-7.5, pref. 6.5-7.0. Pref. both the gamma-globulin and the enzyme are of human origin. Therapeutic agents contg. a gamma-globulin and human uropepsin or uropepsinogen as stabiliser are also claimed. Pref. 0.01-5%, esp. 0.1-1%, of enzyme is used. Used for prophylactic and therapeutic treatment of bacterial and viral infections by intravenous injection of gamma-globulin. Gamma-globulin purified by known methods produces serious side-effects (sudden reduction of blood pressure, chilling, vomitting, pyrexia, cyanosis and shock) when administered intravenously. Treatment of the purified gamma-globulin by known methods (e.g. treatment with proteolytic enzymes (pepsin)) to avoid the side-effects due to complement activation give a product with a very short half-life. The present treatment, with pepin or uropepsin at neutral pH, gives a product suitable for intravenous injection, with a long circulatory half-life and with retention of the opsonic activity of the gamma globulin.

Description

ƒ ^-v>, , "4 ' * ƒ t VO 3527ƒ ^ -v>,, "4 '* ƒ t VO 3527

Werkwijze voor het "bereiden van /w-'globuline voor een intraveneuze injectie en aldus verkregen geneesmiddel.Method for preparing / g-globulin for an intravenous injection and drug thus obtained.

De uitvinding betreft een werkwijze voor het bereiden van globuline voor intraveneuze injecties.The invention relates to a method of preparing globulin for intravenous injections.

dT-globuline is uitgebreid toegepast voor een profylaxe en een therapie van ziekten veroorzaakt door diverse virus- en bacteriesoor-5 ten. Het werd daarbij evenwel slechts int ramus culair toegediend, omdat intraveneuze toediening ernstige nevenreacties kan opwekken, zoals een plotselinge—verlaging van de bloeddruk, afkoeling, braken, pyrexie, cyanose of shock. Om de antilichaamtiter in bloed snel te verhogen is het klinisch evenwel gunstiger y*-globuline intraveneus te injec-10 teren dan int ramus culair, omdat een kleine dosis Y*-globdine intraveneus effectiever is dan intramusculair. Intramusculaire injectie is tevens om andere redenen ongewenst: daarbij kan een lokale ontleding van tf-globuline 0p de injectieplaats optreden, terwijl een intramus-culaire injectie van een grote hoeveelheid ^-globuline ook lokale 15 pijn of ontsteking van de spier kan veroorzaken.dT globulin has been extensively used for prophylaxis and therapy of diseases caused by various virus and bacterial species. However, it was only administered intramuscularly, since intravenous administration can cause serious side reactions, such as a sudden drop in blood pressure, cooling, vomiting, pyrexia, cyanosis or shock. However, in order to rapidly increase the antibody titer in blood, it is clinically more beneficial to inject y * globulin intravenously than int ramuscular, because a small dose of Y * globdine intravenously is more effective than intramuscularly. Intramuscular injection is also undesirable for other reasons: local decomposition of TF globulin at the injection site may occur, while intramuscular injection of a large amount of β-globulin may also cause local muscle pain or inflammation.

De ongunstige reacties^veroorzaakt door een intraveneuze toediening van ïf-globuline worden gewoonlijk verklaard doordat een deel van de -globulinemoleculen tijdens hun zuivering aggregeren en deze aggregaten een niet specifieke complementactivering in de bloedstroom 20 opwekken, die verschillend is van een antigeen-antilichaamreactie.The adverse reactions caused by intravenous administration of β-globulin are usually explained by the fact that some of the globulin molecules aggregate during their purification and these aggregates elicit nonspecific complement activation in the bloodstream different from an antigen-antibody response.

Er zijn daarom diverse pogingen gedaan een werkwijze te vinden voor het bereiden van J^-globuline, dat zonder activering van complement kan worden toegediend, d.w.z. een V -globuline met een verminderde arnti-complementaire activiteit, die geen ongunstige nevenreacties opwekt.Therefore, various attempts have been made to find a method for preparing J-globulin which can be administered without complement activation, i.e. a V-globulin with reduced antibody complement activity, which does not elicit adverse side reactions.

25 Diverse methoden zijn voorgesteld voor het maken van dit soort globuline , b.v. (1) een gedeeltelijke afbraak van V-globuline met een proteolytisch enzym (Vox Sang., 33, 92 (196?) en Int. Arch. Allergy, 31, 380 (1967); (2) chemische modificatie van if-globuline, Vox Sang., 28, k22 (1975); (3) verwijdering van de aggregaten uit Γ-globuline, 8 2 0 2 8 8 1 --------------------------------------- #' * - 2 -Various methods have been proposed for making this type of globulin, e.g. (1) partial degradation of V-globulin with a proteolytic enzyme (Vox Sang., 33, 92 (196?) And Int. Arch. Allergy, 31, 380 (1967); (2) chemical modification of if-globulin, Vox Sang., 28, k22 (1975); (3) removal of the aggregates from Γ-globulin, 8 2 0 2 8 8 1 -------------------- ------------------- # '* - 2 -

Amerikaans octrooischrift 1*.093.606 en de Japanse octroóipublikaties 81519/7¾ en 101.516/7¾; (¾) toevoeging van een of meer stoffen voor het tegengaan van een regeneratie van aggregaten in ^-globuline, dat van aggregaten is bevrijd, Japanse octrooipublikaties 91321/76 en 5 1+7515/78; of (5) toevoeging van een of meer stoffen die de aggregaten in ^-globuline kunnen dissociëren en" tegelijkertijd een regeneratie van aggregaten tegengaan, Japanse octrooipublikatie 20121+/79· Van deze methoden is de ontleding van J^-globuline met een proteolytisch enzym als pepsine of piasmine ter vermindering van zijn anticomplementaire 10 activiteit het eerst voorgesteld en lange tijd als een effectieve methode voor praktische doeleinden beschouwd. Deze methode verlaagt echter de opsonische activiteit van Γ-globuline omdat deze enzymen een gedeeltelijke ontleding van zijn moleculaire structuur teweegbrengen. Bovendien is bekend, dat bij gebruik van pepsine als proteoly-15 tisch enzym het gevormde Jf-globuline een bijzonder korte halveringstijd heeft in de bloedstroom.U.S. Patent 1,093,606 and Japanese Patent Publications 81519 / 7¾ and 101,516 / 7¾; (¾) addition of one or more substances to prevent regeneration of aggregates in β-globulin which has been liberated from aggregates, Japanese Patent Publications 91321/76 and 5 1 + 7515/78; or (5) addition of one or more substances capable of dissociating the aggregates into β-globulin and "simultaneously preventing aggregate regeneration, Japanese Patent Publication 20121 + / 79 · Of these methods, the decomposition of β-globulin with a proteolytic enzyme first proposed as pepsin or piasmin to reduce its anti-complementary activity and long regarded as an effective method for practical purposes, however, this method decreases the opsonic activity of glo-globulin because these enzymes cause partial decomposition of its molecular structure. It is known that when pepsin is used as a proteolytic enzyme, the Jf globulin formed has a particularly short half-life in the bloodstream.

Er werd nu een werkwijze gevonden voor het bereiden van een Γ-globuline dat geschikt is voor intraveneuze toediening vanwege zijn toereikende opsonische activiteit en lange halveringstijd in de bloed-20 stroom door een behandeling van Γ -gobuline met een proteolytisch enzym. Daarbij werd verrassenderwijze gevonden, dat indien Γ-globuline met pepsine bij neutrale pH tussen 6,0 en 7»5-wordt behandeld, ^-glo-buline-aggregaten selectief worden ontleed of gedissocieerd, terwijl de monomere jT-globulinemoleculen nauwelijks worden aangetast.A method has now been found for preparing a glo-globulin suitable for intravenous administration because of its sufficient opsonic activity and long half-life in the blood stream by treatment of Γ-gobulin with a proteolytic enzyme. It was surprisingly found that when dat-globulin is treated with pepsin at neutral pH between 6.0 and 7 6-5,--globulin aggregates are selectively decomposed or dissociated, while the om-globulin molecules are hardly affected.

25 De uitvinding betreft derhalve een werkwijze voor het bereiden van een Γ-globuline^ dat geschikt is voor intraveneuze toedieningfdoor een enzymbehandeling. Meer in het bijzonder wordt daarbij de anticomplementaire activiteit van Γ-globuline verminderd door een selectieve ontleding van de aggregaten zonder een ontleding van de monomere Γ-30 globulinemoleculen; daardoor ontstaat een preparaat zonder ongunstige nevenreacties, met een hoge antilichaamtiter en een lange halveringstijd in de bloedstroom.The invention therefore relates to a method for preparing an glo-globulin which is suitable for intravenous administration by an enzyme treatment. More particularly, the anti-complementary activity of glo-globulin is thereby reduced by selective decomposition of the aggregates without decomposition of the monomeric Γ-globulin molecules; this results in a preparation without unfavorable side reactions, with a high antibody titre and a long half-life in the bloodstream.

Tevens werd gevonden dat het preparaat kan worden gestabiliseerd door een toevoeging van uropepsine, dat gelijktijdig als proteo-35 lytisch enzym en als stabilisator voor r-gl0'DÏlline fungeert.It has also been found that the composition can be stabilized by the addition of uropepsin, which simultaneously functions as a proteolytic enzyme and as a stabilizer for r-glidiline.

82 0 2 8 8 1 ------------------------------------- r * - 3 -82 0 2 8 8 1 ------------------------------------- r * - 3 -

De uitvinding wordt nader toegelicht door de tekening. Hierin zijn fig.1A, B een tweetal grafieken waarbij de gelfiltratiepatronen van onbehandeld en behandeld Γί-globuline (en wel met geïmmobiliseerd uropepsine bij pH 7,0 volgens EXPERIMENT 1), zijn vergeleken, en 5 Fig.2A, B een tweetal grafieken waarbij de gelfiltratiepatro nen van onbehandeld en behandeld JP’-globuline worden vergeleken, waarbij ditmaal de behandeling plaats vond met geïmmobiliseerd uropepsine bij pH 4,5.The invention is further elucidated by the drawing. Here, Figures 1A, B are two graphs comparing the gel filtration patterns of untreated and treated Γί globulin (i.e., with immobilized uropepsin at pH 7.0 according to EXPERIMENT 1), and 5 Figures 2A, B are two graphs where the gel filtration patterns of untreated and treated JP'-globulin are compared, this time treatment with immobilized uropepsin at pH 4.5.

De uitvinding wordt gewoonlijk aldus uitgevoerd: 10 Een oplossing van (P-globuline, bereid volgens een bekende methode, wordt op een pH binnen het traject 6,0 - 7,5, liefst 6,5 - 7,0 gebracht en vervolgens met een passende hoeveelheid pepsine of uropepsi-ne bij een temperatuur van 25 - 37°C en gedurende 12 - 96 uren behandeld.The invention is usually carried out thus: A solution of (β-globulin, prepared by a known method, is adjusted to a pH within the range 6.0 - 7.5, preferably 6.5 - 7.0, and then with a appropriate amount of pepsin or uropepsin at a temperature of 25-37 ° C and treated for 12-96 hours.

15 Het is bekend, dat de optimale pH voor pepsine gewoonlijk ligt tussen 2,0 en 3,0 en dat bij een omzetting van ^-globuline met pepsine binnen dit pH-traject zijn Fc-stuk wordt verwijderd en alleenzijn Ffab'Jg-stuk behouden blijft, waardoor de opsonische activiteit van 37-globuline teloor gaat. Volgens de uitvinding daarentegen""laat men O tf> | - — — —5 20 pepsine °P F-globuline anwsrken'binnen het neutrale traject van 6,0 - 7,5 waardoor alleen de Γ-globuline-aggregaten worden aangetast, maar niet tot nauwelijks de monomere -globulinemoleculen. Daardoor verkrijgt men een ^-globuline met een lage anticomplementaire activiteit zonder dat de opsonische activiteit van het monomere -globuline ver-25 mindert. Een pH boven 7,5 moet niet worden gebruikt, omdat daardoor de enzymactiviteit van pepsine volledig verloren gaat. Met "pepsine” wordt hier zowel pepsine als uropepsine bedoeld.It is known that the optimum pH for pepsin is usually between 2.0 and 3.0 and that when a β-globulin is converted to pepsin within this pH range, its Fc piece is removed and only its Ffab / Jg piece is retained, causing the loss of the opsonic activity of 37-globulin. According to the invention, on the other hand, O tf> | - 20 20 pepsin PF-globulin reacts within the neutral range of 6.0-7.5, affecting only the glo-globulin aggregates, but hardly any monomer globulin molecules. This gives a β-globulin with a low anti-complementary activity without decreasing the opsonic activity of the monomer globulin. A pH above 7.5 should not be used as it completely loses the enzyme activity of pepsin. By "pepsin" here is meant both pepsin and uropepsin.

De uitvinding wordt hieronder aan de hand van de volgende experimentele voorbeelden nader toegelicht.The invention is explained in more detail below with reference to the following experimental examples.

30 EXPERIMENT 1 ^-globuline werd verkregen door een Cohn-fractionering met ethanol en vervolgens gegelfiltreerd over Sephadex G-200. Naast een hoofdpiek overeenkomende met J^-globuline vertoonde het verkregen pro-dukt twee pieken die overeenkwamen met hogere molecuulgewichten zoals 35 weergegeven in fig.1. Het ^-globuline na de gelfiltratie werd met 8202381 ------------ c » - U - uropepsine behandeld zoals weergegeven in voorbeeld I, dat hieronder volgt. Er werd hierbij geen verandering in de hoofdpiek van het pro-dukt waargenomen, wanneer vervolgens opnieuw een gelfiltratie plaats vond, terwijl de twee andere pieken, die aan de aanwezigheid van aggre-5 gaten werden toe geschreven, aanmerkelijk waren verkleind. Het f'-glo-buline vertoonde een anticomplementaire activiteit van ten hoogste 10 CH^q/50 mg t-globuline na deze behandeling met het enzym. Deze waarde is hoogst bevredigend voor -globuline dat voor een intraveneuze injectie bestemd is.EXPERIMENT 1-globulin was obtained by a Cohn fractionation with ethanol and then gel filtered over Sephadex G-200. In addition to a major peak corresponding to β-globulin, the resulting product showed two peaks corresponding to higher molecular weights as shown in Figure 1. The β-globulin after the gel filtration was treated with 8202381 - - - - - - - - uropepsin as shown in Example I, which follows below. No change was observed in the main peak of the product when a subsequent gel filtration took place, while the other two peaks attributed to the presence of aggre-5 holes were markedly reduced. The f'-globulin showed anti-complementary activity of up to 10 CH / q / 50 mg t-globulin after this enzyme treatment. This value is highly satisfactory for globulin intended for intravenous injection.

10 Een overeenkomstig experiment werd uitgevoerd volgens een ge bruikelijke methode bij pH it,5. Hoewel het aldus verkregen produkt een voldoende lage anticomplementaire activiteit vertoonde, gaf het gelfiltratiepatroon duidelijk een moleculaire verdeling aan, waarbij een verschuiving had plaatsgevonden naar lagere molecuulgewichten 15 (fig.2) omdat naast de globuline-aggre gat en ook vele monomere Γ- globulinemoleculen waren ontleed.A corresponding experiment was performed according to a conventional method at pH it, 5. Although the product thus obtained exhibited a sufficiently low anti-complementary activity, the gel filtration pattern clearly indicated a molecular distribution with a shift to lower molecular weights (Fig. 2) because in addition to the globulin-aggregate hole and also many monomeric glo-globulin molecules dissected.

EXPERIMENT 2 - Opsonische activiteit.EXPERIMENT 2 - Opsonic activity.

De opsonische activiteit van Γ-globuline, dat met pepsine volgens de voorbeelden I en III is behandeld (welke hieronder volgen) 20 werd onderzocht volgens de methode van Young (Young et al., The Journal of Infectious Diseases, 126, 257 (1972)).The opsonic activity of glo-globulin treated with pepsin according to Examples I and III (which follow below) was investigated by the method of Young (Young et al., The Journal of Infectious Diseases, 126, 257 (1972). ).

Meer specifiek'.werd daartoe 0,6 cm^ serum dat was opgenomen door te mengen met E. coli (NIHJC-2) bij it°C en 0,1 cm^ te onderzoeken ^-globuline-oplossing met 0,2 cm^ van een suspensie van menselijke 25 neutrofielen (10^ cellen per cm^) alsmede 0,1 cm^ van de suspensie van E. coli (2 x 10 cellen per cnr) gemengd. Dit mengsel werd 2 uren bij 37°C geincubeerd en vervolgens op een gewoon agarmedium gekweekt. Het aantal overlevende bacteriën werd geteld. Het resultaat is weergegeven in tabel A.More specifically, for this purpose 0.6 cm 2 of serum was taken up by mixing with E. coli (NIHJC-2) at 1 ° C and 0.1 cm -1 of globulin solution with 0.2 cm -1 of test. of a suspension of human neutrophils (10 ^ cells per cm ^) as well as 0.1 cm ^ of the suspension of E. coli (2x10 cells per cm) mixed. This mixture was incubated at 37 ° C for 2 hours and then grown on a common agar medium. The number of surviving bacteria was counted. The result is shown in Table A.

30 Het met menselijk uropepsine of varkenspepsine bij pH 7»0 be handelde V-globuline vertoonde een opsonischsactiviteit die vergelijkbaar was met die van menselijk monomeer f-globuline, gezuiverd uit menselijk serum volgens de methode van Sober (Sober et al., J. Am.The V-globulin treated with human uropepsin or porcine pepsin at pH 7 »0 showed an opsonic activity comparable to that of human monomer f-globulin purified from human serum by the method of Sober (Sober et al., J. Am .

Chem. Soc,, 78, 756 (1956)). Daarentegen vertoonde ^-globuline dat 35 bij een pH van it,5 met menselijk uropepsine was behandeld, slechts een 820 2 8 8 1 ---------------------- - -Chem. Soc., 78, 756 (1956)). In contrast, β-globulin that 35 had been treated with human uropepsin at a pH of 1.5 was only 820 2 8 8 1 ---------------------- - -

i" Ai "A

- 5 - geringe opsönische activiteit.- 5 - low sonic activity.

Tabel ATable A

Aantal overlevende bacteriën in 1 cm3 van de omgezette op- 5 lossing •Blanco 1,8 x 105 F -globuline behandeld met 3 mg/cm^ 1,1 x 10^ menselijk uropepsine bij 1 mg/cm^ 4,0 x 10^ pH 7,0 0,3 mg/cm^ 8,0 x 10^ 10 Τ'-globuline behandeld met 3 mg/cm^ 1,3 x 10^ varkenspepsine bij pH 7,0 menselijk monomeer 3^-globu- 3 mg/cm^ 1,2 x 10^ line 15, ¥*-globuline behandeld met 3 mg/csr* 1,7 x 10^ menselijk uropepsine bij pH 4,5 EXPERIMENT 3 - Vergelijking van de halveringstijden in vivo.Number of surviving bacteria in 1 cm3 of the converted solution • Blank 1.8 x 105 F globulin treated with 3 mg / cm ^ 1.1 x 10 ^ human uropepsin at 1 mg / cm ^ 4.0 x 10 ^ pH 7.0 0.3 mg / cm ^ 8.0 x 10 ^ 10 glo'-globulin treated with 3 mg / cm ^ 1.3 x 10 ^ pig pepin at pH 7.0 human monomer 3 ^ -globu- 3 mg / cm ^ 1.2 x 10 ^ line 15, ¥ * globulin treated with 3 mg / csr * 1.7 x 10 ^ human uropepsin at pH 4.5 EXPERIMENT 3 - Comparison of half-lives in vivo.

Een vergelijkende proef werd uitgevoerd onder toepassing van een 20 ^-globuline^verkregen door een behandeling met menselijk uropepsine bij pH 7,0^,en menselijk monomeer Τ'-globuline op groepen van mannelijke konijnen elk met een gewicht van 2 - 2,5 kg. Een intraveneuze injectie van 50 mg T-globuline gemerkt met radioactief jodium (_ VJ) werd daartoe aan elk konijn toegediend. Bloed werd opgevangen 3, 6, 12, 24, 25 36, 48, 60, 72 en 96 uren na de injectie en de radioactiviteit daar van nagegaan en de halveringstijd berekend. De resultaten hiervan zijn weergegeven in tabel B.A comparative test was carried out using a 20 µg-globulin obtained by treatment with human uropepsin at pH 7.0 ^ and human monomer glo-globulin on groups of male rabbits weighing 2 - 2.5 each kg. An intravenous injection of 50 mg T-globulin labeled with radioactive iodine (VJ) was administered to each rabbit for this purpose. Blood was collected 3, 6, 12, 24, 25, 36, 48, 60, 72 and 96 hours after the injection and its radioactivity was checked and the half-life calculated. The results are shown in Table B.

Het T-globuline dat,was behandeld met menselijk uropepsine bij een pH van 7,0 vertoonde een halveringstijd die vergelijkbaar was met 30 die van monomeer menselijk T*-globuline. . -The T globulin treated with human uropepsin at a pH of 7.0 showed a half-life comparable to that of monomeric human T * globulin. . -

Tabel BTable B

T-globuline Halveringstijd in uren Τ'-globuline behandeld met menselijk uropepsine bij pH 7,0 37,2 +3,2 35 monomeer menselijk T-globuline 36,5+4,5 82 0 2 8 8 1 ----------- -.....-........- c - 6 - EXPERIMENT U - Invloed op een infectie van Pseudomonas aeruginosa bij muizen.T-globulin Half-life in hours Τ'-globulin treated with human uropepsin at pH 7.0 37.2 + 3.2 35 monomer human T-globulin 36.5 + 4.5 82 0 2 8 8 1 ----- ------ -.....-........- c - 6 - EXPERIMENT U - Influence on infection of Pseudomonas aeruginosa in mice.

Profylactische handelingen tegen een infectie van Pseudomonas aeruginosa werden vergeleken voor een "f-globuline.verkregen door een 5 behandeling met menselijk uropepsine bij pH 7,0#en monomeer menselijk ^-globuline bij groepen van elk 10 mannelijke 'ddY-muizen met een gewicht van 18 - 20 g volgens de methode van Haranaka (Haranaka et al.,Prophylactic actions against an infection of Pseudomonas aeruginosa were compared for a β-globulin obtained by treatment with human uropepsin at pH 7.0 # and monomer human β-globulin in groups of 10 male ddY mice each weighing from 18 - 20 g according to the method of Haranaka (Haranaka et al.,

The Journal of the Japanese Association for Infectious Diseases, 52, 1*90 (1978)). Een suspensie van 5 x 10° bacteriën in k% mucine werd 10 intraperitoneaal geënt bij elke muis,' waaraan "tevoren subcutaan ^ -globoli-ne was toegediend, verkregen door een behandeling met menselijk uropepsine bij 7,0 of monomeer menselijk ^-globuline in een hoeveelheid van 30 mg per kg. Na 1* dagen werden hun overlevingscijfers bekeken.The Journal of the Japanese Association for Infectious Diseases, 52, 1 * 90 (1978)). A suspension of 5 x 10 ° bacteria in k% mucin was inoculated intraperitoneally in each mouse, which had previously been administered subcutaneously g-globin obtained by treatment with human uropepsin in 7.0 or human om-globulin monomer in an amount of 30 mg per kg After 1 * days, their survival rates were viewed.

De resultaten zijn weergegeven in tabel C.The results are shown in Table C.

15 Be overlevingscijfers van de dieren die Γ-globuline.behandeld met menselijk uropepsine bij pH 7,0,hadden toegediend gekregen, waren gelijk aan die van de dieren, die monomeer menselijk ^-globuline hadden gekregen., en hun cijfers waren significant gunstiger dan die van de controlegroep, waaraan geen T-globuline was toegediend.The survival rates of the animals administered Γ-globulin treated with human uropepsin at pH 7.0 were similar to those of the animals given monomeric human β-globulin, and their rates were significantly more favorable than that of the control group not administered T-globulin.

20 Tabel CTable C

Overlevingscijfer (%)Survival rate (%)

Controle groep 0 muizen behandeld met -globuline dat met menselijk uropepsine bij pH 7,0 was omgezet 70** 25 muizen behandeld met monomeer menselijk f*- globuline 70** ** P 0,01Control group 0 mice treated with globulin reacted with human uropepsin at pH 7.0 70 ** 25 mice treated with monomeric human f * globulin 70 ** ** P 0.01

Hoewel het volgens de uitvinding het gunstigst is met menselijk pepsine te werken, is het ook mogelijk pepsine toe te passen afkomstig 30 - ‘uit andere bronnen. Zo kan men ook maagpepsine en urine-pepsine toepassen, t.w. uropepsine.Although it is most favorable according to the invention to work with human pepsin, it is also possible to use pepsin originating from other sources. For example, stomach pepin and urine pepsin can also be used, i.e. uropepsin.

B.v. kan uropepsine uit menselijke urine worden geïsoleerd en gezuiverd volgens de methode van Seijffers (Seijffers, Amer. J. Physiol, 206, 1106 (19610).E.g. uropepsin can be isolated from human urine and purified by the method of Seijffers (Seijffers, Amer. J. Physiol, 206, 1106 (19610).

35 Als niet-beperkend voorbeeld werd daarbij menselijk urine door 8202881' * - 7 - een DEAE-ceUulosekolom geleid, die was geëquilibreerd met 0,1 M ace-taatbufferoplossing met pH 5»3, waardoor het uropepsinogeen aan de kolom werd geadsorbeerd. Dit uropepsinogeen werd vervolgens met dezelfde bufferoplossing met daarin 0,3 M natriumchloride geëlueerd. Dit eluaat 5 werd geconcentreerd, verder gezuiverd door gelchromatografie onder toepassing van Sephadex G-100 en met een zuur "behandeld.As a non-limiting example, human urine was passed through a DEAE cellulose column, which had been equilibrated with 0.1 M acetate buffer solution of pH 5-3, through 8202881 * 7, thereby adsorbing the uropepsinogen to the column. This uropepsinogen was then eluted with the same buffer solution containing 0.3 M sodium chloride. This eluate was concentrated, further purified by gel chromatography using Sephadex G-100 and treated with an acid.

Maag-pepsine kan worden verkregen volgens b.v. de methode van Tang (Tang et al., Method in Enzymology, 19, bo6 (1970)) door menselijk maagsap door een kolom Amberlite IRC-50 te leiden, die is geëquili-10 breerd met 0,2 M natriumcitraatbuffer met pH 3,0. Ha de kolom vervolgens te hebben gewassen met 0,2 M citraatbuffer met pH 3,8, wordt het geadsorbeerde pepsine geëlueerd met een 0,2 M citraatbuffer met pH 4,2. Maag-pepsine wordt vervolgens uit het eluaat verkregen door verder onder dezelfde voorwaarden na te chromatograferen. Het is zoals 15 gezegd ook mogelijk een pepsine van andere herkomst toe te passen, b.v. een pepsine van varkens.Gastric pepsin can be obtained according to e.g. the Tang method (Tang et al., Method in Enzymology, 19, bo6 (1970)) by passing human gastric juice through a column of Amberlite IRC-50 equilibrated with 0.2 M sodium citrate buffer with pH 3, 0. After having subsequently washed the column with 0.2 M citrate buffer at pH 3.8, the adsorbed pepsin is eluted with a 0.2 M citrate buffer at pH 4.2. Gastric pepsin is then obtained from the eluate by further chromatography under the same conditions. As mentioned, it is also possible to use a pepsin from other sources, e.g. a pig pepsin.

Pepsine kan ook worden bereid uit. gekweekte· tumorcellen in een fusie met pepsine producerende cellen, en zelfs kan het volgens een genetische technologie worden bereid. Het kan b.v. op een grote schaal 20 worden verkregen door een .cultuur van bacteriën zoals E. coli die een recombinantbehandeling me^ een complementair DHA^overgeschreven uit een boodschapper MA templaat voor pepsine met een omgekeerde transcriptase^ hebben ondergaan.Pepsin can also be prepared from it. cultured tumor cells in a fusion with pepsin producing cells, and even can be prepared according to a genetic technology. It can e.g. are obtained on a large scale by a culture of bacteria such as E. coli that have undergone recombinant treatment with a complementary DHA transferred from a messenger MA template for pepsin with a reverse transcriptase.

Pepsine kan voorts in eenoplosbare vorm of in een geïmmobili-25 seerde vorm worden toegepast. B.v. kan pepsine op een passende drager worden vastgelegd, zoals een Sepharose, Sephadex, cellulose of dergelijke .drager. Het gebruik van geïmmobiliseerd pepsine vergemakkelijkt zijn verwijdering van het jf^globuline na de enzymbehandeling. De geïmmobiliseerde vorm is speciaal gewenst wanneer het pepsine niet van mense-30 lijke herkomst is, omdat een verontreiniging met pepsine in het J*-globulinepreparaat dan beslist moet worden tegengegaan.Pepsin can further be used in a soluble form or in an immobilized form. E.g. pepsin can be stored on a suitable support such as a Sepharose, Sephadex, cellulose or the like support. The use of immobilized pepsin facilitates its removal of the globulin after the enzyme treatment. The immobilized form is especially desirable when the pepsin is not of human origin, because an impurity with pepsin in the J * globulin preparation must then absolutely be counteracted.

J^-globuline wordt met pepsine bij 25 - 37°C behandeld, bij' welke temperatuur een gewone enzymreactie ook plaats vindt.The globulin is treated with pepsin at 25 DEG-37 DEG C., at which temperature an ordinary enzyme reaction also takes place.

De reactieduur ligt gewoonlijk tussen 12 en 98 uren afhankelijk 35 van de mate aan anticomplementaire activiteit van het uit gangs- J^-glo- 8202881 ψ - 8 - buline, de activiteit van liet gebruikte pepsine en de hoeveelheden globuline.en pepsine.The reaction time is usually between 12 and 98 hours depending on the degree of anti-complementary activity of the starting bullo-8202881-8-buline, the activity of the pepsin used, and the amounts of globulin and pepsin.

Hoewel chargegewijs werkende methoden kunnen worden toegepast voor de behandeling van Τ'-globuline met geïmmobiliseerd pepsine is 5 het efficiënter en meer gewenst'een ï^-globuline-oplossing door een kolom met geïmmobiliseerd pepsine te laten circuleren. Indien pepsine wordt toegepast in een opgeloste vorm is het nodig de pH van de oplossing b.v. op pH 8,0 - 8,5 te verhogen om het pepsine na de reactie te inactiveren. Desgewenst, speciaal wanneer het gebruikte pepsine 10 niet van menselijke herkomst is, kan het pepsine van· het ^-globuline door een passende methode, b.v. een gelfiltratie, worden gescheiden.Although batchwise methods can be used to treat glo globulin with immobilized pepsin, it is more efficient and more desirable to circulate a globulin solution through a column of immobilized pepsin. When pepsin is used in a dissolved form it is necessary to adjust the pH of the solution e.g. to pH 8.0-8.5 to inactivate the pepsin after the reaction. If desired, especially when the pepsin 10 used is not of human origin, the pepsin of the β-globulin can be obtained by an appropriate method, e.g. a gel filtration, are separated.

Het is gunstig om geïmmobiliseerd pepsine te gebruiken, aangezien het dan gemakkelijk en volledig kan worden gescheiden.It is beneficial to use immobilized pepsin, as it can then be easily and completely separated.

Een met pepsine als boven beschreven behandeld -globuline 15 heeft een anticomplementaire activiteitsspiegel die een standaardwaarde van 20 CH^Q/50 mg ^-globuline niet teboven gaat. Een injectiepreparaat kan uit een aldus behandeld Ϋ-globuline worden bereid volgens een gebruikelijke methode. Hoewel het injectiepreparaat de vorm kan hebben van een vloeistof is het om stabiliteitsredenen beter een gevriesdroogd 20 preparaat te maken, dat direct voor gebruik kan worden opgelost. Het is gunstig een of meer stabilisatoren, zoals menselijk serumalbumine, glycine, sorbitol of gelatine toe te voegen, ^“-globulinepreparaten met een verhoogde stabiliteit kunnen ook worden verkregen door een toevoeging van menselijk uropepsine of uropepsinogeen als een stabili-25 sator in een hoeveelheid van 0,01 - 5$, liefst 0,1 - 1%.A pepsin-treated globulin 15 described above has an anti-complementary activity level that does not exceed a standard value of 20 CH ^ Q / 50 mg ^ globulin. An injection preparation can be prepared from a glo-globulin thus treated by a conventional method. Although the injection preparation may be in the form of a liquid, for stability reasons it is better to make a lyophilized preparation which can be dissolved immediately before use. It is advantageous to add one or more stabilizers such as human serum albumin, glycine, sorbitol or gelatin. Globulin preparations of increased stability can also be obtained by adding human uropepsin or uropepsinogen as an stabilizer in an amount from 0.01 - 5 $, preferably 0.1 - 1%.

De behandeling van ψ-globuline met uropepsine wordt gewoonlijk als boven weergegeven uitgevoerd, maar hij kan ook als volgt worden uitgevoerd: ïf-globuline met een hoge spiegel aan anticomplementaire activiteit wordt in houders geplaatst,· b.v. flessen met een gegeven 30 hoeveelheid; uropepsine wordt hieraan toegevoegd en vervolgens wordt geïncubeerd om de anticomplementaire activiteitsspiegel te verlagen; tenslotte wordt het mengsel gelyofiliseerd, .zoals het is, zonder uropepsine te verwijderen. Bij deze behandeling fungeert uropepsine dus tevens als stabilisator.The treatment of glo-globulin with uropepsin is usually carried out as shown above, but it can also be carried out as follows:--globulin with a high mirror of anti-complementary activity is placed in containers, e.g. bottles with a given amount; uropepsin is added thereto and then incubated to lower the anti-complementary activity level; finally, the mixture is lyophilized, as it is, without removing uropepsin. Uropepsin therefore also acts as a stabilizer in this treatment.

35 Hoewel hij speciaal geschikt is voor het bereiden van een intra- 82 0 2 8 8 1-------------------------- · * i* - 9 - veneus* injecteerbaar menselijk ^-globuline kan de onderhavige werkwijze ook worden toegepast op -globuline van elke dierlijke herkomst.35 Although it is especially suitable for preparing an intra- 82 0 2 8 8 1 -------------------------- · * i * - Venous * injectable human globulin, the present method can also be applied to globulin of any animal origin.

De uitvinding wordt nu nader toegelicht aan de hand van de voorbeelden waarbij erop wordt gewezen, dat deze voorbeelden qua tempera-5 tuur, stromingssnelheid, duur van de enzymbehandeling, concentratie aan ^-globuline en andere factoren niet beperkt zijn.The invention will now be further elucidated by means of the examples, it being pointed out that these examples are not limited in terms of temperature, flow rate, duration of enzyme treatment, concentration of globulin and other factors.

Voorbeeld I - Bereiding van uropepsinogeen.Example I - Preparation of uropepsinogen.

100 dm^ menselijk urine werd geconcentreerd tot ca. 1/1000 van het aanvankelijke volume onder toepassing van een drukultrafiltratie-10 apparaat (Pellicon van MLllipore Co., en Diaflo van Amicon Co.) bij een grens van 10.000 Dalton. 100 cm van de geconcentreerde urine werden aangebracht op een kolom DEAE-cellulose (2,5 x 20 cm) die geëquilibreerd was met een 0,1 M acetaatbuffer met pE 6,0, waarna met dezelfde buffer bëï daarin 0,3 M natriumchloride werd geëlueerd.100 µm human urine was concentrated to about 1/1000 of the initial volume using a pressure ultrafiltration device (Pellicon from MLllipore Co., and Diaflo from Amicon Co.) at a limit of 10,000 Dalton. 100 cm of the concentrated urine were applied to a column of DEAE cellulose (2.5 x 20 cm) equilibrated with a 0.1 M acetate buffer with pE 6.0, after which 0.3 M sodium chloride was added with the same buffer eluted.

15 Eet eluaat werd geconcentreerd tot ca. 100 cm^ door ultrafiltreren en vervolgens gedialyseerd. De gedialyseerde oplossing werd vervolgens aangebracht op een kolom DEAE Sepharose van 2,5 x 20 cm onder dezelfde voorwaarden als boven beschreven. De geëlueerde fractie werd geconcentreerd tot ca. 10 cm^ en aangebracht op een Sephadex G-100 gelfiltratie-20 kolom van 2,5 x 90 cm voor verdere zuivering. Ca. 80 cm^ van de aldus verkregen oplossing werd gelyofiliseerd tot ca. 20 mg uropepsinogeen. Voorbeeld II - Bereiding van varkenspepsine.The eluate was concentrated to about 100 cm @ 2 by ultrafiltration and then dialyzed. The dialyzed solution was then applied to a 2.5 x 20 cm DEAE Sepharose column under the same conditions as described above. The eluted fraction was concentrated to about 10 cm 2 and applied to a 2.5 x 90 cm Sephadex G-100 gel filtration-20 column for further purification. Approx. 80 ml of the solution thus obtained was lyophilized to about 20 mg uropepsinogen. Example II - Preparation of pork spine.

5 kg varkenmaagslijmvlies werd gehomogeniseerd in een menger en het homogenaat geëxtraheerd met 10 dm^ 0,02 M fosfaatbuffer met pH 6,0 25 gedurende 1 uur onder zachtjes roeren. Het verkregen extract werd geleid door een kolom van 10 x 60 cm DEAE-cellulose, geëquilibreerd met dezelfde buffer, waarna het geadsorbeerde pepsinogeen werd geëlueerd met 0,3 M NaCl in dezelfde buffer. Het eluaat werd tot 80 cm^ geconcentreerd door ultrafiltreren door een Diaflo-membraan van Amicon. De ge-30 concentreerde oplossing werd met 1 N zoutzuur aangezuurd op pH 2,0 en 10 minuten bij 37°C bewaard.5 kg of pig gastric mucosa was homogenized in a mixer and the homogenate extracted with 10 dm ^ 0.02 M phosphate buffer pH 6.0 for 1 hour with gentle stirring. The resulting extract was passed through a column of 10 x 60 cm DEAE cellulose, equilibrated with the same buffer, after which the adsorbed pepsinogen was eluted with 0.3 M NaCl in the same buffer. The eluate was concentrated to 80 cm 2 by ultrafiltration through a Diaflo membrane from Amicon. The concentrated solution was acidified to pH 2.0 with 1 N hydrochloric acid and stored at 37 ° C for 10 minutes.

Onmiddellijk hierna werd de pH van de oplossing verhoogd op 4,^0 door toevoeging van 1* H acetaatbuffer met pH 5,0. De oplossing werd vervolgens aangebracht op een kolom van 5 x 90 cm Sephadex G-100, ge-35 equilibreerd met een fysiologische zoutoplossing, waarna met dezelfde 3 2 0 2 8 8 1------------------------------ * - 10 - oplossing werd ontwikkeld. De fracties met varkenspepsine werden opgevangen en aldus ca. 500 mg pepsine verkregen.Immediately after this, the pH of the solution was raised to 4.0 by adding 1 * H acetate buffer with pH 5.0. The solution was then applied to a 5 x 90 cm column of Sephadex G-100, equilibrated with physiological saline and then treated with the same 3 2 0 2 8 8 1 ------------- ----------------- * - 10 - solution was developed. The pig pepin fractions were collected and thus obtained about 500 mg pepsin.

Voorbeeld IIIExample III

(a) Bereiding van geïmmobiliseerd uropepsine.(a) Preparation of immobilized uropepsin.

OO

5 Gedestilleerd water werd toegevoegd aan 10 cmJ Sepharose tot het volume 20 cm^ bedroeg. De pïï-waarde werd met een 6 N natriumhydroxy-deoplossing op 11,0 gebracht. Vervolgens werd 20 cm^ 2,5% cyaanbromide-oplossing toegevoegd en de pH van de suspensie tussen 11,0 en 11,5 gehouden door toevoeging van 6 N natronloogoplossing gedurende 30 minu-10 ten, waarbij de temperatuur van de oplossing op l6°C werd gehouden.Distilled water was added to 10 cm 2 Sepharose until the volume was 20 cm 2. The pi value was adjusted to 11.0 with a 6 N sodium hydroxide solution. Then, 20 cm ^ 2.5% cyanogen bromide solution was added and the pH of the suspension was kept between 11.0 and 11.5 by adding 6 N sodium hydroxide solution over 30 minutes, keeping the temperature of the solution at 16 ° C was held.

Onmiddellijk hierna werd de Sepharose 1+B zorgvuldig met gedestilleerd water en een 0,1 M natriumwaterstofcarbonaatoplossing uitgewassen, waarbij elk was gekoeld op 5°C, ter verwijdering van het cyaanbromide.Immediately after this, the Sepharose 1 + B was carefully washed with distilled water and a 0.1 M sodium hydrogen carbonate solution, each cooled to 5 ° C, to remove the cyanogen bromide.

De Sepharose h-B werd vervolgens gesuspendeerd in een 0,1 M natriumwater- . . 3 15 stofcarbonaatoplossxng tot een suspensie van 20 cm was verkregen.The Sepharose h-B was then suspended in 0.1 M sodium water. . 3 carbon dioxide solution until a suspension of 20 cm was obtained.

Aan deze suspensie was 10 mg uropepsinogeen (geïsoleerd uit menselijke urine volgens de Seijffers-methode) toegevoegd. Omgezet werd 16 uren bij 5°C, terwijl de suspensie zachtjes werd geroerd, waardoor een geïmmobiliseerd uropepsinogeen werd verkregen. Dit geïmmobiliseerde uro-20 pepsinogeen werd. 10 minuten bij pH 2,0 geactiveerd ter omzetting in geïmmobiliseerd uropepsine. Nadat het geïmmobiliseerde uropepsine met gedestilleerd water was gewassen werd een 0,01 M fosfaatbufferoplossing met pH 7,0 met daarin 0,15 M natriumchloride toegevoegd ter vorming van een suspensie van 20 cm , 25 (b) Bereiding van een F-globuline behandeld met uropepsine bij pH 7,0.10 mg uropepsinogen (isolated from human urine by the Seijffers method) was added to this suspension. The reaction was carried out at 5 ° C for 16 hours, while the suspension was gently stirred to obtain an immobilized uropepsinogen. This immobilized uro-20 pepsinogen. Activated for 10 minutes at pH 2.0 to convert to immobilized uropepsin. After the immobilized uropepsin was washed with distilled water, a 0.01 M phosphate buffer solution of pH 7.0 containing 0.15 M sodium chloride was added to form a 20 cm suspension. (B) Preparation of an F-globulin treated with uropepsin at pH 7.0.

oO

Een kolom gevuld met 1,2 cm geïmmobiliseerd uropepsine, bereid volgens (a) werd geëquilibreerd met 0,01 M fosfaatbufferoplossing met pH 7,0 en op een temperatuur van 37°0 gehouden. 20 cm^ van een oplossing met daarin 110 mg per cm^ globuline werd door deze kolom met een 30 stroomsnelheid van'6 cm^ per uur gecirculeerd, waarbij het uropepsine gedurende 96 uren "iiverkte^ pg tabellen D en E geven de veranderingen · in de spiegel aan anti complementaire activiteit van het /‘'-globuline' na verschillende duren van de uropepsinebehandeling en eigenschappen van het verkregen (Γ*-globuline weer.A column filled with 1.2 cm of immobilized uropepsin prepared according to (a) was equilibrated with 0.01 M phosphate buffer solution of pH 7.0 and kept at a temperature of 37 ° 0. 20 ml of a solution containing 110 mg per ml of globulin was circulated through this column at a flow rate of 6 cm per hour, the uropepsin being potent for 96 hours, Tables D and E showing the changes in the mirror of anti-complementary activity of the globulin after different durations of the uropepsin treatment and properties of the resulting globulin.

3202881 » ' J* - 11 -3202881 »'J * - 11 -

Tabel DTable D

Reactieduur in uren O 12 24 48 96 antieomplementaire activiteit 5 CH^g/50 mg f-globuline 86,7 65,4 22,9 16,7 10,0Duration of reaction in hours O 12 24 48 96 anti-complementary activity 5 CH ^ g / 50 mg f-globulin 86.7 65.4 22.9 16.7 10.0

Tabel ETable E

Onbehandeld Met uropepsine be handeld 10 zuiverheid 7S 90% 7S ' 98$ (elektroforese) meer dan 7S 10$ meer dan 7S 2% antieomplementaire 87 CH_n/50 mg F - 10 0Η_Λ/50 mg 50 activiteit globuline globuline 15 • · · "S · ’ * antilichaamtiter mfluenzavurus influenzavirus 0,11 mg/cm^ 0,11 mg/cm-3Untreated Uropepsin-treated 10 purity 7S 90% 7S '98 $ (electrophoresis) more than 7S 10 $ more than 7S 2% anti-complementary 87 CH_n / 50 mg F - 10 0Η_Η / 50 mg 50 activity globulin globulin 15 • · · "S Antibody titer mfluenzavurus influenza virus 0.11 mg / cm ^ 0.11 mg / cm-3

Coxsackie-virus Coxs acki e-virus 0,31 mg/cm3 0,31 mg/cm3Coxsackie virus Coxs acki e virus 0.31 mg / cm3 0.31 mg / cm3

Klebsiella Klebsiella 20 0,63 mg/cm3 . 0,63 mg/cm3 E. coli E. coli 0,63 mg/cm3 0,63 mg/cm3Klebsiella Klebsiella 20 0.63 mg / cm3. 0.63 mg / cm3 E. coli E. coli 0.63 mg / cm3 0.63 mg / cm3

Opsonische activiteit·^* 100 100 25 * minimale concentratie waarbij -globuline een bacterie-agglutinatie veroorzaakt ** relatieve waarde, waarbij de opsonische activiteit van onbehandeld Γ-globuline op 100 was gesteld.Opsonic activity · ^ * 100 100 25 * minimum concentration at which -globulin causes bacterial agglutination ** relative value, where the opsonic activity of untreated glo-globulin was set at 100.

Voorbeeld IVExample IV

30 50 mg r'-glctouline verkregen uit de menselijke placenta (Japan- ' ' * se octrooipublikatie 48-7762), en 1 mg menselijk uropepsine werden op- - gelost in 5 cm3 0,01 M fosfaatbuffer met pH 6,5 met daarin 0,15 M natriumchloride. Na een reactie van 60 minuten bij 37°C werd deze reactie afgebroken door toevoeging van 0,1 N natriumhydrozydeoplossing.50 mg of r'-glctouline obtained from the human placenta (Japanese Patent Publication 48-7762), and 1 mg of human uropepsin were dissolved in 5 ml of 0.01 M phosphate buffer with pH 6.5 containing 0.15 M sodium chloride. After a 60 minute reaction at 37 ° C, this reaction was stopped by addition of 0.1 N sodium hydroxide solution.

35 De eigenschappen van het Γ-globuline dat aldus werd verkregen, zijn 8202881 --------------- - 12 - weergegeven in tabel F.The properties of the glo-globulin thus obtained are 8202881 --------------- - 12 - shown in Table F.

Tabel FTable F

Onbehandeld Met uropepsine behan deld 5 anticomplementaire acti- 60 CH^0/50 mg /*- 11 Cïï^q/50 mg viteit globuline globulineUntreated Uropepsin treated 5 anti-complementary activi 60 CH ^ 0/50 mg / * - 11 Ci ^ q / 50 mg vity globulin globulin

Actilichaamtiter influenzavirus influenzavirus 0,11 mg/cm3 0,11 mg/cm^ .. E. coli E. coli _Actibody titer influenza virus influenza virus 0.11 mg / cm3 0.11 mg / cm ^. E. coli E. coli _

0,63 mg/cnr 0,63 mg/cnT0.63 mg / cnr 0.63 mg / cnT

Opsonische activiteit 100 109 * minimale concentratie, waarbij ft*-globuline een bacterie-agglutina-15 tie veroorzaaktOpsonic activity 100 109 * minimum concentration, with ft * globulin causing bacterial agglutination

Jfcfc relatieve waarde, waarbij de opsonische activiteit van onbehandeld f-globuline werd gesteld op 100.Jfcfc relative value, setting the opsonic activity of untreated f-globulin to 100.

Voorbeeld VExample V

3 - 2 cm geïmmobiliseerd varkenspepsine— Serpharose, verkregen vol-20 gens voorbeeld I, werd in een kolom gebracht en geëquilibreerd met 0,01 M fosfaatbufferoplossing met pH 6,5, en op een temperatuur van 30°C gehouden. Vervolgens werd 20 cm^ van een oplossing met 100 mg/cm^ f*-globuline gedurende 1*8 uren hierin omgezet door hem door de kolom te circuleren met een stroomsnelheid van 10 cm^ per uur. De eigenschappen 25 van het verkregen ^-globuline zijn weergegeven in tabel G.3 - 2 cm of immobilized porcine pepin - Serpharose, obtained according to Example I, was placed in a column and equilibrated with 0.01 M phosphate buffer solution of pH 6.5, and kept at a temperature of 30 ° C. Then 20 cm 2 of a solution containing 100 mg / cm 2 f * -bulbulin was reacted for 1 * 8 hours by circulating it through the column at a flow rate of 10 cm 2 per hour. The properties of the ^-globulin obtained are shown in Table G.

Tabel GTable G

Onbehandeld Met pepsine behandeldUntreated Pepsin treated

Anticomplementaire ac- 65 CH^Q/50 mg ^ - 13 CH^Q/50 mg ƒ*- tiviteit globuline · globuline 30 • - , J ( . Antilichaamtiter · influenzavirus influenzavirus 0,11 mg/cm3 0,11 mg/cm^Anti-complementary activity - 65 CH ^ Q / 50 mg ^ - 13 CH ^ Q / 50 mg globulin · globulin 30 • -, J (Antibody titer · influenza virus influenza virus 0.11 mg / cm3 0.11 mg / cm ^

Coxsackie-virus Coxsackie-virus 0,31 mg/cm3 0,31 mg/cm3Coxsackie virus Coxsackie virus 0.31 mg / cm3 0.31 mg / cm3

Klebsiella Klebsiella 35 0,63 mg/cm3 0,63 mg/cm^ 82 0 2 8 8 1-----------------........Klebsiella Klebsiella 35 0.63 mg / cm3 0.63 mg / cm ^ 82 0 2 8 8 1 -----------------........

- 13 -- 13 -

Tabel G (vervolg) E. coli . E.coli 0,63 mg/cnr 0,63 mg/cm3Table G (continued) E. coli. E.coli 0.63 mg / cm0 0.63 mg / cm3

Opsonische activiteit 100 75 5 * Minimale concentratie waarbij ^-globuline een bacterie-agglmtinatie veroorzaakt *fc Relatieve waarde, waarbij de opsonische activiteit van onbehandeld J^-globuline was gesteld op 100.Opsonic activity 100 75 5 * Minimum concentration at which--globulin causes bacterial aggregation * fc Relative value, where the opsonic activity of untreated ^-globulin was set at 100.

Voorbeeld VIExample VI

10 10 cm3 uropepsine-oplossing met 1,5 mg/cm3 -werd. resp. toegevoegd aan 1000 flessen met elk 500 mg ^-globuline (31 CE^q/50 mg ^-globu-line), waarna de mengsels 96 uren bij pH 6,5 en 37°C werden geincu-beerd. Ra afloop van deze incubatieperiode werden?de mengsels gelyofi-liseerd zonder verwijdering van het uropepsine. De spiegel aan anti-15 complementaire activiteit van het behandelde X*-globuline bedroeg l8 CH^0/50 mg J*-globuline.10 cm3 of uropepsin solution containing 1.5 mg / cm3. resp. was added to 1000 bottles, each containing 500 mg of bul-globulin (31 CE-q / 50 mg of bu-globulin), after which the mixtures were incubated for 96 hours at pH 6.5 and 37 ° C. At the end of this incubation period, the mixtures were lyophilized without removal of the uropepsin. The mirror of anti-complementary activity of the treated X * globulin was 18 CH ^ 0/50 mg J * globulin.

Voorbeeld VIIExample VII

1 g uropepsine werd als stabilisator toegevoegd aan 250 g r-globuline (16 CH^q/50 mg ^-globuline), waarna dit mengsel werd opge- 20 lost in 5 dm3 0,9# fysiologische zoutoplossing. Nadat de oplossing 3 steriel was gefiltreerd werd telkens 10 cm oplossing m flesjes gedaan en gelyofiliseerd. De resultaten bij de metingen van de spiegels aan anticomplementaire activiteit na een opslag van 3 maanden bij k°C zijn weergegeven in tabel H.1 g of uropepsin was added as a stabilizer to 250 g of r-globulin (16 CH ^ q / 50 mg ^ globulin), after which this mixture was dissolved in 5 dm3 0.9 # physiological saline. After the solution was sterile filtered, 10 cm solution in vials was each time put in and lyophilized. The results of the measurements of the levels of anti-complementary activity after 3 months storage at k ° C are shown in Table H.

25 x Tc. Tabel H25 x Tc. Table H

Stabilisator Spiegel aan anticomplemen- Spiegel aan anti- taire activiteit v66r op- complementaire ac-slag CÏÏ_n/50 mg Γ-globu- tiviteit na opslag line 5 CH50/5O mg Jf'-glo- bulineStabilizer Mirror of anti-complemen- Mirror of anti-tare activity before complementary activity CII / 50 mg glo globility after storage line 5 CH50 / 5O mg Jf'-globulin

30 geen 16 W30 no 16 W.

uropepsine l6 1^ 820 2 8 3 1 ---------------------------- 'uropepsin l6 1 ^ 820 2 8 3 1 ---------------------------- '

Claims

9 - I - Conclusions:

A method of preparing globulin for an intravenous injection, characterized in that β-globulin is treated with pepsin or uro-pepsin at a pH between 6.0 and 7.5.

A method according to claim 1, characterized in that the T-glo-5 buline is of human origin.

Process according to claim 1 or 2, characterized in that the pH is between 6.5 and 7.0. Process according to claim 1 or 2, characterized in that the enzyme is of human origin.

A method according to claim 3, characterized in that the enzyme is of human origin.

A method according to claim 1 or 2, characterized in that the enzyme is of non-human origin.

The method of claim 3, wherein the enzyme is of non-human origin.

The method of claim H, wherein the enzyme is used in a soluble form.

The method of claim 5, wherein the enzyme is used in a soluble form.

The method of claim U, wherein the enzyme is used in an immobilized form.

The method of claim 5, wherein the enzyme is used in an immobilized form.

12. The method of claim 6, wherein the enzyme is used in an immobilized form.

The method of claim 7, wherein the enzyme is used in an immobilized form. lb. Method according to claim 1 or 2, characterized in that the J1 globulin is treated with. the enzyme within a temperature range of 25-37 ° C for 12-96 hours.

Method according to claim 3, characterized in that the Γ-globulin is treated with the enzyme within a temperature range of 82 0 2 8-8 1 __________________, _________________ - 15 - 25 - 3T ° C and for 12 - 96 hours.

Process according to claim 1, characterized in that the r'-glohuline is treated with the enzyme within a temperature range of 25-37 ° C and for 12-96 hours.

The method of claim 5, wherein the T-globulin is treated with the enzyme within a temperature range of 25-37 ° C and for 12-96 hours.

18. Process according to claim 6, characterized in that the r "globulin is treated with the enzyme within a temperature range of 25-37 ° C and for 12-96 hours.

The method of claim 7, wherein the β-globulin is treated with the enzyme within a temperature range of 25-37 ° C and for 12-96 hours.

20. The method of claim 8, wherein the Y * globulin is treated with the enzyme within a temperature range of 25-37 ° C and for 12-96 hours.

21. The method of claim 9 wherein the Y * globulin is treated with the enzyme within a temperature range of 25-37 ° C and for 12-96 hours.

The method of claim 10, wherein the β-globulin is treated with the enzyme within a temperature range of 25-37 ° C and for 12-96 hours. The method of claim 11, wherein the β-globulin contains the enzyme is treated within a temperature range of 25 - 37 ° C and 25 for 12 - 96 hours The method of claim 12, wherein the globulin is treated with the enzyme within a temperature range of 25 - 37 ° C and for 12 - 96 hours.

Method according to claim 13, wherein the γ-globulin is treated with the enzyme within a temperature range of 25-37 ° C and for 12-96 hours.

26. A method according to claim 10, characterized in that the γ * -globulin is treated with the enzyme by circulating a Y * -globulin solution through a column filled with the enzyme in a geln-bilized form. 8202881 --------------------------------- - l6 -

27. A method according to claim 11, characterized in that the globulin is treated with the enzyme by circulating the globulin solution through a column which has been stirred with the enzyme in an immobilized form.

A method according to claim 12, characterized in that the T * globulin is treated with the enzyme by circulating a 1 * globulin solution through a column filled with the enzyme in an immobilized form.

29. The method of claim 13, wherein the t-globulin containing the enzyme is treated by circulating a globulin solution through a column filled with the enzyme in an immobilized form.

30. A medicament for an intravenous administration containing globulin and a stabilizer in the form of uropepsin or human uropeptinogen.

The pharmaceutical for intravenous injection according to claim 30, characterized in that the t-globulin is human / "globulin".

32. Medicament for intravenous injection according to claim 30 or 31, comprising 0.01-5% human uropepsin or human uropepsinogen.

The medicament for intravenous injection according to claim 32, containing 0.1 to 11 human uropepsin or uropepsinogen. 8202881 ------------------