NL8201321A

NL8201321A - METHOD FOR TREATMENT OF METASTASIS AND GROWTH OF TUMOR CELLS

Info

Publication number: NL8201321A
Application number: NL8201321A
Authority: NL
Original assignee: Bayer Ag
Priority date: 1981-04-07
Filing date: 1982-03-30
Publication date: 1982-11-01
Also published as: ES511209A0; IT8220621A1; IL65423A0; JPS57179163A; IT8220621A0; DE3212068A1; ZA822335B; IL65423A; CH651753A5; ES8404995A1; FR2502954B1; GR75460B; ES8404994A1; IT1150790B; ES8307753A1; AU551063B2; NZ200234A; CA1265451A; FR2502954A1; ES521457A0

Description

% , * t AANVRAAGSTER NOEMT ALS UITVINDERS: 1. Dr. Wolf-Dieter Busse, 2. Dr. Kenneth V. Honn, 3. Dr. Elke Möller, 4. Dr. Friedel Seuter%, * t APPLICANT SPECIFIES AS INVENTORS: 1. Dr. ir. Wolf-Dieter Busse, 2. Dr. ir. Kenneth V. Honn, 3. Dr. ir. Elke Möller, 4. Dr. ir. Friedel Seuter

Werkwijze voor de behandeling van metastase en de groei van tumorcellenMethod for the treatment of metastasis and the growth of tumor cells

Het primaire doel van een behandeling van kanker is de behandeling en volledige uitroeiing van de primaire tumor. Gelijktijdig met deze behandeling is de verhindering van de metastasering noodzakelijk, afzettingen van primaire tumorcellen en het daaropvolgende indringen in 5 het lymfesysteem of de bloedvaten ter overbrenging gedefinieerd kan worden. Een dergelijke uitbreiding kan door het aanhechten aan de endo-theelwanden en het daaropvolgend doordringen ervan, het zich neerzetten van secundaire tumoren in de perivasculaire weefsels en tenslotte verbreiding van de tumorcellen naar verwijderde plaatsen toe plaatshebben.The primary goal of cancer treatment is the treatment and complete eradication of the primary tumor. Concurrent with this treatment, the prevention of metastasis is necessary, deposits of primary tumor cells and subsequent penetration into the lymphatic system or blood vessels for transmission can be defined. Such extension may occur by adhering to and subsequently penetrating the endothelial walls, depositing secondary tumors in the perivascular tissues, and finally spreading the tumor cells to distant sites.

10 Hoewel over de klinische manifestaties van het metastase proces veel bekend is, weet men slechts weinig over de aan de metastase deelnemende biochemische, immunologische, genetische en hormonale mechanismen. In deze zin kan de metastase als een afzonderlijk verschijnsel beschouwd worden, die op een opeenvolging van gecompliceerde processen berust.10 Although much is known about the clinical manifestations of the metastasis process, little is known about the biochemical, immunological, genetic and hormonal mechanisms participating in the metastasis. In this sense, the metastasis can be considered as a separate phenomenon, based on a succession of complicated processes.

15 Vanwege de betekenis van zowel de behandeling van de groei van de primaire tumor alsook het voorkomen van de metastase hebben de onderzoekers van kanker omvangrijke onderzoekingen uitgevoerd om de met tu-morgroei en metastase verbonden wisselwerkingen op te helderen.Because of the significance of both treatment of primary tumor growth and prevention of metastasis, cancer investigators have conducted extensive studies to elucidate the interactions associated with tumor growth and metastasis.

Een van de biologische eigenschappen, die tumorcellen schijnen te 20 bezitten, is het vermogen met de bloedplaatjes van de gastheer in wisselwerking te treden en zich daaraan te hechten en daardoor het vermogen van de tumor te versterken zich in het microvaatsysteem vast te zetten en aan het vasculaire endotheel te hechten. Als een andere mogelijkheid werd voorgesteld, dat de tumorcellen na het vastzetten ervan 25 de vorming van de deze cellen omgevende, als bescherming werkende plaatjes-tromben te kunnen oplossen. Opdat een succesvolle metastase kan plaatsvinden, moeten de metastasecellen eerst zich aan het vasculaire endotheel vastzetten en aldaar hechten en intravasculair blijven.· ^ ------" " tot het in het omgevende weefselJhinnendrlngt.One of the biological properties that tumor cells appear to possess is the ability to interact with and attach to the platelets of the host, thereby enhancing the ability of the tumor to attach to the microvascular system and to the attach vascular endothelium. As another possibility, it has been proposed that the tumor cells after fixation can dissolve the formation of the platelet-protecting platelets surrounding these cells. In order for a successful metastasis to occur, the metastasis cells must first attach and adhere to the vascular endothelium and remain intravascularly until it penetrates into the surrounding tissue.

___3D- Vanwege de overeenkomsten tussen het aan het vastzetten en aanhechten van de tumorcellen aan het endotheel deelnemende proces en de vorming van niet-tumor-tromben hebben vele onderzoekers ertoe besloten, 8201321 » * ♦ 2 dat plaatsjes op een of andere wijze daarbij een rol spelen. Vanwege deze deelname werden met de plaatjes talrijke onderzoekingen uitgevoerd om de werking van een therapie door middel van anticoagulantia op de metastase te bepalen. De hierna geciteerde onderzoekingen omvatten de 5 toediening van anticoagulerende verbindingen, die krachtige remmers voor een plaatsaggregatie zijn. De resultaten spreken elkaar tot dusverre tegen.___ 3D- Because of the similarities between the process of securing and attaching the tumor cells to the endothelial process and the formation of non-tumor thrombs, many researchers have decided, 8201321 »* ♦ 2, that sites in some way play a role in this. play. Because of this participation, numerous platelets were conducted to determine the effect of anti-coagulant therapy on metastasis. The studies cited below include the administration of anticoagulant compounds, which are potent site aggregation inhibitors. The results so far contradict each other.

Van heparine werd bericht, dat het de metastase zowel vermindert alsook verhoogt, in het bijzonder in de longen [zie Cell Biol.Inti.Rep. 10 _2, (1963) 81-86 en Arch. Surg. 91, (1965) 625-629]. Aspirine gaf gemengde resultaten [zie Eur.J.Cancer J3, (1972) 347-352 en Intl.J.Cancer 11, (1973) 704-718]. Voor Warfarin werd aangetoond, dat het aanzienlijke antimetastatische werkingen na intraveneuze injectie van tumorcellen en in spontaan metastaserende tumoren teweeg brengt [zie Cancer 35, 15 (1975) 5-14 en Cancer Res. ^37, (1971) 272-277]. Aangetoond werd^ dat een door intraveneuze toediening van B-16a-me!anoom-cellen teweeg gebrachte metastase door toediening van het anticoagulatiemiddel prosta-cycline verhinderd kan worden [zie Cell Biol. 87, (180) 649].Heparin has been reported to both reduce and increase metastasis, especially in the lungs [see Cell Biol.Inti.Rep. 10-2, 81-86 (1963) and Arch. Surg. 91, 625-629 (1965)]. Aspirin gave mixed results [see Eur.J.Cancer J3, (1972) 347-352 and Intl.J.Cancer 11, (1973) 704-718]. Warfarin has been shown to produce significant anti-metastatic effects after intravenous injection of tumor cells and into spontaneously metastatic tumors [see Cancer 35, 15 (1975) 5-14 and Cancer Res. ^ 37, 272-277 (1971)]. It has been shown that metastasis induced by intravenous administration of B-16a-myoma cells can be prevented by administration of the anticoagulant prosta-cyclin [see Cell Biol. 87, (180) 649].

Een overzicht over de toepassing van anticoagulantia voor de tu-20 mor-therapie is te vinden bij M.B. Donati c.s., Malignancy and the Hemostatic System, bladzijden 103-120, Saven Press, 1981.An overview of the application of anticoagulants for tu-20 mor therapy can be found at M.B. Donati et al., Malignancy and the Hemostatic System, pages 103-120, Saven Press, 1981.

Het vermoeden werd geuit, dat het gebruik van de therapie door middel van anticoagulantia ten dele daarom minder dan tevreden stellend verlopen is, omdat het te toegepaste anticoagulatiemiddelen aan speci-25 ficiteit ontbreekt en omdat enkele van de middelen óp de tumorcellen zelfwerkingen teweeg brengen, die in totaal de gewenste werking op de bloedplaatjes en daarmee op de metastase kunnen opheffen.It has been suggested that the use of the therapy by means of anticoagulants has therefore in part been less than satisfactory, because the anticoagulants to be used are lacking in specificity and because some of the agents on the tumor cells have self-acting effects. in total, the desired effect on the platelets and thus on the metastasis can be eliminated.

Volgens de onderhavige uitvinding is de in het Amerikaanse oc-trooischrift 4.053.621 geopenbaarde en als therapeutisch werkzaam anti-30 trombotisch middel geoctrooieerde verbinding 3-methyl—>l-[2-(2-naftyl-oxy)-ethyl]-2-pyrazolin-5-on een krachtig antimetastatisch middel met begeleidende antineoplastische werkzaamheid gebleken.In accordance with the present invention, the compound disclosed in U.S. Pat. No. 4,053,621 and a therapeutically active anti-thrombotic agent is 3-methyl-> 1- [2- (2-naphthyl-oxy) -ethyl] -2- pyrazolin-5-one has been shown to be a potent anti-metastatic agent with accompanying anti-neoplastic activity.

De onderhavige uitvinding is op een therapeutische methode ter vermindering van de metastase en de neoplastische groei bij zoogdieren 35 gericht. Deze methode omvat de toediening van een therapeutisch werkzame hoeveelheid 3-methyl-l-[2-(2-naftyloxy)-ethyl]-2-pyrazolin-5-on aan de zoogdieren.The present invention is directed to a therapeutic method to reduce metastasis and neoplastic growth in mammals. This method involves the administration of a therapeutically effective amount of 3-methyl-1- [2- (2-naphthyloxy) -ethyl] -2-pyrazolin-5-one to the mammals.

Zoals in het Amerikaanse octrooischrift 4.053.621 werd beschreven kan de bij de onderhavige uitvinding toegepaste methylpyrazolonverbin-40 ding (voorgesteld door formule 1) langs verschillende wegen bereid wor- 8201321 * $ 3 den, zoals hierna wordt toegelicht. Volgens de reactievergelijking met fig. 1 wordt 2-(2-naftyloxy),-ethylhydrazine met een aceetazijnzuurderi-vaat omgetzet; volgens de reactievergelijkijig met fig. 2 wordt 3-me-thylpyrazolinon-(3) met een 2-(2-naftyloxy)-ethyl-derivaat omgezet; 5 volgens de reactievergelijkinv met fig. 3 wordt 2-(2-naftyloxy)-ethyl-hydrazine met een tetrolzuur-derivaat omgezet.As disclosed in U.S. Patent 4,053,621, the methylpyrazolone compound (represented by Formula 1) used in the present invention can be prepared by various routes, as explained below. According to the reaction comparison with Fig. 1, 2- (2-naphthyloxy) ethylhydrazine is reacted with an acetacetic acid derivative; according to the reaction similar to Fig. 2, 3-methylpyrazolinone (3) is reacted with a 2- (2-naphthyloxy) ethyl derivative; 5 according to the reaction comparison with FIG. 3, 2- (2-naphthyloxy) -ethyl-hydrazine is reacted with a tetrolic acid derivative.

Tot de toepasbare verdunningsmiddelen behoren alle inerte organische oplosmiddelen, eventueel met water verdund, bijvoorbeeld koolwaterstoffen zoals benzeen en tolueen, halogeenkoolwatetstoffen zoals di-10 chloormethaan, alcoholen, zoals methanol en ethanol en organische basen zoals pyridine en picoline.Suitable diluents include any inert organic solvents, optionally diluted with water, for example, hydrocarbons such as benzene and toluene, halocarbons such as di-chloromethane, alcohols such as methanol and ethanol, and organic bases such as pyridine and picoline.

Basische of zure condensatiemiddelen kunnen worden toegepast en de reactietemperatuur kan tussen 10°C nen 200°C gevarieerd worden. De verbinding kan op eenvoudige wijze door middel van gebruikelijke methoden 15 door hertkristalliseren uit een geschikt oplosmiddel gezuiverd worden.Basic or acidic condensing agents can be used and the reaction temperature can be varied between 10 ° C and 200 ° C. The compound can be easily purified by recrystallization from a suitable solvent by conventional methods.

In de onderhavige beschrijving betekent de uitdrukking "farmaceutisch onbezwaarlijk verdunningsmiddel of dragermateriaal" een niet-toxische stof, die na het mengen met de werkzame stof of met de werkzame stoffen deze in een voor de toediening geschikte vorm levert. De be-20 tekenis sluit bij voorkeur water en gebruikelijke bij de chemische synthese toegepaste organische oplosmiddelen met laag molecuulgewicht uit, behalve bij het aanwezig zijn van andere farmaceutisch vereiste bestanddelen zoals zouten in de juiste hoeveelheden, om een isotoon preparaat te bereiden, buffers, oppervlakactieve middelen, kleurstoffen en 25 smaakstoffen en conserveermiddelen. Voorbeelden van geschikte vaste en vloeibare verdunningsmiddelen en dragermaterialen zijn de volgende: water bevattende buffers, die door toevoeging van glucose of zouten isotoon gemaakt kunnen worden; niet-toxische organische oplosmiddelen zoals paraffine, plantaardige oliën, alcoholen, glycolen; gemalen natuur-30 lijke vesteenten (bijvoorbeeld kaollen, aluminiumoxide, talk of krijt); synthetische steenpoeders (bijvoorbeeld sterk dispers kiezelzuur of silicaten); en suiker.In the present description, the term "pharmaceutically harmless diluent or carrier material" means a non-toxic substance which, after mixing with the active substance or active substances, provides it in a form suitable for administration. The meaning preferably excludes water and conventional low molecular weight organic solvents used in the chemical synthesis, except in the presence of other pharmaceutically required ingredients such as salts in the appropriate amounts, to prepare an isotonic preparation, buffers, surfactants agents, dyes and flavors and preservatives. Examples of suitable solid and liquid diluents and carrier materials are the following: aqueous buffers, which can be made isotonic by adding glucose or salts; non-toxic organic solvents such as paraffin, vegetable oils, alcohols, glycols; milled natural vestiges (for example, cauliflowers, alumina, talc or chalk); synthetic stone powders (e.g. highly dispersed silica or silicates); and sugar.

De orale toediening kan onder toepassing van vaste en vloeibare verdunningsvormen zoals poeders, tabletten, dragees, capsules, granu-35 laat, suspensies, oplossingen en dergelijke worden uitgevoerd. Waar aangewezen kunnen de doseringseenheden voor de orale toediening gemier ocapsuleerd worden, om de afgifte te vertragen of over een langere tijd te verlangzamen, zoals bijvoorbeeld door het bekleden of inbedden van deeltjesvormig materiaal in polymeren, wassen of dergelijke.The oral administration can be carried out using solid and liquid diluents such as powders, tablets, dragees, capsules, granules, suspensions, solutions and the like. Where appropriate, the dosage units for oral administration can be ocapsulated ant to delay or delay over a longer period of time, such as, for example, by coating or embedding particulate matter in polymers, waxes or the like.

40 De parenterale toediening kan onder toepassing van vloeibare dose- 8201321 t » 4 ringsvormen, zoals steriele oplossingen en suspensies plaatshebben die voor de subcutane, intramusculaire of intraveneuze injectie bestemd zijn. Deze worden door suspenderen of oplossen van een afgemeten hoeveelheid van de verbinding in een voor injectie geschikt, niet-toxisch 5 vloeibaar versnijdingsmiddel, zoals een water bevattend of olie bevattend milieu en sterilisatie van de suspensie of oplossing bereid. Stabilisatoren, conserveermiddelen en emulgatoren kunnen eveneens toegevoegd worden.Parenteral administration may be in liquid dosage forms such as sterile solutions and suspensions intended for subcutaneous, intramuscular or intravenous injection. These are prepared by suspending or dissolving a measured amount of the compound in an injectable, non-toxic liquid excipient, such as an aqueous or oil-containing medium, and sterilization of the suspension or solution. Stabilizers, preservatives and emulsifiers can also be added.

In het algemeen bedraagt de op het lichaamsgewicht betrokken dage-10 lijkse dosering voor de parenterale toediening 0,01 tot 50 mg/kg, bij voorkeur 0,1 tot 10 mg/kg en voor de orale toediening 0,1 tot 500 mg/kg.In general, the daily weight-related dose for parenteral administration is 0.01 to 50 mg / kg, preferably 0.1 to 10 mg / kg and for oral administration, 0.1 to 500 mg / kg .

Voor de bepaling van de antimetastatische en antineoplastische eigenschappen van 3-methyl-l-[2-(2-naftyloxy)-ethyl]-2-pyrazolin-5-on 15 werd de volgende methode toegepast. Het proefschema bedient zich van twee niet met elkaar in betrekking staande typen van muizen-tumoren (een melanoom een carcinoom), om zoveel mogelijk de mogelijkheid uit te schakelen, dat de verkregen resultaten "uniek" met betrekking tot het enige tumortype zijn. Deze beide tumoren worden als routine voor prin-20 cipiële onderzoekingen over het mechanisme van de metastase en de antineoplastische werking toegepast.The following method was used to determine the antimetastatic and antineoplastic properties of 3-methyl-1- [2- (2-naphthyloxy) -ethyl] -2-pyrazolin-5-one. The test scheme uses two unrelated types of mouse tumors (a melanoma a carcinoma) to eliminate as much as possible the possibility that the results obtained are "unique" with respect to the only tumor type. Both tumors are used as a routine for preliminary studies of the mechanism of metastasis and antineoplastic activity.

A. Het in vivo verkrijgen van de tumor-lijnen.A. Obtaining the tumor lines in vivo.

Subcutaan, amelanotisch B-16 -melanoom (B-16a) en Lewis-longen-carcinoom (3LL) werden van de Division of Cancer Treatment, (NCI), 25 Animal and Human Tumor Bank, Mason Research Institute, Worcester,Subcutaneous, amelanotic B-16 melanoma (B-16a) and Lewis lung carcinoma (3LL) were obtained from the Division of Cancer Treatment, (NCI), 25 Animal and Human Tumor Bank, Mason Research Institute, Worcester,

Massachusetts, USA, verkregen. Beide tumortypen werden na het verkrijgen aan vier passages onderworpen. Een passage omvatte het implanteren van een tumorblok van 2 x 2 mm in het rechter okselholte-gebied (onder toepassing van een Trokarnaald van 0,33 mm * nr. 13) van mannelijke, 30 syngeneïsche gastheermuizen [(C57BL/6J; Jackson Laboratory-stamj. De gastheermuizen wogen tussen 17 en 22 g (zij waren ongeveer 28 dagen oud) en werden met betrekking tot de duur van de lichtinwerking, het dieet, de temperatuur enz. onder identieke omstandigheden gehouden.Massachusetts, USA. Both tumor types were subjected to four passages after acquisition. A passage included implanting a 2 x 2 mm tumor block into the right axillary cavity region (using a 0.33 mm * No. 13 Trojan needle) from male, 30 syngenic host mice [(C57BL / 6J; Jackson Laboratory). stamj. The host mice weighed between 17 and 22 g (they were about 28 days old) and were kept under identical conditions with regard to the duration of the exposure to light, the diet, the temperature, etc.

De getransplanteerde tumoren kregen de gelegenheid in aansluiting 35 aan de implantatie in de syngeneïsche gastheermuizen ongeveer 14 dagen lang te groeien.The transplanted tumors were allowed to grow for approximately 14 days after implantation into the syngeneic host mice.

B. Isolatie en suspensie van tumorcellen.B. Isolation and suspension of tumor cells.

Tumorcellen werden daarna door aseptische afname van de gastheermuizen verkregen en onder toepassing van een volgende vertering met 40 collagenase gedispergeerd, zoals hierna beschreven. De afgenomen tumo- 8201321 «- 4 5 ren werden in dobbelstenen (4x4 mm) verdeeld en het in dobbelstenen gebrachte weefsel werd over 6 tot 8 steriele Erlenmeyerkolven van poly-carbonaat verdeeld (ongeveer 500 mg/kolf). Een hoeveelheid van 10 ml van een "tumordispersieoplossing" (TDS) werd aan elk van de kolven toe-5 gevoegd.Tumor cells were then obtained by aseptic collection from the host mice and dispersed with subsequent collagenase digestion as described below. The collected tumors were divided into dice (4 x 4 mm) and the diced tissue was divided into 6 to 8 sterile flasks of polycarbonate (about 500 mg / flask). 10 ml aliquot of a "tumor dispersion solution" (TDS) was added to each of the flasks.

De TDS werd door het met elkaar mengen van de samenstelling A en de samenstelling B bereid, die hierna beschreven worden.The TDS was prepared by mixing together Composition A and Composition B, which are described below.

Samenstelling A (betrokken op 1 1) 10 9,5 g/1 steriel Eagle's "Minimum Essential Medium" (MEM) (in de handel te verkrijgen bij Gibco, Grand Island, New York), 10 ml/1 niet-essentiële aminozuren (Gibco), 10 ml/1 natriumpyruvaat, 0,35 g/1 natriumwaterstofcarbonaat (15 ramol), 15 5,9 g/1 HEPES (25 mmol) a 4-(2-hydroxxyethyl)-1-piperazine- ethaan-sulfonzuur (een organische buffer; in de handel verkrijgbaar bij Sigma Chemical, St. Louis, Missouri), 150 eenh./ml penicilline, 100 ug/ml neomycine-sulfaat.Composition A (based on 1 1) 10 9.5 g / 1 sterile Eagle's "Minimum Essential Medium" (MEM) (commercially available from Gibco, Grand Island, New York), 10 ml / 1 non-essential amino acids ( Gibco), 10 ml / 1 sodium pyruvate, 0.35 g / 1 sodium hydrogen carbonate (15 ramol), 15 5.9 g / 1 HEPES (25 mmol) a 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethane sulfonic acid ( an organic buffer, commercially available from Sigma Chemical, St. Louis, Missouri), 150 units / ml penicillin, 100 µg / ml neomycin sulfate.

20 De antibiotica werd toegevoegd om er zeker van te zijn dat geen bacteriële verontreiniging plaats vond.The antibiotics were added to ensure that no bacterial contamination occurred.

Samenstelling B is een droog mengsel, dat collagenase met weinig clostripalne en andere proteolytische activiteit bevat; desoxyribonu-clease (DNase), om het van de beschadigde celkernen vrijgemaakte des-25 oxyribonucleoproteïne op te lossen; lima-bonen- of soja-bonen-trypsi-ne-remmers, om elke tryptische restwerking uit te sluiten; menselijk serumalbumine, om niet-specifieke protease-activiteit uit te schakelen en peroxy- alsmede hydroperoxy-vetzuren te absorberen, die door beschadigde membranen worden vrijgemaakt.Composition B is a dry mixture containing collagenase with little clostripalne and other proteolytic activity; deoxyribonuclease (DNase), to dissolve the deoxyribonucleoprotein released from the damaged cell nuclei; lima bean or soy bean trypsin inhibitors, to exclude any tryptic residual action; human serum albumin, to disable nonspecific protease activity and absorb peroxy and hydroperoxy fatty acids released through damaged membranes.

30 Samenstelling B30 Composition B

Gewicht/ml van samenstelling AWeight / ml of composition A.

Collagenase (Worthington Type III) 1 mg DNase I (Sigma Chemical) 50 yg 35 Sojabonen-trypsineremmer (Worthington) 100 ygCollagenase (Worthington Type III) 1 mg DNase I (Sigma Chemical) 50 yg 35 Soybean Trypsin Inhibitor (Worthington) 100 yg

Menselijk serumalbumine 10 yg (vetzuurvrij; Sigma Chemical)Human serum albumin 10 yg (fatty acid free; Sigma Chemical)

Samenstelling B werd afgewogen en in een kolf gebracht en daarna werden 100 ml van de samenstelling A toegevoegd.Composition B was weighed and placed in a flask and then 100 ml of the composition A was added.

40 Het dobbelsteenweefsel in de TDS werd daarna onder lucht in een 820132140 The dice fabric in the TDS was then airborne in an 8201321

* V* V

6 stofwisselingsschudinrichting volgens Duhnoff (90 wentelingen/min.) ge-dispergeerd (30 min. bij 37°C). De bovenstaande lagen werden door een zijgdoek in steriele centrifuge-buisj es met ronde bodem van 50 ml uit polycarbonaat verzameld en 10 min. (25°C) met 900 omwentelingen/min.6 Duhnoff metabolic shaker (90 revolutions / min.) Dispersed (30 min. At 37 ° C). The supernatants were collected through a 50 ml polycarbonate round bottom sterile centrifuge tubes on a side cloth and 10 min (25 ° C) at 900 rpm.

5 (100 g) in een Sorvall SS-34 -Rotor gecentrifugeerd. Na het centrifu geren werden de bovenstaande fracties verwijderd. Het verkregen cellulaire materiaal (korrels) werd tweemaal met MEM-oplossing gewassen, opnieuw in MEM gesuspendeerd en op 4°G gehouden.5 (100 g) centrifuged in a Sorvall SS-34 Rotor. The above fractions were removed after centrifugation. The resulting cellular material (beads) was washed twice with MEM solution, resuspended in MEM and kept at 4 ° G.

Aan het achterblijvende dobbelsteenweefsel werd een hoeveelheid 10 van 10 ml TDS toegevoegd en het weefsel werd in een stofwisselingsschudinrichting gelncubeerd, zoals hiervoor beschreven, behalve dat de tijdsduur 60 min. bedroeg. Het centrifugeren werd herhaald en de opnieuw gesuspendeerde cellen werden verenigd.10 ml of TDS was added to the remaining dice tissue and the tissue was incubated in a metabolic shaker as described above, except that the duration was 60 min. Centrifugation was repeated and the resuspended cells were combined.

De levensvatbaarheid van de cellen werd volgens de vitale kleur-15 stofuitsluitingsmethode (vital dye exclusion method) [vgl. Exptl. Cell Res. 13, (1957) 341-347] bepaald. Het aantal cellen (cell count) werd in een Hamocytometer bepaald. De stroombare celverontreinigingen, bijvoorbeeld macrofagen, rode bloedlichaampjes, enz. werden door visueel onderzoek onder de microscoop bepaald. De tenslotte verkregen celsus-20 pensie bestond voor meer dan 99 % uit monodisperse cellen met ongeveer 25 % verontreiniging door stroombare gastheercellen. Gebruikelijke opbrengsten van 3,0 g van een B-16a- of 3LL-tumor lagen tussen 9 .Cell viability was determined by the vital dye exclusion method [cf. Exptl. Cell Res. 13, (1957) 341-347]. The cell count (cell count) was determined in a Hamocytometer. The flowable cell impurities, for example macrophages, red blood cells, etc. were determined by visual examination under the microscope. The cell suspension finally obtained consisted of more than 99% monodisperse cells with approximately 25% contamination by flowable host cells. Usual 3.0 g yields of a B-16a or 3LL tumor were between 9.

10® en 1,3 . 10^ levensbare tumorcellen.10® and 1.3. 10 ^ viable tumor cells.

De celsuspensies van de eindtrap werden daarna ter definitieve af-25 scheiding van de tumorcellen aan een centrifugale·elutriëring onderworpen. Bij de centrifugale elutriëring werden de cellen in het inwendige van een scheidingskamer aan de inwerking van twee tegengestelde krachten onderworpen, namelijk een door een roterende rotor opgewekt centrifugaal veld en een tegenstroom van vloeistof in de tegengestelde 30 ( centripetale) richting. Een in een milieu gesuspendeerd monster wordt in de scheidingskamer gebracht. Elke cel is er toe geneigd naar een zone te gaan waarin de sedimentatiesnelheid ervan precies door de doorstroomsnelheid van de vloeistof door de scheidingskamer heen wordt genivelleerd. De geometrie van de kamer brengt een gradiënt van de stro-35 mingssnelheden van het ene einde naar het andere toe stand; cellen met een ruim traject verschillende sedimentatiesnelheden kunnen in suspensie gehouden worden. Door verhoging van de stromingssnelheid van de elutriëringsvloeistof (scheidingsmedium) in trappen of door verlaging van de rotosnelheid kunnen opeenvolgende populaties met relatief homo-40 gene celgrootten uit de kamer gewassen worden. Elke populatie bevat 8201321The cell suspensions from the final stage were then centrifuged for final separation of the tumor cells. In the centrifugal elutriation, the cells in the interior of a separation chamber were subjected to the action of two opposing forces, namely a centrifugal field generated by a rotating rotor and a counterflow of liquid in the opposite (centripetal) direction. An environmentally suspended sample is introduced into the separation chamber. Each cell tends to go to a zone where its sedimentation rate is leveled exactly by the flow rate of the liquid through the separation chamber. The chamber geometry creates a gradient of flow rates from one end to the other; cells with a wide range of different sedimentation rates can be kept in suspension. By increasing the flow rate of the elutriation fluid (separation medium) in stages or by decreasing the rotational speed, successive populations with relatively homogenous 40 gene cell sizes can be washed out of the chamber. Each population contains 8201321

#·· !M# ··! M

7 cellen, die groter of dichter (dat wil zeggen sneller sedimenterend) zijn dan die van de. voorafgaande fractie.7 cells, which are larger or denser (ie faster sedimenting) than those of the. preceding fraction.

De centrifugale elutriëring werd door suspensie van de tumorcellen in een "tumor-hersuspensie-oplossing" (TRS) uitgevoerd, die de volgende 5 samenstelling betrokken op 1 liter bezat.The centrifugal elutriation was performed by suspension of the tumor cells in a "tumor resuspension solution" (TRS), which had the following composition based on 1 liter.

9,5 g/1 steriel Eagle’s "Minimum Essential Medium" (MEM)(Gibco), 10 ml/1 niet-essentiële aminozuren (Gibco), 10 ml/1 natriumpyrüvaat, 0,35 ml/1 natriumwaterstofcarbonaat (15 mmol), 10 5,9 g/1 HEPES (25 mmol) (Sigma Chemical), 150 eenh./ml penicilline, 100 pg/ml neomycine-sulfaat.9.5 g / 1 sterile Eagle's "Minimum Essential Medium" (MEM) (Gibco), 10 ml / 1 non-essential amino acids (Gibco), 10 ml / 1 sodium pyruvate, 0.35 ml / 1 sodium hydrogen carbonate (15 mmol), 5.9 g / 1 HEPES (25 mmol) (Sigma Chemical), 150 units / ml penicillin, 100 µg / ml neomycin sulfate.

De suspensie werd onder toepassing van een Beekman-JE-6 -Elutriator-Rotor geëlutrieerd, die in een Beekman J-2-21 -centrifuge 15 met 2000/min. bij 25°C werd toegepast.The suspension was eluted using a Beekman JE-6-Elutriator-Rotor, placed in a Beekman J-2-21 centrifuge at 2000 rpm. was used at 25 ° C.

Een scheidingsmedium uit "Hank’s Balanced Salt Solution" werd onder gebruik van een Cole Palmer Master Flex-pomp met een pompkop nr.A separation medium from "Hank's Balanced Salt Solution" was used using a Cole Palmer Master Flex pump with a pumphead no.

7014 door het systeem gepompt. De pompregellngskast werd door middel van een potentiometer met 10 omwentelingen gecentrifugeerd [zie Anal.7014 pumped through the system. The pump control box was centrifuged by a potentiometer with 10 revolutions [see Anal.

20 Biochem. 98, (1979) 112-115]. De doorstroomsnelheid werd met behulp van een stromingsmeter met dubbele kogel volgens Brooks gemeten.Biochem. 98, 112-115 (1979)]. The flow rate was measured using a Brooks double-ball flow meter.

De ingestelde zoutoplossing volgens Hank werd door het gereedmaken van 900 ml oplossing van de hierna volgende samenstelling en mengen met CaCl2«2 H2O, zoals daarna beschreven, bereid.The adjusted Hank saline was prepared by preparing 900 ml of the solution of the following composition and mixing with CaCl 2 · 2 H 2 O as described subsequently.

25 80 g NaCl 4 g KC1 0,98 g MgS04 30 0,48 g Na2HP04 0,60 g KH2P04 1,85 g CaCl2*2 ^0 werden tot 100 ml oplossing aangevuld en deze werd met de hiervoor aangegeven 900 ml gemengd.80 g NaCl 4 g KCl 0.98 g MgSO 4 30 0.48 g Na 2 HPO 4 0.60 g KH 2 PO 4 1.85 g CaCl 2 * 2 ^ 0 were made up to 100 ml solution and mixed with the above 900 ml.

35 Ongeveer 1 x 10^ cellen werden door een Y-passtuk in het toe- voersysteem in de mengkamer geïnjecteerd. Na verloop van 15 minuten voor de instelling van het evenwicht werden de celresten met een stromingssnelheid van 9 x 10 ml/min. geëlueerd. De tumorcellen werden in 6 fracties van elk 50 ml met stromingssnelheden van ongeveer 12 tot 18 40 ml/min. geëlueerd. De fracties 2 tot 5, die de tumorcellen bevatten, 8201321 <· 8 werden verenigd, opnieuw gecentrifugeerd (100 g) en in 1 tot 2 ml van de hiervoor beschreven TRS opnieuw gesuspendeerd. In het algemeen werden tussen 70 en 75 % van de in de mengkamer geïnjecteerde cellen teruggewonnen.About 1 x 10 4 cells were injected into the mixing chamber through a Y-fitting into the feed system. After 15 minutes before equilibrium adjustment, the cell debris was washed at a flow rate of 9 x 10 ml / min. eluted. The tumor cells were divided into 6 fractions of 50 ml each with flow rates of about 12 to 40 ml / min. eluted. Fractions 2 to 5 containing the tumor cells, 8201321 <8 were pooled, centrifuged again (100 g) and resuspended in 1 to 2 ml of the previously described TRS. Generally, between 70 and 75% of the cells injected into the mixing chamber were recovered.

5 C. Werking van 3-methyl-l-[2-(2-naftyloxy)-ethyl]-2-pyrazolin-5-on op de groei en de metastase van tumorcellen De op deze wijze verkregen B-16a-melanoom- en Lewis-longcarci-noom-cellen werden, zoals hierna beschreven, voor het onderzoek van de antimetastatische en antineoplastische werkzaamheid van de methylpyra-10 zolon-verbinding toegepast.C. Effect of 3-methyl-1- [2- (2-naphthyloxy) -ethyl] -2-pyrazolin-5-one on growth and metastasis of tumor cells. B-16a melanoma and thus obtained Lewis lung cancer cells were used, as described below, for the investigation of the antimetastatic and antineoplastic activity of the methylpyra-10-zolone compound.

(1) Metastase(1) Metastasis

Zoals reeds hiervoor werd vastgesteld, is de metastase een afzonderlijk verschijnsel, dat door een reek gecompliceerde processen wordt voorgesteld. Tegenwoordig vinden twee "model"-systemen voor het onder-15 zoek van de in vivo metastase een brede toepassing. Het eerste model-systeem omvat de subcutane injectie van de tumorcellen in het dier. De subcutane injectie van de tumorcellen en aansluitende ontwikkeling van een primaire tumor, gevolgd door spontane metastase, wordt als "volle" metastase beschoud. Een ander, model-systeem omvat de injectie van de 20 tumorcellen door de staartvene. In het licht van de gecompliceerdheid van de metastase.geldt de staartvenen-injectie als kunstmatig en slechts partieel model-systeem, omdat het alleen de processen gedurende het laatste deel van de metastase weergeeft. Het staartvenen-model-sy-steem geldt echter ook als buitengewoon gunstig met het oog op een 25 standaardisering van de proefomstandigheden [zie "Methods in Cancer Research", hoofdstuk VII, Academic Press. Ine., 1978].As noted above, metastasis is a separate phenomenon presented by a series of complicated processes. Today, two "model" systems for examining in vivo metastasis find wide application. The first model system involves the subcutaneous injection of the tumor cells into the animal. The subcutaneous injection of the tumor cells and subsequent development of a primary tumor, followed by spontaneous metastasis, is considered "full" metastasis. Another model system involves the injection of the 20 tumor cells through the tail vein. In view of the complexity of the metastasis, the tail vein injection is considered an artificial and only partial model system, as it only shows the processes during the last part of the metastasis. However, the tail vein model system is also considered extremely beneficial in standardizing test conditions [see "Methods in Cancer Research", Chapter VII, Academic Press. Ine., 1978].

Als controle-dieren werden (onbehandelde) C57Bl/6J-muizen volgens de volgende werkwijze op volle metastase onderzocht. Celsuspensies van de B-16a- en 3LL-carcinoomcellen, die zoals hiervoor onder A en B be-30 schreven verkregen waren, werden subcutaan in het rechter okselholtege-bied van de mannelijke C57Bl/6J-muizen geïnjecteerd (0,66 mm * nr. 26-naald; 0,2 ml). Verschillende hoeveelheden van de celsuspensies werden in het traject van 1 x 10^ tot 1 x 10^ cellen geïnjecteerd. Proeven over de partiële metastase werden op een zodanige wijze uitgevoerd, dat 35 tumorcellen via de staartvene in de (onbehandelde) controle muizen geïnjecteerd werden. De dieren werden onder identieke omstandigheden van temperatuur, inwerkingsduur van licht, voeding enz. gehouden. Na een waarnemingsperiode van 17 tot 30 dagen werden de voor de volle metastase en voor de partiële metastase gebruikte dieren gedood en werden de 40 longen, lever, nieren, milt en hersenweefsel verwijderd.As control animals, (untreated) C57Bl / 6J mice were tested for full metastasis according to the following procedure. Cell suspensions of the B-16a and 3LL carcinoma cells obtained as described above under A and B were injected subcutaneously into the right armpit cavity region of the male C57Bl / 6J mice (0.66 mm * no 26 needle; 0.2 ml). Different amounts of the cell suspensions were injected in the range of 1 x 10 ^ to 1 x 10 ^ cells. Partial metastasis tests were performed in such a way that 35 tumor cells were injected into the (untreated) control mice via the tail vein. The animals were kept under identical conditions of temperature, duration of action of light, feeding, etc. After an observation period of 17 to 30 days, the animals used for full metastasis and partial metastasis were sacrificed and the 40 lungs, liver, kidneys, spleen and brain tissue were removed.

8201321 98201321 9

Het verwijderde weefsel werd In een oplossing volgens Bouin gefixeerd* Het aantal van de metastatische knoopjes in elk orgaan werd met behulp van een stereo-zoom-microscoop volgens Bausch en Lomb bepaald. Het onderzoek van de controle muizen op metastatische knoopjes gaf bij 5 100 % van de dieren positieve resultaten met betrekking tot metastati sche longtumoren; de incubatietijd voor het tot stand brengen van dergelijke metaetasen bedroeg voor de 3LL-tumorcellen 17 tot 21 dagen en voor de B-16a-tumorcellen 23 tot 30 dagen. In lever, nieren, milt of hersenweefsel werden geen zichtbare knoopjes waargenomen.The removed tissue was fixed in a Bouin solution. * The number of the metastatic nodes in each organ was determined using a stereo zoom microscope according to Bausch and Lomb. The examination of the control mice for metastatic nodes gave positive results with respect to metastatic lung tumors in 100% of the animals; the incubation period for establishing such metaetases was 17 to 21 days for the 3LL tumor cells and 23 to 30 days for the B-16a tumor cells. No visible nodules were observed in liver, kidneys, spleen or brain tissue.

10 (2) Antineoplastische werkzaamheid10 (2) Antineoplastic Efficacy

De antineoplastische werkzaamheid werd in vitro door meting van de DNS-synthese zowel van B-16a- als ook van Lewis-longcarclnoom-cellen door een methode gemeten, die aan de thymidine-opname ten grondslag ligt. Cellen, die ter voorbereiding van de celdeling DNS synthetiseren, 15 zijn door hun vermogen, thymidine op te nemen, gekenmerkt. Derhalve is de cel-proliferatie met de DNS-synthese verbonden. Wanneer de hoeveelheid van het door de tumorcellen gesynthetiseerde DNS verminderd wordt, dan is dat een aanwijzing ervoor, dat de celdeling en daarmee de tumor-groei geremd wordt.Antineoplastic activity was measured in vitro by measuring the DNS synthesis of both B-16a and Lewis lung carcinoma cells by a method underlying thymidine incorporation. Cells that synthesize DNS in preparation for cell division are characterized by their ability to take up thymidine. Hence, cell proliferation is linked to DNS synthesis. When the amount of the DNS synthesized by the tumor cells is reduced, this is an indication that cell division and thereby tumor growth is inhibited.

20 De antineoplastische werkzaamheid werd bovendien door direkte me ting van de groei van de tumorcellen in vitro in weefselculturen bepaald. Deze methode bedient zich van het "plating" of openten van een bekend aantal tumorcellen op een groeimilieu en de bepaling van de werking van de aanwezigheid van de te onderzoeken verbinding op de proli-25 feratie van de tumorcellen. Tenslotte werd de antineoplastische activiteit in vivo op een wijze bepaald, dat bij de muizen subcutaan tumorcellen geïnjecteerd werden en het optreden van de groei van tumorcellen alsmede het gewicht van de groeiende tumorcellen in onbehandelde con-trole-dieren en in met de pyrazolon-verbinding behandelde dieren be-30 paald werden.In addition, the antineoplastic activity was determined by measuring growth of the tumor cells in vitro in tissue cultures. This method involves plating or opening a known number of tumor cells to a growth medium and determining the effect of the presence of the test compound on the proliferation of the tumor cells. Finally, the antineoplastic activity was determined in vivo in such a way that tumor cells were injected subcutaneously into the mice and the occurrence of tumor cell growth as well as the weight of the growing tumor cells in untreated control animals and in the pyrazolone compound treated animals were determined.

De werking van 3-methyl-l-[2-(2-naftyloxy)-ethyl]-2-pyrazolin-5-on op de door staartvenen-injectie van tumorcellen teweeg gebrachte meta-stase resp. op de volle metastase op grond van de subcutabne injectie van tumorcellen wordt in de voorbeelden I en II getoond.The action of 3-methyl-1- [2- (2-naphthyloxy) -ethyl] -2-pyrazolin-5-one on metastasis induced by tail vein injection of tumor cells, respectively. on the full metastasis from the subcutaneous injection of tumor cells is shown in Examples I and II.

35 Voorbeeld IExample I

3 mg 3-methyl-l-[2-(2-naftyloxy)-ethyl]-2-pyrazolin-5-on werden in / 0,6 ml absolute ethanol gesuspendeerd. Het gesuspendeerde pyrazolon werd door instellen van de pH op 9,5 met NaOH opgelost. De uiteindelijke concentratie van het pyrazolon werd door verdunnen van de oplossing 40 met een normaal keukenzoutoplossing (0,9 % NaCl) ingesteld.3 mg of 3-methyl-1- [2- (2-naphthyloxy) -ethyl] -2-pyrazolin-5-one were suspended in / 0.6 ml of absolute ethanol. The suspended pyrazolone was dissolved by adjusting the pH to 9.5 with NaOH. The final concentration of the pyrazolone was adjusted by diluting the solution 40 with a normal table salt solution (0.9% NaCl).

8201321 « ίο8201321 «ίο

Syn^eneïsche C57B1/6J gastheermuizen ontvingen gedurende een tijdsperiode van 3 dagen een injectie op dagelijkse basis van 0,02 en 0,08 mg/muis van de methylpyrazool-5-on-verbinding (subcutaan).Synthetic C57B1 / 6J host mice received a daily injection of 0.02 and 0.08 mg / mouse of the methylpyrazole-5-one compound (subcutaneous) over a 3 day period.

Op de vierde dag werden de voorbehandelde muizen (en de controle 5 muizen) elk met een zoals hiervoor beschreven gereed gemaakte suspensie van 5 x 10^ B-16a-tumorcellen via de staartvene geïnjecteerd. De controle muizen en de behandelde muizen werden onder identieke omstandigheden van temperatuur, inwerkingsduur van licht, voeding enz. gehouden. De muizen werden 14 dagen na de injectie in de staartvenen gedood 10 en hun longweefsel werd onderzocht. De werking van het injecteren van de pyrazolonverbinding in de muizen dén uur voor de injectie van de B-16a~tumorcellen werd eveneens onderzocht.On the fourth day, the pretreated mice (and the control 5 mice) were each injected via tail vein with a suspension of 5 x 10 ^ B-16a tumor cells prepared as described above. The control mice and the treated mice were kept under identical conditions of temperature, duration of action of light, feeding, etc. The mice were sacrificed in the tail veins 14 days after the injection and their lung tissue was examined. The activity of injecting the pyrazolone compound into the mice one hour before the injection of the B-16a tumor cells was also investigated.

Zoals uit de in tabel A samengestelde gegevens blijkt, is de toediening van de pyrazolonverbinding op een zodanige wijze werkzaam, dat 15 daardoor het aantal van de longtumorkoloniën, dat wil zeggen de meta-stase, op drastische wijze verminderd wordt, en wel zowel op het niveau van 0,08 mg als op dat van 0,02 mg.As shown in the data compiled in Table A, the administration of the pyrazolone compound is effective in such a way that it drastically reduces the number of the lung tumor colonies, that is, the metastasis, both on the level of 0.08 mg as at that of 0.02 mg.

Vermoed werd, dat de onderhavige pyrazolonverbinding de vrijmaking van prostacycline stimuleert [zie The Lancet, bladzijden 518-520 (10 20 maart 1979)]. Aangenomen wordt, dat de antitrombotische werking van het prostacycline door een verhoging van de spiegel van het cyclische adenosine-3',5'-fosforzuur (cAMP) in de plaatjes tot stand wordt gebracht. Het is eveneens bekend, dat als fosfodiësterase-remmers bekende verbindingen de splitsing van cAMP vertragen. Dienovereenkomstig zou te 25 verwachten zijn, dat fosfodiësterase-remmers, doordat zij de splitsing van cAMP vertragen, de antitrombotische werking van een antitrombotisch middel, dat door dit mechanisme werkt, bekrachtigen. Omdat plaatjes eveneens aan het mechanisme van de metastase kunnen deelnemen, werd de werking van een goed bekende fosfodiësterase-remmer, van het theofyli-30 ne, op een potentieel synergisme met de pyrazolonverbinding onderzocht .The present pyrazolone compound is suspected to stimulate the release of prostacycline [see The Lancet, pages 518-520 (March 20, 1979)]. The antithrombotic action of the prostacycline is believed to be mediated by an increase in the level of the cyclic adenosine-3 ', 5'-phosphoric acid (cAMP) in the platelets. It is also known that compounds known as phosphodiesterase inhibitors delay cAMP cleavage. Accordingly, it would be expected that phosphodiesterase inhibitors, by delaying cAMP cleavage, would potentiate the antithrombotic action of an antithrombotic agent acting by this mechanism. Since platelets can also participate in the mechanism of the metastasis, the action of a well-known phosphodiesterase inhibitor, of the theophylline, was investigated for a potential synergy with the pyrazolone compound.

Hoewel de resultaten er op wijzen, dat de antimetastastische werking door theofyline versterkt kan zijn, werd vanwege de met de proef gepaard gaande standaardfout een synergisme niet met zekerheid aange-35 toond.Although the results indicate that the antimastastic action may be enhanced by theophylline, synergism has not been demonstrated with certainty due to the standard error associated with the experiment.

8201321 11 * β :d> a) τΊ ό β Μ Ο (U Η 0) Ο __ .μ ,ϋ m icn Ο I £ι ·> * a) i^mps-'^oocojo ο < <η ή cn in 3+1+1 +! +1 +1 +1 4) u bo I cn ΐ'' ό bo *» * * ü c τ-( σ\ cm m <n Ά 5 o oo—i vo cn Ό8201321 11 * β: d> a) τΊ ό β Μ Ο (U Η 0) Ο __ .μ, ic m icn Ο I £ ι ·> * a) i ^ mps - '^ oocojo ο <<η ή cn in 3 + 1 + 1 +! +1 +1 +1 4) u bo I cn ΐ '' ό bo * »* * ü c τ- (σ \ cm m <n Ά 5 o oo — i vo cn Ό

C Η -HC Η -H

<U<You

> u> you

MM

Cd «dCD «d

4J4J

CDCD

33

•H• H

s > 0) CD gs> 0) CD g

Cd OCd O

IJ IIJ I

ï 7 «t L J.ï 7 «t L J.

w £ 2 2 Η β s - o *2w £ 2 2 Η β s - o * 2

<u 2 S<u 2 S

3 cd ™ Μ Λ 6 >*8 5* o. <? 1 i3 cd ™ Μ Λ 6> * 8 5 * o. <? 1 i

- CM O- CM O

0 1 2 <11 3 ^ H ? g g £ g 3 5 3 ? ? ΰ 3 5 ? ? f ΐ 8 5 i i ►; -S 50 1 2 <11 3 ^ H? g g £ g 3 5 3? ? ΰ 3 5? ? f ΐ 8 5 i i ►; -S 5

Cj Η Γ-) Μ γΗ Η *h si O o 0 0 3-1 CL N N τΗ N ö 1 cd cd £*> ai O aj CM W O U W ^ rj I ►. >» *H· ft _ ^ rmmt CL» O CÖ CU 0 d)Cj Η Γ-) Μ γΗ Η * h si O o 0 0 3-1 CL N N τΗ N ö 1 cd cd £ *> ai O aj CM W O U W ^ rj I ►. > »* H · ft _ ^ rmmt CL» O CÖ CU 0 d)

* Λ A f A l I* Λ A f A l I

t i λ s i. s It i λ s i. s I

4J iH rM 1 at 3 JJ4J iH rM 1 at 3 YY

1 >·> >> « ft ® u g —. J3 ^ Ό dt1> ·> >> «ft ® u g -. J3 ^ Ό dt

IJ μ 1 JJ CJ 0} iHIJ μ 1 YY CJ 0} iH

6 <1)<U —) <U Ο Ό Ή 0 cd 11 _L ‘ V u 36 <1) <U -) <U Ο Ό Ή 0 cd 11 _L ‘V u 3

ft 5 ft ft j? ft Ο Ο Oft 5 ft ft j? ft Ο Ο O

£3 8 8 1ΙΜ>Ι£ 3 8 8 1ΙΜ> Ι

cd a) η h 8 'T' m — Hcd a) η h 8 'T' m - H

ö u >* >» i ft 2 C· 4-1 J, fa Z <44 co a cj a)ö u> *> »i ft 2 C · 4-1 J, fa Z <44 co a cj a)

Co cd Λ « e g> ·« 1 o c a oo ö o JH ,Co cd Λ «e g> ·« 1 o c a oo ö o JH,

CM Ö I I Ο I > Ό MCM Ö I I Ο I> Ό M

‘-‘«β CM CM * CM Cd — 9"-" "β CM CM * CM Cd - 9

I _j w w Ο ^ MI _j w w Ο ^ M

Λ ο I I I -y ^ > IS CM CM + CM ö m -Λ ο I I I -y ^> IS CM CM + CM ö m -

Jj 1-11-1¾ >—' *h m 35Yy 1-11-1¾> - '* h m 35

'TL (U i I bo bO I · MTL (U i I bo bO I · M

ft 5 Λ -h 3. 3- -c CVOT-jrHft 5 Λ -h 3.3- -c CVOT-jrH

WO II I at *H _ φ q HHOOrHHHH'gWWII I at * H _ φ q HHOOrHHHH'g

f M jC-CC^e^rd OiCibOOf M jC-CC ^ e ^ rd OiCibOO

- 1 1 ξ 0 * 8 " ·. -3 s- 1 1 ξ 0 * 8 ". -3 s

Si g1 f f i i P ο I o « >o -H cn cn Η H cn r-icno-o fi t is s I I s :,:1 wcdöo cd W CM 00 0 O 00 w—< JS 30 o <U O o Η I 0 o «J3 J3 » · · · * >3 p5 (β ao Ο Η Η O cd 3 Ü 3 8201321 12Si g1 ffii P ο I o «> o -H cn cn Η H cn r-icno-o fi t is s II s:,: 1 wcdöo cd W CM 00 0 O 00 w— <JS 30 o <UO o Η I 0 o «J3 J3» · · · *> 3 p5 (β ao Ο Η Η O cd 3 Ü 3 8201321 12

Voorbeeld IIExample II

De werking van de toediening van de pyrazolon-verbinding gedurende een langere tijdsperiode op bet aantal van de metastatische longkolo-niën van het B-16a en bet Lewis-longcarcinoom werd zoals hierna be-5 schreven bepaald» 3 mg 3-methyl-l-[2-(2-naftyloxy)-ethyl]-2-pyrazolin-5-on werden in 0,6 ml ethanol opgelost en de oplossing werd met geconcentreerde natriumhydroxide op een pH van 9,5 ingesteld.The effect of the administration of the pyrazolone compound over a longer period of time on the number of the metastatic lung colonies of the B-16a and the Lewis lung carcinoma was determined as described below »3 mg 3-methyl-1- [2- (2-naphthyloxy) -ethyl] -2-pyrazolin-5-one was dissolved in 0.6 ml of ethanol and the solution was adjusted to pH 9.5 with concentrated sodium hydroxide.

Bij syngeneïsche C57BL/6J gastheermuizen werd een suspensie van 10 1,8 x 105 B-16a-cellen subcutaan geïnjecteerd, welke suspensie zo als hiervoor beschreven werd bereid. Bij een andere reeks syngeneïsche C57BL/6J gastheermuizen werd een suspensie van 1 x 10^ Lewis-longcar-cinoom-cellen, verkregen zoals hiervoor beschreven, subcutaan geïnjecteerd. Vanaf de dag na de injectie van de tumorcellen ontvingen de mui-15 zen 28 dagen lang een subcutane injectie van een dagelijkse eenheidsdo-sering van hetzij 0,01 hetzij 0,08 mg van de pyrazolonverbinding. De controle muizen en de behandelde muizen werden onder identieke omstandigheden van temperatuur, inwerkinvsduur van licht, voeding, enz. gehouden». De muizen, die de injectie van de B-16a“tumorcellen ontvangen 20 hadden, werden 25 dagen na de injectie van de tumorcellen gedood; de muizen, waarbij de Lewis-longcarcinoom-cellen geïnjecteerd waren, werden 21 dagen na de injectie van de tumorcellen gedood.In syngenic C57BL / 6J host mice, a suspension of 10 1.8 x 105 B-16a cells was injected subcutaneously, which suspension was prepared as described above. In another series of syngenic C57BL / 6J host mice, a suspension of 1 x 10 7 Lewis lung carcinoma cells, obtained as described above, was injected subcutaneously. From the day after the injection of the tumor cells, the mice received a subcutaneous injection of a daily unit dose of either 0.01 or 0.08 mg of the pyrazolone compound for 28 days. The control mice and the treated mice were kept under identical conditions of temperature, exposure time of light, feeding, etc. ». The mice that received the injection of the B-16a tumor cells were sacrificed 25 days after the injection of the tumor cells; the mice injected with the Lewis lung carcinoma cells were killed 21 days after the injection of the tumor cells.

De bij het onderzoek van het longweefsel verkregen experimentele gegevens zijn in tabel B samengevat.The experimental data obtained from the lung tissue examination are summarized in Table B.

25 8201321 “ * 13 υ 3 ^ S0 «Μ £ Ή 0 "Ί ^ s φ ^ r1 Ο Η <Ν ^ Η Η -< Γ» 5 jl ^ μ-' 0 Ü ο ,_ Ό I Μ <1-25 8201321 “* 13 υ 3 ^ S0« Μ £ Ή 0 "Ί ^ s φ ^ r1 Ο Η <Ν ^ Η Η - <Γ» 5 jl ^ μ- '0 Ü ο, _ Ό I Μ <1-

H Μ 0 « AH Μ 0 «A

0) Ο Ο Ό . · . σ 0 S ιΗ . I I I ι ® 31+11 I ι +1 Ü 4-1 C0 _ 0) b0 ·Η βΟ •fH ö {? Λ —Γ β Ο (U <r Ο Η |J (J <0 0 &ο 3 Λ 0 C ^ h !0 ι-Η ^-ν ✓v0) Ο Ο Ό. ·. σ 0 S ιΗ. I I I ι ® 31 + 11 I ι +1 Ü 4-1 C0 _ 0) b0 · Η βΟ • fH ö {? Λ —Γ β Ο (U <r Ο Η | J (J <0 0 & ο 3 Λ 0 C ^ h! 0 ι-Η ^ -ν ✓v

Η ^ CM «Μ Μ CMΗ ^ CM «Μ Μ CM

0J 0 «Μ ι-ι *Η CO Ο 3 ^ ''ι >* ΤΞϊ Λ Η 0 'β' 1-* Ι"« ® 4J Ο ιΗ w ^ ^ 0J ^ Η Ü Λ „ — α} ι φ -η ιί O' οο ® π Li fl ·» * · * * * 0 OIMOOOO a pa fi Λ , . w s 3 VO +| +| +1 +] +1 w ë ω V -h r-. m -h -a· +1 CÖ G P5 Λ * * * * im jj Q -*3“ i*H CN CO ^ I* 0+1-^0J 0 «Μ ι-ι * Η CO Ο 3 ^ '' ι> * ΤΞϊ Λ Η 0 'β' 1- * Ι" «® 4J Ο ιΗ w ^ ^ 0J ^ Η Ü Λ" - α} ι φ - η ιί O 'οο ® π Li fl · »* · * * * 0 OIMOOOO a pa fi Λ,. ws 3 VO + | + | +1 +] +1 w ë V -h r-. m -h - a · +1 CÖ G P5 Λ * * * * im yy Q - * 3 “i * H CN CO ^ I * 0 + 1- ^

2 M2 M

co J2 4 ε ^ 0 n* ft 0 o π 60co J2 4 ε ^ 0 n * ft 0 o π 60

§ O§ O

Ml HMl H

*3 Ί f f f ? ,3 _Q H 1111 *2* 3 Ί f f f? 3.3 H 1111 * 2

HO ? ? T T HHO? ? T T H

N 0 0 0 Ö « λ ή ’’Ί üj yN 0 0 0 Ö «λ ή’ Ί üj y

Ll jQ H rH H iH 0 SL e ο ο ο ο h ft Ο Μ S « g S .Ll jQ H rH H iH 0 SL e ο ο ο ο h ft Ο Μ S «g S.

1 O 3 0 0 0 M ·1 O 3 0 0 0 M

<n 0 * £ £. £ 4JM<n 0 * £ £. £ 4JM

-¾ SS&S: . s S. S A A A A 5!'-¾ SS&S:. s S. S A A A A 5! '

s M 111! Φ 0 O. Os M 111! O 0 O. O

t) hQ I—t I"I *"“* *™“· Φ Ψ O <Ut) hQ I — t I "I *" "* * ™" · Φ Ψ O <U

<üö rH iH iH rH ti t{ - T?<Üö rH iH iH rH ti t {- T?

Λ η P .0 P .0 00:0WΛ η P .0 P .0 00: 0W

b.1 4JJJWJJ 1-)-1-)1-(0)b.1 4YYYWYY 1 -) - 1-) 1- (0)

Mm 0000 33060 a 5 till «η in o >,0 60600¾Mm 0000 33060 a 5 till «η in o>, 0 60600¾

£ ^ 8 Ο § O 33M<N£ ^ 8 Ο § O 33M <N

00 ΗΗΗιΗ 222A00 ΗιΗ 222A

00 >v >·> 6b t* 2S§° 4J+J+J4J 4J+J3 CM 0 H'W'Wiy 3 3 « 0 ^ a 0000 2 2 Λ, ^ ΙΟ 0 O 0 0 ^^000> v> ·> 6b t * 2S§ ° 4J + J + J4J 4J + J3 CM 0 H'W'Wiy 3 3 «0 ^ a 0000 2 2 Λ, ^ ΙΟ 0 O 0 0 ^^ 0

cm o iii* 2 2 Scm o iii * 2 2 S

Urt CM CM CM CM MMO0Urt CM CM CM CM MMO0

1 crt w v-/ v-/ CO CO1 crt w v- / v- / CO CO

‘ j till e cs *rf y 10 CM CM CM CM _5 _S ti m j g i__i i—i i—i i—i r-l H 0 Ü bL B lilt i-H 1+ W -£ j* r* 4 i-H ι—< φ CJ CO J3'j till e cs * rf y 10 CM CM CM CM _5 _S ti mjg i__i i — ii — ii — i rl H 0 Ü bL B lilt iH 1+ W - £ j * r * 4 iH ι— <φ CJ CO J3

So 1111 ο Ο Φ COSo 1111 ο Ο Φ CO

ft IISI ^^aiSft IISI ^^ aiS

^¾¾¾ 1-1 Η ·τ7 30M S|!^^ >0H cncn^cn eosöp bo 0 0 H 60 60 ω ω —ι ι—ι <s p ο ι ό o a a a a + 0 3 n * —^ ¾¾¾ 1-1 Η · τ7 30M S |! ^^> 0H cncn ^ cn eosöp bo 0 0 H 60 60 ω ω —ι ι — ι <s p ο ι ό o a a a + 0 3 n * -

,Mv0 0 -U CM ^ M, Mv0 O-U CM ^ M

U-Hp 30000 ....U-Hp 30000 ....

Ait m ο λ * λ λ ···· l^pqfS UOOOO Φ,ΛΟΤΟ 8201321 14Ait m ο λ * λ λ ···· l ^ pqfS UOOOO Φ, ΛΟΤΟ 8201321 14

Zoals de in tabel B samengevatte proefwaarden laten zien, wordt het aantal van de metastatische longkoloniën, zowel van het B-16a~ melanoom alsook van het 3LL-carcinoom door de toediening van de pyrazo-lonverbinding drastisch verminderd.As the test values summarized in Table B show, the number of the metastatic lung colonies, both of the B-16a melanoma and of the 3LL carcinoma, is drastically reduced by the administration of the pyrazolone compound.

5 Met het oog op de B-16a-melanoomrmetastase leek een doseringsni- veau van 0,01 mg bijna net zo werkzaam te zijn als een dosèringsniveau van 0,08 mg.In view of the B-16a melanoma metastasis, a dose level of 0.01 mg appeared to be almost as effective as a dose level of 0.08 mg.

Zoals reeds hiervoor geschetst wordt de subcutane injectie van tumorcellen en daaropvolgende ontwikkeling van een primaire tumor, ge-10 volgd door spontane metastase, als "volle" metastase beschouwd. Omdat de werkwijze van voorbeeld II deze volle metastase betrof, was het aantal van de in de controle dieren aanwezige longtumorkoloniën kleiner dan dat bij de controle dieren van voorbeeld I, waarbij de metastase op grond van de injectie van de tumorcellen in de staartvene ontwikkeld 15 was. Zowel de gegevens in voorbeeld I, alsook de gegevens in voorbeeld II laten echter zien, dat de pyrazolonverbinding een sterke antimeta-stasen-werkzaamheid bezit.As previously outlined, the subcutaneous injection of tumor cells and subsequent development of a primary tumor followed by spontaneous metastasis is considered "full" metastasis. Because the method of Example II involved this full metastasis, the number of lung tumor colonies present in the control animals was smaller than that in the control animals of Example I, where the metastasis developed from the injection of the tumor cells into the tail vein . However, both the data in Example I and the data in Example II show that the pyrazolone compound has a strong antimetase activity.

De antineoplastische werkzaamheid van de pyrazolonverbinding werd door meting van thymidine-opname als maat voor de DNS-synthese be-20 paald.The antineoplastic activity of the pyrazolone compound was determined by measuring thymidine incorporation as a measure of DNS synthesis.

Voorbeeld IIIExample III

B-16a~ en Lewis-longcarcinoom-ce11en werden zoals hiervoor beschreven verkregen. De gedispergeerde cellen werden in steriele Erlenmeyer-kolven van 25 ml uit kunststof tot een concentratie van 1 x 25 10^ cellen/ml in MEM verdund. Met tritium gemerkt Thymidine (½) met een specifieke activiteit van 1,85 x ÏO”^ tot 2,96 x 10“® s~Vmmol (50-80 Ci/mmol) werd met 7,4 x 10“^ s~V®l (2 yCi/ml) aan elke ml van de celsuspensie toegevoegd.B-16a and Lewis lung carcinoma cells were obtained as described above. The dispersed cells were diluted in sterile 25 ml plastic Erlenmeyer flasks to a concentration of 1 x 25 10 cells / ml in MEM. Tritium-labeled Thymidine (½) with a specific activity of 1.85 x 10 "^ to 2.96 x 10" s ~ Vmmol (50-80 Ci / mmol) was added with 7.4 x 10 "^ s ~ V L1 (2 yCi / ml) added to each ml of the cell suspension.

Aan een reeks kolven, die de B-16a~ en Lewis-longcarcinoom-cel-30 len bevatten, werd de pyrazolonverbinding in hoevelheden van 0,1, 1,0, 10 en 25 yg/ml van het totale volume toegevoegd. De kolven werden vervolgens tezamen met controle kolven van de tumorcellen, die geen pyrazolonverbinding bevatten, bij 37°C in een stofwisselings-schudinrich-ting volgens Dubnoff (90 wentelingen/min.) geïncubeerd.To a series of flasks containing the B-16a and Lewis lung carcinoma cells, the pyrazolone compound was added in amounts of 0.1, 1.0, 10 and 25 µg / ml of the total volume. The flasks were then incubated together with control flasks of the tumor cells, which did not contain pyrazolone compound, at 37 ° C in a Dubnoff metabolic shaker (90 revolutions / min).

35 Met tijdsintervallen van 4 h en 18 h werden 4 gelijke hoeveelheden tot 1 ml met een pipet afgenomen en in conische polypropeenbuisjes van 1,5 ml gebracht. De cellen werden door 8 minuten roteren in een mini centrifuge volgens Brinkman (10.000 g) tot korrels gecentrifugeerd. De bovenstaande fractie werd verwijderd en in een reservoir voor radio-40 actief afval afgevoerd. Een hoeveelheid van 1,0 ml koud trichloorazijn- 8201321 T *2 15 zuur (6 gew./vol.%) werd aan elk buisje toegevoegd on de aanwezige proteïnen neer te slaan, met inbegrip van DNS en RNS. De buisj es werden met een kap gesloten en rondgedraaid, om zoals hiervoor beschreven de cellen door centrifugeren uit elkaar te breken. De verkregen korrels 5 bevatten de in zuur onoplosbare fractie met het DNS. De bovenstaande laag, die de in zuur oplosbare bestanddelen bevat, werd verwijderd. De binnenzijde van elk buisje werd met een watte-prop-staafje afgeveegd om de overmaat in zuur oplosbare radio-activiteit te verwijderen. De korrels werden door toevoeging van 50 pl van een middel dat zorgt voor het 10 oplossen van weefsel, in de handel verkrijgbaar bij Amersham Corporation, Del., Arlington Heights, Illinois, onder de handelsnaam NCS, in elk buisje opgelost. De buisjes werden met kappen afgesloten en bij ongeveer 50eC ongeveer 2 uren lang of tot de korrels opgelost waren, ge-ïncubeerd.At 4 h and 18 h time intervals, 4 equal aliquots up to 1 ml were taken with a pipette and placed into 1.5 ml conical polypropylene tubes. The cells were centrifuged by spinning in a Brinkman mini centrifuge (10,000 g) for 8 minutes. The above fraction was removed and discharged into a radioactive waste reservoir. 1.0 ml of cold trichloroacetic acid 8201321 T * 2 15 acid (6 w / v%) was added to each tube to precipitate the proteins present, including DNS and RNS. The tubes were capped and rotated to break up the cells by centrifugation as described above. The granules obtained contained the acid-insoluble fraction with the DNS. The supernatant containing the acid-soluble ingredients was removed. The inside of each tube was wiped with a cotton swab to remove excess acid soluble radioactivity. The beads were dissolved in each tube by adding 50 µl of tissue dissolution agent, commercially available from Amersham Corporation, Del., Arlington Heights, Illinois, under the tradename NCS. The tubes were capped and incubated at about 50 ° C for about 2 hours or until the granules dissolved.

15 De toppen van de buisjes, die de opgeloste korrels bevatten, wer den afgesneden en de inhoud werd in scintillatie-ampullen overgebracht.The tips of the tubes containing the dissolved granules were cut off and the contents were transferred into scintillation ampoules.

3 ml van een scintillatie-telvloeistof met xyleen in de verhouding 2 : 1 gemengd werden in elke scintillatie-ampul gebracht. Elke ampul werd afgesloten en geslingerd en de hoeveelheid van het door DNS-synthese 20 opgenomen radio-actief gemerkte thymidine werd bepaald. De telwaarden per minuut werden met behulp van een Searle-PDS-computer onder gebruik van de analyse voor de correctie van de teruggang (quench-correction analysis) gecorrigeerd en als procentueel aandeel van de controle-waar— de aangegeven.3 ml of a 2: 1 scintillation counting solution mixed with xylene were placed in each scintillation vial. Each ampoule was sealed and slung and the amount of the radiolabeled thymidine incorporated by DNS synthesis was determined. The counts per minute were corrected using a Searle PDS computer using the quench correction analysis and indicated as a percentage of the control value.

25 De verkregen proefresultaten zijn in fig.Λ voorgesteld. Bij elke pyrazolon-concentratle is de hoeveelheid van het gesynthetiseerde DNS op het niveau van 100 % voor het controle-monster betrokken. Zoals fig.The test results obtained are shown in fig. Each pyrazolone concentrate involves the amount of the synthesized DNS at the 100% level for the control sample. As fig.

4 laat zien, bewerkstelligt de pyrazolonverbinding een van de concentratie afhankelijke afname van de DNS-synthese, zoals deze door middel 30 van de %-thymidine-opname werd bepaald. Deze afname van de DNS-synthese laat zien, dat de pyrazolonverbinding een antineoplastische werkzaamheid bezit.4 shows that the pyrazolone compound effects a concentration dependent decrease in DNS synthesis as determined by the% thymidine incorporation. This decrease in DNS synthesis shows that the pyrazolone compound has antineoplastic activity.

Het aantonen van de inbouw van het thymidine in het DNS werd uitgevoerd, zoals dit in Biochem. and Biophysical Research Communications, 35 87, Nr, 3, bladzijden 795-801 (1979), beschreven werd.Demonstration of the incorporation of the thymidine in the DNS was performed, such as in Biochem. and Biophysical Research Communications, 35 87, No. 3, pages 795-801 (1979).

Een ander bewijs voor de antineoplastische werkzaamheid van de pyrazolonverbinding werd door direkte meting van de proliferatie van de tumorcellen in weefselculturen aangevoerd.Another evidence for the antineoplastic activity of the pyrazolone compound was provided by direct measurement of the proliferation of the tumor cells in tissue cultures.

Voorbeeld IVExample IV

40 B-16a“melanoom-cellen, die zoals hiervoor beschreven verkregen 8201321 i * ié 16 waren, werden in Petrischalen van 60 mm met roosters (gridded) met een dichtheid van 3 x 10^ cellen per plaat overgeënt. De cellen werden in een milieu uit MEM, basisch zoutoplossing volgens Hank en 10 % foetaal kalfsserum, in de handel verkrijgbaar bij Microbiological Associates, 5 Walkersville, Maryland, gekweekt.40 B-16a melanoma cells, which were obtained as described above, 8201321 * 16 16, were seeded into 60 mm Petri dishes with grids (gridded) at a density of 3 x 10 4 cells per plate. The cells were cultured in an environment of MEM, Hank basic saline and 10% fetal calf serum, commercially available from Microbiological Associates, Walkersville, Maryland.

Na een incubatie van 24 uren bij 37°C werden de celtellingen door visueel tellen in een omkeer-microscoop uitgevoerd. Het milieu werd verwisseld en door het hiervoor aangeduide milieu en pyrazolon in een concentratietraj eet, dat van 0,1 tot 25 pg/ml rijkt, vervangen. De con-10 trole-groepen bevatten slechts een uitwisseling van het milieu. Daarna werd het pyrazzolon bevattende milieu elke tweede dag vervangen. Na 8 dagen werden celtellingen, zoals hiervoor beschreven, uitgevoerd en de levensvatbaarheid van de cellen werd volgens de hiervoor genoemde vitale kleurstof uitsluitmethode (vital dye exclusive method) bepaald.After a 24 hour incubation at 37 ° C, the cell counts were performed by visual counting in an inverted microscope. The medium was exchanged and replaced with the above-mentioned medium and pyrazolone in a concentration range ranging from 0.1 to 25 µg / ml. The control groups contain only an exchange of the environment. The pyrazzolone-containing medium was then replaced every second day. After 8 days, cell counts as described above were performed and cell viability was determined by the vital dye exclusive method mentioned above.

15 De verkregen proefresultaten zijn in fig. 5 voorgesteld.The test results obtained are shown in Fig. 5.

De gegevens zijn voorgesteld als gemiddelde waarden van het aantal cellen + standaardfout uit parallelproeven met zes platen. Het getal boven elke dwarsstreep geeft de levensvatbaarheid van de cellen, betrokken op een 100-procents levensvatbaarheid van de cellen aan. De ge— 20 geus laten zien, dat de pyrazolonverbinding de proloferatie van de tumorcellen over hetzelfde doseringstraject remde, waarover de verbinding ook de DNS-synthese remde.The data are presented as mean values of cell number + standard error from parallel tests with six plates. The number above each cross line indicates the viability of the cells, based on a 100 percent viability of the cells. The results show that the pyrazolone compound inhibited the proloperation of the tumor cells over the same dosage range over which the compound also inhibited DNS synthesis.

De index van de levensvatbaarheid, die in het traject tussen 96 + 0,9 en 94+0,4 lag, laat herkennen, dat de antineoplastische wer-25 king van de pyrazolonverbinding niet op cytotoxiciteit van de verbinding berust.The viability index, which was in the range between 96 + 0.9 and 94 + 0.4, indicates that the antineoplastic activity of the pyrazolone compound is not due to compound cytotoxicity.

Voor de meting van de antineoplastische werkingen van de pyrazolonverbinding werd een andere proef in vivo uitgevoerd.Another assay was performed in vivo to measure the antineoplastic activities of the pyrazolone compound.

Voorbeeld VExample V

30 3 mg 3-methyl-l~[2-(2-naftyloxy)-ethyl]-2-pyrazolin-5-on werden in 0,6 ml ethanol opgelost en de oplossing werd met geconcentreerd natriumhydroxide op een pH van 9,5 ingesteld.3 mg of 3-methyl-1 ~ [2- (2-naphthyloxy) -ethyl] -2-pyrazolin-5-one were dissolved in 0.6 ml of ethanol and the solution was concentrated with concentrated sodium hydroxide at a pH of 9.5 set.

Bij syngeneische C57BL/6J gastheermuizen werden 1 x 10^ Lewis— longcarcinoom-cellen (0,2 ml) subcutaan in het okselholtegebied geïn-35 jecteerd. Na een tijdsinterval van 24 uren werd de pyrazolonverbinding 21 dagen lang dagelijks toegediend. De werking van de toediening van theofylline tezamen met de pyrazolonverbinding werd eveneens onderzocht. Gedurende het tijdsinterval werden de muizen onder identieke omstandigheden van temperatuur, inwerkingsduur van licht, voeding enz.In syngenic C57BL / 6J host mice, 1 x 10 7 Lewis lung carcinoma cells (0.2 ml) were injected subcutaneously into the axillary cavity region. After a time interval of 24 hours, the pyrazolone compound was administered daily for 21 days. The action of the administration of theophylline together with the pyrazolone compound was also investigated. During the time interval, the mice were fed under identical conditions of temperature, duration of action of light, feeding, etc.

40 gehouden. De muizen werden 22 dagen na de injectie van de tumorcellen 8201321 17 gedood en door middel van een totale necropsie op de aanwezigheid van subcutane tumoren onderzocht. Aanwezige tumoren werden verwijderd en op een analyse-balans gewogen.40 held. The mice were sacrificed 22 days after the injection of the tumor cells 8201321 17 and examined by total necropsy for the presence of subcutaneous tumors. Tumors present were removed and weighed to an analysis balance.

De verkregen proefresultaten zijn in tabel C samengevat.The test results obtained are summarized in Table C.

8201321 18 “bo os Ό r·* cm >n jjï cn <1· cm —i ^ A A A Λ «* ο ο ο ο ο to Λ +| +1 +| +1 +1 ι8201321 18 “bo os Ό r · * cm> n jjï cn <1 cm” i ^ A A A Λ «* ο ο ο ο ο to Λ + | +1 + | +1 +1 ι

•Ο ϋ G• Ο ϋ G

•Η Ή 00 <Γ σ> Ό 00 >-Η 3 ,Ο S σ\ t'' <f ^ 1Λ ΟΊ Ή Λ) * A A * * * .ι ϋ on ο ο ο ο a) •S ° & £ a) Η ω α) Ό Η „ _ ·• Η Ή 00 <Γ σ> Ό 00> -Η 3, Ο S σ \ t '' <f ^ 1Λ ΟΊ Ή Λ) * AA * * * .ι ϋ on ο ο ο ο a) • S ° & £ a) Η ω α) Ό Η "_ ·

3 4J9«gcnmooooini>.OO3 4J9 «gcnmooooini> .OO

Η CONfM on γμ η 3 3 0) 3 3 3 wo* ** 3 3 οΗ CONfM on γμ η 3 3 0) 3 3 3 wo * ** 3 3 ο

JS 2 (UJS 2 (U

<3 Η Γ-s cm cm cm CM cm CM t-| ft MnJCMf-Hi-ti-··^^\ rH 3<3 Η Γ -s cm cm cm CM cm CM t- | ft MnJCMf-Hi-ti- ·· ^^ \ rH 3

ft O 3 ^ ^ ''ί — ~ Hft O 3 ^ ^ '' - ~ H

iömcosc^cncMO 3 ai 9 4 M 00 Η H «3 _ jj Όiömcosc ^ cncMO 3 ai 9 4 M 00 Η H «3 _ yy Ό

Ü <UÜ <U

3 3 3 H3 3 3 H

3 ο ο λ U> I 1 <u m m in ω μ I ι οι <3 3 3 33 ο ο λ U> I 1 <u m m in ω μ I ι οι <3 3 3 3

U ·Η Ή HU · Η Ή H

Ο Η Η Ο a ο ο £ § Ν Μ Η μ 3 3 3 3 3 3 3 >> fj1 ^ irt Cu 3* Ο ΌΟ Η Η Ο a ο ο £ § Ν Μ Η μ 3 3 3 3 3 3 3 >> fj1 ^ irt Cu 3 * Ο Ό

1 I H1 I H

Q. CM CM 3 3 Ο 113 3 —> rö 3 0 3 Η Η 3 Ο >* £> S 3 ' HI rfS -3 Η -Η 3 ΙΓ) 3 3 3 rfJl 3 3d « « ^ * 3 3 Ο Ο Ο I 1 Η 3 Η Η III θ' Ο 8 Μ η m m m >> Pm ο 111 X X cm λ · Ν 33« 0 0-1¾¾ 3 Η Η Η Η Η Ο 3 3Q. CM CM 3 3 Ο 113 3 -> rö 3 0 3 Η Η 3 Ο> * £> S 3 'HI rfS -3 Η -Η 3 ΙΓ) 3 3 3 rfJl 3 3d «« ^ * 3 3 Ο Ο Ο I 1 Η 3 Η Η III θ 'Ο 8 Μ η mmm >> Pm ο 111 XX cm λ · Ν 33 «0 0-1¾¾ 3 Η Η Η Η Η Ο 3 3

3 Η Η Η >% >» ^ "Η J3 Η Η Η>%> »^" Η J

>, Ο Ο Ο 33 £ 0) ft, ΝΝΝ <3 <3 3 3>, Ο Ο Ο 33 £ 0) ft, ΝΝΝ <3 <3 3 3

ι 333 333Ö0U333 333O0U

CM 3 33 333^3 I >. S3 >ι I 1 3 S ΤΡ .—. CUftiCU CM es 3 · 3 3 Η 111 "w v-»· U 3 Η JH- >; CM CM CM I I .a 3 «3 3 S III CM CM 3 3 60 3 pi, „ _ u_i u-i CO ft 3CM 3 33 333 ^ 3 I>. S3> ι I 1 3 S ΤΡ .—. CUftiCU CM es 3 · 3 3 Η 111 "w v-» · U 3 Η JH->; CM CM CM I I .a 3 «3 3 S III CM CM 3 3 60 3 pi," _ u_i u-i CO ft 3

3 HHH I I _ H 3 H3 HHH I I _ H 3 H

I f>S >s >i >3· h 3 h SI f> S> s> i> 3 h 3 h S

Λ £ £ £ I I <U 3 _ * >, 333 Η H 13 3 3 Mitt 333 . >·. P 3 H « S III 35 £ 33^0- H s·^ /~\ /~\ 3315,.£ £ £ £ I I <U 3 _ *>, 333 Η H 13 3 3 Mitt 333. > ·. P 3 H «S III 35 £ 33 ^ 0- H s ^ / ~ \ / ~ \ 3315 ,.

>> t*. ps >i 33 Mf H 3>> t *. ps> i 33 Mf H 3

3 8 1 3 CM g H3 8 1 3 CM g H

3 0 O 0 1133 0 O 0 113

3 HHH on cl H 3 H3 HHH on cl H 3 H

3 ps Ps HO"3 1 333 60 &0 3 bO O 33 ps Ps HO "3 1 333 60 & 0 3 bO O 3

CM 333 8 S V g „ JCM 333 8 S V g „J

\s 333 I <3 3 3\ s 333 I <3 3 3

I 333 -1 CM 31 HOI 333 -1 CM 31 HO

CM III O O J H UCM III O O J H U

CM CM CM * « 00 3 3 HCM CM CM * «00 3 3 H

I © O 1033 3 III 3 -a 3 3 I' CM CM CM + + 3-33¾ H 3 i—* >—i *·“* 3 3 S 3 3 >, 8 I I I 3 3 3 +1 CD O 3 £ o 33H 3 3 3 3 3 r3 3I © O 1033 3 III 3 -a 3 3 I 'CM CM CM + + 3-33¾ H 3 i— *> —i * · “* 3 3 S 3 3>, 8 III 3 3 +1 CD O 3 £ o 33H 3 3 3 3 3 r3 3

4J0 I I 13HH333S4J0 I I 13HH333S

33 HHHHHH p> ft CO H33 HHHHHH p> ft CO H

β H >ipii>iHHHra3 Γ Ü ,3^^bi>.>iebogw on 3 33 3,3,3,3 3+5,^ 3 3 3 3 CU ft 3* >3 η Ήβ H> ipii> iHHHra3 Γ Ü, 3 ^^ bi>.> iebogw on 3 33 3,3,3,3 3 + 5, ^ 3 3 3 3 CU ft 3 *> 3 η Ή

ft U bO I 6 8 0 0 0 33HHft U bO I 6 8 0 0 0 33HH

§ bO 3 I Γ f 3 3 3 HJ3HH§ bO 3 I Γ f 3 3 3 HJ3HH

p, ft H on CO on ,3 .3 ,3 33p, ft H on CO on, 3.3, 33

? Ο H 3 HHE-i'ACbObO? Ο H 3 HHE-i'ACbObO

bn H 3 H bO bo bO 0333bn H 3 H bO bo bO 0333

ft I T) 0 £ S g bO bO bO > Q Qft I T) 0 £ S g bO bO bO> Q Q

•H CQ 3 3 3* 3* 3*• H CQ 3 3 3 * 3 * 3 *

^ Ή 3 3 H CM CO^ Ή 3 3 H CM CO

3&,3 3000000 33 3 0 * ι «minui · ·· J2PP3 ü O O O CM CM CM 3,00 8201321 193 &, 3 3000000 33 3 0 * ι «minui · ·· J2PP3 ü O O O CM CM CM 3.00 8201321 19

Zoals de proefresultaten in tabel C laten zien, werden zowel de frequentie van het optreden alsook het gewicht van de Lewis-longearci-nooin-tuniofen door de subcutane toediening van de pyrazolonverbinding verminderd; dit laat de antineoplastische werkzaamheid zien en beves-5 tigt de in vitro-gegevens van de voorbeelden III en IV. Theophylline versterkte blijkbaar de werking van de pyrazonlonverbinding, mogelijkerwijze door vergroting van de hoeveelheid van het cAMP.As the test results in Table C show, both the frequency of occurrence and the weight of the Lewis longearci-noin tuniophen were reduced by the subcutaneous administration of the pyrazolone compound; this demonstrates antineoplastic activity and confirms the in vitro data of Examples III and IV. Theophylline apparently enhanced the activity of the pyrazonlon compound, possibly by increasing the amount of the cAMP.

82013218201321

Claims

Therapeutic method for the reduction of metastasis and neoplastic growth in mammals, characterized in that a therapeutically effective amount of 3-methyl-1- [2- (2-naphthyloxy) -ethyl] -2-pyrazazolin -5-one or one of its pharmaceutically harmless salts is administered.

Method according to claim 1, characterized in that the administration is carried out orally.

3. Process according to claim 1, characterized in that the administration is carried out parenterally. 1-H-1--1 +++ H-8201321