NL8201349A - Reagens voor het aantonen en bepalen van cholesterol en cholesterolesters. - Google Patents

Description

I · »;

Reagens voor het aantonen en bepalen van cholesterol en choles-terolesters.

De uitvinding heeft betrekking op een reagens voor het aantonen van cholesterol en cholesterolesters.

van . f

De bepaling cholesterol is voor de medische diagnostiek van grote betekenis.

5 In de klinische chemie bestaat tegenwoordig steeds meer behoefte aan snelle bepalingen voor het aantonen van stoffen in lichaamsvloeistoffen, die weliswaar vaak niet zo heel exakte resultaten opleveren, maar voor routine- en serieonder-zoekingen een sneller en goedkoper resultaat mogelijk maken.

10 De voor de snelle bepaling gebruikte diagnostische middelen zijn hetzij opzuigende dragers, hetzij watervaste films, die alle voor de reaktie benodigde reagentia bevatten. Wanneer men deze diagnostische middelen met de te onderzoeken lichaamsvloeistoffen in aanraking brengt, verkrijgt men kleurreakties, 15 die hetzij aan de hand van vergelijkingskleuren, hetzij met eenvoudige reflektiefotometers kunnen worden beoordeeld.

. Proeven ter bereiding van middelen voor snelle bepalingen van cholesterol door impregnering van opzuigend papier met cholesteroloxydase, peroxydase, een oxydatieindikator 20 en een buffer leverden niet het gewenste resultaat op, aangezien de verkregen proefpapieren niet reageerden met het choles-terolhoudende serum van gebruikelijke concentratie.

Er werd nu gevonden, dat men bruikbare proefpapieren of proeffilms verkrijgt, die trapsgewijze met cholesterol-25 houdend serum reageren, wanneer men de drager bovendien met een grensvlakaktief middel impregneert.

Het reagens van de uitvinding voor het aantonen en bepalen van cholesterol en cholesterolester in lichaamsvloeistoffen bestaat derhalve uit een drager of een kunststoffilm, 30 die met cholesteroloxydase, een systeem voor het aantonen van ^02 buffer en een grensvlakaktieve verbinding met lypofiele en 8201349 * .* > - 2 - hydrofiele eigenschappen'.geïmpregneerd is of .deze ingebed bevat.

De grensvlakaktieve verbinding is doelmatig .in een concentratie van 2 tot 30%, bij voorkeur 10 tot 20% van.de vaste reagentia aanwezig.

5 Als grensvlakaktieve verbinding met lypofiele en hydrofiele eigenschappen gebruikt men bij voorkeur nietionogene wasaktieve stoffen, die tenminste 1 OH-groep in het molekuul bevatten. De bijzondere voorkeur verdienen polyoxyethyleenderi-vaten van alkyl-, aryl- en aralkylalkoholen. Voorbeelden voor 10 dergelijke, de bijzondere voorkeur verdienende grensvlakaktieve verbindingen zijn polyoxyethyleenalkylethers, polyoxyethyleen-alkylcarbonzuuresters, polyoxyethyleensorbitanalkylcarbonzuur-esters, polyoxyethyleenglycerolalkylcarbonzuuresters, polyoxy-ethyleenalkylaminen, polyoxyethyleenpolyoxypropyleenblokpolymeren, 15 polyoxyethyleenalkylthioethers en polyoxyethyleenalkylarylethers.

Speciale voorbeelden zijn hydroxypolyethoxydodecaan, ethyleen-oxydeadditieprodukten van alkylfenolen, polyethoxyethyleenderi-vaten van sorbitananhydriden, en dergelijke. Ook met mercaptanen gemodificeerde polyoxyethyleenderivaten bleken ongeveer evengoed - -20 te zijn. Bij toepassing van genoemde katagorie bij voorkeur ge bruikte grensvlakaktieve verbindingen is a.ls regel 0,005-0,1 gew% voldoende.

Van deze katagorien verbindingen zijn er hele reeksen in de handel, die verschillen in aantal oxyethyleengroe-25 pen. De beste zijn de in water oplosbare typen met een middel matig aantal, oxyethyleengroepen (5-20). Lager geethoxyleerde typen zijn alleen maar dispergeerbaar en daardoor minder goed bruikbaar. Hoger geethoxyleerde verbindingen (meer dan 25) zijn weliswaar oplosbaar in water, maar zo hydrofiel, dat hun akti-30 viteit verkleind wordt.

Van de anionogene grensvlakaktieve stoffen zijn in het bijzonder de zouten van galzuren, zoals cholzuur, taurochol-zuur en desoxycholzuur geschikt en voorts vetzuurzouten en vetzuur sarko si den. Van bijzondere betekenis zijn zwavelzuurderivaten, 35 die zoals bekend bovendien de gekleurde radikale oxydatieproduk- 8201349 - 3 - ten van vele indikatoren(o-tolidine, heterocyclische azinen) kunnen stabiliseren.. Dit zijn bijvoorbeeld -de volgende katago-rien: sulfobarnsteenesters, alkylaryïsulfonaten, alkylsulfaten en alkylpolyoxyethyleensulfaten.

5 Van de kationogene grensvlakaktieve stoffen kun nen bijvoorbeeld alkylpyridinium- of -trimethylammoniumzouten worden gebruikt, maar ook ingewikkeld gebouwde verbindingen, bijvoorbeeld benethoniumchloride.

Van de amfotere grensvlakaktieve stoffen kunnen 10 bijvoorbeeld imidazoliumbetainen worden gebruikt.

Speciale voorbeelden zijn natriumdi-(2-ethylhexyl)-sulfosuccinaat, natriumdodecylsulfaat, natriumoleaat, benzalko-niumchloride en cetylpyridiniumChloride.

Bij voorkeur worden dergelijke ionogene of amfo-15 tere grensvlakaktieve stoffen in kombinatie met de bovengenoem de nietionogene grensvlakaktieve stoffen gebruikt. De geschikte hoeveelheden komen overeen met die van de nietionogene grensvlakaktieve stoffen.

De voorkeur gaat uit naar de nietionogene grens-20 vlakaktieve stoffen met tenminste 1 OH-groep, omdat die een ongeveer 5 tot 10 maal sterkere aktivering en daarmee een overeenkomstige vergroting van de reaktiesnelheid, respektivelijk verkorting van de reaktieduur opleveren ten opzichte van de andere bruikbare oppervlakteaktieve .stoffen. Ook zijn zij in klei-25 nere hoeveelheden werkzaam.

Onder alkylgroepen worden hier dergelijke groepen met ten hoogste 20, in het bijzonder met 12-18 koolstofatomen verstaan.

Van de nietionogene grensvlakaktieve polyoxyethy-30 leenverbindingen zijn in het bijzonder diegene bruikbaar, die een uitgebalanceerde verhouding tussen de hydrofobe rest en de polyoxyethyleenketen hebben en in water oplosbaar zijn.

Eexi maatstaf voor de verhouding tussen hydrofobe rest en polyoxyethyleenketen is de zogenaamde HLB-waarde (zie 35 W.C.Griffin in J.Soc.Cosmetic Chem. J_ (1950), 311 en 5 (1954), 8201349/ / 249.

- 4 -

Bijzonder bruikbaar zijn grens,vlakaktieve stoffen met ÏÏLB-waarden 10-17. Deze waarden moeten als richtgetallen beschouwd worden, aangezien de aktiviteit ook nog afhangt van 5 de aard van de hydrofobe rest.

Een voorkeurs systeem voor het aantonen van bestaat uit peroxydase en een oxydatieindikator, eventueel samen met zwelmiddelen en/of stabilisatoren.

Voor het aantonen van cholesterol in serum zijn 10 normale door impregneren van opzuigende papieren met de reagen tia verkregen proefpapieren bijzonder geschikt. Wanneer men echter cholesterol in zuiver bloed wil aantonen, is het doelmatig de proefpapieren bijvoorbeeld-volgens het DT-OS 1 .598.048 hydrofoob te maken of met een semipermeabel membraan uit cellu-15 loseesters en dergelijke te bekleden. Bij voorkeur worden echter voor het aantonen in zuiver bloed proeffilms gebruikt volgens het DBP 1.598.153.

Voor hun bereiding worden de reagentia, zoals cholesteroloxydase, peroxydase, buffer, indikator en eventueel 20 zwelmiddelen tezamen met de grensvlakaktieve stof in een wateri ge dispersie van een filmvormen polymeer geroerd. Deze dispersie wordt tot een film uitgestreken en gedroogd. Wanneer choles-terolhoudend bloed op een dergelijke reagensfilm gedruppeld wordt en na 1 minuut afgeveegd wordt, worden eveneens verkleu-25 ringen verkregen, waarvan de intensiteit van de hoeveelheid cholesterol afhangt. Deze verkleuringen zijn in het bijzonder voor kwantitatieve bepaling met eenvoudige remissiefotometers geschikt.

Het reagens volgens de uitvinding is voor het 30 aantonen en bepalen van vrij cholesterol geschikt. Wanneer er echter van cholesterolesters sprake is, moet hieruit eerst het cholesterol vrijgemaakt worden. Dit kan op gebruikelijke wijze, zoals door verzepen met waterige alkali geschieden. Bijzonder gunstig is echter de estersplitsing met cholesterolesterase 35 (hetgeen met voorkeur uit mikroorganismen wordt geïsoleerd), * .....

8201349 - 5 - V i' omdat hierbij zeer voorzichtig gewerkt kan worden.

Het cholesterolesterase kan aan de lichaamsvloeistof worden toegevoegd en een bepaalde tijd irikuberen. Deze werkwijze kan zodanig worden uitgevoerd, dat de lichaamsvloei-5 stof wordt opgezogen in kapillairen, waarvan de binnenwand in analogie met het DBP 2.240.672 met cholesterolesterase en eventuele hulpstoffen bekleed is. Na de inkubatie in de kapillairen wordt de vloeistof dan op de beschreven wijze op de proefstroken opgebracht. Wanneer in de lichaamsvloeistof al vrij en 10 veresterd cholesterol aanwezig waren, wordt uiteraard de som van beide aangetoond. Op gunstige wijze kan het cholesterolesterase echter ook in de proefstroken verwerkt worden, zodat reagentia worden verkregen, waarmee in een trap de som van vrij en veresterd cholesterol aangetoond of bepaald kan worden.

15 De systemen, die voor het aantonen van het bij de oxydatie van cholesterol gevormde waterstofperoxyde geschikt zijn, met voorkeur peroxydase, buffers, oxydatieindikatoren en eventueel zwelmiddelen en dergelijke zijn bijvoorbeeld al uit beschrijvingen van snelle proeven voor de bepaling van glucose 20 bekend. Voorbeelden van bruikbare komponenten van dit met voorkeur gebruikte systeem volgen hieronder:

Van de peroxydase is in het bijzonder dat uit mierikswortel geschikt, maar ook laktoperoxydase en dergelijke kunnen gebruikt worden.

25 Als buffer komen de gebruikelijke buffers, zoals fosfaat,- citraat- of boraatbuffer, in aanmerking. De pH die zij aan het diagnotische middel geven, dient tussen 4 en 9, bij voorkeur tussen 5 en 8, te liggen.

Als oxydatieindikatoren komen allerlei verbindingen 30 in aanmerking en wel benzidinederivaten, bijvoorbeeld o-tolidine, o-vanillinederivaten volgens het DT-AS 1.598.133 of heterocyclische azinen volgens het DT-AS 1.648.840.

Aan de recepten voor de diagnostische middelen, in het bijzonder voor de proeffilms, kunnen ook nog zwelmiddelen, 35 zoals natriumalginaat, carboxymethylcellulose, en dergelijke 8201349 ' i'V * - 6 - toegevoegd worden en voorts stabilisatoren voor de enzymen, bijvoorbeeld dithioerythritol.

Grondstoffen voor proeffilms zijn kunststofdis-persies uit bijvoorbeeld polyvinylpropionaat of -acetaat. Hier-5 in worden alle reagentia,, bij voorkeur opgelost, geroerd, waar na het mengsel tot films uitgestreken en gedroogd wordt.

Proefpapieren worden bereid, door de reagentia in water of mengsels uit water en organisch oplosmiddel op te lossen, filtreerpapieren met de oplossing te impregneren en te 10 drogen. Men kan echter ook van te voren met de in water oplosbare reagentia en daarna met de indikatoren in organische oplossing impregneren.

De volgende voorbeelden lichten de uitvinding toe.

15 Voorbeeld I

Filtreerpapier (Schleicher en Schuil 597 NF Ind.) werd met een oplossing met onderstaande samenstelling geïmpregneerd en bij 40°C gedroogd: 1 molaire citraatbuffer, pH 5,25 20 ml 20 cholesteroloxydase (60 E/mg) 0,1 gram peroxydase (70 E/mg) . 0,05 gram gedestilleerd water, totaal 100 ml

Dit papier werd geïmpregneerd met oplossingen van 0,2 gram o-tolidine in 100 ml methyleenchloride die voorts 25 elk nog 1 gram van de volgende grensvlakaktieve stoffen bevatten: a) polyoxyethyleentributylfenolether b) polyoxyethyleensorbitanmonolauraat c) polyoxyethyleennonylfenolether d) polyoxyethyleenlaurylether 30 e) polyoxyethyleencetylether f) polyoxyethyleenstearaat g) polyoxyethyleendodecylthioether

Na drogen werden proefpapieren verkregen, die op cholesterolhoudende sera met groene kleuren reageerden. Wanneer 35 de sera tegelijkertijd ook cholesterolesters bevatten, worden ________ 8201349 - 7 -

sterkere groene verkleuringen verkregen wanneer enige tijd van . te voren een druppel cholesterolesteraseoplossing aan de sera is toegevoegd. Een proefpapier, dat geen van de genoemde grensvlakaktieve stoffen bevat,, reageert niet met bovengenoemde sera. 5 Voorbeeld'XI

Filtreerpapier (Schleicher en Schuil 597 NF, Ind.) werd met een oplossing met onderstaande samenstelling geïmpregneerd en bij 40°C gedroogd: 1 molaire citraatbuffer 20 ml 10 cholesteroloxydase (60 E/mg) 0,1 gram cholesterolesterase (18 E(mg) 0,25 gram peroxydase (70 E/mg) 0,05 gram gedestilleerd water, tot aan 100 ml

Dit papier werd geïmpregneerd met oplossingen van 15 0,2 gram o-tolidine in 100 ml methyleenchloride die bovendien nog elk 0,5 gram van de onderstaande grensvlakaktieve stoffen bevatten: a) polyoxyethyleencocoaat b) polyoxyethyleenoleaat 20 e) polyoxyethyleenpolypropyleenglycol d) polyoxyethyleenstearylamine e) polyoxyethyleenglycerinemonolauraat

Na drogen werden proefpapieren verkregen, die met dergelijke sera groen reageerden. Wanneer deze cholesterol en/of 25 cholesterolester bevatten. Proefpapieren zonder grensvlakaktieve middelen vertonen geen reaktie.

Praktisch hetzelfde gedrag vertonen proefpapieren, die dezelfde hoeveelheid citraatbuffer met pH 5,25 of 6 bevatten. Voorbeeld III

30 Van te voren geïmpregneerd papier volgens voorbeeld I werd daarna geïmpregneerd met oplossingen van 0,3 gram o-tolidine in 100 ml aceton welke de volgende oppervlakteaktieve stof-* fen in concentraties van 1,5 gram bevatten, a) dioctylnatriumsulfosuccinaat 35 b) dodecylbenzeensulfonzuur, natriumzout

8 2 0 1 3 M

* -v - 8 - c) laurylpolyglycolethersulfaat, natriumzout'.

d) natriumalurylsarcosinaat e) natriumlauraat f) cholzuur 5 g) desoxycholzuur h) natriumtaurochölaat

Deze proefpapieren bezaten praktisch dezelfde eigenschappen als de proefpapieren volgens voorbeeld I, alleen waren de reaktiekleuren langer stabiel.

10 Voorbeeld IV

Van te voren geïmpregneerd papier volgens voorbeeld II werd geïmpregneerd met oplossingen, die 0,4 gram o-tolidine en elk 0,5 gram van onderstaande grensvlakaktieve stoffen bevatten: 15 a) laurylpyridiniumchloride b) benzethoniumchloride c) cetyltrimethylammoniumchloride d) 1-hydroxyethyl-1-carboxymethyl-2-alkylimidazoliniumbetaine

De eigenschappen van de proefpapieren kwamen met 20 die van voorbeeld II overeen.

Voorbeeld V

I ·

Filtreerpapier (Schleicher en Schuil 597 NF, Ind.) werd met een oplossing met onderstaande samenstelling geïmpregneerd en bij 40°C gedroogd: 25 1 molaire fosfaatbuffer (pH 6) 25 ml cholesteroloxydase (60 E/mg) 0,1 gram peroxydase (70 E/mg) 0,05 gram cholzuur 1,0 gram aceton 10 ml 30 gedestilleerd water, tot aan 100 ml

Dit papier werd daarna met oplossingen van oxyda-tieindikatoren in 100 ml aceton geïmpregneerd.

De hoeveelheid indikator, hun chemische struktuur en hun kleurreaktie met cholesterolhoudende sera staan in tabel 35 A: 8201349 * , . -= - 9 -

''Tabel A

Hoeveelheid ' Indicator ''klèurrèaktie 0,3 g o-vanillylideen.-p-van.il- violet loylhydrazon 5 0,2g' azino-bis-(N-ethylbenzthia- groen zolon-2-sulfonzuur-5)-diammoniumzout 10 0,1 g azino-bis-(N-alkylchinolon- blauwviolet 2-sulfonzuur-6) -diammoniumzout 0,1 g bis-(N-alkylchinolon-2)-azine violet 15 0,1 g (N-methylbenzthiazolon-2)-N- blauwgroen ethylchinolon-2)-azine 0,3 g (N-methylbenzthiazolon-2)- blauw 1-fenyl-3,4-dimethyltri-20 azolon-5)-azine «

Voorbeeld VI

Uit onderstaande bestanddelen werd een mengsel bereid: 25 polyvinylpropionaatdispersie 45 gram natriumalginaat, 1,85% in 0,5 molaire fosfaatbuffer, pH 5,5 35 gram cholesteroloxydase (60 E/mg) 0,5 gram peroxydase (70 E/mg) 0,25 gram 30 dioctylnatriumsulfosuccinaat 1 gram o-tolidine, opgelost in 6 ml aceton 0,6 gram water 50 ml

Uit dit mengsel werd een film met een dikte van circa 300 nm in natte toestand gemaakt of het werd op een vaste 35 drager gestreken en bij 35°C gedroogd. Wanneer bloed met choles- 82 0 1 3 4 9 - 10 - terol er. ia op de film wordt gedruppeld en het bloed na 1 minuut wordt afgeveegd, worden, al naar gelang van de cholesterol-concentratie, groene verkleuringen met verschillende intensiteit verkregen.

5 Wanneer aan genoemd recept nog 1,0 gram choles- terolesterase wordt toegevoegd, dan worden films verkregen, waarmee ook verhoogde cholesterolgehalten bepaald kunnen worden.

* 10 8201349

Claims (2)

1. Reagens voor het aantonen en' bepalen van cholesterol en cholesterolesteis in vloeistoffen door oxydatie van de cholesterol met zuurstof in aanwezigheid van cholesterol-oxydase tot cholestenon en waterstofperoxyde en voor het aan- 5 tonen van waterstofperoxyde door met peroxydase gekatalyseerde oxydatie van een oxydatieindikator, met het kenmerk, dat het uit een opzuigende drager of een kunst-stoffilm bestaat, die met cholesteroloxydase, een systeem voor 10 het aantonen van 13^2, buffer en tenminste een grensvlakaktieve verbinding met lypofiele en hydrofiele eigenschappen geïmpregneerd is of deze ingebed bevat.

2. Reagens volgens conclusie 1, met het kenmerk, 15 dat de grensvlakaktieve verbinding in een concen tratie van 10 tot 20% aanwezig is. 20 j 8201349